專利名稱：富集和純化用于包括基質(zhì)輔助激光解吸附/電離(maldi)質(zhì)譜(ms)分析的化學(xué)分析的分析 ...的制作方法
背景1發(fā)明領(lǐng)域本方面涉及質(zhì)譜，更確切地說，涉及對(duì)諸如人血清的生物樣品進(jìn)行預(yù)先富集和純化，從而進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附電離質(zhì)譜(MALDI MS)分析。
2.相關(guān)技術(shù)背景用基質(zhì)輔助激光解吸附電離質(zhì)譜(MS)對(duì)沉積在MALDI目標(biāo)板上的樣品進(jìn)行分析，迅速成為對(duì)蛋白質(zhì)、多肽和其它生物分子進(jìn)行分析的方法。MALDI-MS方法是非常靈敏的方法，也是與生物緩沖液最相適應(yīng)的方法。另外，能在皮克摩爾級(jí)(subpicomole)高效地產(chǎn)生大量生物大分子的離子，使該技術(shù)特別有利于對(duì)大分子的的分析。對(duì)諸如血液、血漿或血清的生物樣品粗品中的肽分析物進(jìn)行分析，給質(zhì)譜分析帶來下述的很多特殊性難題。
第一個(gè)需要克服的難題是，生物樣品中有大量鹽(例如，鈉、鉀、氯化物、磷酸鹽和碳酸鹽)。在通常的MALDI分析方法中，陰離子對(duì)多肽樣品的離子化尤其具有抑制作用。陽離子也存在使主要質(zhì)譜峰分裂產(chǎn)生多個(gè)小峰，導(dǎo)致產(chǎn)生具有附加的陽離子加合物質(zhì)量的陽離子加合物光譜的問題。另外，成功的MALDI-MS分析還依賴于分析物在被注入到質(zhì)譜儀之前，分析物與分析物MALDI基質(zhì)物質(zhì)有效地形成結(jié)晶的能力。MALDI基質(zhì)物質(zhì)需要吸收激光，以使基質(zhì)和所吸附的樣品中的分析物發(fā)生氣化和離子化，從而進(jìn)行分析。之后，離子化的分析物分子受質(zhì)譜儀內(nèi)陽極和陰極之間的高電壓產(chǎn)生的高電場(chǎng)的加速進(jìn)入質(zhì)譜儀離子檢測(cè)器中。即使存在少量污染物如鹽或甘油時(shí)，MALDI基質(zhì)對(duì)諸如蛋白質(zhì)和多肽等分析物的解吸附和離子化能力也會(huì)大大減弱。另外，高濃度鹽提高了MALDI-MS需要的激光強(qiáng)度閾值和鹽加合物多肽(在損害游離多肽信號(hào)的情況下)的強(qiáng)度。
第二，在諸如人血清的樣品中，與干擾蛋白(例如白蛋白、免疫球蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白)相比，通常是分析物多肽的拷貝數(shù)(copy number)很低。目標(biāo)多肽常常只有1微摩爾/升-1皮摩爾/升(例如1毫克/毫升到1皮克/毫升)。與此相反，總白蛋白和γ球蛋白，如IgG，IgM的水平范圍從0.01克/毫升到0.1克/毫升，是1×1011倍的數(shù)量。因此，主要豐度蛋白質(zhì)在MALDI混合物光譜中占有優(yōu)勢(shì)。主要峰使低強(qiáng)度峰變得微弱，所以含量少的成分較難被發(fā)現(xiàn)。這個(gè)難題在諸如人血清的生物樣品中非常嚴(yán)重，因?yàn)樯飿悠分写嬖诟叱龆鄠€(gè)數(shù)量級(jí)的干擾蛋白(例如白蛋白、免疫球蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白)和鹽(例如，鈉、鉀、氯化物、磷酸鹽和碳酸鹽)，使低拷貝數(shù)分子的檢測(cè)變得非常困難。
第三，許多分析物多肽是疏水性的，并且與血液、血漿或血清中的主要蛋白結(jié)合，尤其是白蛋白傾向于與疏水性分子非特異性結(jié)合。因此，去除不需要的蛋白可能導(dǎo)致分析物多肽的損失。諸如鹽和清潔劑等化學(xué)裂解劑，有助于分析物多肽與白蛋白的解離，但這些試劑抑制MALDI過程。例如聚乙二醇(PEG)和Trition使MALDI高效解離，并且產(chǎn)生比蛋白質(zhì)、多肽更強(qiáng)的MALDI信號(hào)。因此，這些試劑抑制了蛋白質(zhì)、多肽的MS信號(hào)。在加入化學(xué)裂解劑使多肽與白蛋白解離后，必須對(duì)化學(xué)裂解產(chǎn)生的白蛋白和其它污染蛋白與分析物多肽進(jìn)行分離。另外，要使用含量少的分析物多肽在分離過程中不損失的分離方法。當(dāng)分析物多肽是疏水性的，傾向于與疏水表面結(jié)合時(shí)，分離非常困難。如果用液相色譜方法純化生物多聚體常會(huì)導(dǎo)致30％樣品的損失，并且會(huì)進(jìn)一步引入污染物。對(duì)于大多數(shù)MALDI-MS用戶，這樣的樣品損失是不能接受的。
最后，由于分析物多肽的含量很少，在進(jìn)行MALDI-MS分析前需要富集。首先進(jìn)行多肽的解離，成分的分離，然后富集?，F(xiàn)有技術(shù)采用的方法很費(fèi)力而且需要很多耗時(shí)耗力的步驟。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)方式進(jìn)行這些步驟的方法和裝置。因此，提高了樣品通量，減低了分析成本。
文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了許多用麻煩費(fèi)力的技術(shù)，來進(jìn)行MALDI-MS分析前的污染物的分離。通常，基于液相或親和色譜的方法得到了最大限度的應(yīng)用。利用液相色譜進(jìn)行的分離方法包括將連接體分子用化學(xué)方法連接到液相色譜柱的固定相(產(chǎn)生官能性的固定相)上。當(dāng)樣品裝入色譜柱后，流動(dòng)相流經(jīng)固定相。每一種分析物與固定相的結(jié)合時(shí)間(而不是在流動(dòng)相中的時(shí)間)決定了不同分析物(以及污染物和干擾物)通過液相色譜柱的相對(duì)遷移速度，使分析物得到純化。例如，諸如蛋白質(zhì)和多肽等目標(biāo)分析物分子可以被吸附在官能性的固定相上，而污染物則從色譜柱流出。然后，調(diào)整流動(dòng)相使固定相上的目標(biāo)分子分離出。適用于MALDI-MS的揮發(fā)性緩沖液，諸如乙腈/水混合物，可用作此步驟的流動(dòng)相。用此方式，純化后的目標(biāo)分子從液相色譜柱子流出，收集后用于MALDI-MS分析。此時(shí)樣品一定程度上，不含會(huì)干擾或減弱分析靈敏度的鹽、其它污染物。
因此，需要在MALDI-MS分析前對(duì)樣品進(jìn)行富集的新的裝置、方法和程序。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的之一是提供在對(duì)諸如血清、血漿、全血、腦脊液、尿液等生物樣品進(jìn)行靈敏的基質(zhì)輔助激光解吸附電離質(zhì)譜分析前進(jìn)行預(yù)處理的方法。另一目的是提供一種簡(jiǎn)便、高效的方法，提高樣品通量(throughput)，降低分析成本。再一目的是提供一種這些方法所使用的裝置，該裝置具有使用方便、提供高質(zhì)量數(shù)據(jù)、生產(chǎn)成本較低的特點(diǎn)。最理想的是，該裝置可以為用戶提供預(yù)清洗和預(yù)處理，而需要最少的制備步驟和最少的制備時(shí)間。另一目的是提供一種裝置，該裝置的生產(chǎn)成本低，可單獨(dú)、經(jīng)濟(jì)地使用，因而在臨床研究和人、獸醫(yī)學(xué)臨床診斷應(yīng)用中，不必考慮過多的花費(fèi)而自由使用。由于分析結(jié)果不會(huì)依賴于前期的使用條件、清洗步驟、或分析裝置的磨損程度等，這種可以預(yù)清洗的裝置給使用者帶來了改進(jìn)的一致性和可靠性。在使用前，為使用者提供了不用進(jìn)行費(fèi)力的手工清洗裝置的方便。
另外，我們提供了電泳的裝置和方法，用于改進(jìn)基質(zhì)輔助激光解吸附電離質(zhì)譜分析前樣品的制備。該裝置和方法為用戶提供了分析物解離、電泳分離、富集以及捕獲到MALDI相適的捕獲層上。有利的是，捕獲層是帶有板框架的滑板，該框架與可拆卸的附件組合，使捕獲物直接附在質(zhì)譜分析的MALDI樣品板上?；瑒?dòng)裝置將樣品快速引入到質(zhì)譜儀中，從而使分析物以一種自動(dòng)化的方式進(jìn)行處理。因此滑動(dòng)裝置提供了高通量，減少了樣品的分析成本。這些裝置和方法提供了對(duì)化學(xué)分析樣品的快速和高效的制備、分離、富集和格式化的改進(jìn)系統(tǒng)。本發(fā)明特別適合于質(zhì)譜分析之前生物樣品的制備?？傊狙b置和方法是通用的，并提供了具體實(shí)施方式
，可用來富集單電荷陰離子或單電荷陽離子或多電荷陰離子或多電荷陽離子的肽、多肽、寡肽或蛋白質(zhì)。另外，本方法可用于帶電荷的碳水化合物、糖蛋白、DNA、RNA或其它帶電荷的代謝中間體。
電中性分子(即內(nèi)部不帶電荷的分子)也可以用本文以下公開的電泳裝置和方法進(jìn)行分析，a)電流通過多孔固定相使固定相帶有凈電荷，流動(dòng)的反離子誘導(dǎo)周圍溶劑流，此時(shí)產(chǎn)生電泳誘導(dǎo)的電滲流(EOF)，或b)通過引入帶電膠離子(或帶電粒子)使中性分析物分開。后一種分離(通常在毛細(xì)管中進(jìn)行)的基本原理通常被稱作膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MECC)。這些方法可與本發(fā)明公開的用于分析不帶凈電荷的各種分子的裝置和方法聯(lián)合使用。這樣中性分子包括那些沒有被離子化的基團(tuán)、諸如pH值接近等電點(diǎn)的多肽或蛋白質(zhì)分子的分子、zitterionic species或其它類型的中性分子。
本發(fā)明可以用來富集疏水性或親水性的分子。這種富集的結(jié)果是在集中電場(chǎng)的作用下導(dǎo)致多孔膜在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的、離散位點(diǎn)處捕獲了分析物，其中，調(diào)節(jié)多孔捕獲膜，使之與用于分析分析物的MALDI質(zhì)譜儀的樣品板相適合。為幫助所捕獲的分析物進(jìn)行離子化，在多孔捕獲膜放進(jìn)MALDI質(zhì)譜儀前，將MALDI基質(zhì)引入到膜上的離散位點(diǎn)。帶有多孔捕獲膜的富集和捕獲裝置按照如下所述的方法進(jìn)行使用，以使其能適用于大范圍的生物分子中，在MALDI質(zhì)譜分析之前改進(jìn)樣品的制備。


圖1是富集器的透視圖。
圖2是富集器的俯視圖。
圖3是富集器的側(cè)視圖。
圖4a是柱狀樣品池的放大側(cè)視圖。
圖4b是柱狀樣品池的放大俯視圖。
圖5是與光響應(yīng)電極相接觸的單池和多孔層的放大圖。
圖6是頂部電極和底部電極與電壓電源相連的含分析物樣品的單池及多孔膜視圖。
圖7是MALDI捕獲膜(有分析物捕獲位點(diǎn)的陣列)固定在MALDI的樣品板上的側(cè)視圖，其中膜上的捕獲位點(diǎn)中加有含MALDI基質(zhì)的溶劑。
圖8是滑動(dòng)組件，其具有分離層的頂框部件帶有樣品池，嵌入底表面上具有捕獲層的中間框部件中(俯視圖)。
圖9是圖8組件的頂框部件俯仰視圖。
圖10是圖8組件的底框部件俯視圖。
圖11顯示了與電極(500)接觸的多孔膜(8)的另一實(shí)施方式，具有壓縮層(510)，用來將分析物捕獲和富集在捕獲膜(60)的選擇部分(68)上。
圖12顯示了用于通過電泳富集帶電荷分析物的壓縮層(510)的俯視圖，分析物通過富集孔(518)被富集到捕獲膜的選擇部分上。
圖13是圖11所示實(shí)施方式的另一種變化形式，在捕獲層(60)的底部增加了另外的壓縮層(510)。
圖14是用于分離和富集分析物的具有二維陣列池的裝置。
圖15是圖14中池的側(cè)視圖。
圖16是圖15所示的帶有電極和底部電解液池的裝置。
圖17是圖16所示的多孔捕獲膜900的側(cè)視圖，其由澆鑄到另一固體聚合體層上的孔陣列內(nèi)的多孔聚合體整體材料(monolith material)組成。
圖17A是圖16所示的多孔捕獲膜900的俯視圖，其由澆鑄到另一固體聚合體層上的孔陣列內(nèi)的多孔聚合體整體材料組成。
圖18是池陣列的側(cè)視圖。
圖18A是圖15所示裝置的一個(gè)池的視圖，其中使用了多孔層。
圖19是特殊壓縮層(600)的俯視圖，其上有等電聚焦IPG帶(610)，用于在進(jìn)行質(zhì)譜分析的捕獲前提供改進(jìn)的分離效果。
圖20是不滲透層(600)的俯視圖，其在IPG帶(610)下具有聚焦位點(diǎn)(660)，用于在進(jìn)行質(zhì)譜分析的捕獲前提供改進(jìn)的分離效果。
圖21是泛素寡肽混合物樣品的質(zhì)譜圖，該樣品用(0，1，2，3或4分子)的德克薩斯紅標(biāo)記，并且光富集(photo-concentrated)到500MW截留的CEA透析膜上。通過以下步驟得到此圖譜從膜上提取寡肽置入含CHCA的基質(zhì)溶液中，將溶液直接點(diǎn)到不銹鋼目標(biāo)板上，使溶液揮干。
圖22是圖21所示相同泛素樣品的質(zhì)譜圖。不同的是，泛素樣品被光富集到250,000MW截留的PVDF透析膜上，含CHCA的MALDI基質(zhì)溶液直接點(diǎn)到PVDF膜上，揮干，然后用雙面膠帶(3M)粘貼到不銹鋼MALDI樣品板上。
圖23和23A是被電富集到PVDF捕獲膜上(用芥子酸作為MALDI基質(zhì))的帶負(fù)電荷的血清蛋白的質(zhì)譜圖。
圖24是被電富集到PVDF捕獲膜上(用CHCA作為MALDI基質(zhì))的帶負(fù)電荷的血清蛋白的質(zhì)譜圖。
圖25和25A是被電富集到PVDF捕獲膜上(用芥子酸作為MALDI基質(zhì))的帶正電荷的血清蛋白的質(zhì)譜圖。
圖26是被電富集到PVDF捕獲膜上(用CHCA作為MALDI基質(zhì))的帶正電荷的血清蛋白的質(zhì)譜圖。
圖27顯示了焊接工具、多孔膜和PVDF薄層。
圖28顯示了鉆孔導(dǎo)板、焊接導(dǎo)板和底板。
圖29顯示了焊接的捕獲膜的孔區(qū)域。焊接周長(zhǎng)以直徑表示，為0.5-1mm之間。
圖30顯示了包被有0.5μl的MALDI基質(zhì)的焊接膜。
圖31是5飛摩爾(femtomole)ACTH(片段18-39)的質(zhì)譜圖，其中ACTH位于焊接到固相PVDF膜上的多孔捕獲膜上。
圖32是附有多孔膜的孔的基本實(shí)施方式的示意圖。
圖33A和33B是用溶劑提取樣品前，分析物結(jié)合到捕獲膜上的熒光性分析物(Tr-泛素)的熒光圖象。左側(cè)圖(33A)是膜的頂部(施用樣品的那一面)的圖象，右側(cè)圖(33B)是膜的底部(施用樣品面的相反面)的圖象。
圖34A和34B是用適宜的釋放溶劑乙腈∶水(50∶50)釋放后的分析物結(jié)合到PVDF捕獲膜上熒光性分析物(Tr-泛素)的熒光圖象。左側(cè)圖(34A)是膜的頂部(施用樣品的那一面)的圖象，右側(cè)圖(34B)是膜的底部(施用樣品面的相反面)的圖象。
圖35是在聚合體支撐層上經(jīng)過鉆孔形成的直徑為200μm的整塊多孔捕獲位點(diǎn)。
圖36A、36B、36C和36D是直接來自于支撐層上的4個(gè)分離的整體多孔捕獲位點(diǎn)的質(zhì)譜圖。4個(gè)位點(diǎn)上都檢測(cè)到ACTH片段。
本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種對(duì)電場(chǎng)內(nèi)聚集的帶電荷分析物的多樣品分析物進(jìn)行分離、富集和捕獲的裝置和方法。這些裝置和方法包括一個(gè)或多個(gè)下面描述的方面和/或步驟。
A.貯存多樣品的池圖1，2和3分別給出了富集器的透視圖、俯視圖、側(cè)視圖。該裝置是一個(gè)多池樣品貯存系統(tǒng)，用來在質(zhì)譜分析中同時(shí)制備一個(gè)或多個(gè)樣品。圖中給出了本裝置的基本功能組成。裝置2具有設(shè)置在上表面4上的樣品池6。盡管該裝置可以有不同的外型，但通常為矩形，正如從上表面4所視，每一邊的尺寸為0.5cm-50cm之間。該裝置更常用的是每邊尺寸為2cm-15cm之間的矩形。該裝置的樣品池可為1-1000個(gè)，更常用的是10-100個(gè)池，這有賴于樣品通量和將樣品自動(dòng)化加到樣品池的設(shè)備的可行性。樣品池的形狀可以有多種，如圓柱體、立方體、具有各種形狀的橫截面的長(zhǎng)斜方體，橫截面形狀為如正方形、六角形、五角形等。池的直徑或?qū)挾韧ǔＴ?mm和1cm之間。深度在1mm和2cm之間，更常用的深度在2mm和10mm之間。
圖4a和4b給出了放大的樣品池的俯視圖、側(cè)視圖。每個(gè)樣品池有側(cè)壁12，頂部開口14和底面16。側(cè)壁12是由可以保留含水液體樣品的無孔材料制成，并且有內(nèi)表面20和外表面22。當(dāng)樣品池貯存樣品時(shí)，含水樣品至少與側(cè)壁12的一部分內(nèi)表面20接觸。含水樣品一般來自諸如血液、血漿、血清、腦脊液、尿液、細(xì)胞提取物等生物樣品。池可以貯存液體樣品并使之在分析過程中停留在池內(nèi)。池是用來貯存液體樣品經(jīng)純化和分離(和富集)去除其中可能存在的非分析物而得到的分析物。一般地，側(cè)壁12的高度在1mm和1cm之間，可以貯存1μl(微升)至3ml(毫升)體積的液體樣品。為了便于操作更大或更小體積的樣品，需要的話，本裝置可以按比例進(jìn)行相應(yīng)的放大或縮小，使側(cè)面和底面的尺寸在0.1mm到10cm之間。本裝置的側(cè)壁12和上表面4通常由無孔材料制成。無孔材料可以是陶器或金屬，如不銹鋼、陽極化處理的鋁、銅等。通常無孔材料可以是以下的聚合物，如聚碳酸酯，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚酰亞胺，尼龍，人造絲，氟碳化合物，全氟化碳，聚二甲基硅氧烷，聚酯，丙烯酸(酯)類樹脂，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯，聚甲醛，聚芳酯，聚氯乙烯，PBT-聚酯，聚苯并咪唑乙縮醛共聚物(polybenzimidazone acetalcopolymers)乙縮醛共聚物，聚酰亞胺，乙烯-氯三氟乙烯，PET聚酯，乙烯-四氟乙烯，氟化乙烯丙烯，聚乙烯，聚氨酯，聚酮，聚氯三氟乙烯，聚對(duì)苯二甲酸乙二酯聚酯，聚環(huán)氧丙烷，聚丙烯苯乙烯，聚醚醚酮，聚芳醚砜，聚酰胺酰亞胺，聚芳酯，聚甲基戊烯，聚酮，聚砜，PBT-聚酯和/或聚合物的混合物。其它物質(zhì)也可用來制作富集器，這些物質(zhì)包括丙烯酸(酯)類樹脂，如LUCITE或Plexiglas；丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)；聚甲醛(乙縮醛)，聚芳酯(ARDEL)；聚氯乙烯(PVC)；PBT-聚酯(CELANEX)；聚苯并咪唑(Celazole)；乙縮醛共聚物Celcon或Delrin；聚酰亞胺，如Duratron或Kaptone；乙烯-氯三氟乙烯，如Halar；PET-聚酯，如Ertalyte，乙烯-四氟乙烯，如Tefzel；氟化乙烯丙烯(FEP)；聚乙烯；聚氨酯，如Isoplast；聚酮，如Kadel；聚氯三氟乙烯(Kel-F)；聚偏二氟乙烯(PVDF)；聚對(duì)苯二酸乙二酯聚酯，如Mylar；聚環(huán)氧丙烷和苯乙烯，如Noryl；聚醚醚酮，如PEEKTM；聚四氟乙烯(Teflon)；聚芳醚砜，如Radel；聚酰胺酰亞胺，如Torlon；聚苯硫醚，如Techtron或Ryton；聚芳酯，如Ardel；聚甲基戊烯(TPX)；聚酮，如Kadel；聚砜，如Udel；PBT-聚酯，如Valox。
B.用于分離分析物與干擾物的分離層在樣品池內(nèi)或下方是兩層或多層的多孔層8，用來在靈敏的質(zhì)譜分析中分離、富集、保留和結(jié)合分析物。圖5是兩層或多層的多孔層8的實(shí)例結(jié)構(gòu)的放大橫切面圖。池的底面可全部或部分為多孔的，并且全部或部分暴露于多孔層8。當(dāng)池底面僅部分是多孔時(shí)，池底面通常包括多孔區(qū)24和無孔區(qū)26。當(dāng)用作諸如提高層8材料強(qiáng)度的結(jié)構(gòu)或在側(cè)壁12和多孔層8之間形成密封結(jié)構(gòu)時(shí)，非多孔區(qū)是有利的。
第一多孔吸收層30通常是吸收加到池6中的液體樣品的液體吸收層。例如，液體樣品可以用移液管或其它樣品分配工具加到池中，然后被吸收到層30中。之后，將用于緩沖的導(dǎo)電液體電解質(zhì)，在不顯著稀釋樣品的情況下，加到被吸收的樣品上。未被顯著稀釋的樣品緊鄰于多孔層8。吸收層30通常是不溶于水性溶劑的吸水的聚合纖維性材料或微粒狀材料，如棉花或玻璃纖維、紙或合成纖維或微粒。纖維或微粒可由以下多種物質(zhì)制備得，如纖維素、硝化纖維，纖維素酯，玻璃纖維，尼龍，人造絲，碳氟化合物，全氟化碳，聚二甲基硅氧烷，聚酯，丙烯酸(酯)類樹脂，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯；聚甲醛；多芳基化合物，聚氯乙烯，PBT-聚酯，聚苯并咪唑乙縮醛共聚物，聚酰亞胺，乙烯-氯三氟乙烯，PET聚酯，乙烯-四氟乙烯，氟化的乙烯丙烯，聚乙烯，聚氨酯，聚酮，聚氯三氟乙烯，聚對(duì)苯二甲酸乙二酯等。層30的主要要求是a)能吸收含水樣品，對(duì)于目標(biāo)分析物而言是多孔的。優(yōu)選的層30是由Sephadex顆粒(Pharmacia-Amersham)制成。例如，此Sephadex顆?？梢允荊-50-Course，被微細(xì)尼龍網(wǎng)保留在層32的上表面，尼龍網(wǎng)有20至100微米直徑的網(wǎng)眼(即比Sephadex顆粒的直徑100-300微米小)。Sephadex的體積可以根據(jù)樣品體積大小進(jìn)行調(diào)節(jié)。通常體積大小在5至100微升之間。
色譜分離層40包括第二多孔層。在裝置運(yùn)行中，層40對(duì)于加到池6中的分析物而言有不同的孔。這些分析物可以是蛋白質(zhì)、多肽或肽，它們根據(jù)分子大小的不同、電荷的不同、疏水性的不同或?qū)Ψ蛛x層40的親和性的不同，以不同的速度通過層40。因此分析物從池6中，以不同的速度通過分離層40，進(jìn)入下面的捕獲層60。通常，層40包括一種或多種分離介質(zhì)，使高質(zhì)量(即分子量)樣品組分與低分子量樣品組分相分離。此時(shí)，相比低分子量樣品組分，高質(zhì)量樣品組分在通過層40時(shí)的速度受到延遲。例如，層40可以由諸如透析膜的分子篩構(gòu)成。這種透析膜對(duì)本領(lǐng)域熟悉臨床透析和蛋白純化的技術(shù)人員而言是熟知的。通常這種透析膜可以由以下物質(zhì)構(gòu)成，如纖維素，醋酸纖維素，聚酯等。使用這種膜的一個(gè)問題是如果過量加載大分子(保留分子)后，該膜容易被污染。過量加載造成的嚴(yán)重污染可以用對(duì)流(流動(dòng))去除膜表面的保留分子的方法預(yù)防?？梢岳弥亓Α㈧o水壓力、磁力攪拌棒等方法驅(qū)動(dòng)對(duì)流。優(yōu)選地，層40的第一分離層的介質(zhì)應(yīng)該是諸如瓊脂糖，更優(yōu)選是聚丙烯酰胺的多孔凝膠狀物質(zhì)。對(duì)熟悉用延遲速度的方法將小分子與大分子分離的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，當(dāng)帶電大分子(如DNA，RNA，或蛋白質(zhì))被置入電場(chǎng)中，這種凝膠不會(huì)產(chǎn)生污染。這種依靠電泳對(duì)很大范圍的生物大分子進(jìn)行分離的凝膠都是熟知的。這種凝膠的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可以在電泳分離時(shí)，對(duì)大量樣品進(jìn)行操作，沒有過量的問題。熟知這種凝膠狀物質(zhì)在電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)下通過電泳對(duì)高分子蛋白質(zhì)、DNA、RNA或其它生物聚合物進(jìn)行過濾時(shí)，不會(huì)造成污染和堵塞的問題。蛋白和多核苷酸純化領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的凝膠是聚丙烯酰胺或瓊脂糖。通過調(diào)整孔徑大小可以調(diào)整這種介質(zhì)的濾網(wǎng)性質(zhì)。例如，聚丙烯酰胺的孔徑大小可以通過調(diào)整丙烯酰胺單體的濃度(或雙-丙烯酰胺交聯(lián)體的濃度)而改變。
分離層40可以包括多個(gè)幫助分離生物大分子的亞層52。第二、三、四或更多的分離介質(zhì)可以與第一分離介質(zhì)組合、連續(xù)或混合地使用。例如，分離介質(zhì)的多個(gè)亞層可包括不同孔徑或大小呈梯度排列的孔徑(每種組合中，孔徑從上向下依次增加)，進(jìn)一步預(yù)防多孔分離層40的堵塞。例如頂層是2.5％丙烯酰胺，中間層是5％丙烯酰胺，下層是7.5％丙烯酰胺。另外，亞層52可以由結(jié)合并去除全血、血漿、血清中白蛋白或IgG的特異性物質(zhì)組成。對(duì)這些物質(zhì)的特異性清除可以利用親和色譜的選擇性吸附原理。例如，蛋白質(zhì)、碳水化合物或多核苷酸可被結(jié)合在諸如纖維素、糊精、丙烯酰胺、聚合樹脂等基質(zhì)上面的抗體、植物血凝素或寡核苷酸清除。其它選擇性清除分析物的方法包括將蛋白質(zhì)與金屬(如鋅或鎳)螯合、生物素-抗生物素蛋白作用、疏水染料-白蛋白結(jié)合等，這些技術(shù)在構(gòu)建親和基質(zhì)領(lǐng)域中是熟知的。
C.分析物的富集層和捕獲層第三多孔富集層50可任選放在層40下作為富集層。層50由可為分析物提供高遷移率的物質(zhì)構(gòu)成，該分析物被富集在捕獲層60的捕獲區(qū)68。構(gòu)成富集層50的材料例如為高通透性的瓊脂糖、纖維素(例如Whatman#1或Whatman#2濾紙或類似物)。此類物質(zhì)的固相部分有較大孔徑，但防止富集層50內(nèi)的流動(dòng)仍然是有利的。使用時(shí)，富集層50要足夠厚，防止分析物從分離層40擴(kuò)散和流動(dòng)到下面的捕獲層60。通常的厚度在200至3000微米之間。
富集層50有助于將分析物富集(例如濃縮)在與多孔層8平行的平面上。一旦目標(biāo)分析物在進(jìn)入捕獲層60前，穿過強(qiáng)抗力的分離層40時(shí)，富集就發(fā)生了。富集層40雖是任選存在的，但存在時(shí)，其可幫助富集的分析物進(jìn)入捕獲層60中的捕獲區(qū)68。
位于分離層40和任選的富集層50下面的是分析物捕獲層60。捕獲層60也是多孔的以使離子電流通過。捕獲層60孔徑通常要足夠小，可以使依賴捕獲機(jī)理的捕獲效率最佳化。捕獲機(jī)理可以簡(jiǎn)化為篩分，在這樣情況下孔徑尺寸要比目標(biāo)分析物的尺寸小。當(dāng)通過篩分捕獲小分子蛋白質(zhì)和寡肽，孔徑必須是相當(dāng)小的，數(shù)量級(jí)為10-100埃?？讖娇梢孕∮诨虼笥谀繕?biāo)分析物。當(dāng)捕獲層60的孔徑大于目標(biāo)分析物時(shí)，捕獲層60必須對(duì)目標(biāo)分析物具有親合力，如下所述。
捕獲層60通常是厚度在1微米和1000微米之間的膜。更通常的厚度為10微米至200微米之間。在薄層中捕獲目標(biāo)分析物便于之后提取用于MALDI-MS分析的分析物。另外，與池深18成比例的薄捕獲層60可使分析物按比例富集。捕獲層60的厚度必須足以能使膜具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度和結(jié)合力。
對(duì)于一種典型的分離和捕獲方法，采用的電場(chǎng)范圍為5-100伏特/厘米。通常的電壓為約5伏特(通常為約3伏特至約10伏特)，陽極和陰極之間的距離為約0.4厘米(通常為0.005厘米至約5厘米)。電泳速度為v＝μE (公式1)μ是分析物分子的電泳遷移率，E是電場(chǎng)強(qiáng)度。μ值直接由愛因斯坦關(guān)系式，根據(jù)擴(kuò)散系數(shù)D計(jì)算出D＝(kT/q))μ (公式2)室溫下氨基酸和相似大小的分子的擴(kuò)散系數(shù)大約是10-5cm2/秒。從室溫下單電荷分子的數(shù)值(kt/q)≈0.0259伏特，我們發(fā)現(xiàn)這些分子的μ值大約是4×10-4cm2/(伏特·秒)。因此，根據(jù)公式1，在約20伏特/厘米的電場(chǎng)中這些分子穿過膜的速度大約為(20伏特/cm)·4×10-4cm2/(伏特.秒)＝8×10-3cm/秒(例如大約80微米/秒)。
我們很快發(fā)現(xiàn)，如果膜的厚度為約80微米，穿過膜的時(shí)間將約為1秒。如果是較高電場(chǎng)、較高電泳遷移率或膜的厚度較薄，則穿過時(shí)間要相應(yīng)的短(對(duì)于較低電場(chǎng)、較低電泳遷移率或較厚的膜，則時(shí)間相應(yīng)變長(zhǎng))。本發(fā)明中，穿過膜(分析物和膜之間缺乏親合力)的時(shí)間通常在0.1和100秒之間。
捕獲層60的捕獲機(jī)理優(yōu)選是基于分析物與層60的結(jié)合而不僅是靠篩分。當(dāng)發(fā)生足夠結(jié)合時(shí)，則不再需要通過篩分而捕獲。當(dāng)結(jié)合到捕獲膜60時(shí)，分析物穿過層60的時(shí)間極大地提高(與分子在游離狀態(tài)下的穿過時(shí)間成反比)。例如，如果分子平均花費(fèi)99.99％的時(shí)間進(jìn)行結(jié)合(0.01％的時(shí)間游離)，則穿過時(shí)間提高到104倍。簡(jiǎn)而言之，不進(jìn)行結(jié)合的穿過時(shí)間是1秒，當(dāng)分析物的結(jié)合時(shí)間為99.99％時(shí)，則穿過時(shí)間變成大約10,000秒。通常，穿過膜(與捕獲層60結(jié)合的情況下)的時(shí)間在10至106秒之間。
通過結(jié)合進(jìn)行捕獲與通過篩分進(jìn)行捕獲至少有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，a)孔徑可以比篩分用的孔徑大很多，b)捕獲層60是一種在捕獲分析物分子后，可以被清洗除去污染物的膜。用親合捕獲時(shí)，膜孔徑可以比生物樣本中的水合離子(如鈉、鉀、鈣和氯化物)的直徑大很多。為進(jìn)行有效的結(jié)合捕獲，孔徑必須僅小于分析物在穿過時(shí)間t內(nèi)穿過膜的擴(kuò)散距離x。正如以上所討論，通常t在0.1至1000毫秒之間，d在10-5至10-7cm2/秒之間。以三維擴(kuò)散的表達(dá)式x2＝6Dt (公式3)代表小分子蛋白質(zhì)(擴(kuò)散系數(shù)大約為10-6cm2/秒)的捕獲效率，甚至是上述最快通過時(shí)間(例如0.1毫秒)，我們發(fā)現(xiàn)孔徑x也可能達(dá)到8000埃(或幾乎1微米)。相對(duì)照，為了去除分子量1000-60,000的小分子分析物，用篩分捕獲時(shí)的孔徑常常得小很多倍(大約15-40埃)。因此，對(duì)于電泳速度很高(或使用薄膜)的親合捕獲，允許使用孔徑從10埃至大約1微米的多種孔徑。較慢的電泳速度或使用厚膜則使孔徑相應(yīng)增大(從10埃至10微米或更大)。
這樣的捕獲可以是任何結(jié)合機(jī)理。例如含帶疏水性側(cè)鏈的氨基酸的多肽和蛋白質(zhì)。如此疏水表面和多孔疏水膜傾向于以適當(dāng)高的親合力結(jié)合這樣的分子。這種多孔膜材料為如乙烯-四氟乙烯，例如Tefzel；氟化乙烯丙烯(FEP)；聚乙烯；聚氯三氟乙烯(Kel-F；)；聚偏二氟乙烯(PVDF)；苯乙烯，例如Noryl；聚四氟乙烯(Teflon)多孔Teflon，或類似能很好地結(jié)合多肽和蛋白質(zhì)分析物的物質(zhì)。優(yōu)選分子量大約250,000的PVDF透析膜(從SpectrumLaboratories；Rancho Dominguez，CA獲得)用于捕獲這樣的多肽。另外，由硝化纖維素，尼龍，人造絲，聚酯等類似物制成的多孔捕獲膜，具有與蛋白質(zhì)和多肽的固有親合力，可以用作這些分子的捕獲膜。另外，捕獲層60可用硝化纖維素，纖維素，尼龍，人造絲，聚酯，多孔PVDF等類似物的薄膜制成。
捕獲層60可以是多肽結(jié)合層，可以由結(jié)合多肽的物質(zhì)或衍生后能結(jié)合多肽的物質(zhì)制成。一般地，整個(gè)捕獲層60由相同物質(zhì)制成。另外，層60具有隔離的多肽結(jié)合區(qū)或島。由此，分析物可被富集并結(jié)合層60，然后用蒸餾或凈化水或預(yù)定pH和離子強(qiáng)度的緩沖液如碳酸銨緩沖液清洗。通過清洗結(jié)合有分析物的表面，使可能存在于樣品中的雜質(zhì)，如鹽、或清潔劑被去除。這樣抑制或干擾分析物MALDI信號(hào)的物質(zhì)顯著減少，提高了對(duì)分析物分子檢測(cè)的靈敏度。
用于捕獲多肽的捕獲層60通常由薄的、微孔物質(zhì)制成，如是由蛋白結(jié)合物質(zhì)如聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的透析膜。層60的多孔材料必須經(jīng)得住水或有機(jī)溶劑，如水溶液緩沖液和電解液、甲醇、乙醇，和乙腈，所有的這些試劑被經(jīng)常用于MALDI-MS樣品和MALDI基質(zhì)中。為了結(jié)合多肽和蛋白質(zhì)，結(jié)合層60通常是疏水性的。疏水性可以來自烷基或芳基的有機(jī)基團(tuán)，或是天然存在于聚合物中或通過化學(xué)方法連接到表面上，這種方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。另外，疏水性也可以來自碳氯化合物和碳氟化合物，如乙烯-氯三氟乙烯，全氟化碳，如聚氯三氟乙烯，乙烯-四氟乙烯，氟化乙烯丙烯，聚氯三氟乙烯(Kel-F；)；聚偏二氟乙烯(PVDF)；聚四氟乙烯(Teflon)乙烯-四氟乙烯，例如Tefzel；氟化乙烯丙烯(FEP)等。透析膜的孔隙率還可以允許依靠分子大小進(jìn)行選擇性的捕獲而不是單獨(dú)靠疏水性進(jìn)行選擇。例如5,000分子量大小的疏水性透析膜可用于選擇性保留分子量大于5,000的全部分子。用含有諸如辛基葡糖苷、Triton X-100、NP-40等類似物的清潔劑，或諸如乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等類似物的有機(jī)溶劑的洗脫溶液清洗膜，可以將小分子量的分析物從膜上洗脫出。然后去除洗脫物，蛋白質(zhì)通過疏水性作用結(jié)合到捕獲膜上。
組成捕獲層60的物質(zhì)也可以包括其它與蛋白質(zhì)結(jié)合的聚合物，如聚二甲基硅氧烷，聚酯，丙烯酸(酯)類樹脂，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯；聚甲醛；聚芳酯，聚氯乙烯，PBT-聚酯，聚苯并咪唑，PET聚酯，聚乙烯，聚氨酯，聚對(duì)苯二酸乙二酯聚酯，聚環(huán)氧丙烷，聚丙烯苯乙烯，聚醚醚酮，聚芳醚聚芳酯，聚甲基戊烯，PBT聚酯，和/或聚合物的混合物。其它可以用來制造富集器的物質(zhì)包括，丙烯酸(酯)類樹脂，如LUCITE或Plexiglas；丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)；聚甲醛(乙縮醛)，聚芳酯(ARDEL)；聚氯乙烯(PVC)；PBT-聚酯(CELANEX)；聚苯并咪唑(Celazole)；乙縮醛共聚物Celcon或Delrin；聚酰亞胺，如Duratron或Kaptone；Halar；PET-聚酯，如Ertalyte，聚乙烯；聚氨酯，如Isoplast；聚酮，如Kadel；聚對(duì)苯二酸乙二酯聚酯，如Mylar；聚環(huán)氧丙烷和苯乙烯，如Noryl；聚醚醚酮，如PEEKTM；聚芳醚砜，如Radel；聚酰胺酰亞胺，如Torlon；聚苯硫醚，如Techtron；聚芳酯，如Ardel；聚甲基戊烯(TPX)；聚酮，如Kadel；聚砜，如Udel；聚丙硫醚，如Ryton；PBT-聚酯，如Valox；聚合物的混合物形成的膜，例如Xenoy；或兩層或多層聚合物膜的層壓層。
多孔捕獲膜具有質(zhì)譜儀可識(shí)別的標(biāo)記位置，在該標(biāo)記位置上至少有一預(yù)定位置，其與標(biāo)記位置的距離是已知的。預(yù)定位置相應(yīng)于捕獲區(qū)，捕獲區(qū)是捕獲層上富集目標(biāo)分子的區(qū)域。標(biāo)記位置可以是黑色不透明區(qū)。裝置2聚焦的電泳電流優(yōu)先通過捕獲膜60中的捕獲區(qū)68而不是區(qū)域62，從而導(dǎo)致所選分析物在區(qū)域68得到富集。富集量與區(qū)域68的面積(見66線所示的橫截面(cross-section)成反比，該面積與捕獲膜60上方的全部樣品池6的橫截面積相關(guān)。線64顯示了池的橫截面。因此富集量與線66長(zhǎng)度的平方除以線66長(zhǎng)度的平方所得數(shù)值成正比。富集的分析物被捕獲膜60捕獲，以使它們后來以富集形式(如濃縮形式)被放置在MALDI目標(biāo)板上，從而能從該富集形式中被提取出來。樣品富集區(qū)的直徑大小通常在1至1000微米之間。更通常的富集區(qū)域的直徑在50至200微米之間。
如果分析物穿過捕獲層60，可以在捕獲層60下面放置阻擋層70以預(yù)防分析物的漏出。類似于層30、40、50和60，層70也是多孔的。層70的孔徑要足夠小，以防止所有選擇的目標(biāo)分析物從層70漏出。阻擋層70可以是任何能截留小分子量物質(zhì)的透析膜，例如從Spectrum Laboratories，Inc.獲得的CEA透析膜能截留分子量大約500的物質(zhì)，其與PVDF捕獲膜40能很好地合作，用于保留人血漿或血清中可能存在的目標(biāo)肽。任何適當(dāng)?shù)耐肝瞿?，或其它帶有合適小孔的膜，都可用作阻擋層。如果分析物被層60的上層61通過篩分而捕獲，則無需阻擋層70。
同樣地，設(shè)置在捕獲層60和阻擋層70下面的是任選存在的緩沖層80。緩沖層可以是固體、液體，或者二者的聯(lián)合。例如緩沖層可以是濃縮的緩沖基質(zhì)的液體溶液，如250mM的組氨酸水溶液。最佳的緩沖液的pH值接近所需緩沖物質(zhì)的等電點(diǎn)，對(duì)于組氨酸而言，為大約7.5-8.0。從而在最小的離子導(dǎo)電率下，緩沖能力很強(qiáng)。同時(shí)，天冬氨酸或谷氨酸的飽和溶液，或其它的兩性離子緩沖液也可用于等電點(diǎn)pH2.5-3.0范圍的類似緩沖?；蛘撸@樣的緩沖液可以被混入到包括諸如瓊脂糖或聚丙烯酰胺的水性凝膠或溶膠-凝膠中。
多孔層8可以包括層30、40、50、60、70和80中的所有各層或其中的幾層。分離層40和捕獲層60是裝置必需的，層30、50、70和80是可任選存在的。這些任選的層，提高了裝置的性能，包括更堅(jiān)固的操作性，快速分離，更完全捕獲，或改善pH的穩(wěn)定性或者兼具。
D.用于聚焦電場(chǎng)的電極多孔層8的底面是底部電極100，該電極可提供電流從而使多孔層8內(nèi)產(chǎn)生離子流。包括層30、40、50、60、70和80的層8的所有層，它們對(duì)電解液樣品中的離子是多孔性的，由此使電泳吸引分析物向電極100運(yùn)動(dòng)時(shí)，離子流聚集到捕獲薄膜60的區(qū)域68上。
圖6給出了單個(gè)樣品池6的示意圖，其含有在導(dǎo)電離子液體電解質(zhì)90中的樣品分析物。
頂部電極140浸入在樣品電解液90中作為反電極與導(dǎo)線150相連接。導(dǎo)線150的另一端連接于電源160，該電源也連接于導(dǎo)線120，導(dǎo)線120也連接于底部電極100。電源向頂部電極140施加偏壓，頂部電極140相對(duì)于底部電極具有電勢(shì)。元件6、8、12、90、100、120、140、150和160共同作用形成有電泳分離功能的電解池。如用一個(gè)穩(wěn)壓器，該偏壓可以是預(yù)先確定的、或是恒定值或編程隨時(shí)間而變。另外，電源可以是恒電位計(jì)，其中穿過電解池的電流是預(yù)定的或固定的。在一個(gè)優(yōu)選的工作模式中，電源是恒電位計(jì)，電解池可以在100微安至10毫安之間范圍內(nèi)按恒電位模式運(yùn)行。更常見的是，電流在大約400微安至1毫安之間。電流值被預(yù)定后，電壓在約1至100伏特之間的范圍。更常見的是，電壓在2.0伏特和20伏特之間。
優(yōu)選的底部電極是光導(dǎo)(photoconductive)電極，其使電極內(nèi)的電流路徑限制在電極100的光導(dǎo)區(qū)域200內(nèi)。光導(dǎo)材料可以是諸如摻雜硅或鍺、砷化鎵、二氧化鈦、氧化鎢或類似物的半導(dǎo)體。這些光響應(yīng)(photoresponsive)材料可以是單晶體，或多晶體，即多個(gè)小晶體。另外，光導(dǎo)電極100可以是非晶材料制成的膜。例如，可以通過蒸發(fā)或?yàn)R射沉積方法得到這樣薄膜。優(yōu)選的半導(dǎo)體材料可以是通過低成本絲網(wǎng)印刷技術(shù)沉積TiO2或類似的半導(dǎo)體材料而制成的厚膜。用來制造薄或厚的膜的光導(dǎo)材料的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。
使用來自光源180的聚焦或平行的光束190照射光導(dǎo)電極，將導(dǎo)致光導(dǎo)區(qū)域200的產(chǎn)生。區(qū)域200包括電極100的被照射區(qū)域和圍繞各被照射區(qū)域少數(shù)載流子的擴(kuò)散距離d。對(duì)于諸如純的單晶鍺的材料，距離d可以基本在1毫米數(shù)量級(jí)或更大。在純的單晶硅內(nèi)距離d可以在100-500微米數(shù)量級(jí)，或通過在單晶半導(dǎo)體中適量摻入可以縮短少數(shù)載流子壽命的材料，使距離小于100微米甚至小于1微米。這樣的材料或″壽命殺手″是本領(lǐng)域所熟悉的比如黃金、鐵、銅等的金屬。因此，可以基本控制光導(dǎo)區(qū)域200的尺寸。光束的直徑通常在0.001至1毫米之間。利用小的聚焦光源，比如激光或其它的光源直接穿過孔徑透鏡或聚焦透鏡，光的寬度可以是1-100微米或更少，產(chǎn)生直徑從1-500微米或更小的光導(dǎo)區(qū)域200。
可以用單個(gè)連續(xù)的半導(dǎo)體電極作光響應(yīng)電極，以產(chǎn)生許多有兩個(gè)或兩個(gè)以上光導(dǎo)區(qū)域200的含多個(gè)電解池的陣列(例如參見圖1，2和3)。光響應(yīng)電極100可以通過一個(gè)或一個(gè)以上的導(dǎo)線120連接到電源160，給光響應(yīng)電極100相對(duì)于反電極140施加偏壓。兩個(gè)或兩個(gè)以上的電解池與單個(gè)光響應(yīng)電極連接，通過控制射向光響應(yīng)電極100的光導(dǎo)區(qū)域200的光強(qiáng)度，使穿過每個(gè)電解池的光流分別得到控制?？梢酝ㄟ^控制光束190的光強(qiáng)度獨(dú)立地控制穿過每個(gè)電解池的光流。例如，恒電位模式下，可以通過在電極140和100之間預(yù)先設(shè)置單個(gè)偏壓，分別對(duì)電解池進(jìn)行操作，但要分別獨(dú)立地監(jiān)測(cè)通過電解池的光流，分別為向每個(gè)電解池提供光束的光源提供反饋信號(hào)，使穿過電解池的光流保持預(yù)定值。在恒電位方式下，通過控制照明強(qiáng)度可以對(duì)各電解電池進(jìn)行操作。在一優(yōu)選的運(yùn)行方式中電源是恒電位計(jì)，選擇的電流在100微安到10毫安范圍內(nèi)。更常見的電流在大約400微安到1毫安之間。電流預(yù)定后，電壓在1-100伏特范圍之內(nèi)。更常見的電壓在2.0伏特和20伏特之間。
充當(dāng)反電極的頂部電極140，不必是光響應(yīng)的。頂部電極140優(yōu)選由諸如鉑、黃金、鈀等的插入材料組成。頂部電極140也可以用價(jià)格比較低廉材料，比如不銹鋼、鈦、鉻等物質(zhì)。事實(shí)上任何導(dǎo)電的物質(zhì)都可以用做頂部電極，只要那些電極材料不被含水樣品腐蝕或溶解。為了減低費(fèi)用又保持最佳耐腐蝕性，頂部電極140可以是將惰性材料鍍到價(jià)格比較低廉的材料，比如鐵、銅、鈦、鎢黃銅等之上。反電極也可由導(dǎo)電的含碳材料如碳、石墨等構(gòu)成。其優(yōu)勢(shì)是，可用絲網(wǎng)印刷技術(shù)將含碳物質(zhì)置于非導(dǎo)電聚合體上，由此用便宜的制造方法生產(chǎn)導(dǎo)電物質(zhì)。
本發(fā)明提供了一個(gè)快速體系，用來從諸如血漿、血清和腦脊液等存在鹽、脂質(zhì)和糖等干擾物質(zhì)的復(fù)雜生物樣品中制備和分離需要的分析物。然后分離的分析物以“Z”維(dimension)方式被富集、捕獲到膜60上。通過捕獲區(qū)68將電場(chǎng)聚集在各樣品電解池內(nèi)，分析物也可以以“X”和“Y”維，即在捕獲膜60的平面內(nèi)被富集到捕獲區(qū)68上。
E.具有捕獲位點(diǎn)陣列的捕獲板，可向MALDI目標(biāo)板提供其上的可移動(dòng)負(fù)載物用于MALDI質(zhì)譜分析在分析物分離和富集在捕獲膜60的區(qū)域68后進(jìn)行MALDI質(zhì)譜分析，將結(jié)合層60與其它多孔層分離，并將結(jié)合層60附著在適于MALDI質(zhì)譜分析的樣品板300上，然后引入圖7所示的質(zhì)譜儀中。然后將溶于適當(dāng)基質(zhì)溶劑中的適宜MALDI基質(zhì)以小滴350加到結(jié)合膜的捕獲區(qū)域68上。使溶劑溶解分析物，待溶劑蒸發(fā)后，在捕獲膜60的頂面61上形成摻入分析物的MALDI基質(zhì)晶體。在MALDI質(zhì)譜分析領(lǐng)域，眾所周知的基質(zhì)通常是有機(jī)酸，這些有機(jī)酸在紫外激光器(脈沖氮激光器)激發(fā)的電磁波譜范圍(例如337納米)有強(qiáng)的能量吸收。通常MALDI基質(zhì)以液態(tài)形式加入以再溶解分析物，以小體積比如0.5到5.0微升加入，為了不將樣品分析物顯著稀釋，以免使其平鋪在一稍大面積，以至超過分析物捕獲膜60捕獲區(qū)域68的頂面61。借助于自動(dòng)化分配裝置可以減少基質(zhì)的體積，例如1皮升到1納升。更常見的基質(zhì)體積在1微升和1納升之間。待溶劑液體蒸發(fā)形成MALDI基質(zhì)晶體以后，樣品板即將被送進(jìn)質(zhì)譜儀。在MALDI樣品板300被插進(jìn)質(zhì)譜儀后，MALDI基質(zhì)晶體被強(qiáng)烈的紫外激光脈沖照射，導(dǎo)致一部分分析物分子被電離，該技術(shù)為本領(lǐng)域眾所周知。然后測(cè)定是否存在離散分子量的離子，該方法也為本領(lǐng)域眾所周知。
利用裝置2對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品板上的樣品進(jìn)行MALDI-MS分析。MALDI-MS樣品板通常由導(dǎo)電材料構(gòu)成，來防止激光輔助電離過程中樣品表面的靜電充電。裝置2內(nèi)部的捕獲膜60的橫截面通常很薄，例如在10微米到200微米厚之間，靜電電荷可以與MALDI樣品板電容耦合。
電容耦合防止樣品表面充電產(chǎn)生高壓從而防止電場(chǎng)的任何不良作用，該電場(chǎng)可以加速M(fèi)ALDI質(zhì)譜儀中的電離樣品。另外的薄的非導(dǎo)電裝置可以由導(dǎo)電物質(zhì)構(gòu)成，以便該裝置有合理的厚度。在本例子中，捕獲膜60的厚度可以是1mm或更厚。
導(dǎo)電物質(zhì)可以是前面提到的任何添加了導(dǎo)電物質(zhì)的聚合體。例如添加了以無定形碳或石墨的導(dǎo)電的碳或，可以極大地增加捕獲膜的導(dǎo)電率，這是眾所周知的。另外該裝置可由導(dǎo)電性的金屬，比如不銹鋼、鋁、黃金、銀、鈀、銅、鉻等構(gòu)成。在另外的實(shí)施方案中，摻雜的或本征的半導(dǎo)體材料也可以給裝置提供導(dǎo)電率。如果半導(dǎo)體是本征的，高于半導(dǎo)體帶隙的電磁輻射可以為半導(dǎo)體裝置提供充分的導(dǎo)電率，消除捕獲膜上的任何電荷。
對(duì)MALDI質(zhì)譜儀的操作人員眾所周知的是，可以將小樣品池22定位，可以用激發(fā)激光來激發(fā)池22表面。如下面實(shí)施例中所示的，包括池底面區(qū)域26在內(nèi)的富集分析物30部位的激發(fā)，可以提高分析物檢測(cè)的靈敏度?；|(zhì)一般是放到酸性溶液中與有機(jī)溶劑混合來提高基質(zhì)的可溶性，當(dāng)有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，基質(zhì)就結(jié)晶了。
本發(fā)明中典型的MALDI基質(zhì)的例子包括，但不限于芥子酸(C11H12O5)，通常被稱為CHCA的α-氰基-4-羥基肉桂酸(C10H7NO3)，3，4，5-三甲氧基肉桂酸，龍膽酸(C7H6O4)，三羥基苯乙酮C8H8O4)，蒽三酚(C14H10O3)，2-4-羥基苯基偶氮基)-苯甲酸(C13H10N2O3)，2-氨基苯甲酸，反式-3-吲哚基丙烯酸(C11H9NO2)、阿魏酸(C10H10O4)、煙酸-氮氧化物(C6H5NO3)，2’-6’二羥基苯乙酮(C8H8O3)、甲基吡啶酸(C6H5NO2)、3-羥基甲基吡啶酸和6-氮雜-2-胸腺嘧啶(C4H5N3OS)。通常，這些MALDI基質(zhì)分子溶于與水混溶的有機(jī)溶劑，比如乙腈、丙酮或甲醇中。溶劑和基質(zhì)與這些分子的酸性水溶液，如蟻酸、乙酸或三氟乙酸相混合。其中的酸用以使MALDI基質(zhì)溶液的pH保持充足的酸性，保證風(fēng)干后形成酸性結(jié)晶而不是鹽結(jié)晶。酸性溶液也保證多肽和蛋白質(zhì)分析物以質(zhì)子化狀態(tài)存在，此時(shí)MALDI的激發(fā)效果最好，這是本領(lǐng)域眾所周知的。典型的MALDI基質(zhì)溶液包括50％(體積)的乙腈溶液(包含20mg/ml的CHCA或芥子酸)和50％的0.1％TFA水溶液。
為了便于對(duì)裝置進(jìn)行操作，制作能提供有兩個(gè)或兩個(gè)以上樣品池的陣列并能提供密封多孔層8以及快速拆卸該裝置的部件，可將保留樣品的捕獲層40和MALDI基質(zhì)方便、直接地插入質(zhì)譜儀中。圖8給出了滑動(dòng)組件400的俯視圖，它有頂框部件410和底框部件440。在完成樣品分離和分析物被捕獲到捕獲膜40后，頂框部件和底框部件可以被相互拆卸下來。頂框部件和底框部件440利于捕獲層的拆卸和安裝。頂框部件410構(gòu)成了分離和富集裝置2的頂面4。在頂面4上澆鑄或鉆出鋸齒狀缺口形成樣品池6。將諸如含丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑的聚合液體倒入池中形成需要厚度，可方便地將分離層40插入池6。如通過加入過硫酸胺等鏈激發(fā)劑或核黃素等光敏劑或讓核黃素吸收紫外或400-450nm光的方法，液體就聚合了。這種利用聚合作用制備凝膠的方法為本專業(yè)已知。
圖9為示出底面414的頂框部件410的仰視圖，底表面414有從頂面4向下突出的凸起(projections)412。分離層40填充每個(gè)凸起的底部覆蓋底表面416。通過此途徑，分離層可以直接與隨后的多孔層例如捕獲層60或任選的富集層50接觸?？虿考?10通常有0.5到10mm的厚度，更常見的從0.7到2毫米。池6的總深度等于框部件410的厚度加上凸起412的長(zhǎng)度減去凸起中分離層40的厚度(以及減去任選的保護(hù)層30的深度)。
圖10顯示出滑板組件400的底框部件450的俯視圖。框架部分450的頂面452有洞454，在任何方向延伸穿過框部件450。在框部件450的底表面456的上面放置捕獲層60(或先放任選的富集層50，然后是捕獲層60)，以便分離層40(放在頂框部件410的凸起412中)可以與捕獲層60或富集層50直接接觸，頂框部件410中凸起412的長(zhǎng)度與框架部分450的厚度近似相等。
在底框部件450的上邊452中，壓出一凹陷458，凹陷458是一磁鐵材料，比如一大約1毫米厚的鋼片。在質(zhì)譜分析膜60上的樣品被分析時(shí)，磁鐵材料的功能是將底框部件(連同附著的捕獲膜60)牢固地固定到MALDI樣品板300上。為此，MALDI樣品板在相應(yīng)部位已經(jīng)安裝固定磁鐵。
F.用來提高電場(chǎng)聚集和從捕獲滑板化學(xué)提取分析物的裝置一中可選擇的具體實(shí)施方案見圖11。該方案與圖10類似，除了在分離層40和捕獲層60之間增加了壓縮層510。圖12所示，壓縮層510有不滲透性區(qū)域512和小孔518，允許從分離層40透過不滲透區(qū)域512到捕獲層60的離子導(dǎo)電?？?18的功能是強(qiáng)迫離子電流只通過捕獲膜60的小橫截面捕獲區(qū)域68，孔518的中心實(shí)際上與捕獲膜60的捕獲區(qū)域68的中心對(duì)齊。孔的直徑通常在10微米和2毫米之間。更常見的直徑在50和500微米之間。壓縮層510可以是任一厚度，但為達(dá)到持久和緊湊的目的，通常在50微米和1000微米厚之間。尤其是壓縮膜厚度大于200微米時(shí)，它對(duì)在孔中沉淀多孔的、吸水的、親水的物質(zhì)非常有用，以保持孔中的水相緩沖液沒有氣泡。吸水的疏水物可以是從多種材料中選擇的，例如瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖凝膠、乳液、二氧化硅微粒、玻璃粒子等。親水粒子的直徑要比壓縮層510的厚度小。小心注意粒子表面的電荷。例如當(dāng)帶正電荷的高分子分析物穿過孔518被電泳富集時(shí)，吸水的疏水物應(yīng)選擇中性或表面凈電荷為正的物質(zhì)。表面凈電荷為負(fù)時(shí)，只可以被用作在當(dāng)表面電荷間的距離遠(yuǎn)大于大分子帶正電時(shí)的距離。同樣地，當(dāng)帶負(fù)電荷的高分子分析物穿過孔518被電泳富集時(shí)，吸水的疏水物將選擇中性或表面凈電荷為負(fù)的物質(zhì)。表面凈電荷為正時(shí)，只可以被用在當(dāng)表面電荷間的距離遠(yuǎn)大于大分子帶負(fù)電時(shí)的距離。
可以用來制備壓縮層510的材料包括金屬，如鋁、鈦、鉻、鋅、鉭、鎢，或其與其它元素的混合物。優(yōu)選的聚合體材料為如聚碳酸酯，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚酰亞胺，纖維素，硝化纖維，纖維素酯，尼龍，人造絲，碳氟化合物，全氟化碳，聚二甲基硅氧烷，聚酯，丙烯酸(酯)類樹脂，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯；聚甲醛；聚芳酯，聚氯乙烯，PBT-聚酯，聚苯并咪唑；乙縮醛共聚物；聚酰亞胺；乙烯-氯三氟乙烯；PET-聚酯，乙烯-四氟乙烯；氟化乙烯丙烯；聚乙烯；聚氨酯；聚酮；聚氯三氟乙烯；聚對(duì)苯二酸乙二酯聚酯；聚環(huán)氧丙烷；聚丙烯苯乙烯；聚醚醚酮；聚芳醚砜；聚酰胺酰亞胺；聚芳酯；聚甲基戊烯；聚酮；聚砜；PBT-聚酯和/或聚合物的混合物。其它可以用來制造富集器的物質(zhì)包括，丙烯酸(酯)類樹脂，如LUCITE或Plexiglas；丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)；聚甲醛(乙縮醛)，聚芳酯(ARDEL)；聚氯乙烯(PVC)；PBT-聚酯(CELANEX)；聚苯并咪唑(Celazole)；乙縮醛共聚物Celcon或Delrin；聚酰亞胺，如Duratron或Kaptone；乙烯-氯三氟乙烯乙烯，如Halar；PET-聚酯，如Ertalyte，乙烯-四氟乙烯，如Tefzel；氟化乙烯丙烯(FEP)；聚乙烯；聚氨酯，如Isoplast；聚酮，如Kadel；聚氯三氟乙烯(Kel-F)；聚對(duì)苯二酸乙二酯聚酯，如Mylar；聚環(huán)氧丙烷和苯乙烯，如Noryl；聚醚醚酮，如PEEKTM；聚四氟乙烯(Teflon)；聚芳醚砜，如Radel；聚酰胺酰亞胺，如Torlon；聚苯硫醚，如Techtron；聚芳酯，如Ardel；聚甲基戊烯(TPX)；聚酮，如Kadel；聚砜，如Udel；PBT-聚酯，如Valox。其它的無孔材料也可使用，但尤其優(yōu)選的材料是聚酰亞胺(Kapton)。
任選的第二壓縮層520可以放在捕獲膜60下面，捕獲膜60以″三明治″的方式放在第一和第二壓縮層之間，如圖13所示。
第一壓縮層510的不滲透區(qū)域512可以與捕獲膜60的保留區(qū)域、第二壓縮層不滲透區(qū)域522焊接在一起，以防止捕獲膜60捕獲區(qū)域68中的分析物移動(dòng)(擴(kuò)散、對(duì)流或電場(chǎng)內(nèi)的漂移)到捕獲膜60的區(qū)域62。該捕獲分析物將被保留在區(qū)域68中，在后續(xù)的樣品制備步驟中，例如加入MALDI基質(zhì)后會(huì)保留更多?？梢杂萌軇┗蚣訜岬氖侄魏附颖∧?，這種聚合物和金屬材料的制備和焊接的技術(shù)已經(jīng)眾所周知。
G.進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度的分離步驟本發(fā)明的裝置和方法可以和傳統(tǒng)的分離和富集步驟結(jié)合，達(dá)到進(jìn)一步提高分離和富集效果，產(chǎn)生高檢測(cè)靈敏度。附加的步驟需要額外的時(shí)間，但附加的步驟可以與本發(fā)明中的步驟結(jié)合進(jìn)行自動(dòng)化方式操作。因此這些步驟操作簡(jiǎn)便，要求很少或不必人員干預(yù)或人員參加。
i)等電聚焦例如，等電聚焦步驟可以與前面提到的提純和富集步驟結(jié)合。可以用圖14所示的改進(jìn)裝置進(jìn)行樣品的等電聚焦。改進(jìn)的地方包括在富集層50使用1個(gè)以上的等電聚焦條610。等電聚焦條可以被連續(xù)地放在裝置的第一個(gè)方向620。二個(gè)以上的離散的等電聚焦條可以放在與第一個(gè)方向垂直的第二方向630。要將二個(gè)或以上的條平行放置。將各等電聚焦條610放在壓縮層510的下面，在壓縮層510中富集裂孔的中心下面有裂孔660。圖14中的虛線640給出了每個(gè)富集條610的中心軸。各裂孔660可以看作孔518在第一個(gè)方向620的伸長(zhǎng)。每個(gè)富集條640的中心軸直接在不滲透壓縮層600的裂孔660下面。在有二個(gè)以上等電聚焦條610的地方，有二個(gè)以上的裂孔660，每個(gè)裂孔沿著等電聚焦條610的中心軸640排列，實(shí)質(zhì)上與相互間的裂孔平行。
可以在任何適當(dāng)?shù)撵o止基質(zhì)上進(jìn)行等電聚焦(IEF)，比如纖維素(或玻璃)或其它的碳水化合物纖維膜、交聯(lián)葡聚糖凝膠粒子的柱床、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠。靜止相可以防止流體對(duì)流，提供穩(wěn)定的pH梯度，這種等電聚焦的工藝是已知。例如P.Glukhovskiy和G.Vigh.等電聚焦分離對(duì)映體的分析和制備。分析化學(xué)1999，71，(17)，3814-3820。
簡(jiǎn)要地說，IEF是在水相電解質(zhì)中形成pH梯度，二電極間相隔一段距離，一個(gè)做陽極另一個(gè)作陰極進(jìn)行電泳。可以在陽極端加入酸性介質(zhì)(如高pH)，在陰極端加入更多的堿性介質(zhì)(如低pH)形成pH梯度。也可以讓電流自然地經(jīng)過電解液，從一電極到另一電極形成pH梯度。這是因?yàn)榘凑盏仁?4)，水在陽極被氧化，pH自然降低(4)相反，按照等式(5)，水在陰極被還原，pH升高
(5)通過向電解液中加入兩性電解質(zhì)的方法可以使pH梯度得到穩(wěn)定和線性化。兩性電解質(zhì)是兩性的分子，有可被替代的酸性和堿性基團(tuán)。為了在IEF過程中建立穩(wěn)定的pH梯度，可以使用不同兩性電解質(zhì)的混合物。每種兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)(pI)，它是兩性電解質(zhì)上凈電荷等于零時(shí)的pH。
兩性電解質(zhì)在外加電場(chǎng)中遷移，直到它們到達(dá)它們pI的pH梯度處。然后它們的速度變成零。它們可以緩沖任何外部的pH變化，例如當(dāng)樣品中的分析物進(jìn)入梯度時(shí)。當(dāng)相對(duì)于陰極向陽極施加正電壓時(shí)，不同的兩性電解質(zhì)在陽極和陰極之間的電場(chǎng)中以連續(xù)的方式被安排，最低pls的物質(zhì)最靠近陽極，最高pls的物質(zhì)最靠近陰極。方利的pH為3.0-10的兩性電解質(zhì)混合物來自西格瑪化學(xué)公司，例如號(hào)碼為p1647的產(chǎn)品。
可用共價(jià)結(jié)合將兩性電解質(zhì)固定到基質(zhì)上，在條或平板上形成固定pH梯度(IPG)。
例如，可以從Amersham生物科學(xué)公司購買這樣的IPG strips條。Amersham號(hào)碼為17-6003-73的產(chǎn)品可用來在7厘米的距離上形成pH3-11的梯度。除去IPG技術(shù)具有電流弱、穩(wěn)定性高、兩性電解質(zhì)不和分析物一起流出不干擾后續(xù)的分析的特點(diǎn)外，IPG技術(shù)與兩性電解質(zhì)移動(dòng)形成pH梯度相似。
為了對(duì)帶電荷分析物進(jìn)行等電聚焦，分析物被加到等電聚焦條610的pH梯度中，用同樣的方法加入兩性電解質(zhì)。與兩性電解質(zhì)一樣，分析物析物遷移到它們的等電點(diǎn)并被富集。在穩(wěn)定狀態(tài)下，帶電荷的分析物富集到在等電聚焦條帶460。在此點(diǎn)，等電聚焦停止。
然后多孔層60，70和80被組裝在壓縮層600的下面，附加了頂部電極(140)和底部電極500，加入足夠量的水相緩沖液，使離子穿過多孔層與電極接觸。如前所述施加適當(dāng)?shù)牡钠珘?bias potential)，通過穿過壓縮層的裂縫660進(jìn)入捕獲層60的窄帶，等電聚焦帶中分析物被進(jìn)一步富集。當(dāng)分析物被捕獲到捕獲膜后，拆卸裝置2，捕獲膜60作為滑板組件，如以前描述的那樣，使用適當(dāng)?shù)腗ALDI基質(zhì)溶液并進(jìn)行烘干使之與分析物一起形成MALDI結(jié)晶，然后放到MALDI樣品板上。
按此方法，被分析物在電場(chǎng)中被等電聚焦富集在第一方向620，然后再沿垂直方向650的電場(chǎng)被富集到捕獲膜上預(yù)定的離散分子線，分子線的定義是壓縮層600中相應(yīng)的裂縫660。因此可在高的檢測(cè)敏感性下，方便地檢測(cè)被分析物的質(zhì)譜特性。
實(shí)施例1分離來自血清白蛋白的泛素多肽在PVDF薄膜上進(jìn)行MALDI-TOF分析，用十二烷基硫酸鈉(SDS)提高多肽的遷移率標(biāo)記的蛋白標(biāo)準(zhǔn)用得克薩斯紅(Cat No.T-6134，Molecular Probes，Eugene OR)的NHS-酯和Marina Blue(product# M-10165，Molecular Probes，Eugene OR)分別制備得克薩斯紅標(biāo)記的泛素(TR-泛素)和Marina Blue牛血清白蛋白(MB-BSA)。使用Molecular Probes推薦的標(biāo)記程序。簡(jiǎn)而言之，將NHS-熒光標(biāo)記物約1□g/ml置入二甲基甲酰胺(DMF)中，然后通過攪拌加入到中性標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的濃度為lmg/毫升或更高濃度的蛋白質(zhì)樣品中，使標(biāo)記試劑與蛋白質(zhì)的摩爾比為10/1。使標(biāo)記物與蛋白質(zhì)樣品反應(yīng)一個(gè)小時(shí)。然后反應(yīng)混合物通過經(jīng)250mM L-組氨酸(sigma)緩沖液平衡的P6離心柱(spin column，Bio-Rad)。將標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品25微升等份分裝，冷凍貯藏。
電解池、聚丙烯酰胺，瓊脂糖和多孔膜用光電印跡方法(photo-electroblotting)分離和富集分析物的基本系統(tǒng)如圖6所示。末端開口的樣品池是由一大約2厘米長(zhǎng)和大約2厘米直徑的短圓筒的聚苯乙烯小管形成。分離層附著在管的一端形成樣品池的底部。分離層由10％聚丙烯酰胺預(yù)制的2-3毫米厚片(從biorad處獲得)而制得。聚丙烯酰胺作為分子量篩，延遲大蛋白的電泳速度超過小蛋白和多肽?？梢詼p少聚丙烯酰胺的交聯(lián)，允許大蛋白遷移加快或可提高交聯(lián)以更好地延遲蛋白和多肽的遷移速度，這種凝膠基質(zhì)中電泳分離蛋白質(zhì)的技術(shù)是眾所周知的。
任選地，在樣品加入前，用1％瓊脂糖密封聚丙烯酰胺凝膠的邊緣與樣品池的側(cè)壁(為了防止漏液)。在使用之前，瓊脂糖和聚丙烯酰胺用250mM組氨酸緩沖液(pH 7.8)平衡?；蛘?，丙烯酰胺凝膠可以原位聚合，不需要密封材料。瓊脂糖(Type 1-Blow EEO)來自Sigma Chimical company。通常，稱出100毫克的瓊脂糖放入帶螺旋帽的玻璃瓶中。為了促進(jìn)蛋白質(zhì)和多肽的電遷移率，使用時(shí)加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，使它們的電遷移率較少受周圍環(huán)境pH的影響。當(dāng)使用SDS時(shí)，將含有10□L的10％十二烷基硫酸鈉水溶液(SDS)(Sigma)的10毫升250mM的L-組氨酸西格瑪加到100毫克的瓊脂糖中。(如果不使用SDS時(shí)，則不加入SDS)。在使用之前，將瓊脂糖在微波爐中加熱成液態(tài)。沿著聚苯乙烯圓筒的側(cè)壁將一層瓊脂糖倒在預(yù)制的聚丙烯酰胺上面，以密封所有漏液。然后冷卻瓊脂糖使凝固。接著，將樣品加到1-10微升的含10％甘油250mM的L-組氨酸中。然后將一層running buffer(和上面提到的瓊脂糖溶液相同，但是不含瓊脂糖)小心加到樣品上面。
為了進(jìn)行分析物分子的分離和捕獲，將預(yù)制的聚丙烯酰胺放到一系列多孔膜8的上面。薄膜如下所述，是購得和貯存的，干的或預(yù)先水合的。將膜切成正方形(大約1.5厘米×1.5厘米)，用甲醇漂洗，以濕潤(rùn)并清洗疏水的聚合物。在轉(zhuǎn)移到緩沖水溶液(250mM組氨酸)中后，將它們冷藏直至使用。PVDF透析膜(截留分子量250,000)，再生纖維素透析膜(截留分子量1000)和CEA透析膜(不對(duì)稱纖維素酯)截留分子量500都來自Spectrum Laboratories，Rancho Domingez，CA。PDVF-P(0.45微米池徑)和PDVF-PSQ(0.2微米池徑)來自Millipore，Billerica，Massachusetts。Zeta膜(0.45微米池徑)來自BioRad，Hercμles，CA。
半導(dǎo)體和光學(xué)儀器n型鍺晶片(厚14mil，直徑5厘米)購自美國(guó)的Polishing Corporation公司。晶片的電阻率小于0.4歐姆-厘米。在晶片的上表面使用鎵/銦共熔物和銅絲制作歐姆接觸。。歐姆接觸用五分鐘快干環(huán)氧膠層機(jī)械加固。用作光陽極的強(qiáng)化鍺片，與激光和聚焦光學(xué)器件在一起被安裝到光學(xué)臺(tái)上。安裝過的鍺片用夾子連接到實(shí)驗(yàn)室支架上。用1毫瓦功率的633納米的氦氖光進(jìn)行光電印跡。用直徑100微米到1mm之間的集中光束沖擊底面玻璃的表面。
在這個(gè)實(shí)施例中，強(qiáng)化的鍺晶片被用作光響應(yīng)電極100，如圖100所示。緩沖層80由被250mM組氨酸緩沖溶液飽和的PVDF-P膜組成。在PVDF-P膜上，放置由CEA透析膜形成的阻擋層70。捕獲層60由如上所述的PVDF-透析膜構(gòu)成。聚丙烯酰胺分離層40，與上所述的附加材料一起形成樣品池，被直接組裝到捕獲層、緩沖層和光響應(yīng)電極上。
電泳分離和雜交將0.2μL的TR-泛素、MB-BSA(1-2μg/μL)或兩者加到2μL樣品中，樣品含有包括25％(v/v)甘油的250mM組氨酸緩沖水溶液?；靹驑悠罚诖蠹s1000xg下旋轉(zhuǎn)2分鐘。大約0.5μL的上清液用于分離和電雜交。蛋白質(zhì)混合物的質(zhì)譜結(jié)果與純化的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或多肽樣品(只包含泛素和1％TFA)的結(jié)果相當(dāng)。將純化(標(biāo)準(zhǔn))的泛素樣品直接稀釋在0.1％TFA(達(dá)到800fmol/μl或10fmol/μl)中，以便進(jìn)行MALDI質(zhì)譜分析前，當(dāng)溶劑蒸發(fā)后，沒有干擾物質(zhì)存在。
為了進(jìn)行電泳，將光響應(yīng)電極上的歐姆接觸與穩(wěn)壓器(普林斯頓應(yīng)用研究)連接。在樣品和頂部光響應(yīng)電極之間放置了處于″濕潤(rùn)/緩沖″狀態(tài)的膜組合。在膜層之上放一塑料圓筒(直徑為2厘米，高度為2厘米)。加入熱的瓊脂糖使液體達(dá)到3-5毫米的高度。一旦瓊脂糖固化，加入另一個(gè)3-5毫米高的水相緩沖液(250mM組氨酸的0.01％SDS)。將電解池頂部的反電極(鉑、鈀、或碳)浸入，保持其與瓊脂糖的接近。加入含25％甘油和75％組氨酸緩沖液的樣品(TR-Ub或MB-BSA)，與電解池頂部的圓形反電極形成電接觸。其余的分離和富集程序是在暗室中進(jìn)行。
在光響應(yīng)電極和反電極之間施加偏壓，光源(4毫瓦二極管激光器發(fā)射600-700納米波長(zhǎng))聚焦在晶片的背面(低的)形成大約50微米直徑的點(diǎn)，它的中心與電解池頂部的反電極中心垂直。通常施加給鍺電極(相對(duì)于鉑的反電極)的偏電為+4伏特，可以產(chǎn)生大約500μA的總電流(其中40％是光電流，黑暗時(shí)的電流大約是300μA)。通常允許電泳分離和捕獲的過程進(jìn)行大約9-20分鐘。
在分離和富集完成后，移出樣品池中的反電極和頂部緩沖液。然后移走丙烯酰胺分離層，將捕獲膜浸沒在去離子水(或優(yōu)選浸入0.1％三氟乙酸)中2-5分鐘，去除鹽。然后將捕獲膜(如PVDF薄膜)用3M雙面膠帶粘貼在不銹鋼MALDI樣品板上。然后將基質(zhì)溶液加到薄膜上，風(fēng)干。將樣品板放到質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析。
對(duì)不銹鋼MALDI樣品板直接進(jìn)行MALDI-MS分析，包含樣品的0.5到2.0μl的基質(zhì)溶液直接加到不銹鋼MALDI樣品板上，風(fēng)干。然后把樣品板放到質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析。
MALDI-MS的分析方法使用提供的QGEN_PR2方法在ABI/Perceptive Biosystems VoyagerDE(MALDI-TOF)儀器中進(jìn)行分析。使用CHCA為基質(zhì)溶液，設(shè)定條件為25kV加速電壓，89％柵電壓(grid voltage)、0.25％導(dǎo)線電壓、200ns延遲、2800激光、64平均掃描、3.45e-7托、100低質(zhì)量柵極、負(fù)離子扣除。
結(jié)果如上所述將TR-泛素直接光-電富集到CEA透析膜上(沒有PVDF膜)。圖16所示的質(zhì)譜圖是將從膜上提取的寡肽加到含CHCA的MALDI基質(zhì)溶液中，將溶液直接加到不銹鋼板上風(fēng)干后獲得。多峰代表了共價(jià)結(jié)合了0、1、2、3或4個(gè)分子的得克薩斯紅的各個(gè)泛素多肽。
用于比較，圖17顯示了相同泛素樣品的質(zhì)譜圖，該樣品經(jīng)光-富集到截留250,000MW的PVDF-透析膜上(由截留500MW的CEA透析膜支撐(backed))，光電雜交后，用水清洗PVDF透析膜，干燥，然后將含CHCA的MALDI基質(zhì)溶液直接加到樣品富集位點(diǎn)上?；|(zhì)溶液被蒸發(fā)風(fēng)干后，將PVDF透析膜直接用(3m)雙面膠帶粘貼到不銹鋼MALDI樣品板上，放到質(zhì)譜儀中進(jìn)行MALDI-MS分析。圖16和17顯示了兩個(gè)主要區(qū)別。首先，當(dāng)用PVDF薄膜時(shí)，最大強(qiáng)度峰的離子流的強(qiáng)度是最大的。這表明如果用PVDF薄膜時(shí)，捕獲效率是最大的。第二，用二種不同的膜捕獲，可以看到標(biāo)記了0、1、2、3或4分子的得克薩斯紅的泛素的比例是不同的。用CEA膜捕獲得到的是用0或1分子的得克薩斯紅標(biāo)記的每摩爾泛素的較少分子量。因此表明CEA透析膜更優(yōu)先結(jié)合得克薩斯紅-高標(biāo)記(更多陰性電荷)的泛素分子。相反，通過與直接地將標(biāo)記的泛素樣品加到不銹鋼MALDI目標(biāo)板上的比較結(jié)果分析(未顯示數(shù)據(jù))，表明PVDF薄膜看來更優(yōu)先結(jié)合所有標(biāo)記的泛素分子。
實(shí)施例2用MALDI適合的膜從人血清中分離帶負(fù)電荷的血清多肽分析血液、血漿和血清中低豐度多肽的一個(gè)主要問題是高豐度蛋白掩蓋了低豐度多肽的存在。已有報(bào)道，從血液、血漿和血清的樣品中清除高豐度白蛋白的同時(shí)也去除了很多低豐度多肽。因此找到一個(gè)低豐度多肽與白蛋白分離的方法是很重要的任務(wù)。為了促進(jìn)解離，本研究中用清潔劑處理血清樣品。
人血清樣品制備清潔劑處理的血清樣品在Eppendorf微管(500μL體積)中，將5mg/mL辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)加到10μL人血清(來自Sigma ChemicalCo.)中。然后，將清潔劑處理的血清在4℃過夜貯存，14小時(shí)后放在室溫。然后用3μL的清潔劑處理的血清制備樣品、1μL 250mM組氨酸緩沖液、1μL得克薩斯紅-標(biāo)記的Leu enkephalen(在250mM組氨酸緩沖液中作為示蹤劑)和0.5μL甘油制備樣品。樣品混合物在約1000g下離心約1分鐘，得到1和3μl的液滴。
樣品池和分離層然后將樣品放進(jìn)Serum Profiler analytical cell的樣品貯池中以便分離、富集到MALDI的適合的膜上，進(jìn)行質(zhì)譜分析。富集器的貯池是由非導(dǎo)電物質(zhì)制成的樣品環(huán)構(gòu)成，非導(dǎo)電物質(zhì)為如聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯，聚甲基丙烯酸甲酯，多甲基戊烯，TeflonTM等，這些物質(zhì)形成樣品貯池的側(cè)壁。
樣品貯池的底面將樣品帶進(jìn)與之離子電接觸的分離結(jié)構(gòu)中，該分離結(jié)構(gòu)由一個(gè)或多個(gè)分離介質(zhì)層形成。本實(shí)施例中，分離層由10％聚丙烯酰胺預(yù)制的2-3毫米厚片(從BioRad處獲得)而制得。聚丙烯酰胺作為分子量篩可以延緩大分子蛋白的電泳遷移率，但能提高小分子蛋白和多肽的電泳遷移率。聚丙烯酰胺可以是較低交聯(lián)度使大分子蛋白的電泳遷移率變快，也可以是高交聯(lián)而延緩小分子蛋白和多肽的電泳遷移率，這是本領(lǐng)域凝膠基質(zhì)電泳分離蛋白的人員所熟知的。任選地，凝膠邊緣用1％瓊脂糖密封。瓊脂糖和聚丙烯酰胺在使用前，用pH 7.8的250mM組氨酸緩沖液平衡。(另外丙烯酰胺可在原位聚合而不需要密封材料。)
捕獲層、阻擋層和緩沖層在聚丙烯酰胺分離層下，與之離子電接觸的是捕獲多肽分析物的捕獲層，多肽分析物包括多肽、寡肽和蛋白質(zhì)。捕獲是靠多肽和聚合物捕獲膜的疏水性作用而進(jìn)行。由多孔Teflon或PVDF物質(zhì)組成的膜，對(duì)靠疏水性作用進(jìn)行的多肽捕獲十分有用。在本實(shí)施例中，捕獲膜由PVDF-透析膜組成(截留分子量250,000)，用前在緩沖液水溶液(250mM組氨酸)中于4℃下保存。
捕獲層下方與之離子電接觸的是任選存在的阻擋層，其用于防止非疏水性蛋白質(zhì)和多肽的逃脫。CEA透析膜(不對(duì)稱纖維素酯，截留分子量500)用作阻擋層，用前干燥保存。捕獲膜和阻擋膜被切成正方形(大約1.5cm×1.5cm)，用前用甲醇清洗，以保證清潔。這兩種膜都來自SpectrumLaboratories，Rancho Domingez，CA。分析物在捕獲層被捕獲后直到加入小體積如0.3-2μl的MALDI基質(zhì)溶液前，不需要洗脫步驟。因此疏水性蛋白質(zhì)和多肽被PVDF透析膜捕獲，與捕獲膜的截留分子量無關(guān)。
緩沖區(qū)域在捕獲層和阻擋層的下面，與其離子電接觸的是緩沖區(qū)域，緩沖區(qū)域是用來緩沖(或捕獲)電極表面形成的產(chǎn)物，電極是用來產(chǎn)生電場(chǎng)使分析物在捕獲膜中產(chǎn)生電泳、分離和富集。本發(fā)明中，緩沖區(qū)域由一單層的Immobilon-P膜(來自Millipore Inc.)構(gòu)成，并用pH 7.8的250mM L-組氨酸緩沖液飽和。
光導(dǎo)電極與緩沖層離子電接觸并正好位于其下的是由n-型鍺晶片制成的光響應(yīng)陽極。鍺晶片(厚14mil和直徑5cm)購自美國(guó)Polishing Corporation公司，電阻率小于0.4ohm-cm。用五分鐘快干環(huán)氧膠安裝在玻璃板上的鍺晶片作為工作電極和光陽極。使用鎵/銦共熔物和銅線在晶片上制作的歐姆接觸與銅導(dǎo)線連接。歐姆接觸用五分鐘快干環(huán)氧膠層機(jī)械性加固。
人血清樣品分析的方法為了進(jìn)行樣品的分離和結(jié)合，在丙烯酰胺/瓊脂糖層上部的樣品池中，加入一管(0.5-8μl)經(jīng)清潔劑處理的樣品混合物。然后直接放進(jìn)一個(gè)環(huán)形的與池內(nèi)壁松散接觸的反電極(陰極)，該反電極(陰極)由鉑構(gòu)成。鉑陰極和光響應(yīng)陽極與穩(wěn)壓器(Princeton Appllied Research，model 273)連接，在暗室中(room darkened)，將+4V偏置電壓用于光響應(yīng)陽極和鉑陰極。用1毫瓦輸出的氦/氖633nm光線進(jìn)行光響應(yīng)陽極(光照射在電解液相對(duì)的片上)背面表面的光激發(fā)。制造了激光聚焦系統(tǒng)，加強(qiáng)了照射玻璃底部的激光，該激光聚焦光束的直徑在100微米到1mm范圍內(nèi)。4V的偏壓和同時(shí)照射產(chǎn)生了700mA的總電流(大約30％是光電流)。偏置電壓調(diào)零之前，進(jìn)行了大約20分鐘的分離，然后分開連接上下電極的導(dǎo)線。
然后，拆開聚集室，檢測(cè)膠和膜的熒光性。如果捕獲過程徹底，所有的熒光都包含在捕獲膜內(nèi)。切下帶熒光性的點(diǎn)，浸入去離子水中數(shù)分鐘。PVDF膜風(fēng)干，按實(shí)施例子1描述的方法進(jìn)行MALDI分析。按實(shí)施例子1描述的方法，直接在Voyager DE工作站中對(duì)捕獲的來源于PVDF膜的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。
圖18，18a和19所示的是用MALDI基質(zhì)溶液中的CHCA或芥子酸分析帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)和多肽的通常結(jié)果。用MALDI基質(zhì)溶液中的CHCA對(duì)1000到15,000道爾頓的低分子量的肽和多肽進(jìn)行質(zhì)譜分析可以得到最好結(jié)果。相反，基質(zhì)溶液中的芥子酸使高分子量(＞15,000道爾頓)分子的信號(hào)得到改進(jìn)。因此，分析物與這兩種基質(zhì)物質(zhì)中的每個(gè)分別進(jìn)行MALDI分析，可以為低分子量和高分子量分子都提供理想的結(jié)果。
實(shí)施例3在PVDF薄膜上對(duì)來自人全血清的帶正電荷的多肽進(jìn)行電泳分離以進(jìn)行MALDI-TOF分析與實(shí)施例1和實(shí)施例2相似，在本實(shí)施例中，人血清樣品中的多肽和小分子血清蛋白質(zhì)通過凝膠被電泳富集到捕獲膜上，從而使大分子蛋白質(zhì)與小分子目標(biāo)多肽和小蛋白質(zhì)分離。同前實(shí)施例，帶電荷的多肽和蛋白質(zhì)分子在外加陽極和陰極的電場(chǎng)中遷移。本實(shí)施例中，帶正電荷的分析物分子向帶負(fù)電的陰極遷移，在捕獲膜60的捕獲區(qū)68得到富集并與之結(jié)合。同前實(shí)施例所述，來自捕獲膜的所捕獲的帶正電荷的蛋白質(zhì)被直接進(jìn)行分析。同前實(shí)施例2所述，用Voyager DE質(zhì)譜儀進(jìn)行MALDI分析。
實(shí)施例1，2和本實(shí)施例3的主要區(qū)別在于光導(dǎo)電極在本實(shí)施例3中不是必需的。作為一種替代，與前面所述的頂部電極140相似，非光導(dǎo)電極物質(zhì)也可作為底部電極500，底部電極可作為陰極或陽極。雖然光導(dǎo)電極在一些實(shí)施例中不是必需的，但至少需要帶有孔518的壓縮層510，其用于將分析物富集到捕獲膜60的捕獲區(qū)68。如圖13所示，優(yōu)選地，也可使用第二壓縮層520。壓縮層對(duì)離子流而言是不能滲透的，只能通過孔518使目標(biāo)分析物富集到捕獲膜60的捕獲區(qū)域68分析物上池。因此，不需要光導(dǎo)電極的導(dǎo)向作用。
材料底部電極(500)用Kapton(聚酰亞胺)粘性膠帶覆蓋鈀(Pd)薄片，在底部電極中留出需要的傳導(dǎo)區(qū)域。對(duì)于實(shí)施例，在Kapton膠帶中留有的2mm直徑的洞用來暴露此位置的鈀，用作底部電極的表面。
頂部電極(140)頂部電極由鉑(Pt)線構(gòu)成，是3mm直徑的圓環(huán)形狀。為了與3極的穩(wěn)壓器或趨電器匹配，將頂部電極與穩(wěn)壓器或趨電器的控制電極和參考電極的導(dǎo)線連接。
在1”×3”的Kapton膠帶上鉆2.4mm的洞制備底部電極(500)。粘性膠帶放在一小塊鈀(Pd)薄片上，然后兩者放到顯微鏡的玻璃玻片上。穩(wěn)壓器的工作電極導(dǎo)線直接通過夾子連到薄片。
緩沖層(80)緩沖層由Immobilon-P膜組成，來自Millipore，Inc。Immobilon-P膜用pH 7.8的250mM L-組氨酸水溶液進(jìn)行飽和。
阻擋層(70)截留分子量500，CEA透析膜，來自Spectrum Laboratories，Inc.。
捕獲層(60)截留分子量500，聚偏二氟乙烯的透析膜(PVDF-DM)，來自Spectrum Laboratories，Inc.。
分離層(40)10％聚丙烯酰胺，來自Bio-Rad Laboratories，Inc.。
由飽和的DL-谷氨酸和DL-天門冬氨酸水溶液中的1％低EEO瓊脂糖組成的凝膠(來自Sigma Chem.Co.)用于密封分離層(40)和樣品池(6)的側(cè)壁(12)。
樣品緩沖液用緩沖水溶液稀釋樣品，使頂部電極和底部電極電接觸。用L-谷氨酸和DL-天門冬氨酸(來自Sigma Chem.Co.)飽和緩沖液水溶液，緩沖液的pH是大約3.0。
樣品池(6)上部開口的帶底聚碳酸酯圓筒被用于制造有單池的分離和富集器。單池是19.15mm O.D.×16.95mm I.D.×17.32mm高。
樣品1μl甘油+1μl泛素(來自Sigma Chem.Co.)，其參照制造商的說明用得克薩斯紅進(jìn)行標(biāo)記(Molecular Probes，Inc.)+8μl人血清(來自Sigma Chem.Co.)+≈1μg辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(來自Sigma Chem.Co.)+3μl樣品緩沖液。一旦加入樣品的所有成分，離心并旋渦混勻(混勻)。然后5μl的樣品被移液管加到樣品池。
MALDI基質(zhì)溶液第一MALDI基質(zhì)溶液是在50％乙腈和0.1％三氟乙酸中飽和的a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)。第二MALDI基質(zhì)溶液是溶解在50％乙腈和50％的0.1％三氟乙酸中的10mg/mL芥子酸(SA)。MALDI基質(zhì)溶液的所有材料來自Sigma Chem.Co.。
儀器電極偏壓或電流控制用來自EG&G Princeton Applied Research的273型號(hào)穩(wěn)壓器/趨電器進(jìn)行穩(wěn)壓或趨電模式的操作。
數(shù)據(jù)的獲得來自Dell的Powerlab/4SP，AD儀器和臺(tái)式電腦。
MALDI質(zhì)譜儀Voyager DE Biospectrometry Workstation，(AppliedBoosters，Inc.)。
膜的制備在樣品分離、富集和結(jié)合到PVDF捕獲膜(60)之前，PVDF膜在甲醇中浸泡1分鐘。因?yàn)镻VDF膜是疏水性，甲醇的作用是首先使膜潤(rùn)濕，其次還能用來清洗膜。然后將濕潤(rùn)的PVDF膜放在去離子水中保存。用預(yù)制的來自Bio-RadLaboratories的10％聚丙烯酰胺的凝膠制備分離層(60)。從盒子中取出聚丙烯酰胺，用作為樣品池側(cè)壁(12)的聚碳酸酯圓筒切成圓盤狀池。將切下的圓盤與用作阻擋層(70)的CEA膜一起在去離子水中浸泡過液。預(yù)制聚丙烯酰胺膠的高濃度鹽需要在水中浸泡過液，使導(dǎo)電率減少到適合的范圍。雖然裝置可以在很廣的分離層和樣品緩沖液的導(dǎo)電率范圍進(jìn)行操作，比如1micro-siemen至100milli-siemens，但裝置的理想操作范圍是10micro-siemens至10milli-siemens的較窄范圍。
裝置的構(gòu)建按下列順序?qū)⒍嗫讓臃旁诘撞侩姌O上建造分離和富集器(2)緩沖層、捕獲膜、壓縮層、分離層、加熱的瓊脂糖膠密封分離層的側(cè)壁、水相緩沖液和頂部電極。加熱的瓊脂糖加到樣品池四周的側(cè)壁達(dá)1-2mm深度。當(dāng)瓊脂糖膠凝固，將用作頂部電極的鉑圓環(huán)小心降低到池中，使它接觸瓊脂糖。然后加入足夠的水相緩沖液覆蓋鉑圓環(huán)的頂部電極。該裝置的示意圖見6.
裝置的操作加入1μl甘油+1μL得克薩斯紅標(biāo)記的泛素+8μL人血清+＜1μgoctyt-(3-D-glucopyranoside+3μl水相緩沖液，制備包含人血清的樣品。溶液經(jīng)簡(jiǎn)單的離心、渦旋后，5μl樣品通過鉑圓環(huán)的中心加到小室中。底部電極的偏壓為-5V。連續(xù)監(jiān)測(cè)電流。經(jīng)開始瞬態(tài)后，在后續(xù)45分鐘的分離和富集步驟中，電流穩(wěn)定到大約200μA。得克薩斯紅標(biāo)記的泛素作為標(biāo)記分析物，來跟蹤被分析物分離和捕獲的過程。調(diào)節(jié)適合分離的時(shí)間和電流，以達(dá)到最佳分離和捕獲結(jié)果。
在分離步驟和富集步驟結(jié)束時(shí)，將偏置電壓調(diào)到零，拆卸裝置。用Mineralight，Entela UVGL-58的熒光燈的366nm投影光觀察熒光標(biāo)記的示蹤蛋白質(zhì)，如捕獲膜上的得克薩斯紅標(biāo)記的泛素。切下PVDF-DM捕獲膜上的熒光點(diǎn)，浸入去離子水2分鐘，在氮?dú)庀赂稍?。為了粘貼到MALDI樣品板上，將膜分成2個(gè)或多個(gè)2平方毫米大小的小片。當(dāng)小片放到不銹鋼MALDI樣品板上，至少有1小片上加入了1μl的CHCA基質(zhì)，其余的小片上加入1μl的SA基質(zhì)。一旦基質(zhì)溶劑完全干燥，用干凈的鑷子將膜放到預(yù)先以預(yù)定位置粘附在另一個(gè)不銹鋼MALDI目標(biāo)板上的2平方毫米大小的3M雙面膠帶上。
MALDI-質(zhì)譜分析Voyager DE質(zhì)譜儀的參數(shù)如下20,000V加速電壓，94.1％柵電壓、0.05％導(dǎo)線電壓、11ns延遲、激光設(shè)定為2800、平均掃描數(shù)64、負(fù)離子扣除。
結(jié)果圖20、20a和21給出了典型的帶正電荷多肽和蛋白質(zhì)的MALDI質(zhì)譜結(jié)果。從圖中可見，檢測(cè)到了包括標(biāo)記的泛素示蹤蛋白質(zhì)(參見8600，9330和10,100質(zhì)譜單位)信號(hào)在內(nèi)的大量低分子量蛋白的質(zhì)譜峰。圖18顯示了用芥子酸作為MALDI基質(zhì)(更易使大于20,000分子量的中等程度的蛋白質(zhì)分子離子化)，只有中等程度的白蛋白(大約68,00質(zhì)譜單位)出現(xiàn)。
另外可見34,000質(zhì)譜單位處的小質(zhì)譜峰。除這兩個(gè)質(zhì)譜峰以外，可見的幾個(gè)大于11,000道爾頓的質(zhì)譜峰，無疑是來自于聚丙烯酰胺凝膠分離層中與小分子多肽分離的大分子蛋白質(zhì)。
實(shí)施例4將多孔捕獲介質(zhì)捕獲的分析物附著在電富集孔的陣列中在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，固體材料上的二維陣列的孔是用來電泳富集帶電的分析物至孔處。將捕獲分析物的多孔介質(zhì)附著在孔處(在出口或入口處或之內(nèi))以捕獲富集的分析物。每個(gè)孔由無孔周界圍繞成捕獲介質(zhì)的預(yù)定區(qū)域。無孔周界用來在預(yù)定區(qū)域內(nèi)保留溶液避免占用更大區(qū)域。具有一個(gè)或更多孔的裝置在使用中就具有以下步驟1.)沉積步驟，帶電的分析物作為液體以保留樣品的容量而沉積，其被置于與孔一端的陽極和孔另一端的陰極相接觸的電解液中。
2.)富集和捕獲步驟，分析物被電泳驅(qū)動(dòng)并在孔中富集。在此步驟中仍然帶電的分析物被捕獲到預(yù)先置于孔處(在孔內(nèi)或在孔的出口或入口)的多孔捕獲介質(zhì)的預(yù)定區(qū)域上，由此在預(yù)定區(qū)域內(nèi)富集帶電的分析物。
3.)分析步驟，對(duì)在前面步驟中得到的在預(yù)定區(qū)域被富集的捕獲的帶電分析物進(jìn)行分析。
分析步驟還包括以下亞步驟a)向多孔捕獲介質(zhì)中加入包含液體溶劑和溶解基質(zhì)物質(zhì)的液體分析基質(zhì)溶液，使分析物釋放到液體溶劑和多孔介質(zhì)的上表面，b)多孔捕獲介質(zhì)的預(yù)定區(qū)域內(nèi)，用無孔周界保留液體溶劑，c)蒸發(fā)溶劑使溶解的基質(zhì)物質(zhì)和捕獲的分析物留在多孔介質(zhì)上表面的預(yù)定區(qū)域內(nèi)，d)分析預(yù)定區(qū)域上表面的分析物的特征。
通常分析步驟還進(jìn)一步包括將孔和所附著的多孔捕獲介質(zhì)置入分析分析物的質(zhì)譜儀中。且，質(zhì)譜儀通常是具有對(duì)分析物和基質(zhì)進(jìn)行激光輔助共解吸附的激光的MALDI質(zhì)譜儀。分析物通常是蛋白質(zhì)，多肽或/和肽?？淄ǔＪ且躁嚵行问脚帕械幕旧舷嗤目?。
下面描述的電泳裝置可與孔陣列聯(lián)合使用，進(jìn)行本發(fā)明的步驟。進(jìn)一步描述的是可用于構(gòu)建和使用孔陣列的物質(zhì)和方法的實(shí)施例孔。
下面的實(shí)施例A)中的多孔捕獲膜是將多孔聚偏二氟乙烯(PVDF)(來自Millipore Corporation.Billricia，MA)作為Immobilon-PSQ膜，孔陣列是在固相PVDF(來自McMaster Carr Corporation，Atlanta，GA)的薄片制成。如所述的，用熱焊接在孔四周將多孔膜焊接到固相薄片上制備無孔周界。
將Immobilon-PSQ膜焊接到聚偏二氟乙烯(PVDF)片上在本實(shí)施例中，描述了將諸如Immobilon-PSQ的多孔PVDF捕獲膜永久性附著在固相PVDF片(膜)上的多種方法。這些方法包括將多孔膜熱焊接到諸如由0.010″厚的固相PVDF制成的聚合物片的固體材料上。在該方法中，多孔膜被放在固相聚合物片上的小孔陣列上?？椎墓δ苁鞘刮降奈镔|(zhì)，諸如多肽和蛋白質(zhì)，利用溶劑流經(jīng)孔到達(dá)多孔捕獲膜的上表面。
可按圖27給出的加熱壓模裝置進(jìn)行焊接。理想的壓印裝置，需要有溫度控制裝置，在個(gè)特殊的溫度范圍內(nèi)控制溫度，在超過熔點(diǎn)溫度和低于自動(dòng)著火溫度時(shí)至少有一個(gè)膜被焊接。另外，焊接壓印一般有平的底區(qū)域可以向至少一個(gè)膜的表面施壓。但一般在壓印中心，也有小洞，用于在膜的未焊接的四周部分形成焊接周長(zhǎng)。壓印可用如下面描述的常規(guī)烙鐵制成。為制備焊接壓印，去除圓錐形烙鐵尖頭的底部，然后在頭部鉆洞，5mm長(zhǎng)18G皮下注射用針頭正好穿過該洞。然后烙鐵頭被放到鉆床中，用62°高速不銹鋼鉆池打磨皮下注射用針頭的內(nèi)部。
在焊接時(shí)，要特別注意使焊接工具對(duì)準(zhǔn)PVDF片中的孔?？梢灾苽溷@模(jig)并使鉆頭在25個(gè)洞的陣列上對(duì)準(zhǔn)，然后用焊接烙鐵在相同小洞上對(duì)膜進(jìn)行適當(dāng)?shù)臒岷附?，如圖28所示。鉆模由3部分組成，聚碳酸酯基質(zhì)平板，鋁鉆頭平板(有25小洞的陣列，0.024″直徑)，和鋁焊接烙鐵平板(有25小洞的陣列，0.052″直徑)。
將PVDF多孔膜焊接到PVDF固相膜的方法用3M雙面膠帶的粘貼層將45mm×45mm、0.01″厚的固相PVDF片粘貼到聚碳酸酯基質(zhì)平板的中心。
將鋁鉆頭平板擰到PVDF片上的基板上。
用鉆床中設(shè)計(jì)使用的0.024″英寸直徑的鉆頭和針鉗通過鉆固相PVDF片形成25個(gè)洞的陣列。
去除鉆頭平板，Immobilon-PSQ膜放在洞上，將焊接烙鐵平板擰到基板上。焊接烙鐵平板中的洞正好在PVDF片中的洞上排列對(duì)準(zhǔn)。
烙鐵被調(diào)到大約850，保溫?cái)?shù)分鐘。
用力將烙鐵頭推進(jìn)鋁板中平板的洞中，直到接觸到膜。握住對(duì)著膜的烙鐵1-10秒直到產(chǎn)生可接受的焊接。
完成對(duì)所有25個(gè)洞上的膜的焊接后，去除平板，用顯微鏡觀察膜。
用鑷子，去除焊接點(diǎn)周圍的膜。
然后將焊接的陣列浸于甲醇中進(jìn)行10分鐘聲處理。
有焊接膜的片風(fēng)干后，放入塑料袋中以備使用。
圖29和30給出了膜焊接和含MALDI基質(zhì)物質(zhì)的溶液的應(yīng)用結(jié)果。
提取的樣品的質(zhì)譜分析用上述方法將PDVF-PSQ膜焊接到固相PVDF片上的孔。然后將多孔膜用1μl的甲醇潤(rùn)濕，將含ACTH的多肽片斷的分析物放到約0.5μl PBS緩沖水溶液中的多孔膜的正面(與固相PVDF相對(duì)的一面)。分析物用含芥子酸(SA)基質(zhì)的80∶20ACN/水的混合物(以10mg/mL溶解于80％乙腈，20％0.1％三氟乙酸中)組成的2×0.3μl MALDI基質(zhì)溶液將分析物流到相對(duì)表面。所有的MALDI基質(zhì)溶液來自Sigma Chem.Co.。對(duì)膜的背面進(jìn)行MALDI-TOF分析。結(jié)果見圖31的質(zhì)譜圖。
實(shí)施例5固相聚合膜的孔中多孔整體澆鑄塑料中富集和捕獲的蛋白質(zhì)分析物以及用于MALDI-TOF分析的后續(xù)提取圖32給出了用于MALDI-質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)和多肽分析物的捕獲和后續(xù)提取的基本結(jié)構(gòu)示意圖。此結(jié)構(gòu)由包含一個(gè)或多個(gè)微孔的塑料框組成?？谆虼┛變?yōu)選為小直徑，通常為1微米至2毫米。更通常的穿孔直徑是100微米至1毫米之間。小室的下部分覆蓋有多孔蛋白質(zhì)捕獲膜，如PVDF-PSQ(Immobilon膜，來自Millipore Corp.，Billericia，MA)。用一種或多種密封方法將捕獲膜密封在塑料框上。最簡(jiǎn)單的密封件是由定位環(huán)組成，如與定位環(huán)相適的尼龍墊圈。加入樣品和溶劑后，用玻璃蓋片覆蓋小室。
方法將少量(大約10皮摩爾)德克薩斯紅標(biāo)記的泛素(在水中)加到干燥的PVDF-PSQ膜的上部分。樣品在真空下干燥。向樣品加入40μl乙腈/水溶液，在塑料框上蓋上蓋子。從下面流出溶液并蒸發(fā)。該步驟重復(fù)2次，因此每個(gè)樣品都使用了全部溶液。為了便于進(jìn)行研究，用下面的溶液對(duì)Tr-泛素的最佳提取效果進(jìn)行研究。使用的乙腈與水(ACN/水)的比例為100∶0；95∶5；90∶10；80∶20；70∶30；50∶50。
結(jié)果熒光圖像來自于膜的上部分(點(diǎn)樣樣品)和膜的下部分(提取的樣品)。圖33A與33B和34A與34B給出了一些結(jié)果。溶劑或最佳提取效果為80∶20。
實(shí)施例6將分析物捕獲在電富集孔陣列中形成的整體多孔捕獲材料中在該具體實(shí)施方式
中，整體多孔捕獲物質(zhì)形成于固相物質(zhì)中的二維孔陣列中。在該具體實(shí)施方式
中，帶電分析物被電泳富集到電富集孔陣列的整體塑料的多孔捕獲材料中。捕獲分析物的多孔介質(zhì)被澆鑄到一系列直徑200μm的小洞中，該小洞是預(yù)先在聚偏二氟乙烯(PVDF)支撐層上鉆孔而形成。一旦完成多孔聚合作用，洞的內(nèi)側(cè)壁可用以更好地支撐聚合物物質(zhì)。多孔物質(zhì)是用甲基丙烯酸甲酯作為聚合體物質(zhì)進(jìn)行原位制造的。一般地，支撐層被放在紫外下透明的Tefon-包被的石英片的上面，聚合物物質(zhì)被加樣器加到小洞中。然后用另一紫外下透明的Tefon-包被的石英片覆蓋其上，避免有空氣氣泡存在。最后用紫外線照射該物質(zhì)一段適當(dāng)時(shí)間形成多孔″填充″。觀察各點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)孔隙率是一致的，頂部和底部被支撐層的頂面和底面齊平(flush)。
在我們的試驗(yàn)中，每塊整體多孔捕獲位點(diǎn)都經(jīng)去離子水徹底沖洗并超聲，去除殘留的聚合物和其它潛在的污染物。經(jīng)水清洗后，每個(gè)位點(diǎn)都徹底用甲醇沖洗，然后用0.1％TFA漂洗。接著，用移液管取溶于500fmol BSA中的500fmol ACTH片斷18-39，向每塊整體多孔捕獲位點(diǎn)上加入0.5μl的一滴所取溶液。一旦樣品在整體板上風(fēng)干，用水清洗各位點(diǎn)，將80∶20乙腈/0.1％TFA的1μl飽和的芥子酸加到整體板的背面(加入樣品的相反一面)。最后，使圍繞整體多孔捕獲位點(diǎn)陣列的支持層徹底風(fēng)干，放到MALDI質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析。圖35給出了一單個(gè)多孔捕獲位點(diǎn)通過原位多孔聚合方法原位鑄件圖。圖36給出了來自陣列中4個(gè)不同整體多孔捕獲位點(diǎn)的幾個(gè)MALDI質(zhì)譜圖。在所有的例子中，都檢測(cè)到了目標(biāo)ACTH片斷。
權(quán)利要求
1.一種富集器，其包括頂面，其包括至少一個(gè)形成池的孔；捕獲層；和分離層，其位于頂面和捕獲層之間。
2.權(quán)利要求1的富集器，其中捕獲層是多孔的。
3.權(quán)利要求2的富集器，其中多孔捕獲層是膜。
4.權(quán)利要求3的富集器，其中膜是疏水性膜。
5.權(quán)利要求2的富集器，其中捕獲層是由結(jié)合蛋白質(zhì)的材料構(gòu)成的透析膜。
6.權(quán)利要求1的富集器，其中頂面包括多個(gè)孔，每個(gè)孔形成一個(gè)池。
7.權(quán)利要求6的富集器，其包括10至100個(gè)池。
8.權(quán)利要求1的富集器，其包括位于頂面和分離層之間的多孔層。
9.權(quán)利要求1的富集器，其包括位于捕獲層和分離層之間的多孔層。
10.權(quán)利要求1的富集器，其包括與捕獲層鄰近的阻擋層。
11.權(quán)利要求10的富集器，其包括緩沖層，其中阻擋層位于捕獲層和緩沖層之間。
12.權(quán)利要求1的富集器，其包括位于頂面和分離層之間的多孔層。
13.權(quán)利要求1的富集器，其具有相對(duì)于頂面的底面，其中底面是電極。
14.權(quán)利要求13的富集器，其中底部電極是光導(dǎo)電極。
15.權(quán)利要求14的富集器，其中光導(dǎo)電極是單個(gè)連續(xù)的半導(dǎo)體電極。
16.權(quán)利要求14的富集器，其中光導(dǎo)電極是非連續(xù)的半導(dǎo)體電極。
17.權(quán)利要求1的富集器，其包括位于捕獲層和分離層之間的壓縮層，其中壓縮層包括不滲透性區(qū)域和至少一個(gè)孔，其中所述至少一個(gè)孔通過多孔材料與一個(gè)池孔液液相通。
18.權(quán)利要求17的富集器，其中壓縮層至少一個(gè)孔內(nèi)置有多孔的、吸水的、親水性的物質(zhì)。
19.權(quán)利要求17的富集器，其中壓縮層的不滲透性區(qū)域與捕獲層相附著。
20.權(quán)利要求19的富集器，其中用熱焊接方法在壓縮層的至少一個(gè)孔周圍形成環(huán)形焊縫，使壓縮層的不滲透性區(qū)域與捕獲層相附著。
21.權(quán)利要求1的富集器，其中壓縮層位于捕獲層的下方，壓縮層包括不滲透性區(qū)域和至少一個(gè)孔，其中所述至少一個(gè)孔通過多孔材料與一個(gè)池孔液液相通。
22.權(quán)利要求21的富集器，其中壓縮層的不滲透性區(qū)域與捕獲層相附著。
23.權(quán)利要求22的富集器，其中用熱焊接方法在壓縮層的至少一個(gè)孔周圍形成環(huán)形焊縫，使壓縮層的不滲透性區(qū)域與捕獲層相附著。
24.權(quán)利要求1的富集器，其包括第一壓縮層和第二壓縮層，其中捕獲層位于第一壓縮層和第二壓縮層之間。
25.權(quán)利要求1的富集器，其中第一壓縮層和第二壓縮層都至少含有一個(gè)孔，該至少一個(gè)孔通過多孔材料與所述池孔液液相通。
26.權(quán)利要求1的富集器，其中捕獲膜包括至少一種可被質(zhì)譜儀識(shí)別的標(biāo)記物。
27.權(quán)利要求1的富集器，其中捕獲層具有可被質(zhì)譜儀識(shí)別的標(biāo)記物位置，其中預(yù)定位置與標(biāo)記物位置的距離是已知的。
28.一種富集器，其包括頂面，其包括至少一個(gè)形成池的孔；底面，其是光導(dǎo)電極；多孔捕獲層；分離層，其位于頂面和多孔捕獲層之間；壓縮層，其位于分離層和多孔捕獲層之間，其中壓縮層包括不滲透區(qū)域和至少一個(gè)與至少一個(gè)頂面孔同中心的孔；和壓縮層上的環(huán)形焊縫，其中環(huán)形焊縫至少圍繞著一個(gè)壓縮層的孔。
29.用質(zhì)譜儀測(cè)定分析物的方法，包括(a)提供富集器，該富集器包括頂面，其包括至少一個(gè)形成池的孔；捕獲層；和位于頂面和捕獲層之間的至少一個(gè)分離層；(b)將包含多個(gè)分析物的樣品定位于富集器中；(c)在捕獲層上形成捕獲區(qū)；(d)捕獲區(qū)至少富集一種分析物；(e)從富集器中取出分離層；(f)將MALDI基質(zhì)加到捕獲區(qū)上；(g)將富集器附著在MALDI質(zhì)譜分析儀的分析板上；和(h)用質(zhì)譜儀對(duì)捕獲區(qū)域的分析物進(jìn)行分析。
30.權(quán)利要求29的方法，其中捕獲層具有可被質(zhì)譜儀識(shí)別的標(biāo)記物位置，捕獲區(qū)與標(biāo)記物位置的距離是已知的。
31.權(quán)利要求29的方法，其中富集器包括具有與小室對(duì)準(zhǔn)的光導(dǎo)區(qū)域的電極層，其中在富集器中，通過置入與樣品電性相通的反電極，使至少一種分析物在捕獲區(qū)得到富集；在電極層和反電極之間施加電流；通過導(dǎo)向光源使其通過光導(dǎo)區(qū)域而使聚焦光源照射捕獲區(qū)域。
32.權(quán)利要求29的方法，其中富集器包括磁性部分，MALDI質(zhì)譜儀分析板包括磁性部分，其中富集器與該板通過磁性相連。
33.權(quán)利要求29的方法，其中通過將所述樣品定位到至少一個(gè)池內(nèi)而使樣品定位到富集器內(nèi)。
34.權(quán)利要求29的方法，其中，在至少一個(gè)分離層從富集器取出后，干燥捕獲層。
35.權(quán)利要求29的方法，其中僅將MADLI基質(zhì)施加到捕獲區(qū)域上。
36.多孔捕獲膜，其具有通過聚焦電場(chǎng)在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定離散位置上捕獲的分析物，其中多孔捕獲膜被合適地安裝在MALDI質(zhì)譜分析儀樣品板上。
37.權(quán)利要求36的膜，其中MADLI基質(zhì)物質(zhì)被加到每個(gè)離散的位置上，形成一個(gè)或多個(gè)MADLI基質(zhì)與分析物的結(jié)晶體。
38.制備權(quán)利要求36的多孔捕獲膜的裝置，包括(a)容納樣品的一個(gè)或多個(gè)小室，其中含有電解液從而使樣品與至少一層分離層相接觸；(b)多孔捕獲膜，其位于至少一層分離層的下方；(c)電極層，具有與小室對(duì)準(zhǔn)的光導(dǎo)區(qū)域；(d)電極，在小室內(nèi)與樣品電性相通；(e)光源，其照射光導(dǎo)區(qū)域，導(dǎo)致樣品中的分析物富集到捕獲膜上的預(yù)定離散位置上。
全文摘要
本發(fā)明公開了首先利用電泳驅(qū)動(dòng)分析物通過濾網(wǎng)基質(zhì)去除大分子物質(zhì)的分離低豐度物質(zhì)的方法和裝置，然后保留的低豐度物質(zhì)與捕獲膜上的小的捕獲位點(diǎn)結(jié)合，電泳富集到捕獲膜上。捕獲膜被風(fēng)干，并被置于導(dǎo)電的MALDI樣品板上。
文檔編號(hào)H01J49/02GK1890774SQ200480036663
公開日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2004年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月10日
發(fā)明者迪定·G.·哈費(fèi)曼, 基利恩·迪爾, 詹姆斯·B.·哈金斯四世, 理查德·M.·卡普廖利, 杰里米·諾里斯, 內(nèi)森·S.·劉易斯, 丹尼爾·庫班, 查爾斯·E.·威特諾斯基二世 申請(qǐng)人:蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)公司