專利名稱：一種生產(chǎn)生物油脂和生物柴油的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物能源領域，具體地說是一種生產(chǎn)生物油脂和生物柴油的方法，以海洋灘涂植物大米草作為原料，采用酵母工程菌將大米草分步糖化發(fā)酵的方法，把海灘的有害植物材料變?yōu)樯锬茉?柴油和油脂，是一種變廢為寶和環(huán)境保護相結(jié)合具有重大的經(jīng)濟和社會效益的新工藝技術(shù)。
背景技術(shù)：
大米草(S.anglica)，英文名common cordgrass，是互花米草(S.alterniflora)和狐米草(S.patens)的雜交種，原產(chǎn)英國南海岸，大米草株高20～50cm，最高的可達100cm。根系發(fā)達，基部腋芽可長出新蘗和地上莖，蔓延生長，耐鹽、耐淹性強，能在其他植物不能生長的海灘中潮帶生長。早期，大米草被宣傳報道為可抗較大風浪，具有促淤造陸，保護海堤，提高海灘土壤肥力的作用的先鋒植物和優(yōu)良的牧草飼料。于是全球各地都開始大規(guī)模引種，致使大米草在全球范圍迅速蔓延，現(xiàn)已變?yōu)橐环N全球性草害[劉建，黃建華.謹慎引進植物警惕負面影響.植物保護，2002，28(4)51～53.秦衛(wèi)華，王智，蔣明康.互花米草對長江口兩個濕地自然保護區(qū)的入侵.雜草科學，2004，415～16.]我國的大米草是于1963年從英國引進，至今已有40余年的歷史。首先在江蘇海濱試種，用于沿海護堤和改良土壤，同時生產(chǎn)飼料和造紙原料。到1981年底我國南起廣西合浦縣北至遼寧錦西縣共有3.6萬hm2大米草。近年來，大米草在福建、廣東、江蘇、山東等沿海地區(qū)瘋狂擴散，其覆蓋面積越來越大，已經(jīng)到了難以控制的局面，嚴重影響沿海的養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此給我國的沿海經(jīng)濟和生態(tài)帶來了嚴重問題。大米草嚴重威脅我國海岸生態(tài)安全，現(xiàn)已屬國家公布的第一批16種外來入侵物種。
隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展和世界人口的激增，能源危機日趨加劇。目前，世界各國紛紛展開新能源，特別是可再生生物能源的研究與開發(fā)。生物柴油是最重要的可再生能源產(chǎn)品之一，其化學成分主要是長鏈脂肪酸的低碳酯。國內(nèi)外有關(guān)以稻草、秸稈為主的木質(zhì)纖維素原料水解成可發(fā)酵糖，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂和生物柴油、生物乙醇等。而以大米草為原料的尚未見報道，大米草的主要成分纖維素半纖維素約占60％，可作為一種生產(chǎn)生物柴油的豐富資源，同時對這種具有災害性的入侵物種的利用能起到變廢為寶和保護環(huán)境的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種有效的、水解時間短、糖化發(fā)酵效率高的利用大米草分步糖化發(fā)酵生產(chǎn)生物油脂和生物柴油的方法。
方法原理大米草主要是由纖維素、半纖維素組成，約占生物質(zhì)干重的60％～70％。木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)較復雜，細胞壁中的半纖維素和木質(zhì)素通過共價鍵聯(lián)結(jié)成網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，纖維素鑲嵌其中。在酸作用下半纖維素非常容易被水解成五碳糖，纖維素的晶體結(jié)構(gòu)被破壞進一步糖苷鍵斷裂水解成六碳糖及其他可發(fā)酵糖。而產(chǎn)油微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基(大米草水解液)中碳源充足而某些營養(yǎng)成分(特別是氮源)缺乏時，菌體細胞分裂速度銳減，代謝活動轉(zhuǎn)為以消耗碳源并以合成和積累油脂為主。在油脂積累期，微生物基本上不再進行細胞繁殖，而是將過量的碳水化合物轉(zhuǎn)化為油脂。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種生產(chǎn)生物油脂和生物柴油的方法，以海洋灘涂植物大米草為原料，采用酵母工程菌將大米草分步糖化發(fā)酵生產(chǎn)生物油脂和生物柴油。
具體過程如下1)糖化過程在濃酸低溫常壓下大米草中的纖維素、半纖維素水解成五、六碳糖及其它可發(fā)酵糖。
將經(jīng)干燥、粉碎后的大米草于無機濃酸水溶液中在恒溫水浴、機械攪拌條件下水解；反應完畢加水稀釋后用堿液中和至中性，再用循環(huán)水式真空泵抽濾抽濾進行固液分離，或用濃H3PO4回調(diào)pH至6.0，抽濾去Ca3(PO4)2沉淀；然后用蒽酮法測定水解液中可溶性總糖的含量，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮水解液備用；具體為，A.將大米草經(jīng)過清洗、切短、烘干、粉碎并過篩獲得20～60目顆粒；B.按照固形物的重量含量為5～12.5％加入重量濃度10～80％的無機濃酸(如硫酸)，40～120℃水解1～4小時；力求在最佳水解條件下得最大的糖產(chǎn)率；C.水解液用堿調(diào)至中性，進行固液分離，濾液濃縮作為微生物發(fā)酵液于4℃冷藏備用。
2)發(fā)酵過程以10％的重量接種量將產(chǎn)油酵母的液體種子培養(yǎng)液接種于經(jīng)110～121℃滅菌后的大米草水解液中，于28℃～30℃、180～200r/min的條件下，搖床培養(yǎng)48～96小時；發(fā)酵結(jié)束后測定菌體的生物量、油脂量和殘?zhí)?；具體為，A.將新鮮斜面上長好的產(chǎn)油菌株接種于液體種子培養(yǎng)基中，于28℃～30℃、180～200r/min搖床培養(yǎng)20～48小時；B.以10％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(經(jīng)110～121℃滅菌后的大米草水解液)中，在相同的條件下?lián)u床培養(yǎng)48～96小時；(此發(fā)酵條件對后期油脂的形成起到關(guān)鍵作用)
C.發(fā)酵結(jié)束后測定菌體的生物量、油脂量和殘?zhí)?；或用索氏脂肪測定儀測定每株菌發(fā)酵后相應干重的含油量，然后計算得出產(chǎn)油率。
3)菌體和油脂分離，得生物油脂；生物油脂進行轉(zhuǎn)酯化便可得到生物柴油。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.工藝簡單。本發(fā)明從大米草分步糖化發(fā)酵的角度出發(fā)，以無機酸(如硫酸)對大米草中的纖維素、半纖維素進行水解，再利用產(chǎn)油微生物發(fā)酵將碳水化合物轉(zhuǎn)化為油脂；實現(xiàn)了大米草分步糖化發(fā)酵生產(chǎn)生物油脂和生物柴油的過程。
2.糖化率高，糖的回收率和利用率高。本發(fā)明選用購買的圓紅冬孢酵母產(chǎn)油菌株進行搖瓶發(fā)酵實驗，能較好地利用大米草水解液里的主要單糖(葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)轉(zhuǎn)化為油脂貯存在體內(nèi)，菌體油脂含量高達47.9％；發(fā)酵結(jié)束得到油脂，油脂經(jīng)轉(zhuǎn)酯化就可得到柴油的主要成分；以10％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)96小時，發(fā)酵結(jié)束得到7.75％生物柴油(按大米草原料干基計算)。
3.生產(chǎn)成本低，經(jīng)濟效益好。本發(fā)明是一種由海洋灘涂植物大米草經(jīng)酸水解產(chǎn)糖后利用微生物中的酵母工程菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化為油脂或柴油的新工藝，該工藝產(chǎn)油率高、轉(zhuǎn)化快，在變廢為寶和環(huán)境保護等方面具有廣闊的應用前景。
4.社會效益顯著。本發(fā)明方法對大米草濃酸水解提取可發(fā)酵糖，并通過產(chǎn)油微生物發(fā)酵將碳水化合物轉(zhuǎn)化為油脂，再進行轉(zhuǎn)酯化變可得生物柴油，能緩解化石燃料短缺所帶來的能源危機。


圖1為本發(fā)明用大米草分步糖化發(fā)酵生產(chǎn)生物油脂和生物柴油的工藝流程圖。
具體實施例方式
實施例1原料大米草于2005年9月底采集于江蘇沿海，其主要成分含量為半纖維素23.28％，纖維素35.18％。
1)將大米草清洗、切短、烘干、粉碎并過篩取小于20目的部分；按照固液比1∶10的比例(質(zhì)量∶體積)加入重量濃度60％的硫酸，50℃水浴并攪拌1小時；2)反應完畢后將其用水稀釋，并加入適量的Ca(OH)2調(diào)至中性，進行固液分離，采用蒽酮比色法測可溶性總糖含量；3)將所得到的濾液濃縮作為微生物發(fā)酵液；4)將新鮮斜面上長好的產(chǎn)油菌株接種于液體種子培養(yǎng)基中，于28℃、180r/min搖床培養(yǎng)20～24小時；以(固體為重量、液體為體積的固液比)10％接種量接種于微生物發(fā)酵液(經(jīng)121℃滅菌后的大米草水解液)中，在相同的條件下?lián)u床培養(yǎng)96小時；所述產(chǎn)油菌株為圓紅冬孢酵母As2.1389，購自中國普通微生物菌種保藏中心；(其中As2.1389是1992年中國微生物菌種保藏管理委員會主編的微生物菌種資料中的編號，該資料在2003年又出了增刊改名為中國普通微生物菌種保藏中心)培養(yǎng)基a)菌種保藏培養(yǎng)基(1L)酵母粉2～14g，胰蛋白胨10～20g，瓊脂粉16～30g；b)YEPD培養(yǎng)基(g/L)組成葡萄糖10～30，酵母粉5～16，蛋白胨8～15，pH5.8～6.0；固體培養(yǎng)基在YEPD基礎上加入15g瓊脂粉；液體種子培養(yǎng)基(g/L)組成葡萄糖16～28，(NH4)2SO42～8，酵母粉0.1～0.6，KH2PO40.5～3，MgSO4·7H2O0.1～0.6，pH5.8～6.0；限氮發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)組成葡萄糖50～90，(NH4)2SO41.0～4.0，酵母粉0.1～0.6，KH2PO40.5～3.0，MgSO4·7H2O0.2～.08，pH5.8～6.0；以上培養(yǎng)基均在110～121℃下飽和蒸汽滅菌15min；5)發(fā)酵結(jié)束后測定菌體的生物量、油脂量和殘?zhí)牵?)利用萃取方法進行菌體和油脂的分離；轉(zhuǎn)酯化便可得到生物柴油，每100克干大米草約產(chǎn)生物柴油7.75克。
實施例2原料大米草是于2005年5月采集于浙江沿海，其主要成分含量為半纖維素27.99％，纖維素25.30％。
1)將大米草清洗、切短、烘干、粉碎并過篩取20～40目的部分；按照固液比1∶10的比例(質(zhì)量∶體積))加入重量濃度50％的硫酸，80℃水浴并攪拌4小時；2)反應完畢后將其用水稀釋，并加入適量的Ba(OH)2調(diào)至中性，進行固液分離，采用蒽酮比色法測可溶性總糖含量；3)將所得到的濾液濃縮作為微生物發(fā)酵液；4)將新鮮斜面上長好的產(chǎn)油菌株接種于液體種子培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min搖床培養(yǎng)40～48小時；以重量體積比10％接種量接種于微生物發(fā)酵液(經(jīng)110℃滅菌后的大米草水解液)中，在相同的條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時；所述產(chǎn)油菌株與實施例1相同；培養(yǎng)基a)菌種保藏培養(yǎng)基(1L)酵母粉2～14g，胰蛋白胨10～20g，瓊脂粉16～30g；b)YEPD培養(yǎng)基(g/L)組成葡萄糖10～30，酵母粉5～16，蛋白胨8～15，pH5.8～6.0；固體培養(yǎng)基在YEPD基礎上加入15g瓊脂粉；液體種子培養(yǎng)基(g/L)組成葡萄糖16～28，(NH4)2SO42～8，酵母粉0.1～0.6，KH2PO40.5～3，MgSO4·7H2O0.1～0.6，pH5.8～6.0；限氮發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)組成葡萄糖50～90，(NH4)2SO41.0～4.0，酵母粉0.1～0.6，KH2PO40.5～3.0，MgSO4·7H2O0.2～.08，pH5.8～6.0；以上培養(yǎng)基均在110～121℃下飽和蒸汽滅菌15min；5)發(fā)酵結(jié)束后測定菌體的生物量、油脂量和殘?zhí)牵?)利用萃取方法進行菌體和油脂的分離；轉(zhuǎn)酯化便可得到生物柴油，每100克干大米草約產(chǎn)生物柴油5.65克。
實施例3采用的菌種為1、圓紅冬孢酵母As2.1515；2、粘紅酵母As2.703；3、粘紅酵母As2.704；購自中國普通微生物菌種保藏中心。
培養(yǎng)基a)菌種保藏培養(yǎng)基(1L)酵母粉2～14g，胰蛋白胨10～20g，瓊脂粉16～30g；b)YEPD培養(yǎng)基(g/L)組成葡萄糖10～30，酵母粉5～16，蛋白胨8～15，pH5.8～6.0；固體培養(yǎng)基在YEPD基礎上加入15g瓊脂粉；液體種子培養(yǎng)基(g/L)組成葡萄糖16～28，(NH4)2SO42～8，酵母粉0.1～0.6，KH2PO40.5～3，MgSO4·7H2O0.1～0.6，pH5.8～6.0；限氮發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)組成葡萄糖50～90，(NH4)2SO41.0～4.0，酵母粉0.1～0.6，KH2PO40.5～3.0，MgSO4·7H2O0.2～.08，pH5.8～6.0；以上培養(yǎng)基均在110～121℃下飽和蒸汽滅菌15min。產(chǎn)油微生物的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)將新鮮斜面上長好的產(chǎn)油菌株接種于液體種子培養(yǎng)基中，于28℃～30℃、180～200r/min搖床培養(yǎng)20～48小時。
將采自連云港的大米草適當清洗，將烘箱預熱至110℃～115℃，然后將大米草樣品置入烘箱于105℃恒溫8小時，用粉碎機粉碎大米草樣品至粒徑30目左右，H2SO4濃度按1∶10(質(zhì)量∶體積)加入，在110℃下水解3h。抽濾除去大米草殘渣后，水解液用石灰乳過中和至pH10.0，抽濾去CaSO4沉淀后用濃H3PO4回調(diào)pH至6.0，抽濾去Ca3(PO4)2沉淀，所得水解液于4℃冷藏備用。
將購自中國普通微生物菌種保藏中心的上述三株菌分別保藏斜面種和甘油種。斜面菌種一環(huán)，分別接入液體種子培養(yǎng)基中，500mL三角瓶裝液量100mL，共三瓶，于30℃下、搖床轉(zhuǎn)速200rPmin下培養(yǎng)48h。然后于500mL搖瓶中加入95mL大米草水解液，接入5mL液體種子，在180-200rPmin，30℃下發(fā)酵。所得發(fā)酵液反復離心去上清，將離心所得菌體用蒸餾水吸打離心3次，然后放入直徑9厘米培養(yǎng)皿小于2mm厚分裝，于-20℃的冰箱冷凍60分鐘，待樣品凍好后，置入低溫冷凍干燥機冷凍干燥過夜(第一天下午5點放入第二天8點取出)。將干燥好的樣品于索氏脂肪測定儀分菌株直接測定油脂產(chǎn)出量，所得結(jié)果如下
表1.稱取烘干后的大米草20g(在1L酸液中水解)進行操作的結(jié)果

實施例4將采自連云港烘好的大米草樣品粉碎至粒徑30目，按固液比1∶10(質(zhì)量∶體積)加入10％的H2SO4，在110℃下水解3h。抽濾除去大米草殘渣后，水解液用石灰乳過中和至pH10.0，抽濾去CaSO4沉淀后用濃H3PO4回調(diào)pH至6.0，抽濾去Ca3(PO4)2沉淀，所得水解液于4℃冷藏備用。
采用的菌株與實施例3相同，將保好的斜面菌種一環(huán)分別接入液體種子培養(yǎng)基中，500mL三角瓶裝液量100mL，共三瓶，于30℃下、搖床轉(zhuǎn)速200rPmin下培養(yǎng)48h。然后于500mL搖瓶中加入95mL大米草水解液，接入5mL液體種子，在180-200rPmin，30℃下發(fā)酵。所得發(fā)酵液反復離心去上清，將離心所得菌體用蒸餾水吸打離心3次，然后放入直徑9厘米培養(yǎng)皿小于2mm厚分裝，放入烘箱，105℃恒溫烘烤8小時，將干燥好的樣品分菌株用索氏提取儀測定油脂含量，測定方法為將烘干菌體用濾紙包裝，然后于烘箱105度烘5小時，然后稱量濾紙包的重量，將紙包放入索氏提取器浸提7小時以上，然后將紙包取出放入烘箱105度恒溫30分鐘以上，再稱量紙包的重量，將兩次稱量數(shù)據(jù)相減即為菌體所含生物油脂的重量表2.稱取烘干后的大米草18g(在1L酸液中水解)進行操作的結(jié)果

表3.稱取烘干后的大米草25g(在1L酸液中水解)進行操作的結(jié)果

由此可見，大米草樣品干重為25g時，菌體產(chǎn)油量最高。
現(xiàn)有技術(shù)中的所有產(chǎn)油酵母菌株均可以應用本發(fā)明方法，利用大米草分步糖化發(fā)酵進行生產(chǎn)生物油脂和生物柴油的操作，例如常見的產(chǎn)油酵母有淺白色隱球酵母(Cryptococcus albidus)、彎隱球酵母(Cryptococcus albi2dun)、斯達氏油脂酵母(Lipomyces)、茁芽絲孢酵母(Trichospiron pullulans)、產(chǎn)油油脂酵母(Lipomysli2pofer)、膠粘紅酵母(Rhodotorula giutinis)、類酵母紅冬飽(Rhodosporidium toru2 loides)；在中國生物工程雜志2005。25(12)39～44中，李永紅等對10株酵母菌利用不同單糖為碳源條件下菌體內(nèi)積累油脂的能力進行了初步考察。試驗結(jié)果表明，所有實驗菌株都能同化多種單糖，其中L.starkeyi AS2.1390、R.toruloides AS 2.1389和L.sta rkey i AS 2.1608表現(xiàn)出對碳源利用的廣譜性，能轉(zhuǎn)化五碳糖木糖和阿拉伯糖并在菌體內(nèi)積累油脂，油脂含量最高達到26％。脂肪酸組成分析結(jié)果表明，菌油富含飽和及低度不飽和長鏈脂肪酸，其中棕櫚酸、油酸和亞油酸三者之和占總脂肪酸組成的90％以上，脂肪酸組成分布類似于常見的植物油。這些結(jié)果對利用產(chǎn)油微生物轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素水解混合糖獲取油脂資源的研究具有重要意義。
2003年施安輝、周波通過對粘紅酵母GRL513生產(chǎn)油脂最佳小型工藝發(fā)酵條件的探討發(fā)現(xiàn)，最終油脂產(chǎn)量可達菌體干重的67.12％；生物加工過程(雜志名)，微生物油脂的研究進展及展望(文章題目)2005年vol.3，No.1薛飛燕，張栩，譚天偉(作者)；微生物學通報(雜志名)2000年27(2)酵母誘變獲高產(chǎn)菌株LipomycesStarkeyi HL。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)生物油脂和生物柴油的方法，其特征在于以海洋灘涂植物大米草為原料，采用酵母工程菌將大米草分步糖化發(fā)酵生產(chǎn)生物油脂和生物柴油。
2.按照權(quán)利要求1所述生產(chǎn)生物油脂和生物柴油的方法，其特征在于具體過程如下，1)糖化過程將經(jīng)干燥、粉碎后的大米草于無機濃酸水溶液中攪拌水解；反應完畢加水稀釋后用堿液中和至中性，抽濾進行固液分離，或用濃H3PO4回調(diào)pH至6.0，抽濾去Ca3(PO4)2沉淀；濃縮水解液備用；2)發(fā)酵過程以10％的重量接種量將產(chǎn)油酵母的液體種子培養(yǎng)液接種于經(jīng)110～121℃滅菌后的大米草水解液中，于28℃～30℃、180～200r/min的條件下，搖床培養(yǎng)48～96小時；發(fā)酵結(jié)束后測定菌體的生物量、油脂量和殘?zhí)牵?)菌體和油脂分離，得生物油脂；生物油脂進行轉(zhuǎn)酯化便可得到生物柴油。
3.按照權(quán)利要求2所述生產(chǎn)生物油脂和生物柴油的方法，其特征在于所述步驟1)糖化過程為，A.將大米草經(jīng)過清洗、切短、烘干、粉碎并過篩獲得20～60目顆粒；B.按照固形物的重量含量為5～12.5％加入重量濃度10～80％的無機濃酸，40～120℃水解1～4小時；C.水解液用堿調(diào)至中性，進行固液分離，濾液濃縮作為微生物發(fā)酵液于4℃冷藏備用。
4.按照權(quán)利要求2所述生產(chǎn)生物油脂和生物柴油的方法，其特征在于所述步驟2)發(fā)酵過程為，A.將新鮮斜面上長好的產(chǎn)油菌株接種于液體種子培養(yǎng)基中，于28℃～30℃、180～200r/min搖床培養(yǎng)20～48小時；B.以10％接種量接種于大米草水解液中，在相同的條件下?lián)u床培養(yǎng)48～96小時；C.發(fā)酵結(jié)束后測定菌體的生物量、油脂量和殘?zhí)?；或用索氏脂肪測定儀測定每株菌發(fā)酵后相應干重的含油量，然后計算得出產(chǎn)油率。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物能源領域，具體地說是一種生產(chǎn)生物油脂和生物柴油的方法，以海洋灘涂植物大米草為原料，采用酵母工程菌將大米草分步糖化發(fā)酵生產(chǎn)生物油脂和生物柴油。本發(fā)明是一種由海洋灘涂植物大米草經(jīng)酸水解產(chǎn)糖后利用微生物中的酵母工程菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化為油脂或柴油的新工藝，該工藝產(chǎn)油率高、轉(zhuǎn)化快，在變廢為寶和環(huán)境保護等方面具有廣闊的應用前景。
文檔編號C10G3/00GK101037639SQ20061004609
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者張衛(wèi), 陳慧清, 秦松, 趙宗保, 沈珺珺, 楊慶利, 金美芳 申請人:中國科學院大連化學物理研究所