專利名稱：水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度控制基因bc10及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度控制基因BC10，該基因編碼的蛋白質(zhì)及其功能類似物，編碼其的核苷酸序列，含有該核苷酸的載體和含有該載體的宿主細(xì)胞；另外，本發(fā)明還涉及控制植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度的方法和改良植物細(xì)胞壁成分、含量和結(jié)構(gòu)育種的方法。
背景技術(shù)：
植株莖稈的機(jī)械強(qiáng)度是植物、尤其是農(nóng)作物重要的農(nóng)藝性狀。而莖稈的機(jī)械強(qiáng)度又與莖稈組織中相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞壁厚度直接有關(guān)，是組成植物細(xì)胞壁各種多聚物物理特性的綜合體現(xiàn)。植物細(xì)胞壁是一種復(fù)雜的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由不同的結(jié)構(gòu)多糖、芳香族物質(zhì)和蛋白質(zhì)高度有序地組成[1]，其結(jié)構(gòu)對(duì)保持細(xì)胞形態(tài)，維持植株直立生長的機(jī)械支撐力具有重要作用。植物細(xì)胞壁的生物合成是一個(gè)非常復(fù)雜的代謝過程，涉及纖維素、木質(zhì)素和一些非纖維素成分的合成途徑。因此，細(xì)胞壁中纖維素、木質(zhì)素等主要成分的合成與分布以及沉積是影響植株莖稈支撐力的主要影響因素。對(duì)不同細(xì)胞壁突變體的研究是揭示與莖稈機(jī)械強(qiáng)度有關(guān)的細(xì)胞壁生物合成生理生化以及分子生物學(xué)機(jī)理的有效途徑。植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度首先與纖維素的合成與沉積密切相關(guān)。1996年P(guān)ear等人對(duì)EST隨機(jī)測序，首先從棉花中克隆了植物纖維素合酶催化亞基CesA[2]。而纖維素合酶在植物體中行使功能最直接的證據(jù)則來自于對(duì)擬南芥突變體rsw的研究[3]，該突變體側(cè)根發(fā)育異常，且纖維素含量大幅降低，從中以圖位克隆的方法分離到擬南芥中第一個(gè)纖維素合酶 催化亞基基因AtCesAl。生物信息學(xué)分析表明，CesA基因是一個(gè)龐大的基因家族，它的各成員之間具有極高的保守性M。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，任何一個(gè)目前已克隆的CesA基因發(fā)生突變后，都會(huì)引起比較嚴(yán)重的表型，這暗示著植物基因組中存在著諸多CesA基因在功能上 并不冗余，它們可能分別在不同的發(fā)育時(shí)期和部位起作用，也可能共同參與了同一個(gè)復(fù)合體的形成，協(xié)同作用完成纖維素的合成、晶體化和沉積[5]，但分子機(jī)理還很不清楚。關(guān)于纖維素的沉積，盡管目前已發(fā)現(xiàn)一些蛋白在纖維素的沉積中起著至關(guān)重要的作用，例如擬南芥脆性纖維基因FRAl(Fragile feber 1)編碼的一個(gè)kenesin-like蛋白[6] ；FRA2編碼的Katanin-Iike蛋白m以及COBRA蛋白[8]。但作為細(xì)胞壁最主要的組份，纖維素是高度有序并與細(xì)胞壁的其他組份有機(jī)連接在一起的，目前人們所了解的只是“冰山的一角”。此外，還有大量的糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)參與了非纖維素多糖和蛋白多糖的合成與修飾。以擬南芥為例， 預(yù)測具有415個(gè)GT[9]，但只有極少數(shù)被證明具有生化活性和功能[1°_12]。植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度也與細(xì)胞次生壁的木質(zhì)化有關(guān)。在擬南芥的研究中，發(fā)現(xiàn)一些木質(zhì)化異常的突變體。如Jones在2001年[13]對(duì)一不正常木質(zhì)部突變體irx4研究證實(shí)，木質(zhì)素代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶即肉桂酰輔酶A還原酶(Cirmamoyl-CoA reductase, CCR)。 由於CCR基因的突變，導(dǎo)致木質(zhì)素合成途徑提前終止，細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量較正常植株減 少了 50%，從而導(dǎo)致莖稈支撐力度的下降。因此，植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度是一個(gè)多基因控制的復(fù)雜形狀，其機(jī)制仍十分不詳，了解水稻控制莖稈機(jī)械強(qiáng)度的分子機(jī)制，對(duì)水稻的產(chǎn)量和秸稈的合理利用將產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。隨著基因組測序工作的開展，人們獲得了大量的核苷酸信息。因此在真核生物中 有一大類功能未知的結(jié)構(gòu)域被人為歸類排序，等待人們的研究結(jié)果加以注釋。BClO含有一 個(gè)功能未知結(jié)構(gòu)域DUF266，BClO功能的揭示為具該結(jié)構(gòu)域的其他基因的注解提供了線索。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述研究背景，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度的基 因，所述基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時(shí)編碼具有控制水稻莖 稈機(jī)械強(qiáng)度功能的核苷酸序列。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0. 25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2， 7% SDS)中，65°C預(yù)雜交30分鐘；棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0. 25mol/L磷酸鈉緩沖液， pH7.2,7% SDS,同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65°C雜交16小時(shí)；棄雜交液，加入洗膜液 I(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2,0. 1 % SDS)，65°C洗膜2次，每次10-15分鐘；加入洗膜液 II(10mmol/L 磷酸鈉緩沖液，pH7. 2，0. 1% SDS)，65°C洗膜 10-15 分鐘。本發(fā)明的控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度的基因優(yōu)選具有如圖4和SEQ IDNO :1所示的DNA 序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由本發(fā)明的控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度的基因所編 碼的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選地具有如圖5和SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本發(fā)明中 的SEQ ID NO :2和圖5所示的蛋白質(zhì)含有DUF266結(jié)構(gòu)域。含DUF266結(jié)構(gòu)域的蛋白為植物 特有的蛋白，也是第一個(gè)功能被揭示的這類蛋白。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種含有本發(fā)明的控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度的基因的 植物表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是如圖3所示的pBClOF，該載體可以表達(dá) 由上述核酸序列編碼的多肽。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種培育植物的方法，該方法可使植物莖稈機(jī)械組織 細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分發(fā)生改變，從而引起莖稈機(jī)械強(qiáng)度發(fā)生變化，所述方法包括下列步驟 用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株。關(guān)于序列表的說明SEQ ID NO :1是BClO基因的CDS (氨基酸編碼區(qū)DNA序列)；SEQ ID NO :2是BClO基因編碼的氨基酸序列。


下面結(jié)合附圖對(duì)理解本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并非對(duì)本發(fā)明作限定。圖1.水稻脆稈突變體bclO的表型圖2. BClO基因的圖位克隆圖3.pBC10F載體圖譜圖4. BClO基因的⑶S (氨基酸編碼區(qū)DNA序列)序列圖5. BClO基因編碼的氨基酸序列
圖6. BClO表達(dá)載體圖譜圖7. BClO融合蛋白的體外表達(dá)圖8. BClO融合蛋白的酶活分析
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 1.水稻材料水稻(Oryzasativa ssp.)突變體 brittle culmlO (bclO)，是原始野生型材料粳 稻品種“黃金晴”的自發(fā)突變體材料(購自中國水稻所)。2.分析和定位群體 純合的bclO突變體和水稻品種ZF802 (購自中國水稻所)進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代自交，共 得到870株F2個(gè)體，并以此作為定位群體。在苗期每株取2克左右的嫩葉，用來提取DNA。3.通過簡單重復(fù)序列(SSR，Simple Sequence R印eat)，序列標(biāo)記位點(diǎn)(STS， Sequence-tagged Sites)，和酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS，Cleavedamplified polymorphic sequence)標(biāo)記定位BClO基因。采用改進(jìn)的CTAB方法[14]從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。取大約 IOOmg水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管里提取 DNA,獲得的DNA沉淀溶解于100 μ 1超純水中。每一個(gè)SSR、STS或CAPS反應(yīng)用1 μ 1 DNA樣品。4. BClO基因的初步定位在該階段，對(duì)由150個(gè)F2個(gè)體組成的小群體進(jìn)行SSR和STS分析。我們發(fā)現(xiàn)BClO 基因與兩個(gè)標(biāo)記連鎖并位于二者之間。在此基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)的PCR引物分別以兩個(gè)親本 (即bclO突變體和水稻品種ZF802)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94°C預(yù)變性5min， 94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，35cycles，72°C延伸 IOmins)，將 BClO 基因初步定位在 SSR標(biāo)記RM7349和E3528之間(序列見表1)。表1克隆BClO基因所用引物序列
Markers TypeForword PrimerReverse PrimerEnzyme
RM7349 SSR!'-Τ ΧΤΤΤΤΟΤ ΧΤ ΧσΓΠΧΧ 5'-AGAGACGATCACTGCGCC-3'
E3528STS5'-GGGAAGAAGAGTAGAGGCTG-3'5'-TACACCCCAATATACCTTCG-3'
M1SSR5'-AAGCAAACAAGTGATACTACATAC-3'S'-GCTAGATGACCACCTGCTG^'
M2STS5，-TGCCATTACTGCTGCACG-3，S1-ACGGAGGAGATGCCAGATG-Sf
M3STS5'-ATGAGGTCGTCGGTGAGC-3'5'-GTCTGCCACGCCTTCTTG-3’
M4SSR5'-AACCTCTCCTACCTATTTAGACACC-3'5'-CTAACCTCTAACTAATCAATGAAGTCC-3
M5CAPS5，-CCAAACTTGCTTGCTTCACAC-3，5’-CACAGGCACTATTCCAAGCATAC-3’EarI為了將BClO定位在一個(gè)PAC克隆上，我們用已公布的水稻品種Nipponbare的PAC 文庫(http://rgp. dna. affrc. go. jp)序列構(gòu)建了 BClO位點(diǎn)附近的重疊群，設(shè)計(jì)的PCR引 物分別以兩個(gè)親本(秈稻品種明恢63和dul突變體)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增 (94°C預(yù)變性5分鐘，94。C 1分鐘，55。C 1分鐘，72 dC 1分鐘，35次循環(huán)，72°C延伸10分鐘)。 以此發(fā)展了 STS和SSR標(biāo)記(序列見表1)，并用于群體精細(xì)定位，最終將其定位在一個(gè)PAC克隆 AC084817 和 AC087553 上。 5. BClO基因的精細(xì)定位根據(jù)公布的PAC 克隆 AC084817 和 AC087553 的序列(http //rgp. dna. affrc. go. jp)，設(shè)計(jì)2個(gè)新標(biāo)記M4和M5 (序列見表1)，最后通過連鎖分析將BClO定位在51kb的 范圍之內(nèi)。6. BClO基因的克隆和全長cDNA的獲得首先對(duì)51kb的全長基因組序列用GENSCAN軟件(http://genes.mit. edu/ GENSCAN. html)預(yù)測可能的編碼區(qū)(ORF)，發(fā)現(xiàn)這個(gè)區(qū)間共有10個(gè)0RF。逐個(gè)測序比較突 變體和野生型之間的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)ORF具有17個(gè)堿基的缺失；缺失發(fā)生在該基因的 第二個(gè)內(nèi)含子和第三個(gè)外顯子交界處，從而造成第二個(gè)內(nèi)含子不能被剪切掉，用DNAStar 軟件(Lasergene)SeqEdit分析，該突變會(huì)引起基因的移碼和翻譯的提前終止。而該范圍內(nèi) 的其他基因測序后并沒有發(fā)現(xiàn)任何變化，這樣我們初步確定該基因就是BClO基因。將候 誅區(qū)域的基因組序列和KOME(http://cdna01. dna. affrc. go. jp/cDNA)中的cDNA數(shù)據(jù)進(jìn) 行Blastn分析，結(jié)果在水稻全長cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)該基因的全長cDNA，該基因全長表達(dá)序 列具有1200bp (圖4)，共399個(gè)氨基酸(圖5)。將氨基酸序列送到GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BlastP分析，發(fā)現(xiàn)除了在N端第20到42位氨基酸為一次跨膜區(qū)外，C端還含有唯一的一個(gè) 結(jié)構(gòu)域，但其功能卻從未有人證實(shí)過，被稱為DUF266結(jié)構(gòu)域。BlastX搜索同源序列，發(fā)現(xiàn)凡 具有該結(jié)構(gòu)域的基因均來自于植物，說明它為植物所特有的功能域，可能與細(xì)胞壁的生物 合成有關(guān)。實(shí)施例2水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度控制基因BClO的功能互補(bǔ)及轉(zhuǎn)基因研究含該基因的BAC克隆(購自上海生命所)用Sal I酶切釋放出BClO的全部基因 組片段，共8696bp，包含起始密碼子ATG上游的1980個(gè)堿基和終止密碼子TAA后的2337個(gè) 堿基的全長序列，將該基因組片段插入到雙元載體PCAMBIA1300 (購自CAMIA公司，澳大利 亞)中的Sal I位點(diǎn)間，從而獲得了用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pBClOF(圖3)。質(zhì)粒通過電擊的方法 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105 (購自CAMIA公司，澳大利亞)中 轉(zhuǎn)化水稻，其過程如下1.水稻幼胚培養(yǎng).將bclO突變體的幼胚脫殼，70%乙醇表面消毒3min后，用 0. 1 %氯化汞5分鐘，10%次氯酸鈉溶液浸泡20分鐘，無菌水沖冼3-4次，點(diǎn)播于NB培養(yǎng)基 上誘導(dǎo)愈傷組織，20天左右從成熟胚盾片處長出的愈傷組織繼代于NB培養(yǎng)基上，以后每2 周繼代一次，每次繼代時(shí)都挑選色澤淡黃較致密的胚性愈傷組織。2.農(nóng)桿菌培養(yǎng).一 70°C保存的農(nóng)桿菌菌株接種于含50mg/L卡那霉素和25mg/L 利福平的YEP培養(yǎng)基上，26-28°C，150rpm暗培養(yǎng)16-18小時(shí)活化菌種，YEP固體培養(yǎng)基上劃 平板，于26-28°C暗培養(yǎng)1天，挑取單菌落于YEP液體培養(yǎng)基中，26_28°C，150rpm懸浮培養(yǎng) 16小時(shí)，倒入250ml離心管中4000rpm離心收集農(nóng)桿菌菌體，并用液體培養(yǎng)基懸浮菌體至 0. D600為0. 8-1. 0，用于各種水稻材料的轉(zhuǎn)化。3.水稻材料與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng).水稻愈傷在與農(nóng)桿菌菌液感染前均需先在新鮮 的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天后，才可用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化時(shí)先將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)4天的愈傷組織轉(zhuǎn)移到 IOOml無菌三角錐形瓶中，然后將適量農(nóng)桿菌懸浮液倒入(保證有足夠的菌液把材料淹沒) 上述含有水稻材料的錐形瓶中，室溫下放置20分鐘，并不時(shí)晃動(dòng)，然后將水稻材料取出，在無菌濾紙上吸去多余菌液，隨即轉(zhuǎn)移到鋪有一層無菌濾紙的NB-AS固體培養(yǎng)基上，在26°C 條件下暗培養(yǎng)2-3天。共培養(yǎng)后，從固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上取出轉(zhuǎn)化過的水稻材料，轉(zhuǎn)入含有 50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。4.抗性愈傷組織的篩選及植株再生。第一輪選擇2周后，轉(zhuǎn)到第二輪選擇培養(yǎng)基 上繼續(xù)篩選2周，然后選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基或直接轉(zhuǎn)移到分 化培養(yǎng)基上分化(16小時(shí)光照/天)，再生的小苗在1/2MS上生根壯苗，隨后移入溫室。共 獲得PBClOF質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因株系18個(gè)，均完全恢復(fù)了野生表型。這一結(jié)果證明該基因具有 調(diào)節(jié)水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度的作用。實(shí)施例3 =BClO蛋白的體外表達(dá)和功能驗(yàn)證1.BC10表達(dá)載體的構(gòu)建利用帶有XhoI和BamHI的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物從野生型的cDNA中擴(kuò)增出 BClO基因。所用引物序列如下正向5'-ctcgagAGCTGCACAGATGC-3‘反向5,-ggatccTGCCACCAGGA GGAGGA-3，94 V預(yù)變性5分鐘,940C 1分鐘,60 °C 1分鐘,72 °C 1分鐘，35次循環(huán),72 °C延伸 10分鐘獲得PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連接到T-easy載體(購自Promega)，然后通過電擊法將 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DHlOB感受態(tài)細(xì)胞，并用ABI3730DNAanalyzers型測序儀測序(ABI公司，美 國)，挑選序列完全正確的克隆。通過XholI和BamHI酶切插入到具相同酶切位點(diǎn)的載體 PEGFP-Nl (購自Clontech公司)中(圖6)，測序驗(yàn)證其編碼框的正確性。2. BClO-GFP融合蛋白的表達(dá)將構(gòu)建好的質(zhì)粒，利用質(zhì)粒提取試劑盒(購自北京天庚生物科技有限公司)純化好后，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到中國倉鼠上皮細(xì)胞(CHO)(購自ATCCCCL-61)中進(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)染表 達(dá)時(shí)，由于含有BClO基因的pEGFP-m載體同時(shí)也具有同框的GFP基因，因此在熒光顯微鏡 下可觀察到綠色熒光，證明BClO能在CHO細(xì)胞中表達(dá)。轉(zhuǎn)染兩天后，收集細(xì)胞，并在裂解液 (IOmMTrisCl，pH8. 0,0. ImM EDTA, 5mM DTT,0. 9% NaCl，和 Triton X-100)用槍頭吹打 破碎，在冰上放置兩小時(shí)后，2700rpm離心分別收集上清和沉淀，用Bio-Rad蛋白分析試劑 盒(購自Bio-Rad)定量后取10 μ g上清和沉淀分別進(jìn)行Western Blot分析。結(jié)果顯示， 當(dāng)用GFP單克隆抗體(購自Roche)雜交時(shí)，BClO-GFP融合蛋白的信號(hào)主要在沉淀中(圖 7)，說明它的確為一個(gè)膜蛋白。3. BClO-GFP融合蛋白的功能當(dāng)我們將BClO蛋白序列送到GenBank中進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域空間構(gòu)象比對(duì) [conserved domain architecture retrieval tool (CDART)]時(shí)發(fā)現(xiàn)，DUF266 與動(dòng)物 中的修飾蛋白糖基化的Core2-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶(C2GnT)具有一定的同源性， 因此我們將在CHO細(xì)胞中表達(dá)的BClO蛋白進(jìn)行體外C2GnT的酶活分析，具體步驟如 下將CHO細(xì)胞裂解液沉淀部分的250 μ g粗蛋白與反應(yīng)液[50mM HEPES-NaOH, pH7. 0 ； ImM UDP-[glucosamine-U-14C]-GlcNAc(3. 7kBq, _ 自 Amersham Pharmacia Biotech)； ImMGal β 1 — 3GalNAc α 1 — PNP (購自 Sigma) ；0. IM GlcNAc ；5mM DTT]共 50 μ 1 在 37°C 溫浴2小時(shí)后，加入5ml去離子水終止反應(yīng)；接著過C18S印-Pak柱(購自Waters公司)； 20ml去離子水充分洗滌柱床后，用4ml甲醇洗脫反應(yīng)產(chǎn)物；將甲醇冷凍干燥，再溶于Iml甲醇并在液體閃爍檢測儀(1450MicroBeta TriLux ；Perkin-Elmer)上記錄放射性讀數(shù)，計(jì)算 酶活。圖8顯示，與陰性對(duì)照比較，BC10的確具有一定的C2GnT活性，證明BC10為一種糖基 轉(zhuǎn)移酶。參考文獻(xiàn)1. Bacic, A. , et al. Edi :Priess, J. The biochemistry of plants. New York, Academic Press,14 297-3712.Pear, J. R.，et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996,93 :12637-126423. Arioli, T. , et al. Science. 279，717-720.4. Richmond, T. A.，et al. 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<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1200<212>DNA<213>0ryza sativa<400>1atgaagccgc cgcggaggtg gatgtacggg cggggcggcg ggaaggggaa gccggcgggg 60ctgctgctgc tgggggtgtt cctctgcttg tcggtggtgc tgctgctgct gctgcacggc 120tcgtccccgt cgctggaggg cgaggggagg aagcctgagg cggtggaggc ggcgggggga 180
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ValSerAspSerCysValProLeuTyrAsnPheAsnTyrThrTyrAsp
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TyrlieMetSerSerSerThrSerPheValAspSerPheAlaAspThr
195200205
LysAlaGlyArgTyrAsnProArgMetAspProlielieProValGlu
210215220
AsnTrpArgLysGlySerGinTrpAlaValLeuThrArgLysHisAla
225230235240
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355360365
ProCysPheLeuPheAlaArgLysPheThrArgAlaAlaGlyLeuLys
370375380
LeuLeuAspLeuSerLeulle Ala Ala Asn Gly Ala Ser Thr Met
38539039權(quán)利要求
一種控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度的基因，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時(shí)編碼具有控制植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度功能的核苷酸序列，所述嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液中，所述預(yù)雜交液是0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，7％SDS，在65℃預(yù)雜交30分鐘；棄預(yù)雜交液，加入雜交液，所述雜交液是0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，7％SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段，在65℃雜交16小時(shí)；棄雜交液，加入洗膜液I，所述洗膜液I是20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，0.1％SDS，在65℃洗膜2次，每次10-15分鐘；加入洗膜液II，所述洗膜液II是10mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，0.1％SDS，在65℃洗膜10-15分鐘。
2.按照權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于它具有SEQID NO :1所示的DNA序列。
3. 一種由權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
4.按照權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，其特征在于它具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列。
5. 一種含有權(quán)利要求1或2所述的控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度的基因的植物表達(dá)載體。
6.按照權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體是PBC10F。
7. 一種培育植物的方法，所述方法可使植物莖稈機(jī)械組織細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分發(fā)生改 變，從而引起莖稈機(jī)械強(qiáng)度發(fā)生變化，其特征在于包括下列步驟用按照權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度的基因，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時(shí)編碼具有控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度功能的功能類似物。本發(fā)明還提供了該基因編碼的蛋白質(zhì)，含有該基因的表達(dá)載體，和利用該表達(dá)載體改變植物莖稈機(jī)械強(qiáng)度的方法。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101798574SQ200910077629
公開日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2009年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月9日
發(fā)明者周奕華, 李家洋, 錢前 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所