專利名稱：連接子化合物、配體絡(luò)合物和它們的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可以在表面等離子體共振的感應(yīng)芯片等蛋白質(zhì)分析用載體上固定寡糖等糖鏈的連接子化合物和通過在該連接子化合物中導(dǎo)入糖鏈制得的配體絡(luò)合物、配體載體以及它們的制備方法。
背景技術(shù)：
存在于生物體內(nèi)的各種糖鏈對于維持生物的活動和生命起著重要的作用。為了精密地分析這類糖鏈的功能，必須基于糖鏈復(fù)雜的結(jié)構(gòu)來分析它們的功能。糖鏈功能的分析正在使用的方法是使用結(jié)構(gòu)清楚的寡糖，使糖鏈結(jié)構(gòu)一部分一部分地再現(xiàn)，由此可以搞清楚糖鏈全部結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。
作為上述糖鏈的功能分析方法，公知的有例如表面等離子體共振(下面記為SPR)法。即，在感應(yīng)芯片表面上固定包含模擬了一部分糖鏈的寡糖的配體絡(luò)合物，使用這樣固定了寡糖的感應(yīng)芯片，使與寡糖起特殊相互作用的蛋白質(zhì)等物質(zhì)特定化。由此，可以基于寡糖的結(jié)構(gòu)來進(jìn)行生物活性的正確評價。
但是，因為僅一分子的寡糖其活性并不那么高，評價寡糖生物活性時必須將寡糖鏈集聚在感應(yīng)芯片上。換句話說，使用集聚化的寡糖鏈，通過分析和蛋白質(zhì)的相互作用，可以進(jìn)行寡糖鏈的生物活性的評價。
因此，迄今為止，本發(fā)明人得到了在分子內(nèi)具有可以固定在感應(yīng)芯片表面上的部位和可以導(dǎo)入寡糖鏈的部位的連接子化合物，得到了在該連接子化合物上導(dǎo)入1單位或2單位寡糖鏈而制得的配體絡(luò)合物。從而，通過使用該配體絡(luò)合物，發(fā)現(xiàn)可以集聚化地將寡糖鏈導(dǎo)入到感應(yīng)芯片上(例如參見專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)1等)。
特開2003-836969號公報(2003年3月19日公開)[非專利文獻(xiàn)1]“日本化學(xué)會第79次春季年會演講預(yù)稿集II”，社團(tuán)法人日本化學(xué)會，2001年3月15日，p.1042但是，雖然上述專利文獻(xiàn)1和非專利文獻(xiàn)1中記載的配體絡(luò)合物可以在感應(yīng)芯片表面上以二維序列寡糖糖鏈，但仍然存在難以再現(xiàn)性好地獲得該序列的技術(shù)問題。
即，如上所述，在感應(yīng)芯片表面上集聚多分子的寡糖鏈，分析寡糖鏈的生物活性的情況要求寡糖的糖鏈集聚化狀態(tài)相同，才能再現(xiàn)性好地觀測寡糖鏈和蛋白質(zhì)之間的相互作用。特別重要的是為了觀測寡糖鏈的生物活性，通過在感應(yīng)芯片表面上集聚3單位以上的寡糖鏈，在該感應(yīng)芯片上再現(xiàn)性好地以二維序列，才能再現(xiàn)性好地評價寡糖鏈的生物活性。
但是，上述非專利文獻(xiàn)1中記載的配體絡(luò)合物中，1個配體絡(luò)合物所具有的寡糖鏈?zhǔn)?單位或2單位的。換句話說，上述配體絡(luò)合物是相對于1個連接子化合物結(jié)合1個或2個寡糖鏈制得的產(chǎn)品。因此，為了觀測寡糖鏈的生物活性，在感應(yīng)芯片表面上排列上述配體絡(luò)合物時，必須通過提高配體絡(luò)合物濃度，將配體即糖鏈相互集聚，才能在感應(yīng)芯片表面上集聚3單位以上的寡糖鏈。
通過這樣的方法來集聚寡糖鏈時，控制寡糖鏈的糖鏈間在一定間隔并再現(xiàn)性好地獲得寡糖的排列變得困難。因而，上述現(xiàn)有的配體絡(luò)合物不能再現(xiàn)性好地觀測寡糖的生物活性，進(jìn)行糖結(jié)構(gòu)的分析和寡糖生物活性的評價時會有困難。
本發(fā)明是為了解決上述課題而提出的，其目的在于提供一種新的連接子化合物，其能控制感應(yīng)芯片表面上的糖鏈間距離，再現(xiàn)性好地以二維序列寡糖，以及在該連接子化合物上導(dǎo)入糖分子的新的配體絡(luò)合物、配體載體及它們的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了刻苦鉆研，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用具有可以導(dǎo)入3單位以上的糖分子的部位，并且具有可以結(jié)合到表面等離子體共振(SPR)的感應(yīng)芯片和親和色譜法的載體等蛋白質(zhì)分析用載體上的部位的新連接子化合物，可以再現(xiàn)性好地在上述載體上以二維序列3單位以上的糖分子。
另外，在本發(fā)明人的在先申請(申請?zhí)柼卦?003-190568，公開號特開2004-157108(
公開日2004年6月3日)，本申請優(yōu)先權(quán)日(2004年2月5日)時未公開)中公開了目的在于解決上述問題的其他連接子化合物。但是該其他連接子化合物在分析疏水性非常強的蛋白質(zhì)等時，存在所謂的和連接部分的烷基有非特殊的結(jié)合相互作用的問題。并且，該其他連接子化合物形成連接部分的烷基長度不夠長，在固定的寡糖鏈大的情況下，會有因為寡糖鏈類的立體阻礙而不能有效率地形成金屬-硫鍵的問題。
因而，本發(fā)明人再在連接部分導(dǎo)入寡環(huán)氧乙烷，發(fā)現(xiàn)可以極力抑制非特殊的疏水性相互作用，且能容易調(diào)整提供金屬鍵的二硫基的長度，能有效率地形成金屬-硫鍵，從而完成本發(fā)明。
即，為了結(jié)合上述課題，本發(fā)明中的連接子化合物的特征在于具有通式(1) (式中，a、b、d、e分別獨立地是0以上6以下的整數(shù))表示的結(jié)構(gòu)，上述X具有包含3個以上烴衍生鏈的多分枝結(jié)構(gòu)部位的結(jié)構(gòu)，所述烴衍生鏈在末端上具有芳香族氨基且在主鏈上可以有碳-氮鍵。
并且，本發(fā)明的連接子化合物具有通式(2)
(式中，n是1以上6以下的整數(shù))表示的結(jié)構(gòu)，上述X具有包含3個以上烴衍生鏈的多分枝結(jié)構(gòu)部位的結(jié)構(gòu)，所述烴衍生鏈在末端上具有芳香族氨基且在主鏈上可以有碳-氮鍵。
這里上述烴衍生鏈?zhǔn)侵赣商己蜌浍@得的烴鏈，其中部分碳和氫可以被其他原子和取代基取代。即，上述烴衍生鏈?zhǔn)侵冈谀┒司哂蟹枷阕灏被瑹N鏈的主鏈結(jié)構(gòu)碳-碳鍵(C-C鍵)的部分可以用碳-氮鍵(C-N鍵)、碳-氧鍵(C-O鍵)、酰胺鍵(CO-NH鍵)取代的烴鏈。
根據(jù)上述構(gòu)成，上述連接子化合物可以簡便導(dǎo)入糖分子的部位具有芳香族氨基。上述芳香族氨基因為包含在各烴衍生鏈中，在上述連接子化合物中可以導(dǎo)入3單位以上的糖分子。并且，作為在上述蛋白質(zhì)分析用的載體上可以固定的部位有S-S鍵。
因而，通過插入上述連接子化合物，可以在上述載體上導(dǎo)入集聚的3單位以上的糖分子。并且，因為3單位以上的糖分子導(dǎo)入到1個連接子化合物中，在上述載體表面上可以再現(xiàn)性好地排列3單位以上的糖分子。由此，在上述載體表面上可以觀測糖分子和蛋白質(zhì)的相互作用，同時可以再現(xiàn)性好地評價糖分子的生物活性。
進(jìn)而，由于上述連接子化合物因為在連接部位具有寡亞乙二氧基，和在連接部位具有烷基的情況相比，可以大幅降低與疏水性高的分析對象物引起非特殊相互作用的可能性。并且，上述連接部分通過寡亞乙二氧基構(gòu)成，可以容易地調(diào)節(jié)提供金屬鍵的二硫基到結(jié)合到氨基末端的寡糖鏈的長度。由此，可以使二硫基不受寡糖鏈的影響，可以有效率地形成金屬-硫鍵。
具有上述通式(1)或通式(2)表示結(jié)構(gòu)的連接子化合物中，上述X優(yōu)選具有通式(3) (式中，m1、m2、m3、m4、p1、p2分別獨立地是1以上6以下的整數(shù))表示的結(jié)構(gòu)。
并且，具有上述通式(1)或通式(2)表示結(jié)構(gòu)的連接子化合物中，上述X優(yōu)選具有通式(4) (式中，q1、q2、q3、r1、r2、r3、t1、t2、t3、u1、u2、u3分別獨立地是0以上6以下的整數(shù))表示的結(jié)構(gòu)。
上述連接子化合物的X因為具有3個以上的上述烴衍生鏈，插入該連接子化合物可以在上述載體上導(dǎo)入3單位以上的糖分子。因此，可以控制上述載體表面上3單位以上的糖分子間的間隔，能再現(xiàn)性好地得到糖分子的序列，從而可以再現(xiàn)性好地評價糖分子的生物活性。
并且，為了解決上述課題，本發(fā)明的配體絡(luò)合物的特征在于在上述任何一種連接子化合物的芳香族氨基上導(dǎo)入了糖分子。
接著，上述配體絡(luò)合物具體的優(yōu)選具有通式(5) (式中，m1、m2、m3、m4、n、p1、p2分別獨立地是1以上6以下的整數(shù)。R’是氫或Ro)表示的結(jié)構(gòu)，上述R是選自(6-1)～(6-6)的源自寡糖化合物。
并且，上述配體絡(luò)合物具體的優(yōu)選具有通式(7)
(式中，a、b、d、e、q1、q2、q3、r1、r2、r3、t1、t2、t3、u1、u2、u3分別獨立地是0以上6以下的整數(shù)。b是0時t1、t2和t3不是0，t1、t2和t3是0時，b不是0。并且R’是氫或Ro)表示的結(jié)構(gòu)，上述R是選自上述式(6-1)～(6-6)的寡糖。
通過使用上述配體絡(luò)合物，可以在上述蛋白質(zhì)分析用的載體表面上集聚3單位以上或4單位以上(使用具有通式(5)或通式(7)所示結(jié)構(gòu)的配體絡(luò)合物時)的糖分子并使其固定。像這樣，因為一個配體絡(luò)合物具有3單位以上的糖分子，上述配體絡(luò)合物相互之間沒有在上述載體表面集聚，使用一個配體絡(luò)合物的話，可以集聚3單位以上的糖分子。因此，可以再現(xiàn)性好地測定糖分子的生物活性。并且，可以在上述載體表面上再現(xiàn)性好地以二維序列多個糖分子。因此，通過使用固定了本發(fā)明配體絡(luò)合物的蛋白質(zhì)分析用載體，可以冉現(xiàn)性好地評價糖分子的生物活性。
并且，為了解決上述課題，本發(fā)明的連接子化合物的制備方法的特征在于包括進(jìn)行硫辛酸和胺化合物的縮合反應(yīng)的步驟，該胺化合物具有3個以上用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)芳香族氨基末端的分枝鏈，以及對上述芳香族氨基末端的保護(hù)基團(tuán)脫保護(hù)的步驟。
根據(jù)上述方法，作為在上述蛋白質(zhì)分析用的載體上可以固定的部位具有S-S鍵，作為可以簡便地導(dǎo)入糖分子的部位具有芳香族氨基，可以獲得本發(fā)明的連接子化合物。
并且，為了解決上述課題，本發(fā)明的配體絡(luò)合物的制備方法其特征在于使用上述連接子化合物和糖分子，進(jìn)行還原胺化反應(yīng)。
根據(jù)上述方法，通過還原胺化反應(yīng)，能簡便地將糖分子導(dǎo)入連接子化合物中，從而獲得本發(fā)明的配體絡(luò)合物。
另外，作為上述糖分子，可以使用一切種類的具有還原末端的糖分子。
作為上述糖分子具體的優(yōu)選使用具有通式(8)
表示的肝素部分二糖結(jié)構(gòu)的硫酸化寡糖。
并且作為上述糖分子，具體的優(yōu)選使用選自組(9) 的寡糖的至少一種。
并且，為了解決上述課題，本發(fā)明糖分子的導(dǎo)入方法其特征在于使含有上述配體絡(luò)合物的溶液和載體表面的金屬相接觸。
根據(jù)上述方法，可以將上述配體絡(luò)合物中包含的連接子化合物的S-S鍵轉(zhuǎn)換為和上述載體表面的金屬之間的鍵，從而在載體表面上固定配體即糖鏈。因而，采用使含有配體絡(luò)合物的溶液和載體接觸的簡便方法，可以在載體表面上排列結(jié)合到連接子化合物上的糖分子。
并且，為了解決上述課題，本發(fā)明的配體載體的特征在于在表面具有金屬的載體上固定上述配體絡(luò)合物而制得。
根據(jù)上述結(jié)構(gòu)，通過插入金屬-硫鍵可以在載體表面上牢固地固定配體絡(luò)合物，因而能提供在載體表面再現(xiàn)性好地排列多個糖分子而制得的配體載體。從而，使用上述配體載體的話，可以再現(xiàn)性好地觀測在配體絡(luò)合物中包含的糖分子和與該糖分子相互作用的蛋白質(zhì)等物質(zhì)間的相互作用，因而可以定量地評價糖分子的生物活性。
本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點根據(jù)下面的記載可以充分地明白。并且，本發(fā)明的利益參照添加的附圖并根據(jù)下面的說明來明白。


表示本發(fā)明中該連接子化合物(化合物15)的合成路線的一個例子的示意圖。
表示本發(fā)明中該配體絡(luò)合物(化合物17)的合成路線的一個例子的示意圖。
表示在肝素共存下，bFGF結(jié)合到固定了單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片上的行為的圖表。
表示肝素對bFGF與分別固定了單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc、三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc、四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片的相互結(jié)合作用產(chǎn)生的阻礙率的圖表。
表示改變?nèi)芤褐械幕旌媳群笕鼼lcNS6S-IdoA2S-Glc的全反射紅外吸收譜的圖表。
表示改變?nèi)芤褐械幕旌媳群笏?GlcNS6S-IdoA2S-Glc的全反射紅外吸收譜的圖表。
表示芯片上的硫酸基團(tuán)對于溶液中的三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的混合比的相對強度的圖表。
表示芯片上的硫酸基團(tuán)對于溶液中的四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的混合比的相對強度的圖表。
表示通過SPR法觀察單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和單-Glc的混合比為100/0時的h-vWF相互結(jié)合作用的結(jié)果的圖表。
表示通過SPR法觀察三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和單-Glc的混合比為100/0時的h-vWF相互結(jié)合作用的結(jié)果的圖表。
表示通過SPR法觀察四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和單-Glc的混合比為100/0時的h-vWF相互結(jié)合作用的結(jié)果的圖表。
表示通過SPR法觀察單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和單-Glc的混合比為20/80時的h-vWF相互結(jié)合作用的結(jié)果的圖表。
表示通過SPR法觀察三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和單-Glc的混合比為20/80時的h-vWF相互結(jié)合作用的結(jié)果的圖表。
表示通過SPR法觀察四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和單-Glc的混合比為20/80時的h-vWF相互結(jié)合作用的結(jié)果的圖表。
表示每單位n-vWF的濃度對由圖7(a)和圖8(a)所示結(jié)果獲得的結(jié)合量作圖獲得的圖表。
表示每單位n-vWF的濃度對由圖7(b)和圖8(b)所示結(jié)果獲得的結(jié)合量作圖獲得的圖表。
表示每單位n-vWF的濃度對由圖7(c)和圖8(c)所示結(jié)果獲得的結(jié)合量作圖獲得的圖表。
表示在單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和單-Glc＝100/0時，固定了單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片和rhvWF-A1相互作用的測定結(jié)果的圖表。
表示在單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和單-Glc＝50/50時，固定了單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片和rhvWF-A1相互作用的測定結(jié)果的圖表。
表示在三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和單-Glc＝100/0時，固定了三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片和rhvWF-A1相互作用的測定結(jié)果的圖表。
表示在三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和單-Glc＝50/50時，固定了三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片和rhvWF-A1相互作用的測定結(jié)果的圖表。
表示在四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和單-Glc＝100/0時，固定了四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片和rhvWF-A1相互作用的測定結(jié)果的圖表。
表示在四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和單-Glc＝50/50時，固定了四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片和rhvWF-A1相互作用的測定結(jié)果的圖表。
表示本發(fā)明的連接子化合物(化合物26)的合成路線的一個例子的示意圖。
表示本發(fā)明的配體絡(luò)合物(化合物27)的合成路線的一個例子的示意圖。
表示本發(fā)明的連接子化合物(化合物32)的合成路線的一個例子的示意圖。
表示H2N-TEG-NHBoc(化合物30)的合成路線的一個例子的示意圖。
表示本發(fā)明的配體絡(luò)合物(化合物34)的合成路線的一個例子的示意圖。
實施方式下面詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明的連接子化合物是用于插入到表面等離子體共振(SPR)的感應(yīng)芯片和親和色譜法的載體等蛋白質(zhì)分子用的載體和寡糖等糖(下面記為糖分子)之間，在上述載體上固定糖分子的。因此，上述連接子化合物必須在分子內(nèi)具有可以固定在上述載體上的部位和可以方便導(dǎo)入糖分子的部位。
并且，上述SPR和親和色譜法的目的在于特定化并分離和糖分子有特殊相互作用的蛋白質(zhì)等物質(zhì)。因此，上述連接子化合物必須是和蛋白質(zhì)等物質(zhì)沒有非特殊相互作用的物質(zhì)。
因此，如上述通式(1)或通式(2)所示，本發(fā)明的連接子化合物具有二硫鍵(S-S鍵)作為可以固定在上述載體上的部位。該二硫鍵的硫(S)例如可以和涂覆在蛋白質(zhì)分析用的載體表面上的金(Au)等金屬形成金屬-硫鍵，從而牢固地結(jié)合到上述載體上。
并且，上述連接子化合物為了在蛋白質(zhì)分析用載體表面上以二維序列多個糖分子，同時控制各糖分子間的距離，作為可以簡便地導(dǎo)入糖分子的部位，具有含多個氨基的多分枝部位。即，本發(fā)明的連接子化合物的多分枝部位是具有如上述通式(1)或通式(2)中的X表示的結(jié)構(gòu)的部位，該X如上所述具有包含3個以上的、在末端具有芳香族氨基且在主鏈上可以具有碳-氮鍵和酰胺鍵的烴衍生鏈。
上述芳香族氨基的氨基(-NH2基)是用于通過和寡糖等糖分子的還原胺化反應(yīng)在上述連接子化合物中導(dǎo)入糖分子的反應(yīng)基團(tuán)。換句話說，由糖分子中的平衡產(chǎn)生的醛基(-CHO基)或酮基(-CRO基，R是烴基)和上述連接子化合物具有的氨基反應(yīng)。接著，通過接下來的還原由該反應(yīng)形成的席夫堿，可以容易地在芳香族氨基上導(dǎo)入糖分子。
因而，上述通式(1)或通式(2)的X通過包含3個以上的上述烴衍生鏈，具備同時具有多個多個可導(dǎo)入糖分子的芳香族氨基的多分枝部位。因為在該多分枝型部位含有的各芳香族氨基上導(dǎo)入寡糖等糖分子，可以插入具有上述通式(1)或通式(2)表示結(jié)構(gòu)的連接子化合物，在蛋白質(zhì)分析用的載體表面上再現(xiàn)性好地以二維序列多個糖分子。
進(jìn)而，本發(fā)明的連接子化合物如上述通式(1)或通式(2)所示，在二硫基團(tuán)和芳香族氨基之間具有寡環(huán)氧乙烷。由此可以極力抑制非特殊的疏水性相互作用，且能容易地調(diào)整提供到金屬鍵上的二硫基團(tuán)的長度，有效率地形成金屬-硫鍵。另外，在上述通式(1)中，a、b、d、e可以分別獨立地是0以上6以下的整數(shù)。在b為0時，X內(nèi)部必須具有寡環(huán)氧乙烷。上述通式(2)中，n只要是1以上6以下的整數(shù)，可以沒有限制。
具體來說，上述X如上述通式(3)所示，是2鏈的烴衍生鏈，芳香族氨基在反側(cè)的末端，可以是具有2個結(jié)合到1個氮原子(N)上的二分枝結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)。此時，2個二分枝結(jié)構(gòu)的上述氮可以通過例如插入-CO-CH2-而結(jié)合到1個氮原子(N)上形成分枝結(jié)構(gòu)。由此，上述X是具有帶4個烴衍生鏈的多分枝型部位的結(jié)構(gòu)。另外，上述通式(3)中，m1、m2、m3、m4只要是1以上6以下的整數(shù)，可以沒有限制，可以是彼此不同的整數(shù)，也可以是部分或全部相同的整數(shù)。這其中，從能簡便制備具有上述多分枝部位的化合物考慮，優(yōu)選上述m1～m4是彼此相同的整數(shù)，特別優(yōu)選是2。并且，p1、p2只要是1以上6以下的整數(shù)，可以沒有特別限制，可以是彼此不同的整數(shù)，也可以是彼此相同的整數(shù)。這其中，從制備的簡易性考慮，p1、p2優(yōu)選彼此相同的整數(shù)，特別優(yōu)選是1。
另外，具有上述通式(3)表示的4個烴衍生鏈的X可以在各烴衍生鏈中具有寡環(huán)氧乙烷的結(jié)構(gòu)。例如如上述通式(4)所示，可以在各烴衍生鏈的CH2和NH之間具有寡環(huán)氧乙烷的結(jié)構(gòu)。
并且，上述X如上述通式(4)所示是3個烴衍生鏈，芳香族氨基在反側(cè)的末端，可以具有結(jié)合到1個碳原子(C)上的三分枝結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)。此時，三分枝結(jié)構(gòu)的上述碳例如可以通過插入-C-N-，結(jié)合到1個氮原子(N)上來形成分枝結(jié)構(gòu)。由此，上述X具有帶三個烴衍生鏈的多分枝型部位的結(jié)構(gòu)。
另外，上述通式(4)中，q1、q2、q3只要是0以上6以下的整數(shù)，可以沒有限制，可以是彼此不同的整數(shù)，也可以是部分或全部相同的整數(shù)。這其中，從能簡便制備具有上述多分枝部位的化合物考慮，上述q1～q3優(yōu)選是彼此相同的整數(shù)，特別優(yōu)選是2。并且，r1、r2、r3只要是0以上6以下的整數(shù)，可以沒有限制，可以是彼此不同的整數(shù)，也可以是部分或全部相同的整數(shù)。這其中，從制備的簡易性考慮，上述r1～r3優(yōu)選彼此相同的整數(shù)，特別優(yōu)選是1。并且，u1、u2、u3只要是0以上6以下的整數(shù)，可以沒有限制，可以是彼此不同的整數(shù)，也可以是部分或全部相同的整數(shù)。這其中，從制備的簡易性考慮，上述u1～u3優(yōu)選彼此相同的整數(shù)，特別優(yōu)選是1。進(jìn)而，t1、t2、t3只要是0以上6以下的整數(shù)，可以沒有限制，可以是彼此不同的整數(shù)，也可以是部分或全部相同的整數(shù)。上述通式(1)中X是通式(4)表示的情況下，上述通式(1)的b是0時，，t1、t2、t3優(yōu)選是1以上6以下的整數(shù)。從制備的簡易性考慮，上述t1～t3優(yōu)選彼此相同的整數(shù)，特別優(yōu)選是4。
如上所述，上述X具有在碳和氮等原子上結(jié)合多個上述烴衍生鏈形成分枝結(jié)構(gòu)的多分枝型部位的結(jié)構(gòu)。另外，在上述X中含有的多個烴衍生鏈優(yōu)選都相同，但是如果在末端具有芳香族氨基的話，彼此也可以有不同的結(jié)構(gòu)。
如上所述，具有通式(1)或通式(2)表示的結(jié)構(gòu)的連接子化合物具有可以結(jié)合到蛋白質(zhì)分子用載體上的S-S鍵和可以結(jié)合到寡糖等糖分子上的氨基。因而，例如通過Au-S鍵等金屬-硫鍵上述連接子化合物能固定在蛋白質(zhì)分析用載體上，從而通過插入上述連接子化合物，能將糖分子牢固且簡單地結(jié)合到上述載體上。
并且，上述連接子化合物具有多分枝型部位，在該多分枝型部位的各末端上具有芳香族氨基。因此，通過使用在上述連接子化合物上導(dǎo)入糖分子而制得的配體絡(luò)合物(后述)，可以有效率地在上述連接子化合物上集聚糖分子。并且，因為具有多分枝型部位，在載體表面上結(jié)合含有連接子化合物的配體絡(luò)合物時，可以再現(xiàn)性好地以二維序列多個糖分子。
進(jìn)而，上述連接子化合物可以幾乎無視和蛋白質(zhì)非特異性的相互作用的影響。從而，通過使用本發(fā)明的連接子化合物，可以再現(xiàn)性好地評價糖分子的生物活性。
并且，上述連接子化合物如上述通式(1)或通式(2)所示，在二硫基和芳香族氨基之間具有寡環(huán)氧乙烷。由此，可以極力抑制非特殊疏水性相互作用，且能容易地調(diào)整提供到金屬鍵上的二硫基團(tuán)的長度，有效率地形成金屬-硫鍵。
上述連接子化合物可以通過下面所示的制備方法來制備。即，上述連接子化合物是通過將硫辛酸和胺化合物進(jìn)行縮合反應(yīng)，該胺化合物包含多分枝結(jié)構(gòu)，其具有3個以上的芳香族氨基末端用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的分枝鏈，再對上述芳香族氨基末端的保護(hù)基團(tuán)脫保護(hù)來制備的。
上述硫辛酸具有下述通式(10) 表示的結(jié)構(gòu)。
并且上述胺化合物只要包含具有用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的芳香族氨基末端的分枝鏈，沒有特別限制，上述連接子化合物的多分枝部位保護(hù)相應(yīng)的結(jié)構(gòu)也是可以的。
因而，上述分枝鏈?zhǔn)浅司哂杏帽Ｗo(hù)基團(tuán)保護(hù)的芳香族氨基末端代替上述烴衍生鏈中所包含的芳香族氨基之外，也具有包含于上述烴衍生鏈中的結(jié)構(gòu)。換句話說，上述分枝鏈?zhǔn)窃谟商己蜌浍@得的烴鏈中，可以將部分碳和氫用其他原子和取代基替代的鏈。更具體的，上述分枝鏈可以是具有用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的芳香族氨基末端，同時烴鏈的主鏈結(jié)構(gòu)即碳-碳鍵(C-C鍵)的部分可以被碳-氮鍵(C-N)鍵)或碳-氧鍵(C-O鍵)取代。
并且，上述保護(hù)基團(tuán)是指通過上述縮合反應(yīng)不發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)入芳香族氨基的氨基的取代基。這樣的保護(hù)基團(tuán)只要是在對仲氨基的保護(hù)基團(tuán)脫保護(hù)時不受影響的基團(tuán)，沒有特別限制。作為上述保護(hù)基團(tuán)可以列舉出例如叔丁氧基羰基(-COOC(CH3)3基；記為Boc基)、芐基、烯丙基氨基甲酸酯基(-COOCH2CH＝CH2，Alloc基)等。
作為上述胺化合物，可以列舉出例如具有下述通式(11)
表示的結(jié)構(gòu)的化合物。另外，上述通式(11)中的n、m1～m4、p1、p2分別獨立地是1以上6以下的整數(shù)。這些胺化合物的合成方法用后面的實施例來詳細(xì)描述。
通過上述硫辛酸和胺化合物的縮合反應(yīng)，硫辛酸的羧基(-COOH基)和胺化合物的氨基(-NH2基)縮合，形成酰胺鍵。然后，芳香族氨基末端的保護(hù)基團(tuán)脫保護(hù)，除去保護(hù)基團(tuán)，獲得芳香族氨基，可以得到上述連接子化合物。
另外，上述連接子化合物因為要獲得在上述連接部分上具有寡環(huán)氧乙烷的結(jié)構(gòu)，在其制備方法中，優(yōu)選使用含有寡環(huán)氧乙烷結(jié)構(gòu)的物質(zhì)作為原料。作為該原料可以列舉出例如雙[2-(2-羥基乙氧基)乙基]醚(實施例的化合物1)、分子量不同的市售聚乙二醇(Mw200、300、400、600、1000)(Sigma公司制造)等，這其中，出于能完全控制聚合度，即獲得可控制長度的結(jié)構(gòu)的理由考慮，優(yōu)選使用雙[2-(2-羥基乙氧基)乙基]醚(實施例的化合物1)。
接著，說明本發(fā)明的配體絡(luò)合物。這里，“配體絡(luò)合物”是指在上述連接子化合物的芳香族氨基上導(dǎo)入糖分子制得的產(chǎn)品。本發(fā)明的配體絡(luò)合物可以通過將連接子化合物的氨基和由糖分子中的平衡產(chǎn)生的醛基或酮基反應(yīng)，接著還原由該反應(yīng)形成的席夫堿，在芳香族氨基上導(dǎo)入糖分子。即，通過該還原胺化反應(yīng)，將上述連接子化合物和糖分子結(jié)合。
作為本發(fā)明的配體絡(luò)合物中含有的糖分子只要是具有還原末端的還原糖，就可以沒有特別限制使用一切這樣種類的產(chǎn)品。作為上述糖分子具體可以列舉出例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等單糖類、結(jié)合糖數(shù)為2糖～10糖的麥芽糖、乳糖、后述的硫酸化寡糖等寡糖類、單糖類和寡糖類組合的糖數(shù)在11以上的肝素、硫酸軟骨素、類肝素磺酸酯等多糖類。
并且，作為上述寡糖類，可以列舉出具有抗凝血活性的公知的硫酸化多糖肝素中的具有用下述通式(8) 表示的特定部分二糖結(jié)構(gòu)(稱為“GlcNS6S-IdoA2S”)的硫酸化寡糖、在該硫酸化寡糖的還原末端的羥基上導(dǎo)入葡萄糖而制得的具有下述通式(12) 表示的結(jié)構(gòu)的寡糖。
另外，上述寡糖類和多糖類可以是由同一單糖分子制得的單寡糖和單多糖，也可以是由各種單糖分子及其衍生物制得的糖復(fù)合劑和包含各種單糖分子及其衍生物、寡糖類的復(fù)合多糖類。并且，上述糖分子任何一種都可以是由自然界分離、精制獲得的各種天然糖，也可以是人工合成的糖。
具體來說，本發(fā)明的配體絡(luò)合物是具有上述通式(5)表示的結(jié)構(gòu)的制品。具有該通式(5)表示結(jié)構(gòu)的配體絡(luò)合物是在具有上述通式(2)表示的、X是用上述通式(3)表示的結(jié)構(gòu)的連接子化合物上導(dǎo)入糖分子的制品。糖分子只要是具有還原末端的還原糖，沒有特別限制，優(yōu)選選自通式組(9)和通式(12)的產(chǎn)品。因為用通式(3)表示的X具有帶4個烴衍生鏈的結(jié)構(gòu)，具有通式(5)表示結(jié)構(gòu)的配體絡(luò)合物是在上述連接子化合物上結(jié)合4單位以上的糖分子的制品。另外，上述通式(5)中，m1～m4和通式(3)中的m1～m4一樣，只要是1以上6以下的整數(shù)就沒有限制，可以是彼此不同的整數(shù)，也可以是部分或全部相同的整數(shù)。并且，n只要是1以上6以下的整數(shù)就沒有特別限制。并且，R’可以是氫或寡糖衍生化合物。
并且，本發(fā)明的配體絡(luò)合物是具有上述通式(7)表示結(jié)構(gòu)的制品。具有該通式(7)表示的結(jié)構(gòu)的配體絡(luò)合物是在具有上述通式(1)表示的、X是上述通式(4)表示結(jié)構(gòu)的連接子化合物上導(dǎo)入糖分子的制品。糖分子只要是具有還原末端的還原糖，沒有限制，優(yōu)選選自通式組(9)和通式(12)的產(chǎn)品。因為用通式(7)表示的X具有帶3個烴衍生鏈的結(jié)構(gòu)，具有通式(7)表示結(jié)構(gòu)的配體絡(luò)合物是在上述連接子化合物上結(jié)合3單位以上的糖分子的制品。
因為上述配體絡(luò)合物含有任何一種連接子化合物和糖分子，在連接子化合物內(nèi)的S-S鍵可以和蛋白質(zhì)分析用的載體表面的金屬結(jié)合形成金屬-硫(S)鍵，例如金-硫(Au-S)鍵。由此，通過插入該Au-S鍵，可以提供在上述載體表面集聚了3單位以上糖分子的固定化的配體載體。因而，通過使用上述配體絡(luò)合物，例如獲得在蛋白質(zhì)分析用的載體表面上再現(xiàn)性好地以二維序列多個糖分子而獲得的配體載體，通過使用該配體載體，可以再現(xiàn)性好地評價糖分子的生物活性。另外，作為上述載體表面的金屬除了能使用上述的Au以外，還可以使用Cu、Ag、Pt等金屬，特別優(yōu)選使用Au。
進(jìn)而，上述配體絡(luò)合物在連接部位具有寡環(huán)氧乙烷。由此，可以極大抑制非特殊疏水性的相互作用，且可以容易地調(diào)整提供金屬鍵的二硫基的長度，有效率地形成金屬-硫鍵。
如上所述，本發(fā)明中還可以包含在插入金屬-硫鍵的載體表面上固定本發(fā)明大配體絡(luò)合物而制得的配體載體。該配體載體不限于蛋白質(zhì)分析用，也可以用于檢測和糖分子的相互作用，作為蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)的分析來使用。
上述配體載體是通過將含有該配體絡(luò)合物的溶液和表面上具有金屬膜的載體接觸，使配體絡(luò)合物的S-S鍵的各S原子和載體表面的金屬通過金屬-硫鍵結(jié)合，在載體表面上導(dǎo)入上述配體絡(luò)合物。具體來說，通過在上述配體絡(luò)合物溶液中浸漬蛋白質(zhì)分析用載體一定時間，或者在上述載體上浸漬配體絡(luò)合物溶液(在載體表面流過配體絡(luò)合物溶液)，將在上述配體絡(luò)合物中含有的連接子化合物的S-S鍵置換成與上述載體表面的金等形成的Au-S鍵，可以在載體表面上固定上述配體絡(luò)合物。
作為在配體絡(luò)合物溶液中使用的溶劑沒有特別限制，例如可以列舉出甲醇、水、二甲基乙酰胺(DMAc)和它們的混合溶劑等。并且，浸漬時間可以是0.5小時～12小時左右，浸漬濃度可以是1μM～1mM左右。
如上所述，本發(fā)明的配體絡(luò)合物因為具有S-S鍵，可以簡單地固定在蛋白質(zhì)分析用載體表面上，可以在上述載體上簡單地導(dǎo)入糖分子。
另外，如上在載體上導(dǎo)入糖分子的方法也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明的配體載體可以用于分析糖分子和例如蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)的相互作用。具體來說，上述配體載體可以適用于SPR測定、親和色譜法等中。
例如，作為蛋白質(zhì)分析，進(jìn)行SPR測定可以按照下面的方式來進(jìn)行。即，使用在氣體電鍍金薄膜等金屬薄膜的載體上固定本發(fā)明的配體絡(luò)合物制得的配體載體，將該配體載體和蛋白質(zhì)接觸，根據(jù)常規(guī)方法，使用表面等離子體共振裝置測定共振角度，就可以觀測該配體載體和蛋白質(zhì)的結(jié)合行為。另外，作為在SPR測定中使用的上述載體(感應(yīng)芯片)，可以使用例如玻璃、塑料等，特別適合使用玻璃。而且，配體載體和蛋白質(zhì)的接觸可以通過例如在該配體載體表面流過將蛋白質(zhì)溶解于流動緩沖液獲得的溶液來進(jìn)行。作為這樣的流動緩沖液可以列舉出例如磷酸緩沖液等。
本發(fā)明的配體載體因為具有上述配體絡(luò)合物，可以在載體表面上再現(xiàn)性好地以二維序列多個糖分子。因而，可以再現(xiàn)性好地觀測糖分子的生物活性，可以進(jìn)行糖分子結(jié)構(gòu)的查明和糖分子的生物活性的定量評價。
而且，作為本發(fā)明的配體載體，固定了糖鏈的感應(yīng)芯片例如可以在下述SPR測定中使用。即，使用在載體表面上固定第1糖分子而制得的第1感應(yīng)芯片和在載體表面上固定和上述第1糖分子末端結(jié)構(gòu)不同的第2糖分子而制得的第2感應(yīng)芯片，檢測出使用第1感應(yīng)芯片得到的SPR測定的檢測結(jié)果和使用第2感應(yīng)芯片得到的SPR測定的檢測結(jié)果之差，就可以觀測糖分子的相互作用。這些感應(yīng)芯片可以使用固定不同糖分子的配體絡(luò)合物。用于比較的糖分子可以列舉出例如乳糖和葡萄糖、麥芽糖和葡萄糖、曲二糖和葡萄糖等。這里，使用2個感應(yīng)芯片，但是可以使用在其以上數(shù)量的、導(dǎo)入不同糖分子的感應(yīng)芯片。另外，糖分子末端是指不固定在感應(yīng)芯片上的一側(cè)。
上述SPR測定是使用在第1糖分子中起特殊作用的蛋白質(zhì)等，測定條件一定，上述2個感應(yīng)芯片發(fā)生作用，觀測兩者的共振角度。檢測該兩者的共振角度之差，可以測定糖分子和蛋白質(zhì)等的特殊相互作用。
并且，觀測和糖分子的相互作用的物質(zhì)不限于蛋白質(zhì)。
上面敘述中同時測定2個種類的感應(yīng)芯片，但是并不限于此，可以測定2種以上的感應(yīng)芯片，也可以同時測定。而且，也可以使用在至少1個感應(yīng)芯片中不導(dǎo)入糖分子的制品。例如可以使用只固定連接子化合物的制品。
進(jìn)行上述這樣的SPR測定的話，糖分子以外的相互作用因為可以使用至少2個固定了相同結(jié)構(gòu)的配體絡(luò)合物的感應(yīng)芯片進(jìn)行測定，用至少2個感應(yīng)芯片測定的相互作用的大小之差可以用來作為觀測糖分子引起的相互作用。因而，使用上述測定方法，能降低糖分子以外的部分與其他物質(zhì)的非特殊相互作用，可以觀測糖分子和其他物質(zhì)的特殊相互作用。
實施例下面更詳細(xì)地說明本發(fā)明的連接子化合物和配體絡(luò)合物的合成。并且，本實施例還進(jìn)行使用合成的該配體絡(luò)合物和其他配體絡(luò)合物其特性的比較研究。在其中結(jié)合說明。
本發(fā)明的連接子化合物之一，即具有上述通式(2)中n為4，X為上述通式(3)表示的、p1、p2是1、m1、m2、m3、m4是2的結(jié)構(gòu)的連接子化合物(化合物15)是根據(jù)下面順序來合成的。圖1中示出了合成該連接子化合物(化合物15)的過程。即，在本實施例1的說明中，各化合物中附帶的編號和圖1中記載的編號相對應(yīng)。
如圖1所示，首先，使用雙[2-(2-羥基乙氧基乙基]醚(化合物1)作為原料，在二氯甲烷中BF3·Et2O存在下與重氮基醋酸乙酯(化合物2)反應(yīng)，合成產(chǎn)率為40％的酯化合物(化合物3)。接著，在二氯甲烷中DMAP和吡啶存在下將化合物3和對甲苯磺酰氯反應(yīng)，得到產(chǎn)率為78％的對甲苯磺?；衔?化合物4)?；衔?與N，N，N-二甲基甲酰胺中的疊氮鈉作用，得到產(chǎn)率為90％的疊氮化合物(化合物5)。
將其在甲醇中用1N的NaOH水解，得到產(chǎn)率為98％的羧酸衍生物(化合物6)。在二氯甲烷中將上述化合物6和化合物7用HOBt、EDC·HCl縮合，得到產(chǎn)率為80％的二酯衍生物(化合物8)。將該化合物8在甲醇中用0.6N的NaOH水解，得到產(chǎn)率為93％的二羧酸衍生物(化合物9)。將上述化合物9和二胺衍生物(化合物10)使用FDPP、DIPEA縮合，得到產(chǎn)率為40％的化合物11。將該化合物11的疊氮基與氫接觸而還原，得到產(chǎn)率為80％的胺化合物(化合物12)。
然后，和硫辛酸(化合物13)進(jìn)行縮合，得到產(chǎn)率為59％的化合物14。最后，通過該化合物14中的TFA作用，對Boc基團(tuán)脫保護(hù)，得到產(chǎn)率為91％的具有4單位目標(biāo)芳香族氨基的連接子化合物(化合物15)。
下面更具體地示出由上述合成過程獲得的各化合物的合成方法，同時示出合成的各化合物中1H-NMR譜的測定和重量分析的測定結(jié)果。而且，配體即糖鏈在芯片上的相對濃度要求通過全反射FT-IR(ATR-FT-IR)來測定。其分別通過下面的順序來進(jìn)行。
1H-NMR譜的測定是使用JEOL-JNM-Lambda-500NMR分光光度計和JEOL JNM-GSX400NMR分光光度計、JEOL EX-270NMR分光光度計?；瘜W(xué)位移對于CDCl3是用四甲基硅烷作為基準(zhǔn)物質(zhì)的δ值來表示。CD3OD和DMSO-d6是用殘存溶劑的質(zhì)子的化學(xué)位移為基準(zhǔn)的δ值來表示。重量分析是使用Applied Biosystems，MarinerTM來測定的。ATR-FT-IR測定使用在Shimadzu，IRPrestige-21上搭載1次反射的ATR附帶裝置(MIRacle Ge棱鏡)的裝置。用于ATR-FT-IR測定的感應(yīng)芯片使用和SPR測定時相同的產(chǎn)品。中壓柱硅膠色譜法使用硅膠No.9385(Merck)，薄層硅膠色譜法使用硅膠60 F254(Merck)。無水二氯甲烷使用氫化鈣作干燥劑、在氮氣流下蒸餾的制品。其他脫水溶劑使用從關(guān)東化學(xué)有限公司購買的產(chǎn)品。此外的試劑和溶劑基本上使用特級的產(chǎn)品。
(1)化合物3的合成在50ml的無水二氯甲烷中溶解雙[2-(2-羥基乙氧基)乙基]醚(化合物1)(14.57ml，80mmol)和BF3·Et2O(252ml，2mmol)，滴加0℃下的重氮基醋酸乙酯(化合物2)(1.8ml，17.35mmol)后，在室溫下攪拌70分鐘。在反應(yīng)溶液中加入20ml飽和氯化銨水溶液，用二氯甲烷萃取，用無水硫酸鎂干燥。濾去干燥劑，減壓濃縮，用中壓分離色譜法(600g，己烷∶醋酸乙酯＝1∶3)精制濃縮殘渣，得到無色液體化合物3(2.26g，產(chǎn)率47％)。
對該化合物3進(jìn)行1H-NMR(400MHz，CDCl3)的測定δ4.22(2H，q，J＝7.0，14.2Hz，CO2CH2)，4.14(2H，s，OCH2CO)，3.75-3.62(14H，m，CH2CH2O×3，HOCH2CH2)，3.61(2H，t，J＝4.4Hz，HOCH2)，1.84(1H，bs，OH)，1.28(3H，t，J＝7.3Hz，CH2CH2)。
并且，上述化合物3進(jìn)行ESI-MS(正)的測定，結(jié)果是m/z 303.27[(M+Na)+]。由此可以確認(rèn)化合物3的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物3的分子量是C12H24O7280.15。
(2)化合物4的合成在8ml無水吡啶中溶解上述乙基體化合物3(2.15g，7.66mmol)和DMAP(41.7mg，337mmol)。在0℃下向該溶液中滴加溶解于8ml無水二氯甲烷中的對甲苯磺酸氯化物(1.75g，9.19mmol)的溶液，在室溫下攪拌3小時。在反應(yīng)溶液中加入二氯甲烷和冰水，在二氯甲烷中萃取。用飽和碳酸氫鈉水溶液、水飽和食鹽水平均清洗有機層一次，用無水硫酸鎂干燥。濾去干燥劑，減壓濃縮，用中壓分離色譜法(100g，氯仿∶丙酮＝4∶1)精制濃縮殘渣，得到黃色液體化合物4(2.59g，產(chǎn)率78％)。
對該化合物4進(jìn)行1H-NMR(400MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ7.80(2H，d，J＝8.4Hz，aromatic)，7.35(2H，d，J＝8.4Hz，aromatic)，4.21(2H，q，CO2CH2)，4.16(2H，t，J＝4.8Hz，TsOCH2)，4.14(2H，s，OCH2CO)，3.76-3.59(14H，m，CH2CH2O×3，TsOCH2CH2)，2.45(3H，s，CH3Ar)，1.28(3H，t，J＝7.0Hz，CH2CH3)。
并且，進(jìn)行上述化合物4的ESI-MS(正)測定，結(jié)果為m/z 457.16[(M+Na)+]。由此可以確認(rèn)化合物4的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物4的分子量為C19H30O9S434.16。
(3)化合物5的合成在50ml無水二甲基甲酰胺中溶解上述對甲苯磺?；衔?(1.01g，2.31mmol)和疊氮化鈉(1.53g，2.31mmol)，遮光，在120℃下氮氣氛圍氣中攪拌10小時。用氯仿萃取反應(yīng)溶液，用水、飽和食鹽水平均清洗一次有機層，用無水硫酸鎂干燥。濾去干燥劑，減壓濃縮，用中壓分離色譜法(10g，氯仿∶丙酮＝2∶1)精制濃縮殘渣，得到黃色液體化合物5(638mg，產(chǎn)率90％)。
對該化合物5進(jìn)行1H-NMR(400MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ4.22(2H，q，J＝7.3Hz，CO2CH2)，4.15(2H，s，OCH2CO2Et)，3.75-3.63(12H，m，OCH2CH2O)，3.69(2H，m，N3CH2CH2)，3.39(2H，t，J＝5.1Hz，N3CH2)，1.29(3H，t，J＝7.3Hz，CO2CH2CH2)。
并且，進(jìn)行上述化合物5的ESI-MS(正)測定，結(jié)果為m/z 328.14[(M+Na)+]。由此可以確認(rèn)化合物5的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物5的分子量為C12H23N3O6305.16。
(4)化合物6的合成在24ml甲醇中溶解上述疊氮化合物5(614mg，2.01mmol)，遮光下在0℃下添加1N NaOH4.3ml后，在室溫下攪拌21小時。減壓濃縮反應(yīng)溶液，在濃縮殘渣中加入氯仿后，加入1N HCl直到pH＝2，用氯仿萃取。用飽和食鹽水清洗一次有機層，用無水硫酸鎂干燥。濾去干燥劑，減壓濃縮，得到無色液體化合物6(549mg，產(chǎn)率90％)。
對該化合物6進(jìn)行1H-NMR(400MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ6.19(1H，bs，CO2H)，4.16(2H，s，OCH2CO2H)，3.75-3.64(12H，m，OCH2CH2O)，3.68(2H，m，N3CH2CH2)，3.41(2H，t，J＝5.1Hz，N3CH2)。
并且，進(jìn)行上述化合物6的ESI-MS(負(fù))測定，結(jié)果為m/z 328.14[(M+Na)+]。由此可以確認(rèn)化合物6的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物6的分子量為C10H19N3O6277.13。
(5)化合物7的合成在50ml無水甲醇中溶解二甘氨酸(10.0g，75.1mmol)和BF3·OEt2(22ml，173mmol)，在氬氣氛圍氣中回流5小時后，加入飽和碳酸氫鈉水溶液中和，用氯仿萃取。pH達(dá)到9時在水層中加入三乙胺，再用氯仿萃取，使用無水硫酸鎂作為干燥劑干燥后，濾去干燥劑，減壓濃縮，得到黃色油狀物化合物7(9.61g，產(chǎn)率79％)。
對該化合物7進(jìn)行1H-NMR(400MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ3.74(6H，OMe)，3.48(4H，s，CH2N)，2.00(1H，s，NH)。并且，進(jìn)行上述化合物7的ESI-MS(正)測定，結(jié)果為m/z 162.1[(M+H)+]。由此可以確認(rèn)化合物7的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物7的分子量為C6H11NO2161.07。
(6)化合物8的合成在2ml無水二氯甲烷中溶解上述化合物6(0.35g，1.26mmol)和EDC·HCl(0.27g，1.39mmol)、HOBt(0.19g，1.39mmol)，在氬氣氛圍氣中、0℃下遮光攪拌80分鐘后，加入在1ml無水二氯甲烷中溶解上述化合物7(1.42g，6.83mmol)的溶液，在室溫下攪拌17小時。反應(yīng)溶液用氯仿萃取，有機層用10％檸檬酸和飽和碳酸氫鈉水溶液平均清洗一次。使用無水硫酸鈉作為干燥劑干燥后，濾去干燥劑，進(jìn)行減壓濃縮。用分離硅膠色譜法(50g，氯仿∶丙酮＝10∶1)精制濃縮殘渣，得到白色固體化合物8(0.42g，產(chǎn)率80％)。
對該化合物8進(jìn)行1H-NMR(400MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ4.23，4.11(4H，s，s，CONCH2)，4.18(2H，s，OCH2CON)，3.69，3.66(4H，s，s，CO2CH3)，3.69-3.56(12H，m，OCH2CH2O)，3.61(2H，t，J＝5.1Hz，N3CH2CH2)，3.32(3H，t，J＝5.0Hz，N3CH2)。
并且，進(jìn)行上述化合物8的ESI-MS(正)測定，結(jié)果為m/z 443.17[(M+Na)+]。由此可以確認(rèn)化合物8的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物8的分子量為C16H28N4O9420.19。
(7)化合物9的合成在5ml甲醇中溶解上述化合物8(398mg，947μmol)，加入2N的NaOH(2.1ml)，在0℃下攪拌2.5小時后，加入Dowex 50WX-8(H+形式)直到pH＝2，中和，過濾Dowex 50WX-8，進(jìn)行減壓濃縮。在減壓濃縮得到的濃縮殘渣中加入水，濾去不溶物后，進(jìn)行減壓濃縮和冷凍干燥，得到白色固體化合物9(346mg，產(chǎn)率93％)。
對該化合物9進(jìn)行1H-NMR(400MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為
δ5.66(2H，bs，CO2Hx2)，4.26(2H，s，OCH2CON)，4.24，4.18(4H，s，s，CONCH2)，3.71-3.63(12H，m，OCH2CH2O)，3.67(2H，m，J＝5.1Hz，N3CH2CH2)，3.40(3H，t，J＝4.9Hz，N3CH2)。
并且，進(jìn)行上述化合物9的ESI-MS(負(fù))測定，結(jié)果為m/z 391.15[(M-H)-]。由此可以確認(rèn)化合物9的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物9的分子量為C14H24N4O9392.15。
(8)化合物10的合成在60ml無水二氯甲烷中懸浮N-Boc氨基安息香酸衍生物(3.33g，14.0mmol)和HOBt(1.93g，14.3mmol)，在氬氣氛圍氣中、0℃下攪拌15分鐘，加入在30ml無水二氯甲烷中溶解EDC·HCl(2.87g，15.0mmol)的溶液，攪拌50分鐘。在該溶液中加入二亞乙基三胺(0.79ml，7.00mmol)，遮光下在室溫下攪拌整夜，得到白色結(jié)晶。濾去該白色結(jié)晶后，用甲醇再結(jié)晶，得到白色結(jié)晶化合物10(3.53g，產(chǎn)率92.9％)。
對該化合物10進(jìn)行1H-NMR(400MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ7.77-7.74(4H，d，J＝8.67Hz，aromatic)，7.50-7.48(4H，d，J＝8.57Hz，aromatic)，3.70-3.66(4H，m，J＝5.19Hz CONHCH2)，3.34-3.28(4H，m，J＝5.61Hz CH2CH2ONH)，1.53(18H，s，CH3)。
并且，進(jìn)行上述化合物10的ESI-MS(正)測定，結(jié)果為m/z 542.4[(M+H)+]。由此可以確認(rèn)化合物10的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物10的分子量為C28H39N5O6541.29。
(9)化合物11的合成在5ml無水二甲基甲酰胺中溶解上述化合物9(333mg，847μmol)和二異丙基乙基胺(435ml，2.54mmol)、FDPP(1.00g，2.60mmol)，遮光下在氬氣氛圍氣中、0℃下攪拌30分鐘后，加入在11ml無水二甲基甲酰胺中溶解上述化合物10(1.15g，2.11mmol)的溶液，在室溫下攪拌20小時。減壓濃縮該反應(yīng)溶液，得到的濃縮殘渣用氯仿萃取，用10％的檸檬酸、飽和碳酸氫鈉水溶液平均清洗1次水、有機層，使用無水硫酸鎂作為干燥劑進(jìn)行干燥后，濾去干燥劑，進(jìn)行減壓濃縮。用分離硅膠色譜法(80g，氯仿∶甲醇＝10∶1)精制減壓濃縮得到的濃縮殘渣，得到白色固體化合物11(125mg，產(chǎn)率59％)。
對該化合物11進(jìn)行1H-NMR(400MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ8.18(1H，bs，NHCOPh)，7.86(2H，d，J＝8.4Hz，aromatic)，7.80(1H，bs，PhNHCO)，7.75-7.68(8H，m，NHCOPh，aromatic，PhNHCO)，7.54(1H，bs，PhNHCO)，7.48(2H，d，J＝8.4Hz，NHCOPh，aromatic)，7.42(5H，m，aromatic，NHCOPh)，7.34(2H，d，J＝8.8Hz，aromatic)，7.28(1H，bs，PhNHCO)，3.84(4H，bs，CONCH2)，3.62-3.48(20H，m，OCH2CH2O，NCH2CH2NH)，3.56(2H，t，J＝5.1Hz，N3CH2CH2)，3.43(2H，bs，OCH2CON)，3.35-3.30(4H，m，NCH2CH2NH)，3.26(2H，t，J＝5.1Hz，N3CH2)，3.13，2.98(4H，bs，bs，NCH2CH2NH)，1.52，1.50，1.49(36H，s，s，s，t-butyl)。
并且，進(jìn)行上述化合物11的ESI-MS(正)測定，結(jié)果為m/z 1461.72[(M+Na)+]。由此可以確認(rèn)化合物11的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物11的分子量為C70H98N14O191438.71。
(10)化合物12的合成在12ml甲醇中溶解上述化合物11(165mg，114μmol)，加入5％的Pd/C(55mg)，在氫氣氛圍氣中、室溫下攪拌5小時后，濾去上述Pd/C，減壓濃縮，用分離硅膠色譜法(10g，氯仿∶甲醇＝7∶1)精制得到的濃縮殘渣，得到白色固體化合物12(128mg，產(chǎn)率79％)。
對該化合物12進(jìn)行1H-NMR(400MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ7.78-7.68(8H，m，aromatic)，7.48(8H，m，aromatic)，4.21，4.10(4H，bs，bs，CONCH2)，3.85(2H，bs，OCH2CON)，3.62-3.44(26H，m，OCH2CH2O，NCH2CH2NH，NCH2CH2NH)，3.50(2H，t，J＝5.1Hz，H2NCH2CH2)，2.76(2H，t，J＝5.1Hz，H2NCH2CH)，1.50(36H，s，t-butyl)。
并且，進(jìn)行上述化合物12的ESI-MS(正)測定，結(jié)果為m/z 1413.74[(M+H)+]。另外，該化合物12的分子量為C70H100N12O191412.72。
該化合物12是具有上述通式(11)中n為4，p1、p2是1，m1、m2、m3、m4為2的結(jié)構(gòu)的胺化合物。
(11)化合物14的合成在2ml無水二甲基甲酰胺中溶解上述化合物13(硫辛酸)(3.4mg，16.6imol)和HOBt(1.6mg，16.6μmol)、EDC·HCl(3.2mg，1.66μmol)，在氬氣氛圍氣中、0℃下遮光攪拌。接著，加入在2ml無水二甲基甲酰胺中溶解上述化合物12(23.5mg，16.6μmol)的溶液，在室溫下攪拌22小時。減壓濃縮該反應(yīng)溶液，將得到的濃縮殘渣用二氯甲烷萃取，有機層用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉水溶液平均清洗1次。使用無水硫酸鈉作為干燥劑進(jìn)行干燥后，濾去干燥劑，進(jìn)行減壓濃縮。用分離硅膠色譜法(7g，氯仿∶甲醇＝10∶1)精制濃縮殘渣，得到白色固體化合物14(15.7mg，產(chǎn)率59％)。
對該化合物14進(jìn)行1H-NMR(400MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ8.20，8.00(4H，bs，bs，NHCOPh)，7.86(2H，d，J＝8.8Hz，aromatic)，7.77-7.72(7H，m，COPhNH，aromatic)，7.53(1H，bs，NHCOPh)，7.50-7.36(10H，m，aromatic，J＝8.8Hz，COPhNH)，7.27(2H，bs，COPhNH，CONHCH2)，3.89(4H，bs，CONCH2CO)，3.64-3.37(26H，m，NCH2CH2NH，NCH2CH2NH，OCH2CH2O，CONHCH2，CONHCH2CH2)，3.53(1H，m，SSCH)，3.48(2H，m，NCH2CH2NH)，3.32(4H，m，OCH2CON，NCH2CH2NH)，3.18，2.85(4H，bs，bs，NCH2CH2NH)，3.17-3.04(2H，m，CH2SSCH)，2.44-2.36(1H，m，CH2CH2SS)，2.16(2H，m，CH2CH2CH2CONH)，1.89-1.81(1H，m，CH2CH2SS)，1.69-1.56(4H，m，CH2CH2CH2CONH，CH2CH2CH2CH2CONH)，1.51，1.50(36H，s，s，t-butyl)，1.42-1.34(2H，m，CH2CH2CH2CONH)。
并且，進(jìn)行上述化合物14的ESI-MS(正)測定，結(jié)果為m/z 1601.81[(M+H)+]。由此可以確認(rèn)該化合物14的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物14的分子量為C78H112N12O20S21600.76。
(12)連接子化合物(化合物15)的合成在1ml二氯甲烷中溶解上述化合物14(60.3mg，31.2μmol)，加入TFA(3ml)，0℃下遮光攪拌1小時后，進(jìn)行減壓濃縮，將得到的殘渣溶解在甲醇中，注入填充了Dowex Marathon A(OH-形式)的柱(1.0cmΦ×3.0cm)，進(jìn)行離子交換。減壓濃縮排出液，得到白色固體化合物15(41.2mg，產(chǎn)率91％)。
對該化合物15進(jìn)行1H-NMR(400MHz，DMSO-d3)的測定，結(jié)果為δ8.19，8.05(4H，m，m，NHCOPh)，7.82(1H，bt，CONHCH)，7.53(8H，m，aromatic)，6.51(8H，dd，J＝8.4，1.5Hz，aromatic)，5.61-5.55(8H，m，NH2)，4.24，4.11(4H，s，s，CONCH2CO)，3.93(2H，bs，OCH2CON)，3.60-3.37(31H，m，NCH2CH2NH，NCH2CH2NH，OCH2CH2O，CONHCH2，CONHCH2CH2，SSCH)，3.19-3.06(4H，m，CONHCH2CH2，CH2SSCH)，2.42-2.32(1H，m，CH2CH2SS)，2.04(2H，m，CH2CH2CH2CONH)，1.87-1.78(1H，m，CH2CH2SS)，1.64-1.45(4H，m，CH2CH2CH2CONH，CH2CH2CH2CH2CONH)，1.34-1.28(2H，m，CH2CH2CH2CONH)。
并且，進(jìn)行上述化合物15的ESI-MS(正)測定，結(jié)果為m/z 623.27[(M+2Na)2+]。另外，該化合物15的分子量為C58H80N12O12S21200.55。
該化合物15是具有上述通式(2)中n為4，X用上述通式(3)表示，p1、p2是1，m1、m2、m3、m4為2的結(jié)構(gòu)的連接子化合物。
使用實施例1中得到的連接子化合物15，根據(jù)下面的順序合成具有用在上述通式(5)中n為4，p1、p2是1，m1、m2、m3、m4為2，R’為氫，R是用上述通式(12)表示的寡糖衍生的結(jié)構(gòu)的配體絡(luò)合物。圖2中示出了該合成的化學(xué)反應(yīng)式。
如圖2所示，使用實施例1中得到的連接子化合物15和用上述通式(12)表示的糖分子的化合物16(7當(dāng)量)，進(jìn)行還原胺化反應(yīng)。據(jù)此，得到產(chǎn)率為22％的本發(fā)明配體絡(luò)合物的一個例子化合物17。
具體的，在100ml水、400ml二甲基甲酰胺和10ml醋酸的混合溶劑中溶解上述連接子化合物15(2.0mg，1.67μmol)化合物16(10mg，11.7mmol)，遮光下，在封閉管中37℃加熱25小時。加入在15ml醋酸中溶解NaBH3CN(3.51mg，50.2mmol)的反應(yīng)溶液，在37℃下加熱6天后，減壓濃縮，使用Sephadex G-50(1.6cmΦ×80cm，在PBS中加入0.3M的NaCl溶液)精制。減壓濃縮由精制得到的目標(biāo)餾分，使用Sephadex G-25(1.6cmΦ×40cm，水)對濃縮殘渣脫鹽。減壓濃縮脫鹽得到的目標(biāo)餾分，溶解于水中，進(jìn)行冷凍干燥，得到白色粉末化合物17(1.7mg，產(chǎn)率22％)。
對該化合物17用實施例1記載的方法進(jìn)行1H-NMR(400MHz，D2O)的測定，結(jié)果為δ7.65-7.58(8H，m，aromatic)，6.78-6.67(8H，m，aromatic)，5.37(4H，bs，H-1”)，5.13(4H，bs，J＝2.5Hz)，4.52(4H，bs，H-5’)，4.29(10H，m，H-6a”，H-3’，CONCH2CO)，4.19(10H，m，H-6b”，H-2’，CONCH2H2CO)，4.05(3H，m，H-4’)，3.99-3.92(14H，m，H-2，H-6a，H-5”，OCH2CON)，3.87(8H，m，H-5，NCH2CH2NH)，3.83(8H，m，H-3，NCH2CH2NH)，3.77-3.70(8H，m，H-4，NCH2CH2NH)，3.71(4H，t，J＝9.9Hz，H-3”)，3.64-3.50(25H，m，H-6b，NCH2CH2NH，OCH2CH2O，CONHCH2，CONHCH2CH2，SSCH)，3.54(3H，s，OCH3)，3.45-3.19(14H，m，H-1a，H-1b，NCH2CH2NH，CH2SS)，3.34(4H，t，J＝9.6Hz，H-4”)，3.24(4H，dd，J＝3.4，10.5Hz，H-2”)，2.35-2.28(1H，m，CH2CH2SS)，2.27(2H，bt，CH2CH2CONHCH2)，1.89 1.84(1H，m，CH2CH2SS)，1.56 1.46(2H，m，CH2CH2CONH)，1.35-1.14(2H，m，CH2CH2(CH2)2CONH)。
并且，進(jìn)行上述化合物17的ESI-MS(負(fù))測定，結(jié)果為m/z 1449.93[(M-10Na+7H)3]。由此可以確認(rèn)化合物17的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物17的分子量為C134H196N16Na16O108S144572.48。
該化合物17是具有上述通式(5)中n為4，p1、p2是1，m1、m2、m3、m4為2，R’為氫，R用通式(6-3)表示的寡糖衍生的化合物結(jié)構(gòu)的配體絡(luò)合物。
本實施例中，使用實施例2中得到的，具有在上述通式(5)中n為4，p1、p2是1，m1、m2、m3、m4為2，R’為氫，R用通式(6-3)表示的寡糖衍生的化合物的結(jié)構(gòu)的配體絡(luò)合物(下面對于該配體絡(luò)合物記為“四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc”)，檢驗和蛋白質(zhì)的分子間相互作用。
本實施例中，為了比較，本發(fā)明人對于以前發(fā)現(xiàn)的其他兩種配體絡(luò)合物也進(jìn)行同樣的實驗，比較研究其相互作用。上述其他兩種配體絡(luò)合物具體是指上述專利文獻(xiàn)1中記載的配體絡(luò)合物，是下面通式(13)表示的配體絡(luò)合物。下面將該配體絡(luò)合物記為“單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc”。
并且，其他配體絡(luò)合物的另一種是特開2004-157108中記載的配體絡(luò)合物，是下面通式(14)表示的配體絡(luò)合物。下面對于該配體絡(luò)合物記為“三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc”。另外，上述特開2004-157108在本申請的優(yōu)先權(quán)日沒有公開。
[實施例3-1特異性的相互作用的確認(rèn)]首先，作為實施例3-1，為了確認(rèn)固定了上述通式(8)表示的二糖結(jié)構(gòu)(GlcNS6S-IdoA2S)的芯片和肝素結(jié)合性的蛋白質(zhì)的特異性的相互作用，進(jìn)行阻礙實驗。即，在用于阻礙肝素結(jié)合性蛋白質(zhì)和GlcNS6S-IdoA2S結(jié)構(gòu)的結(jié)合的抑制劑共存下，研究肝素結(jié)合性蛋白質(zhì)是否會結(jié)合到芯片上。
本實驗使用肝素(來自豬小腸，Mw＝17600)作為抑制劑，bFGF作為肝素結(jié)合性蛋白質(zhì)。抑制，bFGF，也稱為FGF-2，在血管內(nèi)皮細(xì)胞和纖維胚細(xì)胞中工作，通過發(fā)揮血管新生作用、促進(jìn)肉芽組織形成的作用來治愈創(chuàng)傷。在生物體內(nèi)和存在于細(xì)胞表面上的肝素類似物質(zhì)類肝素磺酸酯相互作用，發(fā)現(xiàn)有生物活性。和bFGF結(jié)合的必要的最小結(jié)合單位據(jù)報導(dǎo)是下述通式(15)表示的5糖(參考文獻(xiàn)M.Maccarana，B.Casu & U.Lindahl，J.Biol.Chem.268卷，8857頁，1993年)。
在上述結(jié)構(gòu)中，不含有葡糖胺的6位被硫酸化的結(jié)構(gòu)。但是，類肝素磺酸酯中的IdoA2S-GlcNS結(jié)構(gòu)和bFGF的締合中，可以確認(rèn)不特定多數(shù)的6位硫酸化不是必須的，這在活性部位的形成中是必須的。因此，為了觀測與GlcNS6S-IdoA2S結(jié)構(gòu)的相互作用，選擇bFGF作為蛋白質(zhì)。
接著，使用分別固定上述的單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc、三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc、四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片，進(jìn)行肝素共存下合bFGF結(jié)合的阻礙實驗。即，在200nM的bFGF溶液中改變肝素的濃度為3、10、100、300、1000nM進(jìn)行混合，注入到芯片中。
圖3中表示了bFGF結(jié)合到固定了單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片上的行為。從該圖可知，確認(rèn)了bFGF對固定了單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片的結(jié)合對肝素濃度的依賴性降低。即，確認(rèn)了bFGF對固定了單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片的結(jié)合不會因為肝素造成阻礙。
根據(jù)由上述實驗得到的3種芯片各自的數(shù)據(jù)可以計算出各芯片中bFGF結(jié)合的阻礙率。其結(jié)果示于圖4中。另外，上述阻礙率是用在不同濃度的肝素共存下的最大角度變化量與沒有肝素共存時的最大角度變化量的比值的百分率來表示的。
根據(jù)圖4所示的曲線圖，將bFGF對芯片的結(jié)合阻礙率的50％的地方定義為IC50。結(jié)果是固定了單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片的IC50＝2.5nM，固定了三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片的IC50＝94nM，固定了四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片的IC50＝71nM，固定了單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片的IC50值比其他兩種芯片的值低一個數(shù)量級，確認(rèn)其受到的肝素阻礙效果強。根據(jù)任何一種芯片其阻礙率都依賴于肝素的濃度而變化，可以得出結(jié)論這些芯片能對肝素結(jié)合性蛋白質(zhì)即bFGF特殊辨認(rèn)。
首先，將三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc或四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc與結(jié)合了沒有糖鏈的分子的連接子化合物(非糖鏈-連接結(jié)合化合物，下面稱為單-Glc)在溶液中混合，進(jìn)行向芯片的固定，對于由其混合比(試驗比)而引起的芯片上的配體硫酸化二糖的密度變化，采用ATR-FT-IR法來研究。溶液中的三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc或四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的比例在0、25、50、75、100％這些值內(nèi)變化。其結(jié)果示于圖5(a)、(b)中。圖5(a)是改變?nèi)芤褐械幕旌媳鹊娜?GlcNS6S-IdoA2S-Glc的全反射譜，圖5(b)是改變?nèi)芤褐械幕旌媳鹊乃?GlcNS6S-IdoA2S-Glc的全反射譜。
為了觀測波數(shù)(wavenumber)在1200-1303cm-1范圍內(nèi)來自硫酸基團(tuán)的S＝0的伸縮振動，使用該區(qū)域的吸光度曲線，通過多變量分析法進(jìn)行硫酸基團(tuán)的定量，以芯片上的硫酸基團(tuán)的相對強度對溶液中的配體絡(luò)合物的混合比作圖。其結(jié)果示于圖6(a)、(b)中。圖6(a)是表示芯片上的硫酸基團(tuán)的相對強度對溶液中的三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的混合比的曲線圖，圖6(b)是表示芯片上的硫酸基團(tuán)的相對強度對溶液中的四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的混合比的曲線圖。圖6(a)、(b)所示的一次曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.9993、0.9610，從而表示配體硫酸化二糖在芯片上的固定率(芯片表面的糖鏈密度)與任何溶液中的配體絡(luò)合物的存在比成比例。
接著研究芯片表面的配體即硫酸化二糖的相對密度對蛋白質(zhì)相互作用的影響。這里，進(jìn)行與來自人血漿的vWF(下面稱為h-vWF)的相互作用的分析。
將上述3種各配體絡(luò)合物(單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc、三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc、四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc)和單-Glc的混合比分別改變?yōu)?00/0和20/80，制備六種芯片，用SPR法觀察與h-vWF的相互作用。這里，說明根據(jù)SPR法測定的順序。
測定中，使用SPR670(日本激光電子有限公司制造)。并且，對感應(yīng)芯片，在13×20×0.7mm的玻璃基盤上氣體電鍍作為粘合層的2nm鉻，再在其上氣體電鍍50nm的金屬膜(日本激光電子有限公司制造)，使用該制品，放入UV臭氧清潔機(日本激光電子有限公司制造的NL-UV253)中用紫外線照射30分鐘，用臭氧清潔芯片表面。
接著將感應(yīng)芯片裝入專用的PTFE室(日本激光電子有限公司制造)后，在甲醇/水＝1/1的混合溶液(但是在單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc混合時為甲醇溶液)中溶解上述6種芯片(0.1mM)，取出50μl該溶液，加入PTFE室內(nèi)，用Parafilm封口膜密封。在室溫下、Bio Dancer(New Brunswick Scientific公司制造)上緩慢地整夜振蕩裝有該芯片的PTFE室。
用甲醇清洗該芯片6次，用水清洗1次后，在依次用甲醇、水清洗1次。風(fēng)干后，將其安裝在SPR670的感應(yīng)芯片彈筒里。用流動的緩沖液將芯片表面充分平衡化后，用激光照射金膜，觀察此時表面等離子體共振的角度變化。流動的緩沖液使用pH為7.4的等滲性磷酸緩沖溶液(PBS)。并且，SPR測定都在25℃下進(jìn)行。bFGF使用STRATHMANN BIOTEC AG公司制造的(Recombiant HumanFGF-基本型，MW；17000，LotNo.；471120)產(chǎn)品，h-vWF使用CALBIOCHEM公司制造的(von Willebrand Factor，Human Plasma，MW；270000(換算成單體單位)，Lot No.；B41632)。
進(jìn)行該SPR測定時，邊改變h-vWF的濃度為10、20、40、80、160nM，邊注入到各芯片上，觀測結(jié)合的相互作用，觀察h-vWF在芯片上的固定形態(tài)。此時，因為還沒有發(fā)現(xiàn)不使配體硫酸化二糖發(fā)生改性且能從芯片上完全解離h-vWF的解離劑，解離常數(shù)(KD)的計算要從芯片上的h-vWF的結(jié)合量來求得。h-vWF的結(jié)合量是以固定配體絡(luò)合物的狀態(tài)為基線，改變濃度后注入的h-vWF的感應(yīng)器(gram)的曲線大致一定時與基線的差作為結(jié)合量。
圖7(a)～(c)中表示上述3種各配體絡(luò)合物(單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc、三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc、四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc)和單-Glc的混合比為100/0時的結(jié)合相互作用。(a)是單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的情況，(b)是三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的情況，(c)是四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的情況。并且，圖8(a)～(c)中表示上述3種各配體絡(luò)合物(單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc、三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc、四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc)和單-Glc的混合比為20/80時的結(jié)合相互作用。(a)是單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的情況，(b)是三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的情況，(c)是四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的情況。
將該結(jié)果得到的結(jié)合量對h-vWF的濃度作圖，示于圖9(a)～(c)。(a)是單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的情況，(b)是三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的情況，(c)是四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的情況。圖9中也示出了由各圖的曲線計算出解離常數(shù)(KD)的結(jié)果。
如圖9(a)所示，使用固定了單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc＝100/0和單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc＝20/80的配體硫酸化二糖的芯片時，解離常數(shù)分別變?yōu)镵D＝35nM和41nM。如圖9(b)所示，使用固定了三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc＝100/0和三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc＝20/80的配體硫酸化二糖的芯片時，解離常數(shù)分別變?yōu)镵D＝27nM和24nM。進(jìn)而，使用固定了四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc＝100/0和四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc＝20/80的配體硫酸化二糖的芯片時，解離常數(shù)分別變?yōu)镵D＝32nM和35nM。
根據(jù)該結(jié)果，使用h-vWF作為分析體時，明顯看出改變配體糖鏈在芯片上的存在比對親合性幾乎沒有影響。并且，即使使用固定了糖鏈間距離不同的配體絡(luò)合物的芯片，和h-vWF的相互作用中糖鏈間距離之差對解離常數(shù)的值沒有影響。這認(rèn)為是因為h-vWF存在多聚體結(jié)構(gòu)，存在多個肝素結(jié)合性區(qū)域，受此影響解離速度顯著變慢，糖鏈間距離之差沒有反映到解離常數(shù)上。
接著，使用源自大腸桿菌的重組人-vWF部分蛋白質(zhì)(下面稱為rhvWF-Al)的話(該大腸桿菌只具有帶有1個肝素結(jié)合性區(qū)域的Al網(wǎng)絡(luò)部分)，對于芯片上的群集化糖鏈和蛋白質(zhì)之間的相互作用，認(rèn)為可以研究糖鏈間距離之差對糖鏈-糖鏈結(jié)合性蛋白質(zhì)間的相互作用的影響，從而進(jìn)行如下所述的實驗。rhvWF-Al根據(jù)文獻(xiàn)(M.A.Cruz，R.I.Handin & R.J.Wise，J.Biol.Chem.268卷，21238頁，1993年)來制備。
這里，作為配體絡(luò)合物使用上述的3種各配體絡(luò)合物(單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc、三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc、四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc)和單-Glc，改變上述3種配體絡(luò)合物/單-Glc的存在比分別為100/0、50/50，制備芯片并使用。改變rhvWF-Al濃度，測定與芯片的結(jié)合相互作用的結(jié)果示于圖10～圖12中。另外，圖10(a)是單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc＝100/0下制備芯片的情況，圖10(b)是單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc＝50/50下制備芯片的情況。圖11(a)是三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc＝100/0下制備芯片的情況，圖11(b)是三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc＝50/50下制備芯片的情況。圖12(a)是四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc＝100/0下制備芯片的情況，圖12(b)是四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/單-Glc＝50/50下制備芯片的情況。
根據(jù)這些結(jié)果計算出的解離常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合速度常數(shù)、解離速度常數(shù)匯總于表1中。另外，表1中解離常數(shù)KD(kd/ka)，結(jié)合常數(shù)KA(ka/kd)，結(jié)合速度常數(shù)ka，解離速度常數(shù)kd。


如表1所示，固定單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片和固定三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片相比，解離常數(shù)變大(KD＝2.6μM)。并且，相對減小芯片上的糖鏈固定密度的話解離常數(shù)的值變得更大(KD＝3.79μM)。另一方面，對固定三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片相對減小芯片上的固定密度時，發(fā)現(xiàn)解離常數(shù)的值增加了若干(KD＝1.20μM→1.50μM)。并且，固定了四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片即使改變芯片上的固定密度，解離常數(shù)幾乎不變(KD＝0.99μM→1.00μM)。
并且，如表1所示，固定了單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片相比固定了其他2個配體絡(luò)合物的芯片，確認(rèn)具有高1個數(shù)量級的解離速度常數(shù)(kd)。這認(rèn)為是因為三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc具有控制分子內(nèi)硫酸化寡糖鏈間距離的糖鏈群集，即使芯片上糖鏈的固定密度相對降低也難以受其影響。
換句話說，對于和rhvWF-Al的相互作用，固定了單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片如果降低芯片上糖鏈的相對固定密度的話，確認(rèn)其結(jié)合力會降低。與此相對，固定了三-GlcNS6S-IdoA2S-Glc和四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片即使降低芯片上糖鏈的相對固定密度，其結(jié)合力也沒有太大的變化。
根據(jù)以上的結(jié)果證明了對于硫酸化寡糖糖鏈-糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)間的相互作用，要增大結(jié)合力的話，像固定單-GlcNS6S-IdoA2S-Glc的芯片這樣，僅在芯片上以二維層面聚集具有類似配體絡(luò)合物結(jié)構(gòu)的硫酸化寡糖鏈?zhǔn)遣怀浞值?，必須具有如?GlcNS6S-IdoA2S-Glc和四-GlcNS6S-IdoA2S-Glc這樣的在分子水平上控制糖鏈間距離的群集結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的連接子化合物之一，即具有在上述通式(1)中，a是1，b是4，d是1，e是4，X用上述通式(4)表示，q1、q2、q3是2，r1、r2、r3、t1、t2、t3、u1、u2、u3是0的結(jié)構(gòu)的連接子化合物(化合物26)和具有在上述通式(7)表示的，a是1、b是4、d是1、e是4，q1、q2、q3是2，r1、r2、r3、t1、t2、t3、u1、u2、u3是0，R’是氫，R是通式(6-2)的結(jié)構(gòu)的連接子化合物(化合物27)用下面順序來合成。在圖13中示出了該連接子化合物(化合物26)的合成過程。另外，圖14中示出了由該連接子化合物(化合物26)合成配體絡(luò)合物(化合物27)的過程。另外，在本實施例4的說明中，各化合物附帶的編號和圖13和圖14中記載的編號相對應(yīng)。
1H-NMR譜的測定使用JOEL-Delta600分光光度計。化學(xué)位移在CDCl3時以四甲基硅烷(0.00ppm)作為基準(zhǔn)物質(zhì)，用δ值表示。在D2O時以DHO(4.65ppm)作基準(zhǔn)物質(zhì)，用δ值表示。重量分析使用PerSeptive BiosystemMarinerTM生物光譜測定工作站來測定。中壓硅膠柱色譜法使用硅膠60(Merck，0.040-0.063mm)來進(jìn)行。薄層色譜法使用預(yù)涂覆硅膠60F254(Merck，0.5mm)。全部試劑、脫水溶劑從關(guān)東化學(xué)有限公司制造的產(chǎn)品購入。
(1)N3-TEG-三價-(OtBU)3(化合物20)的合成(參見圖13)在20ml甲醇中溶解O2N-三價-(OtBU)3(化合物18)(757mg，1.70mmol)和氯化鎳六水合物(NiCl2·6H2O)(80.8mg，0.340mmol)，分5次添加當(dāng)量分的氫化硼鈉(322mg，8.50mmol)，在室溫下攪拌30分鐘。濃縮除去甲醇后，加入水和氯仿。用硅藻土過濾后，用氯仿萃取3次濾液。使用無水硫酸鈉干燥有機相后，濾去干燥劑，減壓濃縮。在10ml無水二甲基甲酰胺中溶解得到的濃縮殘渣(化合物19)和N3-TEG-COOH(化合物6)(441mg，1.70mmol)，在室溫下、氬氣氛圍氣中依次加入DIEA(592μl，3.40mmol)、HOAt(463mg，3.40mmol)、EDC·HCl(652mg，3.40mmol)，攪拌16小時。在反應(yīng)液中加入水后，用醋酸乙酯萃取3次水相。用飽和食鹽水清洗有機相，使用無水硫酸鎂干燥后，濾去干燥劑，進(jìn)行減壓濃縮。用硅膠柱色譜法(50g，氯仿∶丙酮＝50∶1)精制得到的濃縮殘渣，得到無色油狀物N3-TEG-三價-(OtBU)3(化合物20)。產(chǎn)量為839mg(73％)。
對該化合物20進(jìn)行1H-NMR譜(600MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ3.90(s，2H，-OCH2CONH-)，3.70-3.67(m，14H，-OCH2CH2O-×3，N3CH2CH2O)，3.39(t，2H，J＝4.8Hz，N3CH2CH2O)，2.21 2.18(m，6H，CH2CH2CO×3)，2.00-1.96(m，6H，-CH2CH2CO-×3)，1.43(s，27H，-CH3×9)。
進(jìn)行ESI-MS(正)測定，結(jié)果為m/z 697.45[(M+Na)+]。由此可以確認(rèn)化合物20的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物20的分子量為C32H58N4O11676.41。
(2)TEG-三價-(OtBUu)3(化合物22)的合成(參見圖13)在10ml甲醇中溶解上述化合物20(N3-TEG-三價-(OtBU)3)(837mg，1.24mmol)，加入10％的Pd/C(200mg)，在氫氣氛圍氣中、室溫下攪拌1.5小時。濾去上述Pd/C，減壓濃縮濾液。在10ml無水二甲基甲酰胺中溶解得到的濃縮殘渣(化合物21)和硫辛酸(385mg，1.87mmol)，在氬氣氛圍氣中、室溫下依次加入DIEA(325μl，1.87mmol)、HOAt(254mg，1.87mmol)、EDC·HCl(358mg，1.87mmol)，攪拌13小時。在反應(yīng)液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液后，用醋酸乙酯萃取3次水相。用飽和食鹽水清洗有機相，使用無水硫酸鎂干燥后，濾去干燥劑，進(jìn)行減壓濃縮。用硅膠柱色譜法(50g，氯仿∶甲醇＝30∶1)精制得到的濃縮殘渣，得到無色油狀物TEG-三價-(OtBu)3(化合物22)。產(chǎn)量為1.05g(99％)。
對該化合物22進(jìn)行1H-NMR譜(600MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為
δ3.91(s，2H，-OCH2CONH-)，3.70-3.54(m，13H，-OCH2CH2O-×3，CH2CH(CH2-)(S-))，3.55(t，2H，J＝5.5Hz，-CONHCH2CH2O-)，3.45(q，2H，J＝5.5Hz，-CONHCH2CH2O-)，3.20-3.16(m，1H，-SCH2(1H)-)，3.14-3.09(m，1H，-SCH2(1H)-)，2.49-2.43(m，1H，-SCH2CH2(1H)-)，2.22-2.17(m，8H，-CH2CH2CO-×3，-NHCOCH2CH2-)，2.00-1.96(m，6H，-CH2CH2CO-×3)，1.94-1.88(m，1H，-SCH2CH2(1H)-)，1.74-1.62(m 4H，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.52-1.41(m，2H，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.44(s，27H，-CH3×9)。
由此可以確認(rèn)化合物22的結(jié)構(gòu)。
(3)TEG-三價-(NHBoc)3(化合物25)的合成(參見圖13)在二氯甲烷/水(2.2ml，10/1)中溶解上述化合物22(TEG-三價-(OtBu)3)(500mg，0.587mmol)，在0℃下加入TFA(2ml)，在相同溫度下攪拌1小時。濃縮反應(yīng)溶液后，與甲苯共沸。將得到的濃縮殘渣(化合物23)和N-Boc-苯二胺(化合物24)(612mg，2.94mmol)溶解在無水二甲基甲酰胺(10ml)中，在氬氣氛圍氣中、室溫下依次加入DIEA(380μl，2.94mmol)、HOAt(400mg，2.94mmol)、EDC·HCl(563mg，2.94mmol)，攪拌19小時。在反應(yīng)溶液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液后，用AcOEt萃取3次水相。用飽和食鹽水清洗有機相，使用無水硫酸鎂干燥后，濾去干燥劑，進(jìn)行減壓濃縮。用硅膠柱色譜法(50g，氯仿∶丙酮＝3∶1)精制得到的濃縮殘渣，得到淡黃色油狀物TEG-三價-(NHBoc)3(化合物25)。產(chǎn)量為230mg(31％)。
對該化合物25進(jìn)行1H-NMR譜(600MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為
δ8.72(bs，3H，-NHCO-)，7.56(bs，3H，aromatic)，7.22-7.10(m，6H，aromatic)，6.91(bs，3H，-NHCO-)，3.85(s，2H，-OCH2CONH-)，3.67-3.57(m，9H，ethyleneglycol chain，CH2CH(CH2-)(S-))，3.55-3.47(m，6H，ethylene glycol chain，-CONHCH2CH2O-)，3.38(q，2H，J＝5.2Hz，-CONHCH2CH2O-)，3.14(ddd，1H，J＝5.5，6.9，12.4Hz，SCH2(1H))，3.08(ddd，1H，J＝6.9，6.9，12.4Hz，SCH2(1H)-)，2.43-2.35(m，7H，-CH2CH2CO-×3，-SCH2CH2(1H)-)，2.08(t，2H，J＝6.9Hz，-NHCOCH2CH2-)，2.17-2.12(m，6H，-CH2CH2CO-×3)，1.88-1.83(m，1H，-SCH2CH2(1H)-)，1.65-1.50(m 4H，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.50(s，27H，-CH3x9)，1.46-1.29(m，2H，-COCH2CH2CH2CH2-)。
由此可以確認(rèn)化合物25的結(jié)構(gòu)。
(4)配體絡(luò)合物TEG-三價-(Mal)3(化合物27)的合成(參見圖13和圖14)在二氯甲烷/水(4.4ml，10/1)中溶解上述化合物25(TEG-三價-(OtBu)3)(500mg，0.587mmol)，在0℃下加入TFA(2ml)，在相同溫度下攪拌1.5小時。濃縮反應(yīng)溶液后，與甲苯共沸。得到的濃縮殘渣(化合物26)不精制，在接下來的還原胺化反應(yīng)中使用。產(chǎn)量為252mg。
下面對圖14進(jìn)行說明。在二甲基乙酰胺/水(1∶1，600μl)中溶解得到的殘渣(化合物26)(12.1mg，8.88μmol)和麥芽糖(9.60mg，26.7μmol)，在37℃下放置7小時。在反應(yīng)液中加入醋酸(30μl)和氰基氫化硼鈉(5.58mg，88.8μmol)，在37℃下再放置70小時。冷凍干燥反應(yīng)液后，得到的殘渣用分離高速液體色譜法(ODS柱，甲醇/水＝50/50)精制。得到白色固體配體絡(luò)合物TEG-三價-(Mal)3(化合物27)。
對該化合物27進(jìn)行1H-NMR譜(600MHz，D2O)的測定，結(jié)果為δ7.02(dd，3H，J＝7.6，8.2Hz，aromatic)，6.72(s，3H，aromatic)，6.60(dd，3H，J＝1.4，7.6Hz，aromatic)，6.44(dd，3H，J＝1.4，8.2Hz，aromatic)，4.91(d，3H，J＝3.4Hz，H-1’×3)，3.82-3.73(m，8H，H-2×3，H-5×3，OCH2CONH-)，3.73-3.67(m，9H，H-3×3，H-5’×3，H-6a’×3)，3.65(dd，3H，J＝2.1，12.4Hz，H-6b’×3)，3.59(dd，3H，J＝4.8，12.4Hz，H-6a×3)，3.55(dd，3H，J＝5.5，6.2Hz，H-4×3)3.55(dd，3H，J＝9.6，9.6Hz，H-3’×3)，3.50-3.36(m，12H，-OCH2CH2O-×3)，3.45-3.40(m，3H，H-6b×3)，3.42-3.38(m，1H，CH2CH(CH2-)(S-))，3.38(dd，3H，J＝3.4，10.3Hz，H-2’×3)，3.40(t，2H，J＝5.5Hz，-CONHCH2CH2O-)，3.25(dd，3H，J＝9.6，9.6Hz，H 4’×3)，3.15 3.10(m，5H，CONHCH2CH2O，H 1a×3)，3.02(dd，J＝8.2，13.7Hz，H-1b×3)，3.01-2.97(m，1H，-SCH2(1H)-)，2.96-2.91(m，1H，-SCH2(1H)-)，2.29-2.25(m，6H，CH2CH2CO-×3)，2.26-2.19(m，1H，-SCH2CH2(1H)-)，2.05-1.98(m，6H，-CH2CH2CO-×3)，1.99(t，2H，J＝6.9Hz，-NHCOCH2CH2-)，1.74-1.69(m，1H，-SCH2CH2(1H)-)，1.50-1.30(m 4H，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.16-1.10(m，2H，-COCH2CH2CH2CH2-)。
進(jìn)行ESI-MS測定，結(jié)果為m/z為981.41[(M+2Na)2+]。由此可以確認(rèn)化合物27的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物27的分子量為C82H132N8O39S21916.80。
本發(fā)明的連接子化合物之一，即具有在上述通式(1)中，a是4，b是0，d是0，e是0，X用上述通式(4)表示，q1、q2、q3是2，r1、r2、r3是1，t1、t2、t3是4，u1、u2、u3是1的結(jié)構(gòu)的連接子化合物(化合物32)和具有在上述通式(7)表示的，a是4、b是0、d是0、e是0，q1、q2、q3是2，r1、r2、r3是1，t1、t2、t3是4，u1、u2、u3是1，R’是氫，R是通式(6-2)的結(jié)構(gòu)的配體絡(luò)合物(化合物34)用下面順序來合成。在圖15中示出了該連接子化合物(化合物32)的合成過程。圖16中示出了在合成上述連接子化合物(化合物32)過程中使用的化合物30的合成過程。并且，在圖17中示出了由該連接子化合物(化合物32)合成配體絡(luò)合物(化合物34)的過程。另外，在本實施例5的說明中，各化合物附帶的編號和圖15、圖16和圖17中記載的編號相對應(yīng)。
1H-NMR譜的測定使用JOEL-Delta600分光光度計?；瘜W(xué)位移在CDCl3時以四甲基硅烷(0.00ppm)作為基準(zhǔn)物質(zhì)，用δ值表示。在D2O時以DHO(4.65ppm)作基準(zhǔn)物質(zhì)，用δ值表示。重量分析使用PerSeptive BiosystemMarinerTM生物光譜測定工作站來測定。中壓硅膠柱色譜法使用硅膠60(Merck，0.040-0.063mm)來進(jìn)行。薄層色譜法使用預(yù)涂覆硅膠60F254(Merck，0.5mm)。全部試劑、脫水溶劑從關(guān)東化學(xué)有限公司制造的產(chǎn)品購入。
(1)三價-(OtBu)3(化合物28)的合成(參見圖15)在20ml甲醇中溶解O2N-三價-(OtBu)3(化合物18)(757mg，1.70mmol)和NiCl2·6H2O(80.8mg，0.340mmol)，在0℃下分5次添加當(dāng)量分的氫化硼鈉(322mg，8.50mmol)，然后在室溫下攪拌反應(yīng)液30分鐘。濃縮除去甲醇后，在反應(yīng)溶液中加入水和氯仿。用硅藻土過濾后，用氯仿萃取3次水相。使用無水硫酸鈉干燥有機相后，濾去干燥劑，減壓濃縮。在10ml無水二甲基甲酰胺中溶解得到的濃縮殘渣(化合物19)和硫辛酸(351mg，1.70mmol)，在室溫下、氬氣氛圍氣中依次加入DIEA(592μl，3.40mmol)、HOAt(463mg，3.40mmol)、EDC·HCl(652mg，3.40mmol)，攪拌16小時。在反應(yīng)溶液中加入水后，用醋酸乙酯萃取3次水相。用飽和食鹽水和飽和碳酸氫鈉水溶液清洗有機相，使用無水硫酸鎂干燥后，濾去干燥劑，進(jìn)行減壓濃縮。用硅膠柱色譜法(50g，己烷∶醋酸乙酯＝3∶1)精制得到的濃縮殘渣，得到淡黃色油狀物三價-(OtBu)3(化合物28)。產(chǎn)量為750mg(73％)。
對該化合物28進(jìn)行1H-NMR譜(600MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ5.91(s，1H，-CONH-)，3.57(ddd，1H，J＝6.2，6.2，12.4Hz，CH2CH(CH2-)(S-))，3.18(ddd，1H，J＝5.5，5.5，12.4Hz，-SCH2(1H)-)，3.11(ddd，1H，J＝6.9，7.6，12.4Hz，-SCH2(1H)-)，2.46(ddd，1H，J＝6.2，6.2，12.4Hz，-SCH2CH2(1H)-)，2.22(t，8H，J＝7.6Hz，-CH2CH2CO-×3)，2.11(dd，2H，J＝6.9，7.6Hz，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.97(t，6H，J＝7.6Hz，-CH2CH2CO-×3)，1.91(ddd，1H，J＝6.9，6.9，12.4Hz-SCH2CH2(1H)-)，1.74-1.57(m 4H，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.51-1.38(m，2H，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.43(s，27H，-CH3×9)。
并且進(jìn)行13C-NMR(150MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ172.9、172.1、80.7、57.3、56.3、40.2、38.5、37.2、34.6、30.0、29.8、28.9、28.1、25.3。由此可以確認(rèn)化合物28的結(jié)構(gòu)。
(2)N3-TEG-NHBoc(化合物33)的合成(參見圖16)在6ml1，4-二噁烷中溶解N3-TEG-CO2Et(化合物5)(500mg，1.64mmol)，在0℃下反應(yīng)液中加入氫氧化鈉水溶液(1ml，150mg/ml)，在相同溫度下攪拌3小時。濃縮除去1，4-二噁烷后，加入5％的硫酸氫鉀水溶液和氯仿。用氯仿萃取3次水相，使用無水硫酸鈉干燥有機相后，濾去干燥劑，進(jìn)行減壓濃縮。得到的殘渣(化合物6)不精制，在接下來的偶聯(lián)反應(yīng)中使用。產(chǎn)量為435mg(96％)。在無水二甲基甲酰胺中溶解得到的濃縮殘渣和N-Boc-苯二胺(化合物24)(327mg，1.57mmol)，在氬氣氛圍氣中、室溫下依次加入DIEA(410μl，2.35mmol)、HOAt(320mg，2.35mmol)、EDC·HCl(451mg，2.35mmol)，攪拌14小時。在反應(yīng)溶液中加入水后，用醋酸乙酯萃取3次水相。用飽和食鹽水和飽和碳酸氫鈉水溶液清洗有機相，使用無水硫酸鎂干燥后，濾去干燥劑，進(jìn)行減壓濃縮。用硅膠柱色譜法(50g，甲苯∶醋酸乙酯＝1∶1)精制得到的濃縮殘渣，得到淡黃色油狀物N3-TEG-NHBoc(化合物33)。產(chǎn)量為597mg(81％)。
對該化合物33進(jìn)行1H-NMR譜(600MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為
δ8.81(bs，1H，-NHCO-)，7.61(s，1H，aromatic)，7.35(d，1H，J＝6.9Hz，aromatic)，7.26-7.20(m，2H，aromatic)，6.71(bs，1H，-NHCO-)，4.10(s，2H，-OCH2CONH-)，3.78-3.70(m，8H，ethyleneglycol chain)，3.67-3.62(m，6H，ethyleneglycol chain，-CONHCH2CH2O-)，3.35(t，2H，J＝5.5Hz，-CONHCH2CH2O-)并且進(jìn)行13C-NMR(150MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ168.3、152.6、139.0、138.0、129.5、114.5、114.3、109.8、80.5、71.2、70.6、70.6、70.6、70.5、70.4、70.2、70.0、50.6、28.3。由此可以確認(rèn)化合物33的結(jié)構(gòu)。
(3)H2N-TEG-NHBoc(化合物30)的合成(參見圖16)在4ml甲醇中溶解上述化合物33(N3-TEG-NHBoc)(200mg，0.425mmol)，加入10％的Pd/C(200mg)，在氫氣氛圍氣中、室溫下攪拌1.5小時。濾去上述Pd/C后，減壓濃縮。得到的殘渣(化合物30)不精制，使用在接下來的反應(yīng)中。產(chǎn)量為174mg(93％)。
(4)三價-(TEG-NHBoc)3(化合物31)的合成(參見圖15)在二氯甲烷/水(2.2ml，10/1)中溶解上述化合物28(三價-(OtBu)3)(64.2mg，0.106mmol)，在0℃下加入TFA(2ml)，在相同溫度下攪拌1小時。濃縮反應(yīng)液后，與甲苯共沸。在3ml無水二甲基甲酰胺中溶解得到的濃縮殘渣(化合物29)和H2N-TEG-NHBoc(化合物30)(174mg，0.425mmol)，在氬氣氛圍氣中、室溫下依次加入DIEA(92.6μl，0.532mmol)、HOAt(72.3mg，0.532mmol)、EDC·HCl(102mg，0.532mmol)，攪拌14小時。在反應(yīng)溶液中加入水后，用醋酸乙酯萃取3次水相。用飽和食鹽水清洗有機相，使用無水硫酸鎂干燥后，濾去干燥劑，進(jìn)行減壓濃縮。用硅膠柱色譜法(50g，氯仿∶甲醇＝30∶1)精制得到的濃縮殘渣，得到淡黃色油狀物三價-(TEG-NHBoc)3(化合物31)。產(chǎn)量為64.7mg(36％)。
對該化合物31進(jìn)行1H-NMR譜(600MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為
δ8.88(bs，3H，-NHCO-×3)，7.67(bs，3H，aromatic)，7.42(bs，3H，-NHCO-×3)，7.31(d，3H，J＝7.7Hz，aromatic)，7.27(d，3H，J＝8.2Hz，aromatic)，7.22(dd，3H，J＝7.7，8.2Hz，aromatic)，6.63(bt，3H，J＝4.8Hz，-NHCO-×3)，4.11(s，6H，-OCH2CONH-×3)，3.78-3.58(m，36H，ethylene glycol chain)，3.57-3.49(m，1H，CH2CH(CH2-)(S-))，3.50(t，6H，J＝5.5Hz，-CONHCH2CH2O-×3)，3.36(q，6H，J＝5.2Hz，-CONHCH2CH2O-×3)，3.15(ddd，1H，J＝5.5，6.9，11.0Hz，-SCH2(1H)-)，3.09(ddd，1H，J＝6.9，6.9，11.0Hz，-SCH2(1H)-)，2.42(ddd，1H，J＝6.9，6.9，12.4Hz，-SCH2CH2(1H)-)，2.12-2.06(m，8H，-CH2CH2CO-×3，-NHCOCH2CH2CH2-)，1.95-1.88(m，6H，-CH2CH2CO-×3)，1.87(ddd，1H，J＝6.9，6.9，12.4Hz，-SCH2CH2(1H)-)，1.70-1.50(m 4H，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.50(s，27H，-CH3×9)，1.48-1.33(m，2H，COCH2CH2CH2CH2-)。
并且進(jìn)行13C-NMR(150MHz，CDCl3)的測定，結(jié)果為δ173.3、172.8、168.4、152.8、139.3、137.8、129.3、114.5、114.4、110.1、80.2、71.1、70.5、70.4、70.4、70.3、70.1、70.1、69.7、57.3、56.4、40.1、39.2、38.3、37.0、34.5、31.1、30.5、28.8、28.3、25.4。并且進(jìn)行ESI-MS測定，結(jié)果為m/z為875.41[(M+2Na)2+]。由此可以確認(rèn)化合物31的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物31的分子量為C81H128N10O25S21704.85。
(5)配體絡(luò)合物三價-(TEG-Mal)3(化合物34)的合成(參見圖16和圖17)在二氯甲烷/水(2.2ml，10/1)中溶解上述化合物31(三價-(TEG-NHBoc)3)(64.7mg，37.9μmol)，在0℃下加入TFA(2ml)，在相同溫度下攪拌2.5小時。濃縮反應(yīng)液后，與甲苯共沸。得到的殘渣(化合物32)不精制，用在接下來的還原胺化反應(yīng)中。產(chǎn)量為70mg。
下面對圖17進(jìn)行說明。在二甲基乙酰胺/水(1∶1，400μl)中溶解得到的殘渣(化合物32)(含有6.95mg，3.77μmol)和麥芽糖(4.07mg，11.3μmol)，在37℃下放置13小時。然后在反應(yīng)液中加入醋酸(20μl)和氰基氫化硼鈉(2.24mg，35.6μmol)，在37℃下放置59小時。冷凍干燥反應(yīng)液后，得到的殘渣用分離高速液體色譜法(ODS柱，甲醇/水＝50/50)精制，得到白色固體三價-(TEG-Mal)3(化合物34)。產(chǎn)量為4.46mg(50％)。
對該化合物34進(jìn)行1H-NMR譜(600MHz，D2O)的測定，結(jié)果為δ7.05(dd，3H，J＝7.6，8.2Hz，aromatic)，6.77(s，3H，aromatic)，6.63(dd，3H，J＝1.4，7.6Hz，aromatic)，6.47(dd，3H，J＝1.4，8.2Hz，aromatic)，4.92(d，3H，J＝3.4Hz，H-1’×3)，4.01(s，6H，-OCH2CONH-×3)，3.81(ddd，3H，J＝2.1，4.8，7.6Hz，H-2×3)，3.71(ddd，3H，J＝4.1，7.6Hz，H-5×3)，3.74-3.68(m，9H，H-3×3，H-5’×3，H-6a’×3)，3.65(dd，3H，J＝2.1，12.4Hz，H-6b’×3)，3.64-3.60(m，3H，H-6a×3)，3.64-3.42(m，36H，-OCH2CH2O-×9)，3.56-3.52(m，6H，H-4×3，H-3’×3)，3.47-3.43(m，3H，H-6b×3)，3.42-3.39(m，1H，CH2CH(CH2-)(S-))，3.38(dd，3H，J＝3.4，9.6Hz，H-2’×3)，3.37(t，6H，J＝4.8Hz，-CONHCH2CH2O-×3)，3.26(dd，3H，J＝9.6，9.6Hz，H-4’×3)，3.15(dd，3H，J＝4.8，13.7Hz，H 1a×3)，3.14(t，6H，CONHCH2CH2O×3)，3.06(dd，J＝7.6，13.7Hz，H-1b×3)，3.01(ddd，1H，J＝6.2，6.2，11.0Hz，-SCH(1H)-)，2.95(ddd，1H，J＝6.9，6.9，11.0Hz，-SCH2(1H)-)，2.24(ddd，1H，J＝6.2，6.2，12.4Hz，-SCH2CH2(1H)-)，2.00(t，2H，J＝6.9Hz，-NHCOCH2CH2-)，1.96-1.92(m，6H，CH2CH2CO-×3)，1.77-1.69(m，7H，-CH2CH2CO-×3，-SCH2CH2(1H)-)，1.52-1.32(m 4H，COCH2CH2CH2CH2-)，1.20-1.14(m，2H，-COCH2CH2CH2CH2-)。
還進(jìn)行ESI-MS測定，結(jié)果為m/z為1214.57[(M+2Na)2+]。由此可以確認(rèn)化合物34的結(jié)構(gòu)。另外，該化合物34的分子量為C102H170N10O49S22283.06。
另外，為了實施發(fā)明的最佳形態(tài)乃至具體實施方式
或?qū)嵤├苁贡景l(fā)明的技術(shù)內(nèi)容可以完全清楚明白，但是不應(yīng)當(dāng)僅限于這些具體例子來進(jìn)行狹義的解釋，在本發(fā)明精神和下面記載的權(quán)利要求范圍內(nèi)，可以進(jìn)行各種變化來實施。
工業(yè)實用性如上所述，本發(fā)明的連接子化合物具有芳香族氨基末端來作為可以導(dǎo)入3單位以上糖分子的位置。并且，作為在表面等離子體共振(SPR)的感應(yīng)芯片和親和色譜法的載體等蛋白質(zhì)分析用載體上可以結(jié)合的部位有S-S鍵。進(jìn)而，要極力抑制非特殊疏水性相互作用，且能容易地調(diào)整提供到金屬鍵上的二硫基團(tuán)的長度，要在二硫基團(tuán)和芳香族基團(tuán)之間具有寡環(huán)氧乙烷。
因而，通過使用上述連接子化合物，可以起到所謂的在上述載體表面上再現(xiàn)性好地以二維序列3單位以上的糖分子的效果。并且，上述連接子化合物因為可以幾乎無視和蛋白質(zhì)的非特殊相互作用的影響，在觀測糖分子和蛋白質(zhì)相互作用時，可以再現(xiàn)性好地評價糖分子的生物活性。進(jìn)而，可以有效率地形成金屬-硫鍵。
并且，本發(fā)明的配體絡(luò)合物是在上述連接子化合物中導(dǎo)入糖分子的制品。
因而，通過在蛋白質(zhì)分析用的載體表面上導(dǎo)入上述配體絡(luò)合物，可以再現(xiàn)性好地二維序列多個糖分子，因而能起到所謂的再現(xiàn)性好地評價糖分子的生物活性的效果。進(jìn)而，可以起到有效率地形成金屬-硫鍵的效果。
根據(jù)本發(fā)明，可以能控制感應(yīng)芯片表面上的糖鏈間距離，并且再現(xiàn)性好地二維序列寡糖而獲得連接子化合物，并且可以在該連接子化合物中導(dǎo)入糖分子而獲得配體絡(luò)合物。該連接子化合物和配體絡(luò)合物對于寡糖鏈芯片的實用化和普及非常有用。
固定寡糖鏈的芯片如果作為糖鏈和蛋白質(zhì)的功能分析的工具來發(fā)展的話，不僅對闡明與寡糖鏈有關(guān)的生命現(xiàn)象有貢獻(xiàn)，而且可期待能成為醫(yī)藥品開發(fā)中的重要技術(shù)。因而，本發(fā)明認(rèn)為具有高度有用性。
權(quán)利要求
1.一種連接子化合物，其特征在于具有通式(1) (式中，a、b、d、e分別獨立地是0以上、6以下的整數(shù))表示的結(jié)構(gòu)，上述X具有包含3個鏈以上的多分枝結(jié)構(gòu)，該鏈?zhǔn)怯煽梢栽谀┒司哂蟹枷阕灏被?，同時在主鏈上具有碳-氮鍵的烴衍生的鏈。
2.如權(quán)利要求1所述的連接子化合物，其特征在于具有通式(2) (式中，n是1以上、6以下的整數(shù))表示的結(jié)構(gòu)，上述X具有包含3個鏈以上的多分枝結(jié)構(gòu)，該鏈?zhǔn)怯煽梢栽谀┒司哂蟹枷阕灏被瑫r在主鏈上具有碳-氮鍵的烴衍生的鏈。
3.如權(quán)利要求1或2所述的連接子化合物，其特征在于上述X具有通式(3) (式中，m1、m2、m3、m4、p1、p2分別獨立地是1以上、6以下的整數(shù))表示的結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求1或2所述的連接子化合物，其特征在于上述X具有通式(4) (式中，q1、q2、q3、r1、r2、r3、t1、t2、t3、u1、u2、u3分別獨立地是0以上、6以下的整數(shù))表示的結(jié)構(gòu)。
5.一種配體絡(luò)合物，其特征在于是通過在權(quán)利要求1～4的任何一項中所述的連接子化合物的芳香族氨基上導(dǎo)入糖分子得到的。
6.一種配體絡(luò)合物，其特征在于具有通式(5) (式中，m1、m2、m3、m4、n、p1、p2分別獨立地是1以上、6以下的整數(shù)。R’是氫(H)或R。)表示的結(jié)構(gòu)，其中，上式R是選自式(6-1)～式(6-6) 的源于寡糖的化合物。
7.一種配體絡(luò)合物，其特征在于具有通式(7) (式中，a、b、d、e、q1、q2、q3、r1、r2、r3、t1、t2、t3、u1、u2、u3分別獨立地是0以上、6以下的整數(shù)。并且b是0時t1、t2和t3不是0，t1、t2和t3是0時b不是0。并且R’是氫(H)或R。)表示的結(jié)構(gòu)，其中，上式R是選自式(6-1)～式(6-6) 的源于寡糖的化合物。
8.如權(quán)利要求1～4的任何一項中所述的連接子化合物的制備方法，其特征在于包括使硫辛酸和具有用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)芳香族氨基末端的3個以上支鏈的胺化合物進(jìn)行縮合反應(yīng)的步驟，以及使上述芳香族氨基末端的保護(hù)基團(tuán)脫保護(hù)的步驟。
9.一種配體絡(luò)合物的制備方法，其特征在于使用權(quán)利要求1～4的任何一項所述的連接子化合物和糖分子進(jìn)行還原胺化反應(yīng)。
10.如權(quán)利要求9所述的配體絡(luò)合物的制備方法，其特征在于作為上述糖分子，使用通式(8) 表示的具有肝素部分二糖結(jié)構(gòu)的硫酸鹽化寡糖。
11.如權(quán)利要求9所述的配體絡(luò)合物的制備方法，其特征在于作為上述糖分子，使用選自組(9)中 的寡糖的至少一種。
12.一種糖分子的導(dǎo)入方法，其特征在于是在載體表面上排列的糖分子的導(dǎo)入方法，其通過將含有權(quán)利要求5～7的任何一項記載的配體絡(luò)合物的溶液和表面上具有金屬的載體接觸。
13.一種配位基載體，其特征在于是通過將權(quán)利要求5～7的任何一項所述的配體絡(luò)合物固定在表面上具有金屬的載體上來制備的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的連接子化合物，其能極力抑制非特殊的疏水性相互作用，且可以容易調(diào)整提供金屬鍵的二硫基的長度，從而有效率地形成金屬－硫鍵，以及新的配體絡(luò)合物、配體載體和它們的制備方法。連接子化合物具有上述通式(1)(式中，a、b、d、e分別獨立地是0以上6以下的整數(shù))表示結(jié)構(gòu)。上述X具有包含3個以上烴衍生鏈的多分枝結(jié)構(gòu)部位的結(jié)構(gòu)，該烴衍生鏈在末端具有芳香族氨基同時在主鏈上可以具有碳－氮鍵。并且，配體絡(luò)合物是在上述連接子化合物中導(dǎo)入糖分子的制品。
文檔編號G01N33/53GK1918143SQ20058000411
公開日2007年2月21日 申請日期2005年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月5日
發(fā)明者隅田泰生, 荒野明男, 楠本正一, 麥克·索伯, 若尾雅廣 申請人:獨立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機構(gòu), 國立大學(xué)法人鹿兒島大學(xué)