專利名稱：一種重組藻類體內(nèi)生產(chǎn)生物柴油的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物能源和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到藻類油脂及其用于制備生 物柴油的方法。具體來說，本發(fā)明涉及了使用重組藻類來生產(chǎn)生物柴油的方法，是一種低投 入高產(chǎn)率的生物柴油生產(chǎn)方法。該方法使用了一種含有能表達(dá)丙酮酸脫羧酶(以下稱之為 PDC)活性和能表達(dá)乙醇脫氫酶(以下稱之為ADH)活性的藻類，通過基因工程技術(shù)將一個(gè)能 表達(dá)脂肪酸乙脂合成酶(以下稱之為FAEES)活性的基因轉(zhuǎn)入進(jìn)去，在藻類沒有實(shí)質(zhì)性增殖 的條件下，體內(nèi)表達(dá)的FAEES就能在一定的條件下催化藻類體內(nèi)的(內(nèi)源)乙醇與脂肪酸 反應(yīng)，從而體內(nèi)生成生物柴油。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，人口的增長使得不斷增加的油脂需求量與自然資源嚴(yán)重短缺的矛盾日益尖 銳，特別是隨著日趨嚴(yán)重的全球性能源短缺與環(huán)境惡化，使得人們不得不從環(huán)境保護(hù)與資 源開發(fā)的角度出發(fā)，積極開發(fā)替代石化燃料的可再生新能源，如生物柴油就是一種具有很 大發(fā)展?jié)摿η噎h(huán)境友好的可再生清潔能源。生物能源具有能量密度、含硫量低、燃燒充分、 潤滑性能好等液體能源產(chǎn)品所期望的優(yōu)良性能。自1988年以來，許多歐洲國家已經(jīng)開始將 生物柴油作為傳統(tǒng)柴油的替代品，但由于較高的原料成本，使得生物柴油的價(jià)格高于傳統(tǒng) 柴油，這嚴(yán)重地制約了生物柴油的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，因此選取合適的、低成本的油脂資源是生物 柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向。 目前有關(guān)生物柴油制備的研究基本上集中于植物油方面，都是以植物油或餐飲廢 棄油脂為原料，利用植物油為原料，成本高；而以餐飲廢棄油脂為原料，也存在原料難以收 集和運(yùn)輸?shù)睦щy，因此這些研究難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。在利用植物油脂制備生物柴油的過 程中，原料成本就占了總成本的70%-85%,這嚴(yán)重制約了生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用。藻類生物體內(nèi)含有大量的油脂，通過基因工程技術(shù)在藻類生物體內(nèi)制備生物柴油 (即脂肪酸乙脂和脂肪酸甲脂)，這可以為生物柴油的制備提供更加廉價(jià)的原料，因?yàn)樵孱?分布的范圍極廣，對(duì)環(huán)境條件要求不嚴(yán)，適應(yīng)性較強(qiáng)，在只有極低的營養(yǎng)濃度、極微弱的光 照強(qiáng)度和相當(dāng)?shù)偷臏囟认乱材苌睢２粌H能生長在江河、溪流、湖泊和海洋，在短暫積水或 潮濕的地方也能生長。從熱帶到兩極，從積雪的高山到溫?zé)岬娜瑥某睗竦牡孛娴讲缓苌?的土壤內(nèi)，幾乎到處都有藻類分布。而且該過程不需要大量勞動(dòng)力。生產(chǎn)生物柴油的常用 方法是酯交換法，即在油脂中加入一定量的低碳醇，如甲醇或乙醇等，在堿或酸催化劑作用 下，在一定的溫度和時(shí)間反應(yīng)生成生物柴油，同時(shí)產(chǎn)生副產(chǎn)物甘油。本發(fā)明將基因工程技術(shù) 與酯交換反應(yīng)制備生物柴油的技術(shù)相結(jié)合，提出了一種用藻類體內(nèi)油脂制備生物柴油的方 法，目前尚未見過有相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，成本低、產(chǎn)率高、原料資源豐富，同時(shí)具有不占用土地、不消 耗油資源的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種以高生產(chǎn)率高效率生產(chǎn)生物柴油的方法，包含使用 一種由含有一個(gè)PDC活性基因且含有一個(gè)ADH活性基因的藻類，通過基因工程技術(shù)將一個(gè) 能表達(dá)脂肪酸FAEES活性的基因轉(zhuǎn)入進(jìn)去，這種藻類體內(nèi)表達(dá)的FAEES就能催化藻類體內(nèi) 的乙醇與脂肪酸反應(yīng)，從而體內(nèi)生成生物柴油。本發(fā)明將公開一種利用基因工程技術(shù)在藻類中轉(zhuǎn)入FAEES基因，從而產(chǎn)生一種體 內(nèi)生產(chǎn)生物柴油的辦法。本發(fā)明是建立在通過重組藻類生產(chǎn)乙醇的基礎(chǔ)之上的。藻類植物是植物界中沒有真正根、莖、葉分化，以光能自養(yǎng)生活，生殖器官由單細(xì) 胞構(gòu)成和無胚胎發(fā)育的一大類群。以小球藻為例，小球藻是單細(xì)胞浮游種類，細(xì)胞微小，圓 形或略橢圓形，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞內(nèi)有1個(gè)杯形或曲帶形載色體，細(xì)胞老熟時(shí)載色體分裂成數(shù) 塊。無蛋白核，只有蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa Chick.)有蛋白核。無性生殖 時(shí)，原生質(zhì)分裂形成2、4、8、16個(gè)似親孢子，母細(xì)胞壁破裂時(shí)，孢子放出成為新的植物體。小球 藻在我國分布甚廣，生活于含有機(jī)質(zhì)的小河、溝渠、池塘等水中，在潮濕的土壤上也有分布。實(shí)施方案如下本發(fā)明中可以使用來自各種生物的、能表達(dá)FAEES活性的基因。通過基因工程技 術(shù)，在表達(dá)FAEES的基因已獲得的前提下，進(jìn)行基因擴(kuò)增(PCR技術(shù))、體外重組、重組體向寄 主細(xì)胞導(dǎo)入、再經(jīng)過重組體的克隆篩選與鑒定，得到能夠表達(dá)外源基因FAEES的轉(zhuǎn)型小球藻。按照本發(fā)明轉(zhuǎn)型的宿主微生物是藻類生物，該藻類不同于以上現(xiàn)有技術(shù)中作為宿 主的菌類。本發(fā)明的主要特征之一是，選擇一種由含有一個(gè)PDC活性的基因且含有一個(gè)能表 達(dá)ADH活性的基因的DNA的能生產(chǎn)(內(nèi)源)乙醇的藻類作為主要轉(zhuǎn)型宿主，按照本發(fā)明轉(zhuǎn) 型藻類的使用，藻類制備FAEES。這一發(fā)明處于國際領(lǐng)先水平，具有重大意義。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施實(shí)例詳細(xì)說明本發(fā)明，但不應(yīng)視為本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例一藻種培養(yǎng)所培養(yǎng)的藻種為本公司研發(fā)中心已構(gòu)建好，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)化ADH和PDC的轉(zhuǎn)基因小球 藻，該過程的詳細(xì)方法見本公司另一專利《一種通過重組藻類生產(chǎn)乙醇的方法》。配制稀釋的LB培養(yǎng)基，按藻液與培養(yǎng)液1 2的比例擴(kuò)種于IOOOmL的三角燒瓶 中。將三角瓶放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制其培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度75. 3 80. lmmol/m2s, 溫度為26°C，pH為6 8。每天攪拌三次，每次1分鐘，待藻體達(dá)到一定密度后按藻液與培 養(yǎng)液1 4的比例擴(kuò)種于3000ml的三角燒瓶中，放在溫度較低、光線較弱的地方，人工通入 經(jīng)過過濾的空氣進(jìn)行培養(yǎng)，每3個(gè)星期左右擴(kuò)種1次。擴(kuò)大培養(yǎng)的程序?yàn)?000mL三角燒瓶 —20L細(xì)口玻璃瓶一桶中培養(yǎng)一生產(chǎn)池。實(shí)施例二 FAEES基因克隆到穿梭載體將目的基因FAEES與PET28載體連接，以質(zhì)粒形式存在，簡稱PET-FAEES。以 PET-FAEES作為模板，進(jìn)行PCR。為了在PCR中克隆FAEES基因，合成下列引物并使用FAEES 基因擴(kuò)增引物
(a-l)5， -ccgCTCGAG ATA GCC ACC ATGCCGCCCTACACC-3’(b-1) 5，-tgcTCTAGATCACTGTTTCCCGTTGCCATT-3，PCR (Polymerase Chain Reaction)在下列條件用 “DNA 熱循環(huán)者”和 Tag DNA 聚 合酶(Takara公司)作為反應(yīng)試劑進(jìn)行的。反應(yīng)物PCR緩沖劑、1. 25mM dNTP混合物、模板、引物(上游和下游)、Tag酶、無菌 水。將以上成分混合，并使該混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR 循環(huán)變性過程94°C 60s退火過程52°C 60s延伸過程72°C 120s由以上過程組成的一個(gè)循環(huán)重復(fù)30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，將以上反應(yīng)混合物IOul 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物片段大小是否符合FAEES片段大小。FAEES基因與穿梭質(zhì)粒pKYL71連接用膠回收試劑盒(Invitrogen公司)回收作為PCR產(chǎn)物的FAEES目的片段，詳細(xì) 步驟參考試劑盒內(nèi)的說明書?；厥蘸蟮钠闻cPGEM-T載體連接，其連接體系為反應(yīng)緩沖 劑、pGEM-T載體、PCR產(chǎn)物FAEES片段、T4連接酶。反應(yīng)1小時(shí)后轉(zhuǎn)入4°C連接反應(yīng)16小 時(shí)。藍(lán)白斑篩選連接產(chǎn)物，酶切獲得目的片段FAEES，構(gòu)建穿梭載體。將以上連接反應(yīng)產(chǎn)物用氯化鈣的方法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)狀態(tài)的Escherichia coli JM109細(xì)胞，涂布到含有0. 2M IPTG的固體培養(yǎng)基(IOg蛋白胨、5g酵母粉、5gNaCl、和16g 瓊脂溶解于1升雙蒸水)。在該培養(yǎng)基挑取白色陽性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，16小時(shí)后收集細(xì)胞并 利用堿裂解法小量制備質(zhì)粒。然后酶切質(zhì)粒并回收FAEES目的片段。該片段與同樣經(jīng)過酶 切處理的基因表達(dá)載體，如PKYL71載體連接，其連接體系為pKYL71、FAEES、T4連接酶、無 菌水。連接產(chǎn)物為目的基因FAEES與載體連接的質(zhì)粒，簡稱FAEES-載體。實(shí)施例三根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化利用凍融法把以上構(gòu)建好的FAEES-載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于 固體培養(yǎng)基上(LB+40mg/L利福平+25mg/L鏈霉素+75mg/L慶大霉素)，挑取單菌落，在2mL 農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)過夜，取ImL以上培養(yǎng)物，加入50mL農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中， 28°C培養(yǎng)至OD6tltl = 1. 0，將50mL農(nóng)桿菌液經(jīng)3500 4000r/min離心8min收集菌體，用UMl 液體培養(yǎng)基重懸，28 °C繼續(xù)培養(yǎng)3 4h，至OD6tltl = 0. 5。實(shí)施例四藻的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化株的篩選將以上培養(yǎng)好的藻種放入上述農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中，在190r/min，28°C搖床上共培養(yǎng) IOmin后，用無菌濾紙吸去除多余菌液，置于鋪有一層無菌濾紙的UMl培養(yǎng)基上，用封口膜 封好培養(yǎng)皿，25°C，于暗處共培養(yǎng)約60h，之后依次用無菌水、含500mg/L氨芐青霉素的無菌 水和用含500mg/L氨芐青霉素的UMl將農(nóng)桿菌洗掉，放在稀釋的LB培養(yǎng)基上，用封口膜封 好培養(yǎng)皿，暗處培養(yǎng)，待藻種生長到一定密度時(shí)，轉(zhuǎn)至UM3培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)至配 制稀釋的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到藻種轉(zhuǎn)化株，而非轉(zhuǎn)化株則在含有50mg/L卡娜霉素的培養(yǎng)基 上逐漸死亡。利用初步熱解技術(shù)篩選總脂產(chǎn)量高、不飽和脂肪酸含量低的藻種大量培養(yǎng)。實(shí)施例五藻轉(zhuǎn)化株的生物柴油體內(nèi)生產(chǎn)
在稀釋的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)藻種生長到一定密度時(shí)，收集培養(yǎng)混合物。以生物催 化工藝生產(chǎn)生物柴油，工藝簡述如下生物酯反應(yīng)，藻類體內(nèi)的乙醇與脂肪酸，脂肪酸乙脂 合成酶催化，在一定溫度與常壓下進(jìn)行酯交換生物反應(yīng)。重力沉淀、水洗、分層。甘油的分 離與粗制脂肪酸乙脂的獲得。催化劑的脫出與精制生物柴油的獲得。所獲得生物柴油以EN 14214為標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例六藻轉(zhuǎn)化株的生物柴油體外生產(chǎn)將藻轉(zhuǎn)化株含F(xiàn)AEES基因并能穩(wěn)定表達(dá)的藻類破碎，在37°C反應(yīng)1_24小時(shí)，進(jìn)行 體外生物轉(zhuǎn)酯化酶反應(yīng)后，經(jīng)分離純化得到脂肪酸己酯即生物柴油，副產(chǎn)物為甘油。所獲得 生物柴油以EN 14214為標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種利用藻類油脂及其用于制備生物柴油的生物技術(shù)方法。其特征在于，包括藻類體內(nèi)乙醇的制備和利用藻類體內(nèi)油脂與乙醇發(fā)生酯交換反應(yīng)制備體內(nèi)生物柴油的方法，即使用了一種含有能表達(dá)丙酮酸脫羧酶(以下稱之為PDC)活性和能表達(dá)乙醇脫氫酶(以下稱之為ADH)活性的藻類，通過基因工程技術(shù)將一個(gè)能表達(dá)脂肪酸乙脂合成酶(以下稱之為FAEES)活性的基因轉(zhuǎn)入進(jìn)去，在藻類體內(nèi)表達(dá)的FAEES就能在一定的條件下催化藻類體內(nèi)的乙醇與脂肪酸反應(yīng)，體內(nèi)得到生物柴油，副產(chǎn)物為甘油。
2.按權(quán)利要求一所述利用藻類油脂及其用于制備生物柴油的方法。其特征在于，所述 利用藻類油脂及其用于制備生物柴油的步驟如下①.藻類生物體內(nèi)乙醇的制備1)基因克隆由細(xì)菌中克隆pdc基因和Adh基因。由人肝臟細(xì)胞克隆FAEES基因。2)質(zhì)粒構(gòu)建將pdc和Adh分別連接到質(zhì)粒pUC19中，得到pdc+pUC19和Adh+pUC19。 制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。3)質(zhì)粒擴(kuò)增在大腸桿菌中擴(kuò)增質(zhì)粒。提取質(zhì)粒。4)構(gòu)建表達(dá)載體酶切質(zhì)粒PUC19，電泳，膠回收目的基因。再用酶切載體，得粘性末 端。將pdc基因和Adh基因分別連接到質(zhì)粒載體，得到pdc+載體和Adh+載體，F(xiàn)AEES+載 體。5)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用上一步得到兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。6)轉(zhuǎn)染藻類轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌與藻類共培養(yǎng)，使pdc基因和Adh基因，F(xiàn)AEE基因插入藻 類基因組中。7)基因表達(dá)洗去農(nóng)桿菌后，大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因藻類。8)乙醇的檢測(cè)。檢測(cè)培養(yǎng)基中乙醇含量的變化。如果檢測(cè)到乙醇明顯增加，則說明以 上兩種基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入藻類。②.藻類生物油脂酯交換制備生物柴油由人肝臟細(xì)胞克隆FAEES基因。以農(nóng)桿菌為介質(zhì)，再將FAEES基因轉(zhuǎn)入上述轉(zhuǎn)基因藻 中。檢測(cè)脂肪酸的含量變化。當(dāng)含量不再變化時(shí)，破碎藻細(xì)胞經(jīng)分離收集培養(yǎng)混合物，以催 化工藝生產(chǎn)生物柴油，副產(chǎn)物為甘油。藻轉(zhuǎn)化株的生物柴油體內(nèi)生產(chǎn)和藻轉(zhuǎn)化株的生物柴 油體外生產(chǎn)。
3.按權(quán)利要求二所述生產(chǎn)的生物柴油技術(shù)。權(quán)利要求包括脂肪酸乙脂合成酶FAEES和 脂肪酸甲脂合成酶FAMES，在生物柴油(脂肪酸乙脂和脂肪酸甲脂)的體內(nèi)和體外生物合成應(yīng)用。
4.按權(quán)利要求所述的藻類包括小球藻，微藻，常見的藻類和其他不常見藻類，淡水和咸 水藻類。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物能源和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到藻類油脂及其用于制備生物柴油的方法。包括藻類體內(nèi)乙醇的制備和利用藻類體內(nèi)油脂與乙醇發(fā)生酯交換反應(yīng)制備生物柴油的方法，具體來說，本發(fā)明涉及了使用重組藻類來生產(chǎn)生物柴油的方法。該方法使用了一種含有能表達(dá)丙酮酸脫羧酶(PDC)活性和能表達(dá)乙醇脫氫酶(ADH)活性的藻類，通過基因工程技術(shù)將一個(gè)能表達(dá)脂肪酸乙脂合成酶(FAEES)活性的基因轉(zhuǎn)入進(jìn)去，在藻類體內(nèi)表達(dá)的FAEES就能在一定的條件下催化藻類體內(nèi)的乙醇與脂肪酸反應(yīng)，得到生物柴油，副產(chǎn)物為甘油。該技術(shù)條件溫和、成本低、易于控制，以藻類生物體內(nèi)油脂為原料，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C10L1/02GK101892092SQ20091014289
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者黃赤夫 申請(qǐng)人:湖北匯特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司