專利名稱：：血管生成素-2的特異結合劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及識別血管生成素-2(Ang-2)并且與之結合的特異結合刑.更具體地說，本發(fā)明涉及特異性結合Ang-2的所述特異結合刑及其片段的制備，診斷用途，和治療用途.
背景技術：
：血管發(fā)生，從存在的血管生成新的血管，對于#>多生理和病理過程都是比需的.一般來說，血管發(fā)生由血管生成因子原和抗血管生成因子嚴格調節(jié)，但是在象癌癥，眼新血管病，關節(jié)炎，和牛皮癬這樣的疾病的情況下，該過程可能錯誤進行，F(xiàn)olkman，J.，Nat.Med.，1:27-31(1995).有很多種疾病已知與不受調節(jié)的或者不期望的血管發(fā)生相關.這樣的疾病包括但不限于，眼新血管形成，例如視網(wǎng)膜病(包括糖尿病視網(wǎng)膜病)，與年齡有關的斑變性，牛皮癬，成血管瘤(hemangioblastoma),血管瘤，動脈硬化，炎性疾病，例如類風濕性或風濕性炎癥，尤其是關節(jié)炎(包括類風濕性關節(jié)炎)，或者其他慢性炎癥，例如慢性哞喘，動脈粥樣硬化或者移植后動脈粥樣硬化，子宮內膜異位，和瘤，例如所謂的實體瘤和液體(或血液)腫瘸(例如白血病和淋巴瘤).與不期望的血管發(fā)生相關的其他疾病對于那些本領域技術人員是顯而易見的.雖然很多信號轉導系統(tǒng)在血管發(fā)生的調節(jié)中涉及，但是表征得最充分并且最具內皮細胞選擇性系統(tǒng)之一涉及Tie-2受體酪氨酸激酶(稱作"Tie-2"或，'Tie-2R"(也稱作"0RK");鼠Tie-2也稱作"tek")及其g己體，血管生成素(Gale，N.W,和Yancopoulos,G.D,,GenesDev,l3:lOH-lO"[l"9)有四種已知的血管生成素；血管生成素-l("Ang-l")至血管生成素-4("Ang-4").這些血管生成素也稱作"Tie-2配體".(Davis,S.，等，Cell，87:1161-1169[1996];Grosios，K.，等，CytogenetCellGenet,84:118-120[1999];Holash，J.，等，InvestigativeOphthalmology&VisualScience,42:1617-1625[1999；Koblizek，T.I.，等，CurrentBiology,8:529-532[1998];Lin,P.,等，ProcNatlAcadSciUSA,95:8829-8834[1998];Maisonpierre,P.C.，等，Science,277:55-60[1997〗；Papapetropoulos，A.，等，LabInvest,79:213-223[1999〗;Sato,T.N.，等，Nature,375:70-74[1998;Shyu，K.G.,等，Circulation,98:2081-2087[1998;Suri，C.，等，Cell,87:1171-1180[1996];Suri，C.，等，Science,282:468-471[1998];Valenzuela，D，M.,等，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA,96:1904-1909[1999];Witzenbichler，B.，等，JBiolChem,273:18514-18521[1998〗),Ang-1與Tie-2結合刺激培養(yǎng)的內皮細胞中的受體磷酸化作用，發(fā)現(xiàn)Ang-2刺激和拮抗Tie-2受體磷酸化作用(Davis,S.，等，[1996〗,上文;Maisonpierre,P.C.，等，[1997]，上文;Kim，I.，J.H.Kim,等，Oncogene19(39):4549-4552(2000);Teichert-Kuliszewska，K.，P.C.Maisonpierre,等，CardiovascularResearch49(3):659-70(2001)).小鼠Tie-2和Ang-1敲除物的表型是類似的并且提示Ang-l-刺激的Tie-2磷酸化作用通過保持內皮細胞-支持細胞附著而介導子宮中發(fā)育血管的改變和穩(wěn)定(D鵬nt，D.J.，等，Genes&Development,8:1897-1909[1994；Sato,T.N.，等，Nature,376:70-74[1995];Suri，C.,等，[1996],上文).認為Ang-1在血管穩(wěn)定中的作用在成年人中是保守的，而且廣泛而基本性表達(Hanahan,D.，Science,277:48-50(1997];Zagzag，D.，等，ExperimentalNeurology,159:391-400[1999).相反，Ang-2表達主要限于血管改造部位，認為在那里阻斷Ang-1功能，從而誘導有益于血管發(fā)生的血管可塑性狀態(tài)(Hanahan，D.,[1997],上文；Holash,J.，等，Science,284:1994-1998[1999；Maisonpierre,P.C.，等，U997，上文).很多公開的研究支持證明病態(tài)血管-選擇性Ang-2表達與血管發(fā)生有關.這些病理學情況包括，例如，牛皮褲，斑變性，和癌癥(Bunone，G.,等，AmericanJournalofPathology,155:1967-1976[1999]'，Etoh，T.,等，CancerResearch,61:2145-2153[2001];Hangai，M.，等，InvestigativeOphthalmology&VisualScience,42:1617-1625[2001];Holash,J.，等，[1999上文;Kuroda，K.，等，JournalofInvestigativeDermatology,116:713-720[2001；Otani，A.，等，InvestigativeOphthalmology&VisualScience,40:1912-1920〖1999];Stratmann,A,,等，AmericanJournalofPathology,153:1459-1466[1998];Tanaka，S.，等，JClinInvest,103:34-345[1999];Yoshida，Y.，等，InternationalJournalofOncology,15:1221-1225[1999jYuan,K.，等，JournalofPeriodontalResearch,35:165-171[2000〗；Zagzag，D.，等，[1999上文).這些研究大多數(shù)聚焦在癌癥上，其中很多癌癥類型表現(xiàn)出顯示血管Ang-2表達.與在病理性血管發(fā)生中的表達相反，正常組織中Ang-2表達十分有限(Maisonpierre，P.C.，等，[1997，上文；Mezquita,J.，等，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,260:492-498[1999]).在正常成年人體內血管發(fā)生的三個主要部位是卵巢，胎盤，和子宮；這些是其中檢測到Ang-2mRNA的正常(即，非癌)組織中主要組織.一些功能研究提示Ang-2可能在腫瘤血管發(fā)生中涉及.Ahmad等(CancerRes.，61:1255-1259[2001)描述Ang-2超量表達并且支持性證明這與小鼠異種移植模型中腫瘤生長增加有關.也參見Etoh等，上文，和Tanaka等，上文，其中給出支持Ang-2超量表達與腫瘤血管過多相關的數(shù)據(jù)，但是，相反，Yu等.(Am.J.Path.,158:563-570[2001])報道數(shù)據(jù)支持證明Lewis肺癌和TA3乳房癌細胞中Ang-2超量表達延長用相應的轉染子注射的小鼠的存活.在過去的幾年中，很多出版物提出Ang-l，Ang-2和/或Tie-2可能是抗癌治療的靶物.例如，美國專利Nos.6,166,185，5,650,490，和5,814,464各自公開了抗-Tie-2配體抗體和受體的概念.Lin等(Proc.Natl.Acad,SciUSA,95:8829-8834U998〗)對小鼠注射腺病毒表達可溶Tie-2;聲稱可溶Tie-2減小小鼠產生的腫瘤的數(shù)目和大小.在最近的研究中，Lin等(J.Clin.Invest.,100:2072-2078[1997])對大鼠注射可溶形式的Tie-2;聲稱這種化合物減小大鼠的肺瘤大小.Siemeister等(CancerRes.，59:3185-3189[1999])制備出表達Tie-2胞外結構域的人黑素瘤細胞系，對棵鼠注射這些細胞系，得出結論聲稱可溶Tie-2導致肺瘤生長和腫瘤血管發(fā)生的"顯著抑制".從這個信息看，并且已知Ang-l和Ang-2都結合Tie-2，從這些研究不能清楚地看出iAng-l，Ang-2，或Tie-2會是抗癌治療的有吸引力的靶物.提高這些分子的半壽期的一些肽與穩(wěn)定的血漿蛋白例如Ig恒定區(qū)的融合體描述于，例如，PCT公開W000/24782,2000年5月4日公開，先前描述過提高分子半壽期的一種蛋白質或者其片段與一種穩(wěn)定的血漿蛋白質例如Ig恒定區(qū)的融合體(例如，實施例，美國專利No.5,480,981;Zheng等，J.Immunol.，154:5590-5600,(1995);Fisher等，N.Engl.J.Med.，334:1697-1702，(1996);VanZee,K.等，J.Immunol.,156:2221-2230，(1996);美國專利No.5,808,029,1998年9月15日公開；Capon等，Nature,337:525-531,(1989);Harvill等，Im肌notech.，1:95-105，(1995);W097/23614,1997年7月3日公開；PCT/US97/23183，filedDec.11，1997年12月11日申請；Linsley，J.Exp.Med.，174:561-569,(1991);WO95/21258，1995年8月10日公開).有效的抗-Ang-2療法可能使大量的癌癥患者受益，因為大多數(shù)實體肺瘤需要新血管化生長直徑超過1-2毫米.這樣的療法對其他與血管發(fā)生相關的疾病例如視網(wǎng)膜病，關節(jié)炎和牛皮癬有廣泛的應用.對于特異性識別并結合Ang-2的新的藥物有著未開發(fā)的需求.這樣的藥物將有用于對與Ang-2活性相關的病態(tài)的診斷篩選和治療干預.因此，本發(fā)明的一個目的是提供調節(jié)Ang-2活性的Ang-2的特異結合刑.
發(fā)明內容本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，其中所述重鏈包含選自下組的重鏈可變區(qū)526HC(SEQIDNO.1);528HC(SEQIDNO.3);531HC(SEQIDNO.5);533HC(SEi[)IDNO.7);535HC(SEQID7NO.9);536HC(SEQIDNO，11);537HC(SEQIDNO.13);540HC(SEQIDNO.15);543HC(SEQIDNO.17);544HC(SEQIDNO.19);545HC(SEQIDNO.21);546HC(SEQIDNO.23);551HC(SEQIDNO.25);553HC(SEQIDNO.27);555HC(SEQIDNO.29);558HC(SEQIDNO.31);559HC(SEQIDNO.33);565HC(SEQIDNO,35);F1-C6HC(SEQIDNO.37);FB1-A7HC(SEQIDNO.39);FD-B2HC(SEQIDNO.41);FE-B7HC(SEQIDNO.43);FJ-G11HC(SEQIDNO.45);FK-E3HC(SEQIDNO.47);G1D4HC(SEQIDNO.49);GC1E8HC(SEQIDNO.51);H1C12HC(SBQIDNO.53);IA1-1E7HC(SEQIDNO.55);IF-1C10HC(SEQIDNO.57);IK-2E2HC(SEQIDNO.59);IP-2C11HC(SEQIDNO.61);及其抗原結合片段；所述輕鏈包含選自下組的輕鏈可變區(qū)526k(SEQIDNO.2);536k(SEQIDNO.12);543k(SEQIDNO.18);544k(SEQIDNO.20);551k(SEQIDNO,26);553k(SEQIDNO.28);555k(SEQIDNO.30);558k(SEQIDNO.32);565k(SEQIDNO.36);FE-B7k(SEQIDNO.44);FJ-G11k(SEQIDNO.46);FK-E3k(SEQIDNO.48);IA1-1E7k(SEQIDNO.56);IP-2C11k(SEQIDNO.62);528X(SEQIDNO.4);5313i(SEQIDNO.6);533X(SEQIDNO.8);535X(SEQIDNO.10);537X(SEQIDNO.14);540X(SEQIDNO.16);545X(SEQIDNO.22);546k(SEQIDNO.24);559k(SEQIDNO.34);F1-C6X(SEQIDNO.38);FB1-A7k(SEQIDNO.40);FD-B23i(SEQIDNO.42);G1D4X(SEQIDNO.50);GC1E83i(SEQIDNO.52);H1C12k(SEQIDNO.54);IF—ICIOX(SEQIDNO.58);IK-2E2X(SEQIDNO.60);及其抗原結合片段.本發(fā)明還提供了包含至少一種選自下組的肽的特異結合劑SEQIDNO.1;SEQIDNO.3;SEQIDNO.5;SEQIDNO,7;SEQIDNO.9;SEQIDNO.11;SEQIDNO.13;SEQIDNO.15;SEQIDNO.17;SEQIDNO.19;SEQIDNO.21;SEQIDNO.23;SEQIDNO.25;SEQIDNO.27;SEQIDNO.29;SEQIDNO.31;SEQIDNO.33;SEQIDNO.35;SEQIDNO.37;SEQIDNO.39;SEQIDNO.41;SEQIDNO.43;SEQIDNO.45;SEQIDNO.47;SEQIDNO.49;SEQIDNO.51;SEQIDNO.53;SEQIDNO.55;SBQIDNO.57;SEQIDNO.59;SEQIDNO.61;SEQIDNO.2;SEQIDNO.12;SEQIDNO'18;SEQIDNO.20;SEQIDNO.26;SEQIDNO.28;SEQIDNO.30;SEQIDNO.32;SEQIDNO.36;SEQIDNO.44;SEQIDNO.46;SEQIDNO.48;SEQIDNO.56;SEQIDNO,62;SEQIDNO.4;SEQIDNO.6;SEQIDNO.8;SEQIDNO.10;SEQIDNO.14;SEQIDNO.16;SEQIDNO.22;SEQIDNO.24;SEQIDNO.34;SEQIDNO.38;SEQIDNO.40;SEQIDNO.42;SEQIDNO.50;SEQIDNO.52;SEQIDNO.54;SEQIDNO.58;和SEQIDNO.60及其片段.應該理解，特異結合刑可以是，例如抗體，如多克隆、單克隆、嵌合的、人源化或完全的人抗體.所述抗體也可以是單鏈抗體.本發(fā)明還涉及產生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤.可以理解，本發(fā)明涉及如此處所描述的偶聯(lián)物.該偶聯(lián)物可以是，例如，本發(fā)明的特異結合刑(如抗體).本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的特異結合刑(如抗體)的核酸分子，以及包含所述核酸分子的栽體，以及包含所述栽體的宿主細胞.此外，本發(fā)明提供了一種制備特異結合刑的方法，包括，(a)用至少一種編碼權利要求1的特異結合劑轉化宿主細胞；(b)在所述宿主細胞中表達核酸分子；和(c)分離所述特異結合刑.本發(fā)明進一步提供一種制備抗體的方法，包括(a)用至少一種編碼本發(fā)明抗體的核酸分子轉化宿主細胞；(b)在所述宿主細胞中表達核酸分子；和(c)分離所述特異結合劑.本發(fā)明還涉及抑制哺乳動物中不期望的血管發(fā)生的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的特異結合刑.本發(fā)明還提供治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的特異結合刑.本發(fā)明還涉及抑制哺乳動物中不期望的血管發(fā)生的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的抗體.本發(fā)明還提供治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的抗體.應該理解，本發(fā)明進一步涉及包含本發(fā)明的特異結合刑和藥學可接受制刑的藥物組合物.該藥物組合物可以包含本發(fā)明的抗體和藥學可接受制劑，本發(fā)明提供了一種調節(jié)或抑制血管生成素一2活性的方法，包括施用一種或多種本發(fā)明的特異結合刑.本發(fā)明提供了一種調節(jié)或抑制血管生成素-2活性的方法，包括施用一種或多種本發(fā)明的抗體.本發(fā)明還涉及調節(jié)哺乳動物血管滲透性或血漿滲漏中至少一項的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的特異結合刑.本發(fā)明還涉及治療哺乳動物中以下病癥中的至少一種的方法眼新血管病，肥胖，成血管瘤，血管瘤，動脈硬化，炎性疾病，炎性紊亂，動脈粥樣硬化，子宮內膜異位，腫瘤性疾病，骨相關疾病，或者牛皮褲，包括施用治療有效量的本發(fā)明的特異結合刑.此外，本發(fā)明涉及治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的特異結合刑和化療藥物，本領域技術人員應該理解，特異結合刑和化療藥物不需要同時施用，本發(fā)明還涉及治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的抗體和化療藥物.特異結合劑和化療藥物不需要同時施用.本發(fā)明還提供一種包含以下任意一種互補決定區(qū)l(CDRl)的特異結合刑526HC(SEQIDNO.1);528HC(SEQIDNO.3);531HC(SEQIDNO.5);533HC(SEQIDNO.7);535HC(SEQIDNO.9);536HC(SEQIDNO.11);537HC(SEQIDNO.13);540HC(SEQIDNO.15);543HC(SEQIDNO.17);544HC(SEQIDNO.19);545HC(SEQIDNO.21);546HC(SEQIDNO.23);551HC(SEQIDNO.25);553HC(SEQIDNO.27);555HC(SEQIDNO.29);558HC(SEQIDNO.31);559HC(SEQIDNO.33);565HC,IDNO.35);F1-C6HC(SEQIDNO.37);FB1-A7HC(SEQIDNO.39);FD-B2HC(SEQIDNO'41);FE-B7HC(SEQIDNO.43);FJ-G11HC(SEQIDNO.45);FK-E3HC(SEQIDNO，47"G1D4HC(SEQIDNO，49)，GC1B8HC(SEQIDNO.51);H1C12HC(SEQIDNO.53);IA1-1E7HC(SEQIDNO.55);IF-ICIOHC(SEQIDNO.57);IK-2E2HC(SEQIDNO.59);IP-2C11HC(SEQIDNO.61);526k(SEQIDNO.2);536k(SEQIDNO.12);543k(SEQIDNO.18);544k(SEQIDNO.20);551k(SEQIDNO.26);553k(SEQIDNO.28);555k(SEQIDNO.30);558k(SBQIDNO.32);565k(SBQIDNO.36);FE-B7k(SEQIDNO.44);FJ-G11k(SEQIDNO.46);FK-E3k(SEQIDNO.48);IA1-1E7k(SEQIDNO,56);IP-2C11k(SEQIDNO.62);528X(SEQIDNO.4);531X(SEQIDNO.6);533k(SEQIDNO.8);535k(SEQIDNO.10);105373i(SEQIDNO.14);540X(SEQIDNO,16);545X(SEQIDNO.22);546X(SEQIDNO.24);5593i(SEQIDNO.34);F1-C6k(SEQIDNO.38);FB1-A7k(SEQIDNO.40);FD-B23t(SEQIDNO.42);G1D4X(SEQIDNO.50);GC1E8k(SEQIDNO.52);H1C123i(SEQIDNO.54);IF-1C10X(SEQIDNO.58);和IK-2E2X(SEQIDNO.60).本發(fā)明還涉及一種包含以下任意一種互補決定區(qū)2(CDR2)的特異結合劑526HC(SEQIDNO.1);528HC(SEQIDNO.3);531HC(SEQIDNO.5);533HC(SEQIDNO.7);535HC(SEQIDNO.9);536HC(SEQIDNO.11);537HC(SEQIDNO.13);540HC(SEQIDNO.15);543HC(SEQIDNO.17);544HC(SEQIDNO.19);545HC(SEQIDNO.21);546HC(SEQIDNO.23);551HC(SEQIDNO.25);553HC(SEQIDNO.27);555HC(SEQIDNO.29);558HC(SEQIDNO.31);559HC(SEQIDNO.33);565HC(SEQIDNO.35);F1-C6HC(SEQIDNO.37);FB1-A7HC(SEQIDNO.39);FD-B2HC(SEQIDNO.41);FE-B7HC(SEQIDNO.43);FJ-G11HC(SEQIDNO.45);FK-E3HC(SEQIDNO.47);G1D4HC(SEQIDNO.49);GC1E8HC(SEQIDNO.51);H1C12HC(SEQIDNO.53);IA1-1E7HC(SEQIDNO.55);IF-1C10HC(SEQIDNO.57);IK-2E2HC(SEQIDNO.59);IP-2C11HC(SEQIDNO.61);526k(SEQIDNO.2);536k(SEQIDNO.12);543k(SEQIDNO.18);544k(SEQIDNO.20);551k(SEQIDNO.26);553k(SEQIDNO.28);555k(SBQIDNO.30);558k(SBQIDNO.32);565k(SEQIDNO.36);FE-B7k(SEQIDNO.44);FJ-G11k(SEQIDNO.46);FK-E3k(SEQIDNO.48);IA1-1E7k(SEQIDNO.56);IP-2C11k(SEQIDNO.62);528X(SEQIDNO.4);531k(SEQIDNO.6);533X(SEQIDNO.8);5353i(SEQIDNO.10);537k(SEQIDNO.14);540k(SEQIDNO.16);5453i(SEQIDNO.22);546k(SEQIDNO.24);559X(SEQIDNO.34);F1-C6X(SEQIDNO.38);FB1—A7k(SEQIDNO.40);FD-B2k(SEQIDNO.42);G1D43i(SEQIDNO.50);GC1E8k(SBQIDNO.52);H1C12X(SEQIDNO.54);IF-1C10X(SEQIDNO.58);和IK-2E2X(SEQIDNO.60).本發(fā)明還涉及一種包含以下任意一種互補決定區(qū)3(CDR3)的特異結合刑526HC(SEQIDNO.1);528HC(SEQIDNO.3);531HC(SEQIDNO.5);533HC(SEQIDNO.7);535HC(SEQIDNO.9);536HC(SEQIDNO.11);537HC(SEQIDNO,13);540HC(SEQIDNO.15);543HC(SEQIDNO.17);544HC(SEQIDNO.19);545HC(SEQIDNO.21);546HC(SEQIDNO.23);551HC(SEQIDNO.25);553HC(SEQIDNO.27);555HC(SEQIDNO.29);558HC(SEQIDNO.31);559HC(SEQIDNO.33);565HC(SEQIDNO.35);F1-C6HC(SEQIDNO.37);FB1-A7HC(SEQIDNO.39);FD-B2HC(SEQIDNO.41);FE-B7HC(SEQIDNO.43);FJ-G11HC(SEQIDNO.45);FK-E3HC(SEQIDNO.47);G1D4HC(SEQIDNO.49);GC1E8HC(SEQIDNO.51);H1C12HC(SEQIDNO.53);IAHE7HC(SEQIDNO.55);IF-ICIOHC(SEQIDNO.57);IK-2E2HC(SEQIDNO,59);IP-2C11HC(SEQIDNO.61);526k(SEQIDNO.2);536k(SEQIDNO.12);543k(SEQIDNO,18);544k(SEQIDNO,20);551k(SEQIDNO.26);553k(SEQIDNO.28);555k(SEQIDNO.30);558k(SEQIDNO.32);565k(SEQIDNO.36);FE-B7k(SEQIDNO.44);FJ-G11k(SEQIDNO.46);FK-E3k(SEQIDNO.48);IA1-1E7k(SEQIDNO.56);IP-2C11k(SEQIDNO.62);528人(SEQIDNO.4);531X(SEQIDNO.6);5333i(SEQIDNO.8);535人(SEQIDNO.10);537X(SEQIDNO.14);540X(SEQIDNO.16);545X(SEQIDNO.22);546X(SEQIDNO.24);559k(SEQIDNO.34);F1-C6X(SEQIDNO.38)'，F(xiàn)B1-A71(SEQIDNO.40);FD-B23i(SEQID亂42)'，G1D4X(SEQIDNO,50);GC1E8k(SEQIDNO.52);H1C12k(SEQIDNO.54);IF-1C103i(SEQIDNO.58);和IK-2E23t(SEQIDNO.60).本發(fā)明還提供一種編碼本發(fā)明的特異結合刑的核酸分子.此外，本發(fā)明涉及一種檢測生物樣品中血管生成素-2水平的方法，包括(a)使本發(fā)明的特異結合刑與樣品接觸，和(b)確定特異結合刑與樣品的結合程度.本發(fā)明還涉及一種檢測生物樣品中血管生成素-2水平的方法，包括(a)使本發(fā)明的抗體與樣品接觸，和(b)確定抗體與樣品的結合程度.本發(fā)明還涉及抑制哺乳動物不期望的血管發(fā)生的方法，包括施用治療有效量的這里描述的多肽或組合物.本發(fā)明還涉及調節(jié)哺乳動物血管發(fā)生的方法，包括施用治療有效量的這里描述的多肽或組合物.本12發(fā)明還涉及抑制哺乳動物中以不期望的血管發(fā)生為特征的胂難生長的方法，包括施用治療有效量的這里描述的多肽或組合物.另外，本發(fā)明涉及治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的這里描述的多肽或組合物，和化療藥物.在優(yōu)選的實施方案中，所迷化療藥物是5-FU，CPT-ll，和脫乙酜基紫杉醇(Taxotere)中的至少一種.但是要明白也能使用其他合適的化療藥物和其他癌癥療法.可以明白本發(fā)明的特異結合劑能被用來治療與失去控制的或不期望的血管發(fā)生相關的多種疾病.這樣的疾病包括但不限于，眼新血管化，例如視網(wǎng)膜病(包括糖尿病視網(wǎng)膜病和與年齡相關的黃斑變性)，牛皮褲，成血管瘤，血管瘤，動脈硬化，炎性疾病，例如類風濕性或風濕性炎癥，特別是關節(jié)炎(包括類風濕性關節(jié)炎)，或者其他慢性炎性紊亂，例如慢性哮喘，動脈或移植后動脈粥樣硬化，子宮內膜異位，和肝瘤性疾病，例如所謂實體瘤和液體瘤(例如白血病).通過施用特異結合刑能治療的另外的疾病對于本領域技術人員是顯而易見的.這樣的另外的疾病包括但不限于肥胖，血管滲透，血漿滲漏，骨相關疾病，包括骨質疏松.因此，本發(fā)明進一步涉及治療這些與失去控制或不期望的血管發(fā)生相關的疾病的方法.本發(fā)明的其他實施方案通過這里提供的公開內容容易變成顯而易見的.困1描述了用本發(fā)明的抗Ang-2抗體(克隆533，537或544),對照抗體，或者磷酸緩沖鹽水(PBS)治療的攜帶肺瘤的小鼠腫瘤體積(y-軸)對時間(x-軸)的曲線圖.實施例中描述了詳細情況.困2A，2B,和2C描述分別在全長人Ang-2(hAng-2)，hAng-2的N-末端，和hAng-2的C-末端，對于根據(jù)本發(fā)明的抗體TN8-Con4-C，Ll-7-N，和12-9-3-C,以及對于對照抗體，Tie2-Fc,C2B8，或5B12的表位定位數(shù)據(jù)(O.D.370),實施例中描述了詳細情況.具體實施例方式這里使用這部分的標題只是為了組織的目的，而不是為了在任何方面限制描述的主趙.對于重組DNA分子，蛋白質，和抗體制備，以及對于組織培養(yǎng)和細胞轉化可以應用標準技術.酶促反應和純化技術一般根據(jù)廠商說明進行或者根據(jù)現(xiàn)有技術通常公開的使用常規(guī)方法進行，例如Sambrook等(分子克隆:實驗室手冊"MolecularCloning:ALaboratoryManual"冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.[1989])中給出的那些，或者根據(jù)這里描述的.除非提供具體的定義，這里描述的相關術語，試驗方法和分析化學，合成有機化學，藥學和藥刑化學技術是本領城公知的和常規(guī)使用的.標準技術可以用于化學合成，化學分析，藥物制備，制刑，和送遞，和對患者的治療.除非另外具體說明，貫穿說明書使用的術語如下定義，術語"Ang-2"指美國專利No.6,166,185的圍6中給出的多肽("Tie-2配體-2")或者其片段以及相關的多肽，包括等位變體，剪接變體，衍生物，取代，缺失，和/或插入變體，融合肽和多肽，和種間同系物或者其片段.Ang-2多肽可以包括或可以不包括另外的末端殘基，例如，前導序列，引導序列，氨基末端甲硫氨酸，和賴氨酸殘基，和/或標記或融合蛋白序列，取決于制備它的方法.術語"生物活性"當與Ang-2或Ang-2特異結合刑相關聯(lián)使用時指具有Ang-2或Ang-2特異結合刑的至少一種活性特征的肽或多肽.Ang-2的特異結合刑就Ang-2的至少一種生物活性來說可以具有激動刑，拮抗劑，或中和或阻斷活性.術語'，特異結合刑"指一種分子，優(yōu)選蛋白質分子，其以高于其它血管生成素的親和力結合Ang-2(及這里定義的其變體和衍生物).一種特異結合刑可以是一種蛋白質，肽，核酸，碳水化合物，脂質，或者優(yōu)先與Ang-2結合的小分子量化合物.在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的特異結合刑是以已知技術通過的抗體，如多克隆抗體，單克隆抗體(mAb),嵌合抗體，CDR嫁接的抗體，多特異性抗體，雙特異性抗體，催化抗體，人源化抗體，人抗體，抗獨特型(抗Id)抗體和可以以可溶或結合形式標記的抗體，及其片段、變體或衍生物，它們單獨存在或與其它氡基酸序列組合，所述技術包括但并不限于蘇促裂解，化學裂解，肽合成或重組技術.本發(fā)明的抗-Ang-2特異結合刑能結合Ang-2的部分，調節(jié)，例如，抑制或促進，Ang-2的生物活性和/或其他Ang-2-相關活性.術語"多克隆抗體"是指識別并且結合相同抗原上的不同表位的抗體的異質混合物.可以從粗制血清制刑中獲得多克隆抗體，或者可以使用例如抗原親和層析或蛋白A/蛋白G親和層析進行純化.術語"單克隆抗體"是指由相同的核酸分子編碼的抗體集合，所述抗體任選由單個雜交瘤或其它細胞系產生，或由轉基因哺乳動物產生，這樣一般每種單克隆抗體將識別抗原上的相同表位.術語"單克隆"不限于用于制備抗體的特定方法，該術語也不限于在特定物種，如小鼠、大鼠等中產生的抗體.術語"嵌合抗體"是指一種抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來源于特定物種或屬于特定抗體種類或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而所述鏈的其余部分與來源于另一物種或屬于另一抗體種類或亞類的抗體中的相應序列相同或同源.也包括所述抗體的片段，它們顯示出需要的生物活性(即，特異性結合Ang-2的能力).見美國專利4，816，567和Morrisonetal.，ProcNatlAcadSci(USA),81:6851-6855[1985〗.術語"CDR嫁接的抗體"是指一種抗體，其中來自特定物種或同種型的一種抗體的CDR被重組插入相同或不同物種或同種型的另一種抗體的構架中.術語"多特異性抗體"是指一種具有識別一種或多種抗原上的一個以上表位的可變區(qū)的抗體.該類型抗體的亞類是識別相同或不同抗原上的兩種不同表位的"雙特異性抗體"."催化"抗體是指這樣的抗體，其中一種或多種細胞毒性的，或更普遍地說，一種或更具有生物活性的部分連接于與導向結合刑，術語"人源化抗體"是指一種特定類型的CDR嫁接的抗體，其中抗體構架區(qū)來源于人，但是每個CDR被來源于另一物種的CDR,如鼠CDR取代，術語"CDR"在下文定義，術語"完全的人"抗體是指其中CDR和構架區(qū)均來源于一種或多種人DNA分子的抗體.術語"抗獨特型"抗體是指任何特異性結合于識別抗原的另一種抗體的任何抗體.可以用此處描述的用于產生Ang-2特異性抗體的方法產生抗獨特型抗體，只是這些抗體產生自例如用Ang-2特異性抗體或其Ang-2結合片段免疫動物，而不是Ang-2多肽自身或其片段.這里使用的術語"變體"包括其中天然存在的(至少一種公知的)結合刑的氨基酸序列中的氨基酸殘基被插入，缺失和/或取代的那些肽或多肽.本發(fā)明的變體包括如下所迷的融合蛋白."衍生物"包括以不同于插入，缺失或取代的變體的一些方式化學修飾的那些結合刑."特異性結合Ang-2"指本發(fā)明的特異結合刑(例如抗體，或者其片段)識別并結合成熟的，全長或部分長度的人Ang-2多肽或者其直向同源物的能力，這樣其親和性(根據(jù)例如這里描述的親和性ELISA或BIAcore測定確定)或者其中和能力(根據(jù)這里描述的例如，中和作用ELISA測定或類似測定來確定)至少是相同的任何其他血管生成素或其他肽或多肽的親合力或中和能力的大小的10倍，但是任意地是50倍，100，250或500倍，或者甚至至少IOOO倍，其中抗體的肽部分笫一次與人Fc部分融合用于在這樣的測定中評價.術語"抗原結合域"或"抗原結合區(qū)"是指含有與抗原相互作用并且在結合刑上賦予其對抗原的特異性和親和力的特異結合刑氨基酸殘基(或其它部分)的特異結合刑(如抗體分子)的部分.在抗體中，抗原結合域通常稱作"互補決定區(qū)或CDR".術語"表位"指在一個或多個結合刑的抗原結合區(qū)能被特異結合刑例如抗體識別和結合的任何分子的部分.表位通常由化學活性表面分子基團例如氨基酸或糖基側鏈組成，并且具有特異三維結構特征以及特異電荷特征.這里使用的表位可以是連續(xù)或不連續(xù)的.術語"抑制和/或中和表位"是一種表位，當被特異結合刑例如抗體結合時，它導致體內，體外，或者原位包含這樣的表位的分子，細胞，或生物體的生物活性的喪失(或者至少降低).在本發(fā)明的上下文中，中和表位位于Ang-2的生物活性區(qū)或者與Ang-2的生物活性區(qū)有關.或者，術語"活性表位"是一種表位，當被本發(fā)明的特異結合劑例如抗體結合時，導致Ang-2的生物活性構象激活，或者至少維持，術語"抗體片段"指肽或多肽，其包括完全完整抗體的部分，完全的抗體包含兩個功能獨立的部分或片段稱作"Fab"的抗原結合片段和稱作"Fc"的羧基末端可結晶片段.Fab片段包括來自重鏈和輕鏈的笫一恒定區(qū)(CH1和CL1)以及結合特異性抗體的來自重鏈和輕鏈的可變區(qū).重鏈和輕鏈的每一個都包括三個互補決定區(qū)(CDRs)和分開各個CDRs的構架氨基酸殘基.Pc區(qū)包括笫二和第三重鏈恒定區(qū)(CH2和CH3)并且參與效應物功能如補體激活和呑噬細胞攻擊.在一些抗體中，F(xiàn)c和Fab區(qū)由抗體"鉸鏈區(qū)"分開，并且，根據(jù)全長抗體如何被蛋白酶促裂解，鉸鏈區(qū)可以與Fab或Fc片段締合.例如，用木瓜蛋白酶裂解抗體，導致鉸鏈區(qū)與得到的Fc片段締合，而用胃蛋白酶裂解，提供了其中的鉸鏈區(qū)與兩個Pab片段同時締合的片段.由于兩個Fab片段實際上是在胃蛋白酶裂解之后共價連接的，得到的片段被稱作F(ab02片段.Fc結構域可以具有相對長的血清半壽期，而Fab的壽命短.[Caponetal.，Nature,337:525-31(1989)]當作為融合蛋白的一部分表達時，F(xiàn)c結構域可以賦予更長的半壽期或者帶來諸如Fc受體結合、蛋白A結合、補體固定和可能甚至胎盤轉移至與其融合的蛋白中的功能.Pc區(qū)可以是天然存在的Fc區(qū)，或者可以經(jīng)改變而改進某些質量，如治療質量或循環(huán)時間.術語"可變區(qū)"或"可變結構域"是指抗體輕鏈和/或重鏈的一部分，一般包括重鏈中的大約氨基末端的120-130個氨基酸和輕鏈中的大約100-110個氨基末端氨基酸.可變區(qū)一般在氨基酸序列中，甚至在相同物種的抗體中廣泛不同.抗體的可變區(qū)一般決定其特定抗原的每種特定抗體的結合和特異性.序列的可變性集中在那些稱作互補決定區(qū)(CDRs)的區(qū)域中，而可變區(qū)中保守性更高的區(qū)城稱作構架區(qū)(FR)，輕鏈和重鏈的CDRs在其中含有很大程度負責抗體與抗原的直接相互作用的氨基酸，而FRs中的氨基酸可以顯著影響抗原結合/識別，如下文所討論.當涉及抗體時，根據(jù)恒定區(qū)的氨基酸序列，術語"輕鏈"集中指兩種不同的類型，即K或k.當涉及抗體時，根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，術語"重鏈"是指五種不同的類型，即a，5,s，y和M.重鏈和輕鏈的組合產生了五種公知的抗體類型，分別為IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，包括四種公知的IgG亞類，命名為IgGl，IgG2，IgG3和IgG4.當與象核酸分子，多肽，宿主細胞等這樣的生物材料相關使用時，17術語"天然存在的"指在自然界發(fā)現(xiàn)的沒有被人改變的那些.術語"分離的"當與Ang-2相關或與Ang-2的特異結合刑相關的使用時，指沒有至少一種其天然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的污染多舦或化合物的化合物，優(yōu)選基本上沒有會干擾其治療或診斷用途的污染哺乳動物多肽.當術語"成熟"與Ang-2抗體或者其片段相關使用時，或者與Ang-2的其他蛋白質特異結合刑相關使用時，指沒有前導序列或信號序列的肽或多肽.在例如在原核宿主細胞中表達本發(fā)明的結合刑時，"成熟"肽或多肽還可以包括另外的氨基酸殘基(但是仍然沒有前導序列)，例如氨基末端甲硫氨酸，或者一個或多個甲碟氨酸和賴氨酸殘基.可以使用用這種方法制備的肽或多肽，這些另外的氨基酸殘基已經(jīng)被去除或者沒有被去除.術語"有效量"和"治療有效量"與Ang-2的特異結合刑相關使用時，指對于支持Ang-2的一種或幾種生物活性水平可觀察變化是有用的或必需的量.所述變化可以是Ang-2活性水平的提高或降低.優(yōu)選地，所述變化是Ang-2活性水平的降低.特異結合劑和抗體此處使用的術語"特異結合刑"是指此處描述的具有識別和結合Ang-2的特異性的分子.適當?shù)奶禺惤Y合刑包括，但不限于，抗體及其衍生物，多肽和小分子.可以使用本領域公知的方法制備適當?shù)奶禺惤Y合劑.本發(fā)明的一種示例性的Ang-2多肽特異結合刑能夠結合Ang-2的某一部分，并且優(yōu)選調節(jié)Ang-2多肽的活性或功能.特異性結合Ang-2多肽的抗體和抗體片段等特異結合刑在本發(fā)明的范圍內.抗體可以是多克隆抗體，包括單特異性多克隆抗體，單克隆抗體，重組抗體，嵌合抗體，人源化抗體，如CDR嫁接的抗體，人抗體，單鏈抗體，催化抗體，多特異性和/或雙特異性抗體，及其片段，變體和/或衍生物.一般通過多次皮下或腹膜內注射添加或不添加佐刑的Ang-2多肽或其片段在動物(如兔、倉鼠、山羊、綿羊、馬、豬、大鼠、沙鼠、豚鼠、小鼠或任何其它適當?shù)牟溉閯游?，以及其它非哺乳動物物種)中產生針對Ang-2多肽的單克隆抗體.所述佐刑包括，但不限于弗氏完全和不完全佐刑，礦物凝膠如氯氣化鋁，和表面活性物質如溶血卵磷脂、多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔血藍蛋白和二硝基苯酚.BCG(baci11iCalmette-Guerin)和Corynebacteriumparv咖是可能有用的人類佐刑.將抗原多肽與在要免疫的物種中具有免疫原性的栽體蛋白，如匙孔血藍蛋白，血清，白蛋白，牛血紅蛋白或大豆胰蛋白酶抑制刑偶聯(lián)可能是有用的.同樣，聚集刑如明礬也可用于增強免疫應答，免疫后，對動物取血，測定抗Ang-2多抗體滴度，這可以使用"實施例"部分描述的測定法來確定.多克隆抗體可以在檢測到它們的血清中利用，或者可以從血清中純化，使用例如抗原親和層析或蛋白A或G親和性層析.可以使用例如，但不限于傳統(tǒng)的"雜交瘤"方法或更新的"噬菌體展示"技術產生針對Ang-2多肽的單克隆抗體.例如，可以按照Kohleretal.，Nature256:495[1975；thehumanB-cellhybridomatechnique[Kosboretal.,ImmunolToday4:72(1983);Coteetal.，ProcNatlAcadSci(USA)80:2026-2030(1983);Brodeuretal.，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63，MarcelDekker，Inc.，NewYork,(1987)]andtheEBV-hybridomatechnique[Coleetal.，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanRUssInc，NewYorkN.Y.，pp77-96，(1985)]中描述的雜交瘤方法制備單克隆抗體.本發(fā)明還提供了產生與Ang-2多肽反應的單克隆抗體的雜交瘤細胞系.當使用雜交瘸技術時，可以使用骨號瘤細胞系.所述適用于生產雜交瘤的融合程序的細胞系優(yōu)選不產生抗體，具有高融合效率，并且由于缺乏酶而使得它們不能在僅僅支持所需的融合細胞(雜交瘤)生長的某些選擇性培養(yǎng)基中生長.例如，用于小鼠融合的細胞系為Sp-20,P3-X63Mg8，P3-X63-Ag8.653,NSI/I.Ag41，Sp210-Ag",F0,NS0/U,MPC-11，MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul，用于大鼠融合的細胞系為R210.RCY3，Y3-Ag1,2.3，IR983F和4B210,其它適用于細胞融合的細胞系為U-266,GM1500-GRG2，LICR-L0N-HMy2和UC729-6.考慮雜交瘤和其它產生單克隆抗體的細胞系為本發(fā)明的新組合物.也可使用噬菌體展示技術從任何物種產生單克隆抗體.優(yōu)選地，該技術用于產生完全的人抗體，其中編碼單Fab或Fv抗體片段的多核苷酸在嗟菌體顆粒的表面上表達，[Hoogenboometal.，JMolBiol227:381(1991);Marksetal.，JMolBiol222:581(1991);也見美國專利No.5，885，793].可以使用這里描迷的結合測定"篩選"每個噬菌體，以鑒定那些具有Ang-2親和性的抗體片段.因此，這些方法通過在絲狀噬菌體的表面展示抗體片段所有組成成分而模擬免疫選擇，并且隨后通過它們與Ang-2的結合選擇噬菌體.一種這樣的方法描述于以Adams等的名義提交的PCT申請PCT/US98/17364，該申請描述了使用這樣的方法分離MPL-和msk-受體的高親和性和功能性激動抗體片段.在該方法中，按照以前的描述[Mullinaxetal.,ProcNatlAcadSci(USA)87:8095-8099(1990)]，可以通過從外周血淋巴細胞克隆天然重排的人V基因而產生完全的人抗體所有組成成分的基因.一旦鑒定了編碼本發(fā)明的全長單克隆抗體的每條鏈或Fab或Fv片段的多核苷酸序列，可以采用公知的重組技術和本領域的常規(guī)實踐，使用真核或原核宿主細胞表達單克隆抗體多核苷酸.或者，生產轉基因動物，其中編碼所需特異結合刑的多核苷酸被導入受體動物，例如，小鼠，兔，山羊或牛，采用的方式允許編碼單克隆抗體或其它特異結合劑的多核苷酸分子表達.一方面，可以將編碼單克隆抗體或其它特異結合劑的多核苷酸連接至哺乳動物特異性調節(jié)序列，并且嵌合多核苷酸可以被導入靶動物的生殖系.得到的轉基因動物然后在其乳中產生需要的抗體[Pollocketal.,JImmunolMeth231:147-157(1999);Littleetal.，ImmunolToday8:364-370(2000)]此外，通過用編碼單克隆抗體或其它特異結合劑的多核苷酸轉染適當植物，使用植物表達并且產生Ang-2特異結合刑如單克隆抗體.在本發(fā)明的另一種實施方案中，來源于人之外的物種的單克隆或多克隆抗體或其片段可以是"人源化的"或"嵌合的".對非人抗體進行人源化的方法是本領域公知的(見美國專利5,859,205，5，585，089，和5，693，762)例如，人源化是利用本領域描述的方法[Jonesetal.，Nature321:522-525(1986);Riechmamietal,，Nature,332:323-327(1988);VerhoeyenetaL,Science239:1534-1536(1988)]，通過用人抗體的相應區(qū)域取代如嚙齒動物的互補決定區(qū)(CDRs)的至少一部分而進行的.如此處所討論和本領域所公知，本發(fā)明還提供了這些人抗體的變體和衍生物.本發(fā)明還包括結合Ang-2多肽的完全的人抗體，及其片段、變體和20/或衍生物，可以使用此處描述的噬菌體展示技術產生所述抗體.或者，可以使用在不產生內源性免疫球蛋白的情況下能夠產生人抗體的所有組成成分的轉基因動物(如小鼠)產生所迷抗體.這可以通過用Ang-2抗原或其片段免疫動物而完成，其中Ang-2片段具有Ang-2獨特的氨基酸序列.所述免疫原可以任選與栽體偶聯(lián)，見，例如，Jakobovitsetal.,ProcNatlAcadSci(USA)，90:2551-2555(1993);Jakobovitsetal.，Nature362:255-258(1993);Bruggermannetal.，YearinI咖uno，7:33(1993).在一種方法中，所述轉基因動物是通過使編碼其中的重鏈和輕鏈免疫球蛋白的內源性基因座失去功能，并且將編碼人重鏈和輕鏈蛋白的基因座插入其基因組而制備.然后將具有少免疫系統(tǒng)修飾的動物.當施用免疫原時，這些轉基因動物能夠產生具有人可變區(qū)的抗體，包括人(而不是，例如鼠)的氨基酸序列，它們對于所需的抗原是免疫特異性的.見PCT申請PCT/US96/05928和PCT/US93/06926.其它方法描述于美國專利5,545，807,PCT申請PCT/US91/245，PCT/GB89/01207，以及EP546073B1和EP546073A1.也可以如此處所迷，通過在宿主或者通過在此處所描述的雜交瘤細胞中表達重組DNA而產生人抗體.轉基因是通過4艮多不同的途徑完成的.見，例如，Bruggemanetal.，ImmunolToday17:391-7(1996).在一種方法中，構建一種微基因座，這樣，人工使得種系構型中的基因片段彼此接近.由于大小限制(即一般小于30kb),得到的微基因座將含有有限數(shù)量的不同基因片段，但仍然能夠產生抗體的大的所有組成成分.僅僅含有人DNA序列，包括啟動子和增強子的微基因座在轉基因小鼠中是完全有功能的.當在轉基因動物中需要更大數(shù)目的基因片段時，使用酵母人工染色體(YACs).YACs可以從數(shù)十萬堿基到1Mb,并且通過直接微量注射到卵中或者通過將YAC轉移到胚胎干(ES)細胞系中而導入小鼠(或其它適當?shù)膭游?基因組.一般地，通過純化DNA的脂轉染或酵母原生質球融合而將YACs轉移到ES細胞中，其中純化的DNA攜帶于微團中，并且以類似于雜交瘤融合程序的方式進行融合.在DNA轉移之后選擇所需的BS細胞是通過在YAC上引入本領域公知的任何選擇標記而完成的.作為另一種選擇，使用在細菌大腸桿菌宿主中擴增的噬菌體P1栽體.盡管這些栽體比YAC攜帶更少的插入的DNA,這些克隆容易以足夠高的產率生長，以便允許直接微量注射到小鼠卵中.已經(jīng)證明使用不同Pl栽體的混合物可以導致高水平的同源重組.一旦已經(jīng)使用本領域公知的任何檢測循環(huán)抗體的血清水平的技術(如ELISA)鑒定了適當?shù)霓D基因小鼠(或其它適當?shù)膭游?，將轉基因動物與其中的內源Ig基因座被破壞的小鼠雜交，該結果提供了其中基本上所有的B細胞都表達人抗體的后代.作為另一種選擇，用人Ig基因座置換完整的動物Ig基因座，其中得到的動物僅僅表達人抗體，在另一種方法中，用人基因座中的特定和相應區(qū)域置換動物基因座的部分.在某些情況下，從該程序得到的動物可以表達與完全的人抗體不同的嵌合抗體，這取決于小鼠Ig基因座中置換的性質.也可以通過體外將人脾細胞(B或T細胞)暴露于抗原，然后在免疫受損的小鼠如SCID或nod/SCID中重建暴露的細胞而產生人抗體.見Bramsetal.，JImmunol,160:2051-2058[1998];Carballidoetal.,NatMed，6:103-106[2000].在一種方法中，將人胎組織移植到SCID小鼠(SCID-hu)中，導致長期造血和人T細胞發(fā)育[McCuneetal.，Science241:1532-1639(1988);Ifversenetal.，SemImmunol8:243-248(1996)].這些嵌合小鼠中的任何體液免疫應答完全依賴于這些動物中T細胞的共發(fā)育[Martenssonetal.，Immunol83:1271-179(1994)].在一種可選擇的方法中，將人外周血淋巴細胞腹膜內(或其它方式)移植到SCID小鼠中[Mosieretal.，Nature335:256-259(1988)],當用激發(fā)刑，如葡萄球菌外毒素A(SEA)[Martenssonetal.，Immunol84:224-230(1995)],或抗人CD40單克隆抗體[Murphyetal.，Blood86:1946-1953(1995)處理移植細胞時，檢測到了更高水平的B細胞產生.或者，通過組裝每個人VH片段和隨機核苷酸的D片段以及人J片段從未重排的V基因片段產生完全合成的人重鏈所有組成成分[Hoogenboometal.，JMolBiol227:381-388(1992).同樣，通過組合每個人V片段和J片段構建輕鏈所有組成成分[Griffithsetal.，EMB0J13:3245-3260(1994)].將編碼完整抗體(即重鏈和輕鏈)的核普酸作為單鏈Fv片段連接，并且將該多核苷酸與編碼絲狀噬菌體小外被蛋白的核苷酸連接.當在噬菌體表面表達該融合蛋白時，通過使用固定抗原進行選擇而鑒定編碼特異性抗體的多核苷酸，在另一種方法中，通過使一條鏈與噬菌體蛋白融合，并且將另一條鏈分泌到細菌周質中而將抗體片段組裝為兩個Fab片段[Hoogenboometal.,NuclAcidsRes19:4133-4137[1991];Barbasetal.,ProcNatlAcadSci(USA)88:7978-7982(1991)〗.一般通過重組方法產生嵌合的、人源化的、CDR嫁接的和完全的人抗體或其片段.可以用此處描述的材料和方法將編碼每種抗體的重鏈和輕鏈或其片段的多核苷酸分子導入宿主細胞并且進行表達.在一種優(yōu)選實施方案中，所述抗體在哺乳動物宿主細胞，如CHO細胞中產生，所述產生的詳細內容描述于下文.特異結合劑的融合配偶體在本發(fā)明的另一實施方案中，包含Ang-2抗體可變區(qū)，如具有此處描述的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)或具有此處描述的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的多核苷酸可以在N末端或C末端與人IgG的Fc區(qū)的一個或多個結構城融合.當與一種治療蛋白，如Ang-2特異性抗體的Fab—起構建時，F(xiàn)c結構域可以提供更長的半壽期，或者摻入Fc受體結合、蛋白A結合、補體固定以及可能甚至是胎盤轉移等功能[Caponetal.,Nature,337:525-531(1989)],在一個例子中，可以使用本領域技術人員公知的方法，可以在抗Ang-2Fab或Fv片段等特異結合刑多肽(例如從噬菌體展示文庫獲得)的N末端或C末端融合抗體鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū).可以使用蛋白A或蛋白G親和柱純化得到的融合蛋白.已經(jīng)發(fā)現(xiàn)融合于Fc區(qū)的肽和蛋白與未融合的對應物相比表現(xiàn)出顯著更長的體內半壽期.同樣，與Fc區(qū)的融合允許融合多肽的二聚化/多聚化.Fc區(qū)可以是天然存在的Fc區(qū)，或者可以經(jīng)改變而改進某些質量，如治療質量、循環(huán)時間、減少聚集問題等.本領域公知的其它例子包括以下這些，其中可以來自于人或其它物種或可以是合成的Fc區(qū)與CD30L的N末端融合以治療霍奇金病、退行性淋巴瘤和T細胞白血病(美國專利5,480,981),Pc區(qū)與TNF受體融合以治療膿毒性休克[Fisheretal.，NEnglJMed，334:1697-1702(1996)],Fc區(qū)與Cd4受體融合以治療AIDS〖Caponetal.,Nature,337:525-31(1989)].催化抗體是另一種類型的融合分子，并且包括一種或多種細胞毒性部分或更普遍的是一種或多種生物活性部分連接的抗體，所述抗體與特異結合劑連接.見，例如[Raderetal.，ChemEurJ12:2091-2095(2000).該類型的細胞毒性刑改進抗體介導的細胞毒性，并且包括直接或間接刺激細胞死亡的細胞因子、放射性同位素、化療藥物(包括藥物前體)、細菌毒素(如假單孢菌外毒素、白喉毒素等)、植物毒素(如蓖麻毒蛋白、gelonin等)、化學偶聯(lián)物(如maytansinoid毒素，calechaemicin等)、放射性偶聯(lián)物、醉偶聯(lián)物(RNA酶偶聯(lián)物、抗體定位的酶/藥物前體治療[ADEPT])等部分.一方面，細胞毒性劑可以通過將該試刑結合于抗體上的一種可選擇的抗原識別位點而"連接"于雙特異性或多特異性抗體的一種成分.作為一種選擇，可以在將編碼毒素的多核苷酸連接于編碼結合刑的多核苷酸之后將蛋白毒素表達為與特異結合刑的融合蛋白.在另一種選摔中，可以共價修飾特異結合刑以包括需要的細胞毒素，所述融合蛋白的例子是免疫原性多肽、具有長循環(huán)半壽期的蛋白，如免疫球蛋白恒定區(qū)、標記蛋白、促進所需特異性結合劑多肽純化的蛋白或多肽，以及促進多聚蛋白(如用于二聚體形成/穗定性的亮氨酸拉鏈基序)形成的多肽序列.這種類型的插入性變體通常具有天然分子的所有或大部分，在N或C末端連接于笫二種多肽的所有或一部分.例如，融合蛋白一般使用來自其它物種的前導序列，以便允許蛋白在異源宿主中的重組表達.另一種有用的融合蛋白包括添加免疫學活性結構域,如抗體表位，以便促進融合蛋白的純化.在融合蛋白的結合處或其附近引入裂解位點將促進在純化后去除外源性多肽.一種有用的融合包括連接功能性結構域如酵的活性位點、糖基化位點、細胞導向信號或跨膜區(qū).這種類型的插入變體一般具有在N-或C-末端與笫二多肽的全部或部分連接的天然分子的全部或大部分.例如，融合蛋白一般使用來自其他物種的前導序列以允許在異源宿主沖重組表達蛋白質.另一種有用的融合蛋白包括免疫活性結構域例如抗體表位的加入，以有利于融合蛋白的純化，融合連接處或附近裂解位點所包含的會有利于在純化之24后去除外來多肽，其他有用的融合物包括功能結構域的連接，例如來自酶的活性位點，糖基化結構域，細胞定向信號或跨膜區(qū).有很多可以在本發(fā)明中使用的商售融合蛋白表達系統(tǒng).特別有用的系統(tǒng)包括但不限于谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)系統(tǒng)(Pharmacia)，麥芽糖結合蛋白系統(tǒng)(NEB，Beverley,Mass.)，F(xiàn)LAG系統(tǒng)(IBI,NewHaven,Conn.)，和6xHis系統(tǒng)(Qiagen，Chats窗th，Calif.).這些系統(tǒng)能產生只帶有少數(shù)附加氛基酸的重組肽和/或抗體，這少數(shù)附加氨基酸不可能顯著重組多肽抗原能力.例如，F(xiàn)LAG系統(tǒng)和6xHis系統(tǒng)只加入短序列，已知這兩種系統(tǒng)免疫原性不好并且不會不利地影響多肽折疊成它的天然構象.另一種有用的N-末端融合體是蛋白質或肽的N-末端區(qū)Met-Lys二肽的融合體.這樣的融合體可以產生蛋白質表達或活性的有利的提高.一種特別有用的融合構建體可以是其中特異結合刑肽與半抗原融合以增強特異結合刑融合構建體的免疫原性的那種，所述特異結合刑融合構建體可以用于例如產生本發(fā)明的抗獨特型抗體.所述融合構建體增加免疫原性是本領域技術人員公知的，例如，特異結合刑與輔助抗原如hsp70,或例如來自白喉毒素鏈的肽序列，或細胞因子如IL-2的融合體可以用于激發(fā)免疫應答.在另一種實施方案中，可以制備增強抗原結合刑組合物導向于特定位點或細胞.也考慮其它融合構建體，它包括具有所需特性，如延長血清半壽期的IgG恒定區(qū)或用于導向的抗體或其片段的異源多肽.其他融合體系產生多肽雜合體，其中期望從期望的肽或抗體切除融合配偶體.在一個實施方案中，融合配偶體通過含有蛋白酶的特異識別序列的肽序列與重組抗體連接.合適的序列的例子是煙草Etch病毒蛋白醉(LifeTechnologies,Gaithersburg，Md.)或因子Xa(NewEnglandBiolabs，Beverley,Mass.)識別的那些.本發(fā)明還提供了融合多肽，其包括與截短的組織因子(tTF)組合的Ang-2抗體的可變區(qū)的全部或部分，如具有此處描述的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)或具有此處描迷的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，TTF是由作為腫瘤血管凝固刑發(fā)揮作用的人血凝固-誘導蛋白質的截短形式構成的血管靶向刑，如美國專利Nos.:5,877,289;6,004,555;6,132,729;6,132,730;6,156,321;和歐洲專利No.BP0988056所述.TTF與抗-Ang-2抗體或舦，或者其片段的融合有利于抗-Ang-2向把細胞的送遞.特異結合劑的變體本發(fā)明的特異性結合刑的變體包括插入，缺失，和/或取代變體.在本發(fā)明的一個方面，提供了插入變體，其中一個或多個氨基酸殘基補充了特異結合刑氨基酸序列.插入可以位于氨基酸蛋白的一端或兩端，或者可以位于特異結合刑氨基酸序列的內部區(qū)域.在一個末端或者兩個末端有附加殘基的插入變體能包括，例如，包括氨基酸標記或標記的融合蛋白和蛋白質.插入變體特異結合刑多肽，其中將一個或多個氨基酸殘基添加到特異結合刑氨基酸序列，或其片段.本發(fā)明的變體產物還包括成熟的特異結合刑產物.所迷特異結合刑產物去除了前導序列或信號序列，得到的蛋白質與野生型Ang-2多肽相比有附加的氨基末端殘基.附加的氨基末端殘基可以來源于另一種蛋白，或可以包括一個或多個不能鑒定為來自于特定蛋白的殘基.包括氨基酸位置-1有附加的甲^氨酰殘基的特異性結合刑(Met—1-特異結合刑)，這些是在位置-2和-1有附加的甲疏氨酸和賴氨酸殘基(Met—2-Lys'-特異結合刑)的特異性結合刑產物.有附加的Met，Met-Lys,Lys殘基(或一個或多個堿性殘基，一般地)的變體特別用于在細菌宿主細胞中提高重組蛋白質生產.本發(fā)明還包括使用特異表達系統(tǒng)產生的具有附加的額氨基酸殘基的特異性結合刑.例如，使用表達作為谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合產物的一部分的期望的多肽的商售栽體提供從期望的多肽裂解GST成分之后在氨基酸位置-1具有附加的甘氨酸殘基的期望的多肽.也包括在其他栽體系統(tǒng)表達得到的變體，包括其中一般在序列的羧基和/或氨基末端向氨基酸序列中插入聚組氨酸標記的那些插入變體還包括上文所述的融合蛋白，其中特異結合刑多肽的氨基和/或羧基末端與另一個多肽，其片段或者一般沒有識別是任何特異蛋白質序列的一部分的氨基酸融合.另一方面，本發(fā)明提供缺失變體，其中特異結合刑多肽中一個或多個氨基酸殘基被去除.從特異結合刑多肽的一個或兩個末端進行缺失，或者在抗體氨基酸序列中去除一個或多個殘基.缺失變體必須包括特異結合刑多肽的所有的片段.26抗體片段包括結合于抗原多肽上的表位的抗體部分.所述片段的例子包括Fab和F(ab')2片段，它們例如是通過全長抗體的醉促或化學裂解產生的.其它結合片段包括通過重組DNA技術，如含有編碼抗體可變區(qū)的核酸序列的重組質粒的表達等產生的那些.本發(fā)明還包括Ang-2結合刑的多肽片段，其中所述片段維持了特異性結合Ang-2多肽的能力.此處也包括含有本發(fā)明的肽或多肽的至少5,10，15，20，25,3035,40,45或50個連續(xù)氨基酸的片段.優(yōu)選的多肽片段顯示出本發(fā)明的抗原結合劑獨特或特異的免疫學特性.可以通過本領域公知和常規(guī)實踐的任何方法制備具有所.需免疫學特性的本發(fā)明的片段.另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的特異結合刑的取代變體.一般認為取代變體與原來的多肽"相似"，或者與原來的多肽具有一定的"同一性百分比"，并且包括其中多肽的一個或多個氨基酸殘基被去除并且由其它殘基置換的多肽.一方面，取代作用性質是保守的，但是本發(fā)明包括也是不保守的取代作用.通過公知的方法能容易地計算相關的多肽的同一性和相似性.這樣的方法包括但不限于下面文獻描述的那些ComputationalMolecularBiology,Lesk，A.M.，編著，OxfordUniversityPress,NewYork(1988);Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,編著，AcademicPress,NewYork(1993);ComputerAnalysisofSequenceData,Part1，Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.，編著,HumanaPress,NewJersey(1994);SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G,,AcademicPress(1987)jSequenceAnalysisPri邁er，Gribskov，M.和Devereux，J.,編著，M.StocktonPress,NewYork(1991);和Carillo等，SIAMJ.AppliedMath.,48:1073(1988).設計測定兩個多肽的相關性或同一性百分比的優(yōu)選方法，得到測試序列之間的最大匹配.公眾能夠得到的計算機程序中描述了測定同一性的方法.測定兩個序列之間的同一性的優(yōu)選的計算機程序方法包括但不限于，GCG程序包，包括GAP(Devereux等，Nucl.Acid,Res.，12:387(1984);GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsinMadison,WI，BLASTP，BLASTN,和FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.215:403—410(1990)).公眾從theNationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)和其他來源(BLASTManual,Altschul等NCB/NLM/NIHBethesda，Md.20894;Altschul等，上文(1990))能獲得BLASTX程序.也可以使用公知的SmithWaterman算法來測定同一性，用于將兩個氨基酸序列比對的一些比對方案可以導致兩個序列只有一個短的區(qū)匹配，這個小的比對區(qū)可以具有非常高的序列同一性，即使兩個全長序列之間沒有顯著相關性.因此，在一些實施方案中，選擇的比對方法(GAP程序)可以導致跨距至少是比較的靶多肽全長的10%對齊，即，比較至少400個氨基酸序列時至少40個連續(xù)的氨基酸，比較至少300至大約400個氨基酸序列時至少30個連續(xù)的氨基酸，比較至少300至大約400個氨基酸序列時至少30個連續(xù)的氨基酸，比較200至大約300個氨基酸序列時至少20個連續(xù)的氨基酸，比較大約100至200個氨基酸序列時至少IO個連續(xù)的氨基酸.例如，利用計算機算法GAP(GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,Wis.),將要測定序列同一性百分比的兩個多肽對它們各個氨基酸進行最佳匹配比對("匹配跨度"，根據(jù)算法確定).在一些實施方案中，空位罰分(一般計算為^平均對角線；'，平均對角線"是使用的比較矩陣的對角線的平均值；"對角線"是特定比較矩陣分配給每一個完全氨基酸匹配的分數(shù)或數(shù)目)和空位延長罰分(它通常是空位罰分的1/10倍)，并且與算法聯(lián)合使用象PAM"0或BLOSUM62這樣的比較矩陣.在一些實施方案中，算法還使用標準比較矩陣(關于PAM250比較矩陣，參見Dayhoff等，AtlasofProteinSequenceandStructure,5(3)(1978);關于BLOSUM62比較矩陣，參見Henikoff等，Proc.Natl.Acad.SciUSA,89:10915-10919(1992)).在一些實施方案中，多肽序列比較參數(shù)包括如下算法Needleman等，J.Mol.Biol.,48:443-453(1970);比較矩陣上文Henikoff等(1992)的BLOSUM62;空位罰分12空位延長罰分4相似性閾值0使用上述參數(shù)的GAP程序是有用的.在一些實施方案中，使用GAP28算法，上述參數(shù)對于多肽比較是默認參數(shù)(對于末端空位沒有罰分).在一些實施方案中，對于多核普酸分子序列(與氨基酸序列相對應)的參數(shù)包括如下算法Needleman等，上文(1970);比較矩陣匹配-+10，錯配-O空位罰分50空位延長罰分3使用上述參數(shù)的GAP程序也是有用的，上述參數(shù)對于多核苷酸分子比較是默認參數(shù).其他例舉的算法，空位罰分，空位延長罰分，比較矩陣，相似性閾值等也可以使用ProgramManual,WisconsinPackage,笫9版，1997年9月中提出的那些.進行的具體選擇對于本領域技術人員來說是顯而易見的并且取決于要進行的具體比較，例如DNA-與-DNA,蛋白質-與-蛋白質，蛋白質-與-DNA;另外，比較是否在給定序列對之間(其中一般優(yōu)選GAP或BestPit)或者在一個序列和一個序列的大數(shù)據(jù)庫之間(其中FASTA或BLASTA是優(yōu)選的).如這里使用的，按常規(guī)使用20種常見氨基酸和它們的縮寫.參見Immunology-ASynthesis(笫二版，E.S，Golub和D,R.Gren,Eds.，SinauerAssociates,Sunderland,Mass.(1991))，這里為了所有的目的引作參考，氨基酸可以具有L或D立體化學(除了Gly之外，其即不是L也不是D)，并且本發(fā)明的多肽和成分可以包括立體化學的混合物.但是，L立體化性是優(yōu)選的.本發(fā)明還提供了反向分子，其中氨基酸的氨基末端至羧基末端序列是反向的.例如，具有正常序列X,-X2-X3的分子的反向應該是X廣X廣X,..本發(fā)明還提供了逆-反向分子，其中，如上所述，氨基酸的氨基末端至羧基末端序列是反向的，并且一舦的"L"對映異構體的殘基被改變?yōu)?D"立體異構型.二十種常見氨基酸的立體異構體(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸，例如[oc]-，[cc-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，和其他非常見氨基酸也是本發(fā)明的多肽的合適的成分.非常見氨基酸的例子包括但不限于氨基脂肪酸，p-丙氨酸，p-氨基丙酸，氨基丁酸，哌啶酸,氨基癸酸,氨基庚酸，氨基異丁酸,氨基庚二酸，二氨基丁酸，鎖鏈素，二氨基庚二酸，二氨基丙酸，N-乙基甘氦酸，N-乙基天冬跣胺，幾基賴氨酸，異-羥基賴氨酸,羥基脯氨酸，異鎖鏈素，異-異亮氨酸，N-甲基甘氨酸,肌氨酸，N-甲基異亮氨酸，N-甲基翔氨酸，新纈氨酸,正亮氨酸，烏氨酸，4-羥基脯氨酸，[Y]-羧基谷氨酸，[d-N,N，N-三甲基賴氨酸，[d-N-乙?；嚢彼幔?-碑酸絲氨酸，N-乙耽基絲氛酸，N-甲?；资璋彼?，3-甲基組氛酸，5-羥基賴氨酸，[d-N-甲基精氨酸，和其他相似氛基酸和氨基酸(例如，4-羥基脯氨酸).類似地，除非具體說明，單鏈多核苷酸序列的左手端是5'端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向指為5'方向.初始RNA轉錄本的5'至3'加入方向稱作轉錄方向；和RNA具有相同序列并且是RNA轉錄本的5'至5'端的DNA鏈上的序列區(qū)稱作"上游序列"；和RNA具有相同序列并且是RNA轉錄本的3'至3'端的DNA鏈上的序列區(qū)稱作"下游序列".保守性氨基酸取代可以包括非天然存在的氨基酸殘基,它們一般是通過化學肽合成，而不是通過在生物系統(tǒng)中合成而摻入的.這些包括肽模擬物和氨基酸部分的反向或插入形式.天然存在的殘基可以根據(jù)它們共同的側鏈性質分為幾類1)疏水性Met,Ala，Val，Leu，lie;2)中性疏水性Cys，Ser，Thr，Asn,Gln;3)酸性Asp，Glu;4)堿性His,Lys，Arg;5)影響鏈取向的殘基Gly，Pro;和6)芳香Trp，Tyr，Phe.例如，非保守性取代可以包括將這些類中的一個變化為另一類中的一個.所述取代的殘基可以引入人抗體中與非人抗體同源的區(qū)域，或者引入分子的非同源區(qū).根據(jù),一些實施方案，進行這樣的變化時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)(hydropathicindex).以氨基酸的疏水性和電荷特征為基礎對各種氨基酸指派親水指數(shù).它們是異亮氨酸(+4.5);幾氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氛酸/胱氨酸(+2.5);蛋氨酸(十l.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-O.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-O.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-l.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3，5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5).本領域知曉氨基酸親水指數(shù)在對蛋白質帶來相互影響的生物學功能中的重要性.Kyte等，J.Mol.Biol.,157:105-131(1982),已知某些氨基酸可以被具有相似親水指數(shù)或分數(shù)的另外的氨基酸取代而仍然保留相似的生物活性，在根據(jù)親水指數(shù)進行變化中，在一些實施方案中，包括親水指數(shù)在土2之內的氨基酸取代.在一些實施方案中，包括親水指數(shù)在土l之內的那些，在一些實施方案中，包括親水指數(shù)在土0.5之內的那些.本領域還知曉，以親水性為基礎能有效地進行類似氨基酸的取代，特別是在由此產生的生物功能抗體或肽是為了在免疫實施方案中應用的情況下，本發(fā)明愔況就是如此.在一些實施方案中，蛋白質最大局部平均親水性，這由其相鄰氨基酸的親水性支配，與它的免疫原性和抗原性相關，即，與蛋白質的生物學性質相關.對這些氨基酸殘基指定下面的親水性值精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0士1);絲氨酸(+0.3);天冬氨酸(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(O);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5±1);丙氨酸(-O.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);蛋氨酸(-l.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)在根據(jù)相似親水性值進行改變中，在一些實施方案中，包括其親水性值在土2之內的氨基酸取代.在一些實施方案中，包括親水性值在±1之內的那些，在一些實施方案中，包括親水性值在土O.5之內的那些，人們以親水性為基礎還可以鑒定主要氨基酸序列中的表位這些區(qū)也稱作"表位核心區(qū)".下面表l中給出例示的氨基酸取代作用.表1氨基酸取代作用<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>應用公知的技術，本領域技術人員能確定這里給出的多肽的合適的變體.在一些實施方案中，本領域技術人員通過定位據(jù)信對于活性不是重要的區(qū)而可以鑒定可以改變而不破壞活性的分子的合適的區(qū).在一些實施方案中，人們能鑒定在相似肽或多肽中保守的分子的殘基和部分.在一些實施方案中，即使對生物活性或者對結構是重要的區(qū)也可以進行保.守性氨基酸取代而不破壞生物學活性或者不會不利地影響多肽結構.另外，本領域技術人員能進行對相似多肽鑒定對于活性或結構重要的殘基的結構-功能研究.考慮這樣的比較，人們能預測蛋白質中相應于相似蛋白質中對于活性或結構重要的氨基酸殘基的氨基酸殘基的重要性.本領域技術人員可以選擇對于這樣預測的重要的氨基酸殘基的化學類似氨基酸取代作用.本領域技術人員還能分析與相似多肽中的結構相關的三維結構和氨基酸序列.考慮這樣的信息，本領域技術人員可以對抗體預測有關其三維結構的氨基酸殘基比對.在一些實施方案中，既然這樣的殘基可能在與其他分子的重要的相互作用中涉及，本領域技術人員可以選擇不對預測在蛋白質表面上的氡基酸殘基產生根本變化.此外，本領域技術人員可以獲得在各個期望的氨基酸殘基處包含單一氨基酸取代的試驗變體.然后利用本領域技術人員公知的活性測定能對變體進行篩選.這樣的變體可以被用來收集有關合適的變體的信息.例如，如果有人發(fā)現(xiàn)對特定氨基酸殘基的改變導致活性破壞，不期望的降低，或者不適活性，可以避免有這樣改變的變體.換句話說，根據(jù)從這樣的常規(guī)實驗收集的信息，本領域技術人員能容易地確定應該單獨地或與其他突變組合地避免進一步的取代作用的氨基酸.很多科學出版物致力于二級結構的判斷，參見，MoultJ.，Curr.Op.Biotech.,7(4):422-427(1996),Chou等，Biochemistry,13(2):222-245(1974);Chou等，Biochemistry,113(2):211-222(1974)'，Chou等，Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol"47:45-148(1978);Chou等，Ann.Rev.Biochem.，47:251-276和Chou等，Biophys.J.，26:367-384(1979).此外，目前可獲得輔助判斷二級結構的計算機程序.一種二級結構判斷方法是以同源性模型為基礎的，例如，具有大于30%序列同一性的，或者大于40X相似性的兩個多肽或蛋白質常常具有相似的結構拓樸學.近來蛋白質結構數(shù)據(jù)的增長(PDB)為二級結構提供了提高的可預測性，包括多肽或蛋白質結構中可能的折疊數(shù)目.參見Holm等，Nucl.Acid.Res.，27(1):244-247(1999).有人提出(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3):369-376(1997))—種給定多肽或蛋白質有有限數(shù)目的折疊，而且一旦明了關鍵的結構數(shù)目，結構預測將變得大大地更加精確.確定二級結構的另外的方法包括"threading，'(Jones,D.，Curr.33Opin.Struct.Biol.，7(3):377-87(1997);Sippl等，Structure,4(1):15-19(1996))，"曲線分析"(Bowie等，Science,253:164-170(1991);Gribskov等，Meth.Enzym.，183:146-159(1990);Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13):4355-4358(1987)),和"改良鍵合"(參見Holm，上文(1999)，和Brenner,上文(1997)),在一些實施方案中，抗體變體包括糖基化變體，其中與原多肽的氨基酸序列相比，改變了糖基化位點的數(shù)目和/或類型，在某些實施方案中，蛋白變體包含比天然蛋白更多或更少的N-連接的糖基化位點.一種N-連接的糖基化位點特征在于序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定為X的氨基酸殘基可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸殘基.對構成該序列的氨基酸殘基的取代或加入提供加入N-連接的糖鏈的可能的新的位點，或者，可以去除該序列的取代作用會去除已有的N-連接的糖鏈，還提供了N-連接的糖鏈的重排，其中一個或多個N-連接的糖基化位點(一般是天然存在的那些)被去除并且產生一個或多個新的N-連接的位點.其它優(yōu)選的抗體變體包括半胱氨酸變體，其中與原氨基酸序列相比，缺失了一個或多個半胱氨酸殘基，或者用另一種氨基酸(如絲氨酸)取代.當例如在分離不溶的包含體之后將抗體重新折疊為生物活性構象時，半胱氨酸變體可以是有用的.半胱氨酸變體一般比天然蛋白的半胱氨酸數(shù)目少，并且一般為偶數(shù)，以減少未配對半胱氨酸導致的相互作用.根據(jù)某些實施方案，氨基酸取代(1)減少對蛋白水解的易感性，(2)減少對氧化的易感性，(3)改變對形成蛋白復合物的結合親和力，(4)改變結合親和力，和/或(5)賦予或修飾所述多肽上的其它功能特性.根據(jù)某些實施方案，可以在天然存在的序列中(在某些實施方案中，在形成分子間接觸的結構域外的多肽部分)進行單個或多個氛基酸取代(在某些實施方案中，保守氨基酸取代).在某些實施方案中，保守氨基酸取代一般不會顯著改變母體序列的結構特征)如取代氨基酸不應該破壞母體序列中的螺旋，或破壞作為母體序列特征的其它類型的二級結構.本領域公知的多肽二級和三級結構的例子描述于Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(Creighton,Ed,，W,H,FreemanandCompany,NewYork(1984))jIntroductiontoProteinStructure(C，BrandenandJT，Tooze,eds.，GarlandPublishing,NewYork,N.Y,(1991))jandThorntonetat.Nature354:105(1991).作為多肽或肽取代變體的本發(fā)明的特異結合刑分子中最多可以有大約10-12X的原始氨基酸序列被取代.對于抗體變體，重鏈可以有50，49,48,47,46，45,44，43,42,41,40,39,38,37,36，35,34,33,32，31，30,29,28，27,26，25,24,23,22，21,20，19,18，17,16,15,14，13,12，11，10，9,8，7,6,5,4，3,2，或1個氨基酸被取代，而輕鏈可以有25，24，23，22，21，20，19，18，17，16，15，14,13，12，11，10,9，8,7,6,5，4,3，2,或1個氨基酸被取代,特異結合劑的衍生物本發(fā)明還提供特異結合刑多肽的衍生物.衍生物包括具有不同于氨基酸殘基的插入，缺失或取代的修飾的特異結合刑多肽.優(yōu)選地,修飾作用性質是共價的，并且包括例如，與聚合物，脂質，其他有機和無機部分的化學鍵合.可以制備提高特異結合刑多肽的循環(huán)半壽期的本發(fā)明的衍生物，或者可以設計提高多肽對期望的細胞，組織，或器官的定向能力的本發(fā)明的衍生物.本發(fā)明進一步包括衍生的結合刑，被共價修飾而包括一個或多個水溶性聚合物連接，例如聚乙二醉，聚氧乙二醇，或聚丙二醇，描述于美國專利Nos.:4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4，791，192;和4,179,337.本領域公知的其他有用的聚合物包括一甲氣基-聚乙二醇，葡聚糖，纖維素或者其他以碳水化合物為基礎的聚合物，聚-(N-乙烯基吡咯烷嗣)-聚乙二醇，丙二醇均聚物，a聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物，聚氣乙基化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇，以及這些聚合物的混合物.特別優(yōu)選的是用聚乙二醉(PEG)亞基共價修飾的特異結合刑產物.水溶性聚合物可以在特定位置例如在特異結合刑產物的氨基末端鍵合，或者與多肽的一個或多個側鏈隨機連接.2000年10月17日公布的Gonzales等人的美國專利No.6,133，426描述了用于提高對特異性結合刑，和對于人源化抗體的治療能力的PEG的使用.抗體誘變的靶位點35可以使用某些策略搮作Ang-2-特異性抗體的固有性質，如抗體對其靶的親和力.這些策略包括使用編碼抗體的多核苷酸分子的位點特異性或隨機誘變而產生抗體變體，然后進行設計用于回收表現(xiàn)出所需改變，如增加或降低的親和力的抗體變體的篩選步驟.誘變策略最常見的靶氨基酸殘基是CDRs的氨基酸殘基.如上文所述，這些區(qū)域含有實際上與Ang-2相互作用的殘基和其它影響這些殘基的空間排列的氨基酸.然而，也已經(jīng)證明CDR區(qū)外的可變區(qū)的構架區(qū)中的氨基酸對抗體的抗原結合特性有顯著貢獻，并且可以作為操作所述特性的把，見Hudson,Curr0pinBiotech,9:395-402(1999)及其中的參考文獻.可以通過將隨機或定點嫌變限制于CDRs中相當于容易在親和力成熟過程中"超變"的區(qū)域的位點而產生更小和更有效篩選的抗體變體文庫，見Chowdhury和Pastan，NatureBiotech,17:568-572[1999]及其中的參考文獻.已知以此方式確定超變位點的DNA元件的類型包括直接和反向重復，某些共有序列，二級結構和回文序列.共有DNA序列包括四堿基序列嚷呤-G-嘧啶-A/T(即A或G-G-C或T-A或T)和絲氨酸密碼子AGY(其中Y可以是C或T)因此，本發(fā)明的一種實施方案包括其目標為增加抗體對其靶的親和力的誘變策略.這些策略包括誘變整個可變重鏈和輕鏈，僅僅誘變CDR區(qū)，誘變CDRs中的共有序列超變位點，誘變構架區(qū)，或這些方法的任意組合(在此上下文中的"誘變"可以是隨機或定點的).可以通過本領域技術人員公知的技術，如X線結晶學分辨所討論的抗體和抗體-配體復合物的結構而完成對CDR區(qū)的確定描繪和包含抗體結合位點的殘基的鑒定.基于所述抗體晶體結構的分析和表征的各種方法都是本領域技術人員公知的，并且盡管不能確定，也可以用于估計CDR區(qū).所述常用方法的例子包括Kabat，Chothia,AbM和接觸限定.Kabat限定是基于序列變異性，并且是最常用的預測CDR區(qū)的限定.[JohnsonandWu,NucleicAcidsRes,28:214-8(2000)]Chothia限定是基于結構環(huán)區(qū)的定位[Chothiaetal.,JMolBiol,196:901-17(1986);Chothiaetal.,Nature,342:877-83(1989)],AbM限定是Kabat和Chothia之間的折中，AbM是由OxfordMolecularGroup生產的用于抗體結構模擬的完整程序組[Martinetal.,ProcNatlAcadSci(USA)86:9268-9272(1989);Rees，etal.,ABMT",acomputerprogramformodelingvariableregionsofantibodies,Oxford,UK;OxfordMolecular,Ltd.],AbM程序組采用已知數(shù)據(jù)庫和從頭開始的方法的組合棋擬來自一級測序的抗體三級結構.最近引入了稱作接觸限定的其它限定[MacCallumetal.，JMolBiol,5:732-45(1996)].該限定是基于可獲得的復雜晶體結構的分析.根據(jù)習慣，一般將重鏈中的CDR區(qū)稱作HI,H2和H3并且按順序編號，以便從氨基末端向羧基末端計數(shù).輕鏈中的CDR區(qū)一般稱作LI，L2和L3并且按順序編號，以便從氨基末端向羧基末端計數(shù).根據(jù)Chothia和AbM限定，CDR-H1的長度為大約10-12個殘基，并且一般起始于Cys之后4個殘基，或者根據(jù)Kabat限定一般在5個殘基之后.Hl之后一般是Trp,—般是Trp-Val，但也可以是Trp-Ile，或Trp-Ala,根據(jù)AbM限定，Hl的長度為大約10-12個殘基，而Chothia限定排除了最后4個殘基.根據(jù)Kabat和AbM限定，CDR-H2—般起始于HI的末端后15個殘基，在H2之前的殘基一般是Leu-G1u-Trp-11e-G1y,但也可以有多個變異H2之后一般是氨基酸序列Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala.根據(jù)Kabat限定，H2的長度為大約16-19個殘基，而AbM定義預測長度一般為9-12個殘基.CDR-H3—般起始于H2末端后的33個殘基，并且之前一般是氨基酸序列(典型為Cys-Ala-Arg).H3后一般是氨基酸序列-Gly,H3的長度是3-25個殘基.CDR-L1一般起始于大約殘基24，并且一般隨后是Cys.CDR-L1之后的殘基一般是Trp,并且一般以序列Trp-Tyr-Gln，Trp-Leu-Gln，Trp-Phe-Gln，或Trp-Tyr-Leu起始.CDR-L1的長度為大約10-17個殘基.本發(fā)明的抗體的推定的CDR-L1精確符合該模式，Cys之后是15個氨基酸，然后是Trp-Tyr-Gln.CDR-L2起始于Ll末端后的大約16個殘基.一般其后是殘基Ile-Tyr，Val-Tyr,Ile-Lys或Ile-Phe.CDR-L2的長度為大約7個殘基.CDR-L3—般起始于L2末端后33個殘基，其后一般是Cys.L3之后一般是氨基酸序列Phe-Gly-XXX-Gly.L3的長度為大約7-11個殘基，本領域已經(jīng)描述過各種用于修飾抗體的方法.例如，美國專利5,530:101(屬于Queen等，1996年6月25日)描述了制備人源化抗體的方法，其中人源化免疫球蛋白重鏈可變區(qū)構架區(qū)的序列與供體免疫球蛋白重鏈可變區(qū)構架區(qū)的序列具有65S-95X的同一性.除CDRs外，每個人源化免疫球蛋白鏈一般將含有來自于供體免疫球蛋白構架區(qū)的氨基酸，所述構架區(qū)例如能夠與CDRs相互作用以影響結合親和力，所述氨基酸例如是通過分子模擬預測的緊鄰供體免疫球蛋白中的CDR或者約3埃內的一個或多個氨基酸.可以通過使用各種位置標準中的任意一個或全部而設計每一條重鏈和輕鏈.當組合至完整抗體中時，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白對人基本沒有免疫原性，并且保留與抗原，如含有表位的蛋白或其它化合物的供體免疫球蛋白基本相同的親和力.也參見1997年12月2日授權的Queen等的美國專利5,693,761中的相關方法("Polynucleotidesencodingimprovedhumanizedimmunoglobulins"),1997年12月2日授權的Queen等的美國專利5,693,762("HumanizedImmunoglobulins"),以及1996年12月17日授權的Queen等的美國專利5，585，("HumanizedImmunoglobulins"),1996年10月15日授權的美國專利5,565，332("Productionofchimericantibodies-acombinatorialapproach")的一個實施例中描述了制備與母體抗體具有相似的結合特異性但具有增加的人類特征的抗體和抗體片段的生產方法.人源化抗體是通過鏈混排獲得的，例如，使用噬菌體展示技術，并且將包含感興趣抗原的特異性非人抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)的多舦與人互補(輕或重)鏈可變區(qū)的所有組成成分進行組合.鑒定了感興趣抗原的特異性雜合配對物，并且將來自所選的配對物的人類鏈與人類互補可變區(qū)(輕或重)的所有組成成分進行組合.從得到的抗體多肽二聚物文庫選自雜合體并且用于笫二個人源化混排步猓.或者，如果該雜合體已經(jīng)具有使其具有治療價值的足夠人類特征，則省略該笫二步.也描述了進行修飾以増加人類特征的方法.也見Winter,FEBSLetts430:92-92(1998).作為另一個例子，2000年4月25日授權的Carter等的美國專利6，054，297描述了通過用相應的人CDR氨基酸序列取代CDR氨基酸序38列和/或用相應的人FR氨基酸序列取代FR氨基酸序列而制備人源化抗體的方法.作為另一個例子，1998年6月16日授權的Studnicka等的美國專利5,766，886("Modifiedantibodyvariabledomains")描述了用于鑒定抗體可變區(qū)的氛基酸殘基的方法，所述可變區(qū)可以進行修飾而不減少抗原結合域的天然親和力，同時減少其對異源物質的免疫原性，其中還描述了用于施用于異源物種的修飾的抗體可變區(qū)的制備方法.如所討論的內容，通過本領域公知的任何方法對抗體進行的修飾，一般設計為增加受體中對抗原的結合親和力和/或減少抗體的免疫原性.在一種方法中，可以修飾人源化抗體以去除糖基化位點，從而增加抗體對其相關抗原的親和力[Coetal.,MolImmunol30:1361-1367(1993)]."重塑形"、"超嵌合化"和"veneering/resurfacing"等技術產生了具有更強治療潛能的人源化抗體[Vaswamietal.,AnnalsofAllergy,Asthma,&Immunol81:105(1998);Roguskaetal.，ProtEngineer9:895-904(1996)],也參見2000年月6日授權的Hardman等的美國專利6,072，035，其中描迷了對抗體進行重新塑形的方法.盡管這些技術通過減少外源殘基的數(shù)目而減少了抗體的免疫原性，它們不能防止重復施用抗體之后的抗獨特型和抗異型反應.用于替代這些方法減少免疫原性的方法描述于Gillilandetal.，JImmunol62(6):3663-71(1999).在許多情況下，對抗體進行人源化導致失去了抗原結合能力.因此優(yōu)選"逆向突變"人源化抗體以包含原始(最常見是嚙齒類)抗體中的一個或多個氨基酸殘基，以便試圖恢復抗體的結合親和力.例如參見Saldanhaetal.,MolImmunol36:709-19(1999).非肽特異結合劑類似物/蛋白質模擬物此外，也包括提供穩(wěn)定結構或減小生物降解性的肽的非肽特異結合劑類似物.在選擇的抑制肽的基礎上通過非肽部分置換一個或多個殘基能制備肽模擬物類似物.優(yōu)逸地，非肽部分允許肽保留它的天然構象，或者穩(wěn)定一種優(yōu)選的，例如，生物活性構象，它保留識別和結合Ang-2的能力，一方面，得到的類似物/模擬物顯示對Ang-2的提高的結合親和力.Nachman等，Regul.Pept.57:359-370(1995)中描迷了從肽制備非肽模擬物類似物的方法的一個例子.如果期望，例如通過本發(fā)明肽的糖基化作用，酰胺化作用，羧酸化作用，或磷酸化作用，或者通過產生酸加成鹽，觥胺，醋，特別是C-末端醋，和N-耽基衍生物，能修飾本發(fā)明的特異結合刑肽.通過與其他部分形成共價或非共價復合物，也可以對特異結合刑肽加以修飾，產生肽衍生物.通過在N-或C-末端使化學部分與合物.特別地，預見所述特異結合刑肽能與報道基團結合，包括但不限于放射性標記，熒光標記，醉(例如，催化測熱反應或熒光反應)，底物，固體基體，栽體(例如，生物素或抗生物素蛋白).因此，本發(fā)明提供一種包括抗體分子的分子，其中所述分子優(yōu)選進一步包括選自放射性標記，熒光標記，酶，底物，固體基體，栽體的報道基團.這樣的標記是本領域技術人員公知的，例如，特別包括生物素標記.這樣的標記的應用是本領域技術人員公知的，并且描述于，例如，美國專利Nos.3,817,837;3,850,752;3,996,345;和4,277,437.有用的其他標記包括但不限于放射性標記，熒光標記和化學發(fā)光標記，涉及使用這樣的標記物的美國專利包括，例如美國專利Nos.3,817,837;3,850,752;3,939，350;和3，996，345.本發(fā)明的任何肽可以包括任何這些標記的一個，兩個，或多個.制備特異結合劑的方法根據(jù)常規(guī)技術可以在溶液中或者在固相栽體上合成作為蛋白的本發(fā)明的特異結合刑.固相肽合成目前的限制是85-100氨基酸長度.但是，化學合成技術通?？梢杂糜诨瘜W連接一系列小肽以產生全長多肽.各種各樣的自動合成儀是商業(yè)上可獲得的并且可以根據(jù)公知的方法使用參見,例如，Stewart和Young(上文)；Tam等，J.Am,Chem.Soc.，105:6442，(1983);Merrifield,Science232:341-347(1986);Barany和Merrifield,ThePeptides,GrossandMeienhofer,編著,AcademicPress,NewYork,l-284jBarany等，Int.J.Pep.ProteinRes，,30:705-739(1987);和美國專利No.5,424,398,各篇文獻在此引作參考.固相肽合成方法使用共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，含有0.1-1.0mM胺/克聚合物.這些肽合成方法使用丁基氣羰基(t-BOC)或9-芴基甲氧羰40基(FMOC)保護oc-氨基.兩種方法都涉及分步合成，從肽的C-末端開始每一步加上一個^IU^酸(參見，Coligan等，Curr.Prot.Immunol.，WileyInterscience，1991，笫9單元).完成化學合成時，可以將合成肽去保護，去除t-B0C或FMOC^保護基團并且降低的溫度下用酸處理從聚合物上裂解下來(例如，液體冊-10%茴香酸在Or下處理大約0，25至大約1小時).蒸發(fā)溶刑之后，用1X乙酸溶液從聚合物萃取出肽，然后凍干，得到粗產物.一般通過象在SephadexG-15上使用5N乙酸作為溶刑進行凝膠過濾這樣的技術進行純化.將過柱的合適的級分凍干得到同質肽或肽衍生物，然后用標準技術進行表征，象氨基酸分析，薄層色謙法，髙效液相色謙法，紫外吸收光譜法，摩爾旋光，溶解性，并且通過固相埃德曼降解定量測定.抗-Ang2-抗體、及其衍生物、變體和片段，以及其它基于蛋白的Ang-2結合刑的化學合成允許將非天然存在的4U^酸摻入試刑.重組DNA技術是制備本發(fā)明的全長抗體和其他蛋白質特異性結合刑或者其片段的常規(guī)方法.可以將編碼抗體或片段的cDNA分子插入表達栽體，其接著可以被插入宿主細胞產生抗體或片段.可以理解編碼所述抗體的cDNAs可以被修飾，以改變"原始"cDNA(從mRNA翻譯)，以便提供密碼子簡并或允許在各種宿主細胞中的密碼子偏好使用.一般情況下，應用這里實施例中描述的方法能獲得編碼肽的DNA分子.當需要獲得與原始抗體分子相關的Fab分子或CDRs時，可以使用標準技術篩選適當?shù)奈膸?噬菌體展示文庫；淋巴細胞文庫等)，以鑒定和克隆相關Fabs/CDRs.用于所述篩選的探針可以是編碼原始抗體Fab部分的全長或截短的Fab探針,針對原始抗體Fab部分的一個或多個CDRs的探針，或其它合適的探針.當采用DNA片段作為探針時，典型的雜交條件是Ausubel等(CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocolsPress[1994])中提出的那些.雜交之后，根據(jù)象探針大小，克隆的探針的期望的同源性，篩選的文庫的類型，和篩選的克隆的數(shù)目達樣的因素，在合適的嚴謹度下洗滌探針印跡.高嚴謹度嬸選的例子是在50-65iC之間的溫度下，0,1XSSC，和O.1%SDS.可以使用各種各樣的表達栽體/宿主系統(tǒng)包含和表達編碼本發(fā)明的特異結合刑多肽的多核苷酸分子.這些系統(tǒng)包括但不限于微生物，例如重組堪菌體，質?；蛘沉NA表達栽體轉化的細菌；酵母表達栽體轉化的酵母；病毒表達栽體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；病毒表達栽體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)轉染的或者細菌表達栽體(例如，Ti或pBR322質粒)轉化的植物細胞體系；或者動物細胞體系.重組特異結合刑蛋白質生產中有用的哺乳動物細胞包括但不限于VER0細胞，HeLa細胞，中國倉鼠卵巢(CH0)細胞系，COS細胞(例如C0S-7)，W138,BHK，HepG2，3T3，RIN，MDCK,A549,PC12,K562和293細胞，以及此處描述的雜交瘤細胞系.哺乳動物細胞系優(yōu)選用于制備特異結合刑如抗體和抗體片段，它們一般被糖基化，并且其活性需要正確的重折疊，優(yōu)選的哺乳動物細胞系包括CH0細胞、雜交瘤細胞和骨拔瘤細胞.下文描述一些用于重組表達特異結合刑蛋白的示例性方法.術語"表達栽體"指用于從DNA(RNA)序列表達多肽的質粒，噬菌體，病毒或栽體.一個表達栽體可以包括轉錄羊元，包括下面結構的組裝(1)遺傳元件或者在基因表達中具有調節(jié)作用的元件，例如啟動子或增強子，(2)被轉錄到mRNA中并且翻譯成蛋白質的編碼結合刑的結構或序列，和(3)合適的轉錄起始和終止序列.要在酵母或真核表達系統(tǒng)中使用的結構單元優(yōu)選包括使宿主細胞胞外分泌翻譯的蛋白質的前導序列.或者，沒有前導序列或轉運序列表達重組蛋白質的情況下，可以包括氨基末端甲疏氨酰殘基.這種殘基可以或可以不接著從表達的重組蛋白裂解，提供肽終產物.例如，使用商售表達系統(tǒng)，例如Pichia表達系統(tǒng)(Invitrogen，SanDiego,Calif.)，根據(jù)生產商的說明，可以在酵母中重組表達肽.這種系統(tǒng)還依賴指導分泌的前-原-a序列，但是甲醇誘導時醇氧化酶(A0X1)啟動子驅動插入片段的轉錄.通過，例如，用來從細菌和哺乳動物細胞上清液純化肽的方法，從酵母生長培養(yǎng)基純化分泌的特異結合刑肽.或者，可以將編碼特異結合劑肽的cDNA克隆到桿狀病毒表達栽體pVL1393(PharMingen，SanDiego,Calif.)中.可以根據(jù)生產商說明(PharMingen)使用這種栽體在沒有sF9蛋白質的培養(yǎng)基中感染Spodopterafrugiperda細胞，產生重組蛋白，使用肝素-瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia)純化并濃縮特異結合刑蛋白.或者，在昆蟲系統(tǒng)中表達肽.用于蛋白質表達的昆蟲系統(tǒng)是本領域技術人員公知的.在一個這樣的系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核型內多角體病毒(AcNPV)能被用作在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞或粉紋夜蛾(TrichopUsia)幼蟲中表達外源基因的栽體.可以將特異結合刑肽編碼序列克隆到病毒的不重要的區(qū)，例如多角體蛋白基因，并且置于多角體蛋白啟動子的控制下.成功插入特異結合刑肽會使得多角體蛋白基因失活，并且產生沒有外被蛋白外殼的重組蛋白.可以使用重組病毒感染草地夜蛾細胞或粉紋夜蛾幼蟲，表達肽.Smith等，J.Virol.46:584(1983);Engelhard等，Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)91:3224-7(1994).在另一個實施例中，通過PCR能擴增編碼特異結合刑肽的DNA序列，并且克隆到合適的栽體中，例如，pGEX-3X(Pharmacia).設計pGEX栽體產生包括谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)的栽體編碼的融合蛋白，和通過插入到栽體克隆位點中的DNA片段編碼的特異結合刑蛋白.能制備包括例如一個合適的酶切位點的PCR引物.僅使用有利于表達的融合部分或者另外不期望與感興趣的肽連接，然后從融合蛋白的GST部分切割下來重組特異結合劑融合蛋白.pGEX-3X/特異結合劑肽構建體被轉化到大腸桿菌XL-1Blue細胞(Stratagene,LaJollaCalif.)中，并且分離各個轉化體并且培養(yǎng).純化各個轉化體的質粒DNA，并且使用自動測序儀部分測序，證實以合適的方向編碼核酸插入片段的期望的特異性結合劑的存在.使用此處描述的重組系統(tǒng)表達編碼抗-Ang-2抗體及其片段的多核苷酸可以導致產生抗體或其片段，所述抗體或其片段必須"重折疊"(正確產生各種二硫橋)而獲得生物活性.所述抗體的典型重折疊程序見此處的實施例和下面的章節(jié).可以如下純化特異結合刑，所述特異結合刑被制備成細菌中的不溶性包含體，離心破壞宿主細胞；在O.15MNaCl,10mMTris,pH8,1mMEDTA中洗滌；并且在室溫下用0.1毫克/毫升溶菌酶(Sigma,St.Louis,Mo.)處理15分鐘.超聲處理澄清溶胞產物，并且通過以12，OOOXg離心10分鐘沉積細胞碎屑.將含有特異結合刑的沉淀重新懸浮于50mMTris，pH8,和10mMEDTA,用50S甘油分層，并且以6,OOOXg離心30分鐘.將沉淀重新懸浮于沒有狄8十+和0&++的標準鹽酸緩沖鹽溶液(PBS)中.通過將重新懸浮的沉淀在變性SDS-PAGE(Sambrook等，上文)中分級分離而進一步純化特異結合刑.凝膠在0.4MKC1中浸透，顯現(xiàn)蛋白質，將其切下并且在沒有SDS的凝膠展開緩沖液中電洗脫.如果在細菌中產生的GST/融合蛋白是可溶蛋白，可以利用GSTPurificationModule(Pharmacia)將其純化，用于重組蛋白表達的哺乳動物宿主系統(tǒng)是本領城技術人員公知的.對于加工表達蛋白或者產生某些翻譯后修飾的特定能力選擇宿主細胞菌林，所述修飾在提供蛋白質活性中有用.這樣的多肽修飾作用包括但不限于乙酰化作用，羧化作用，糖基化作用，砩酸化作用，脂質化作用和酕化作用，與象CHO這樣的宿主細胞不同，HeLa，MDCK,293,W138等具有這樣的翻譯后活性的特定細胞機構和特征機理，并且可以選擇來確保引入的外來蛋白質的正確修飾和加工.可以利用很多種篩選系統(tǒng)來回收已經(jīng)被轉化重組產生蛋白質的細胞.這樣的選棒系統(tǒng)包括但不限于HSV胸腺嘧咬核苷激醉，次黃嘌呤-烏噪呤磷酸核糖轉移酶和腺噪呤磷酸核糖轉移酶基因，分別在tk-，hgprt-或aprt-細胞中.還有，抗-代謝物抗性被用作下面篩選的基礎DHFR,它帶來甲氨嚷呤抗性；gpt,它帶來審盼酸抗性；neo，它帶來氨基苷G418抗性并帶來綠黃隆抗性;和hygro,它帶來潮審素抗性.可以使用的其他可選擇基因包括trpB，它使得細胞利用吲哚代替色氛酸，或hisD，它使得細胞利用histinol代替組氨酸.給出用于鑒定轉化體的可視指征的標記包括花色素苷,p-葡萄糖搭酸酶及其底物，GUS，和熒光素睞及其底物，熒光素.特異性結合劑的純化和重折疊在某些情況下，本發(fā)明的特異性結合劑為了有生物活性可能需要"重折疊"并且被氧化為合適的三級結構并且產生二硫鍵.應用本領域公知的很多種方法能實現(xiàn)重折疊.這樣的方法包括，例如,在離液劑的存在下將可溶性多肽試劑暴露給通常高于7的pH.離液刑的選擇類似于胞函體增溶作用使用的選摔,但是一般使用低濃度的離液劑舉例的離液刑是胍在大多數(shù)情況下，重折疊/氣化溶液還含有還原刑加特定比例的其氣化形式，產生特定的氣化還原潛能，使得可能存在形成半耽氨酸橋的二疏化合物.一些常用的氧化還原對包括半耽氨酸/胱胺，谷胱甘肽/二疏雙GSH,二氯化銅，二硫蘇糖醇DTT/二嚷烷DTT,和2-巰基乙醇(bME)/二疏-bME.在《艮多情況下，可以使用輔助溶劑提高重折疊效率.通常使用的輔助溶刑包括甘油，各種分子量的聚乙二醇，和胍.期望純化本發(fā)明的特異結合刑蛋白或其變體.蛋白質純化技術是本領域公知的.這些技術在一個水平上包括多肽和非多肽級分的分級分離.將所述特異結合刑多肽與其他蛋白質分離之后，應用實現(xiàn)部分或完全純化(或者純化至均勻)的色詳法和電泳技術能進一步純化感興趣的多肽.特別適合制備本發(fā)明的特異結合刑的分析方法是離子交換色謙法，排阻層析；聚丙烯跣胺凝膠電泳；等電聚焦.純化肽的特別有效的方法是快速蛋白質液相色譜法或HPLC.本發(fā)明的一些方面涉及純化，在特定實施方案中，涉及所編碼特異結合刑蛋白或肽的大量純化.這里使用的術語"純化的特異結合刑蛋白或肽"，是意指與其他成分可分離的成分，其中將特異結合刑蛋白或肽純化至相對其天然可獲得狀態(tài)的任何程度，因此純化的特異結合刑蛋白或肽也稱作從其天然存在的環(huán)境脫離的特異結合劑蛋白或肽.一般，"純化的"指經(jīng)分級分離去除各種其他成分的特異結合刑組合物，所述組合物基本上保持其表達的生物活性.使用術語"基本上純化"時,該概念指特異結合刑組合物，其中特異結合劑蛋白或肽形成組合物的主要成分，例如組合物中蛋白質構成大約50、大約60X，大約70X，大約80、大約大約95X或更多.從現(xiàn)有公開物來說，本領域技術人員公知很多用于定量特異結合刑的純化的方法.這些包括，例如，測定活性級分特異結合活性，或者通過SDS/PAGE分析測定級分中特異結合刑的量.評定特異結合刑級分的純度的優(yōu)選的方法是計算級分的特異性結合活性，將它與開始的提取物的結合活性比較,這樣計算出純化度，這里通過"-純化倍數(shù)"評價.用來表示結合活性的量的實際單位當然取決于選擇進行純化的特定分析技術和特異結合刑蛋白或肽是否顯示可檢測結合活性.適合在結合刑蛋白純化中使用的各種技術對于本領域技術人員是公知的.這些包括，例如，用碟酸銨沉淀，PBG，抗體(免疫沉淀)等或者通過熱變性，接著離心；色譜步稞例如親和色譜(例如，Protein-A-Sepharose)，離子交換，凝膠過濾，反相，羥基磷灰石和親和色謙；等電聚焦，凝膠電泳，以及這些和其他技術的組合.正如本領域公知的，相信進行各種純化步驟的順序是可以改變的，或者可以省略一些步騍，仍然得到制備基本上純的特異性結合刑的合適的方法.一般不要求本發(fā)明的特異結合刑總是以其最純化的狀態(tài)提供.亊實上，想到在一些實施方案中比基本上純稍差的特異結合刑產物具有用途.通過組合中較少的純化步驟，或者通過使用不同形式的相同的一般純化方案，可以實現(xiàn)部分純化.例如，知道使用HPLC設備進行的陽離子交換柱色譜一般會導致比利用低壓色譜系統(tǒng)的相同技術更大"倍數(shù)"的純化作用.顯示低度相對純化的方法在特異結合刑的總回收中，或者在特異結合刑的結合活性的保持中有益.已知特異結合刑的遷移隨著SDS/PAGE的不同條件可以改變，有時改變顯著[Capaldi等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，76:425(1977)].因此明白在不同的電泳條件下，純化或部分純化的特異性結合劑表達產物的表觀分子量可以變化.結合分析免疫結合分析一般使用與分析物靶抗原特異性結合并且經(jīng)常固定分析物靶抗原的捕獲刑.捕獲刑是與分析物特異性結合的部分.在本發(fā)明的一個實施方案中，捕獲刑是特異性結合Ang-2的特異結合刑或者其片段.這些免疫結合分析是本領域公知的[Asai，編著MethodsinCellBiology,Vol.37,AntibodiesinCellBiology,AcademicPress,Inc.,NewYork(1993)〗.免疫結合分析常常使用標記試刑，它是捕獲刑或抗原形成的結合的復合物存在的信號.標記試劑可以是包括結合的復合物的分子之一；即它可以是標記的特異性結合刑或者標記的抗特異性結合刑抗體.或者，標記試刑可以是笫三分子，通常是另一種抗體，它結合結合的復合物.標記試劑可以是，例如，帶有標記的抗特異性結合刑抗體.二抗，對結合的復合物是特異性的，可以沒有標記，但是能被笫四分子結合，笫四分子對于二抗是其中一員的抗體物質是特異性的.例如,二抗可以被可檢測部分修飾，例如生物素，它之后被笫四分子結合，所述笫四分子例如醉標記的鏈霉抗生物素蛋白.能特異性結合免疫球蛋白的恒定區(qū)的其他蛋白質，例如蛋白質A或蛋白質G也可以被用作標記試刑，這些結合蛋白質是鏈球菌細胞壁正常成分并且具有與各種物種的免疫球蛋白恒定區(qū)的強的非免疫原反應性，Akerstrom，J.Immunol.,135:2589-2542(1985);Chaubert，Mod.Pathol.，10:585-591(1997).在分析中，每一次混合試刑之后可能要求溫育和/或洗滌步騍.溫育步驟可以是大約5秒至幾小時，優(yōu)選大約5分鐘至大約24小時.但是，溫育時間取決于分析形式，分析物，溶液體積，濃度等.通常，在環(huán)境溫度下進行分析，但是在一定溫度范圍內可以進行.A.非竟爭性結合鑒定法免疫結合鑒定法可以是非竟爭性類型.這些分析有一定量的直接測量的捕獲分析物.例如，在優(yōu)選的"夾心"鑒定法中，捕獲試刑(抗體)可以直接結合固體底物，在那里被固定.這些固定化捕獲試刑然后捕獲(結合)分析樣品中存在的抗原.這樣被固定的蛋白質然后結合標記試刑，例如帶有標記的二抗.在另一個優(yōu)選的"夾心"鑒定法中，二抗沒有標記，但是可以被對二抗從中衍生的物質的抗體特異性的標記抗體結合.二抗還可以被可檢測部分例如生物素修飾，第三標記分子例如鏈審抗生物生蛋白能特異性結合生物素-參見Harlow和Lane，Antibodies,ALaboratoryManual,Ch14，ColdSpringHarborLaboratory,NY(1988),這里引作參考.B.竟爭性結合鑒定法免疫結合鑒定法可以是竟爭性類型.通過測定樣品中存在的分析物置換的或者從捕獲試刑完全去除的加入的分析物的量，間接測定樣品中存在的分析物的量.在一個優(yōu)選的竟爭性結合鑒定法中，向樣品加入通常被標記的已知量的分析物，樣品然后接觸抗體(捕獲試刑).與抗體結合的標記分析物的量與樣品中存在的分析物的濃度成反比(參見，Harlow和Lane,Antibodies,ALaboratoryManual,Ch14,pp.579-583，上文).在另一個優(yōu)選的竟爭性結合鑒定法中，捕獲試刑固定在固體底物上.通過測定蛋白質/抗體復合體中存在的蛋白質的量，或者通過測定保留的沒有復合的蛋白質的量，可以測定與捕獲試刑結合的蛋白質的量.通過提供標記蛋白質可以測定蛋白質的量.Harlow和Lane(上文)，在另一個優(yōu)選的竟爭性結合鑒定法中，利用半抗原抑制作用，這里，已知的分析物固定在固體底物上.向樣品加入已知量的抗體，并且樣品接觸固定的分析物，與固定的分析物結合的抗體的量與樣品中存在的分析物的量成反比.通過測定抗體的固定級分或者溶液中保留的級分可以測定固定化抗體的量。測定可以是直接的，其中抗體被標記，或者通過接著加入標記部分而間接測定，所述標記部分如上所述特異性結合抗體.c.競爭性結合鑒定法的應用竟爭性結合鑒定法可以用于交叉反應測定，允許技術人員測定本發(fā)明的特異結合刑識別的蛋白質或酶復合體是不是期望的蛋白質而不是交叉反應分子，或者測定融合蛋白是不是對抗原是特異性的而不結合不相關的抗原.在這種類型的鑒定法中，抗原可以固定到固體栽體上并且向測試中加入未知蛋白質混合物，它會與特異結合刑與固定化蛋白質的結合相竟爭.該竟爭分子還結合與所述抗原不相關的一種或幾種抗原.將蛋白質與特異結合刑和固定化抗原結合相竟爭的能力與和固體栽體固定化的相同蛋白質的結合相比較，測定蛋白質混合物的交叉反應.D.其他結合鑒定法本發(fā)明還提供Western印跡法，測定或定量分析樣品中Ang-2的存在.所述技術一般包括以分子量為基礎通過凝膠電泳分離樣品蛋白質并且將蛋白質轉移到合適的固體栽體，例如硝基纖維素過濾器，尼龍過濾器，或衍生化尼龍過濾器.樣品和特異性結合Ang-2的抗體或者其片段溫育并且檢測得到的復合體.這些抗體可以直接被標記或者接著被檢測，使用特異性結合抗體的標記抗體.實施例中闡述了檢測破壞Ang—2與其受體結合的Ang—2特異結合刑的結合測定.診斷分析本發(fā)明的肽或者其片段用于特征在于表達Ang-2或亞基的癥狀或疾病的診斷，或者用于對用Ang-2的誘導物，其片段，Ang-2活性的激動劑或抑制刑治療的患者監(jiān)測的檢定中.對于Ang-2的診斷鑒定包括使用特異結合劑和標記檢測人體液或者細胞或組織提取物中的Ang-2的方法.本發(fā)明的特異結合劑可以在有或沒有修飾作用下使用.在優(yōu)選的診斷鑒定法中，通過連接，例如標記或報道分子，將特異結合刑標記.很多種標記和報道分子是公知的，其中的一些已經(jīng)在這里描述.特別地，本發(fā)明用于人疾病的診斷.本領域公知很多種使用對各種蛋白質特異的多克隆和單克隆抗體測定Ang-2蛋白質的方法.例子包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA),放射免疫測定(RIA)和熒光激活細胞分類(FACS).使用與Ang-2上兩個不干擾表位反應的單克隆抗體的兩個位點單克隆為基礎的免疫測定是優(yōu)選的.這些測定方法描述于，例如，Maddox等，J.Exp.Med.，158:1211(1983).為了提供診斷基礎，通常確定人Ang-2表達的正常或標準值.在本領域公知的適合復合體形成的條件下，通過將來自正常受試者優(yōu)選人的體液或細胞提取物與抗Ang-2的抗體混合，來實現(xiàn)測定.使用對照和疾病樣品，通過比較特異結合刑與已知重的Ang-2蛋白質的結合能定量測定標準復合體形成的量.然后，將從正常樣品獲得的標準值與從可能受疾病影響的受試者的樣品獲得的值相比較.標準值和實驗值之間的偏差表明對于疾病狀態(tài)中的Ang-2的作用，對于診斷應用，在一些實施方案中，本發(fā)明的特異結合劑或肽一般用可檢測部分標記.可檢測部分可以是任何能直接或間摔產生可檢測信號的那些.例如，可檢測部分可以是放射性同位素，例如H，C，P,S,或I，熒光或化學發(fā)光化合物，例如熒光素異疏代氛酸醋，諾丹明，或熒光素;或者酶，例如堿性磷酸酶，[P]-半乳糖苷酶,或辣根過氣化物酶.Bayer等，Meth.Enz.,184:138-163，(1990).疾病本發(fā)明提供用于治療人疾病和病理狀態(tài)的結合Ang-2的特異結合刑，可以與其他治療藥物結合使用調節(jié)Ang-2結合活性或者其他細胞活性的試刑，以增強它們的治療效果或者降低可能的副作用.一方面，本發(fā)明提供用于治療特征在于細胞中不期望的或異常水平的Ang-2活性的疾病和癥狀的藥物和方法.這些疾病包括癌癥，和其他超增殖癥狀，例如增生，牛皮褲,接觸性皮炎，免疫失調，和不孕癥.本發(fā)明還提供了治療動物包括人的癌癥的方法，包括對動物施用有效量的特異性結合刑，所述特異結合刑抑制或降低Ang-2活性.本發(fā)明進一步涉及抑制癌細胞生長的方法，包括生物系統(tǒng)中細胞增殖，侵入，和轉移過程，所述方法包括使用本發(fā)明的化合物作為癌細胞生長抑制刑.優(yōu)選地，應用所述方法對活體動物例如哺乳動物抑制或減小癌細胞生長，侵入，轉移，或腫瘤發(fā)生.本發(fā)明的方法還容易適合在測試系統(tǒng)中使用，例如，分析癌細胞生長及其性質，以及鑒定影響癌細胞生長的化合物.本發(fā)明的方法可治療的癌癥優(yōu)選在哺乳動物中發(fā)生.哺乳動物包括，例如，人和其他靈長目，以及寵物或陪伴動物例如狗和貓，試驗用動物例如大鼠，小鼠和兔,和農場動物例如馬，豬，羊，和牛.瘤或腫瘤包括其中細胞增殖失控且進行性的組織細胞的生長.一些這樣的生長是良性的，但是其他稱作惡性并且可能導致生物死亡.惡性胂瘤或癌與良性生長的區(qū)別在于，除,了表現(xiàn)出進行性細胞增殖之外，它們可以侵犯周圍的組織并且轉移，此外，惡性肺瘤特征在于它們表現(xiàn)出較大分化損失(較大去分化)，以及相對另一種和它們周閨組織的它們的組織的較大損失.這種性質也稱作"退行發(fā)育"，本發(fā)明可治療的腫瘤還包括實體瘸，即，癌和肉瘤.癌包括滲透(侵入)周圍組織并且發(fā)生轉移的得自上皮細胞的那些惡性腫瘤.腺癌是得自腺組織的癌，或者它形成可識別腺組織.另一個寬的分類或癌包括肉瘤，它們是包埋在纖絲或同質物質象胚胎締結組織中的細胞.本發(fā)明還能治療骨拔或淋巴系統(tǒng)癌癥，包括白血病，淋巴瘤和一般不以腫瘤質存在而是分布在血管或淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)中的其他癌癥.能接受本發(fā)明治療的癌或腫瘸的類型包括，例如，ACTH-產生腫瘤，急性淋巴細胞白血病，急性非淋巴細胞白血病，腎上腺內皮癌，膀胱癌，腦癌，乳腺癌，子宮頸癌，慢性淋巴細胞白血病，慢性髄細胞白血病，結腸癌，皮膚T-細胞淋巴瘤，子宮內膜癌，食管癌，Ewing's肉瘤，膽囊癌，毛狀細胞白血病，頭頸癌，霍奇金淋巴瘤，Kaposi's肉瘤，腎癌，肝癌，肺癌(小細胞和非小細胞)，惡性腹膜積液，惡性胸膜積液，黑素瘤，間皮瘤，多樣骨號瘤，神經(jīng)胚細胞瘤，神經(jīng)膠質瘤，非霍奇金淋巴瘤，骨肉瘤，卵巢癌，卵巢(胚細胞)癌，胰腺癌，陰莖癌，前列腺癌，視網(wǎng)膜母細胞瘤，皮膚癌，軟組織肉瘤，辟狀細胞癌，胃癌，睪丸癌，甲狀腺癌，滋養(yǎng)層腫瘤，子宮癌，陰道癌，陰戶癌，和Wilms'腫瘤.關于一些類型的實驗確定的癌癥的治療，本發(fā)明在這里特別詳細地描述.在這些詳述的治療中，使用現(xiàn)有技術標準體外和體內模型.這些方法能被用來鑒定預期在體內治療方案中有效的藥物.但是，明白本發(fā)明的方法不局限于這些腫瘤類型的治療，而是延伸到源自任何器官系統(tǒng)的實體瘤.其侵入或轉移與Ang-2表達或活性有關的癌癥特別易于用本發(fā)明抑制或者甚至被誘導退化.本發(fā)明還通過包括使用下面的本發(fā)明的化合物而實施，例如與另一種抗癌化療藥物例如任何常用化療藥物結合的特異結合刑.特異性結合刑與這樣的其他藥物結合能使化療方案有增強的作用.熟練醫(yī)師會想到很多種化療法能結合本發(fā)明的方法.可以使用任何化療藥物，包括烷基化試刑，抗代謝物，激素和拮抗刑，放射性同位素，以及天然產物.例如，本發(fā)明的化合物能和抗生素一起給藥，所迷抗生素例如阿審素和其他蒽環(huán)審素類似物，氮芥例如環(huán)褲耽胺，嘧啶類似物例如5-氣尿嘧啶，順鉑，羥基脲，紫杉醇及其天然和合成衍生物，等.在另一個實施例中，在混合腫瘤情況下，例如乳腺癌，其中腫瘤包括促性激素依賴性和非促性激素依賴性細胞，該化合物可以和抑那通或果絲瑞寧(LH-RH的合成肽類似物)聯(lián)合給藥.其他抗腫瘤方案包括使用四環(huán)素化合物和另一種治療用藥程式，例如，手術，放射等，這里也稱作"輔助抗腫瘤用藥程式"因此，本發(fā)明的方法可以使用這樣的常規(guī)方案進行，好處是減小副作用并且增強藥效，本發(fā)明因此提供用于治療多種癌癥，包括實體瘤和白血病，的組合物和方法.可以治療的癌癥類型包括但不限于乳腺癌，前列腺癌，和結腸癌；所有形式的肺支氣管原癌；骨拔癌；黑素瘤；肝臟腫瘤；成神經(jīng)細胞瘤；乳頭狀瘤；胺前體攝取與脫羧細胞瘤；迷芽瘤；腮原瘤；惡性癌綜合癥；癌心臟?。话?例如,Walker癌,基細胞癌，basosqua邁ous癌,Brown-Pearce癌，導管癌，Ehrlich腫瘤，Krebs2癌，梅克爾細胞，粘蛋白，非小細胞肺癌，燕麥細胞，乳頭狀痏，硬癌，細支氣管癌，支氣管原癌，辨狀細胞癌，和移行細胞癌)；組織細胞性??；白血病；惡性組織細胞增多；Hodgkin's??；免疫增殖小細胞肺癌；非霍金森淋巴瘤；漿細胞瘤；網(wǎng)狀內皮組織增殖；黑素瘤；成軟骨瘤；軟骨瘤；軟骨肉瘤；纖維瘤；纖維肉瘤；巨細胞腫瘤；組織細胞瘤；脂瘤；脂肉瘤；間皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；顱咽管瘤；無性細胞瘤；錯構瘤；間葉瘤；中腎瘤；肌肉瘤；成釉細胞瘤；牙骨質瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；tophoblastic腫瘤，此外，也可以治療下面類型的癌癥腺瘤；膽管瘤；膽脂瘤；cyclindroma;囊腺癌；囊腺瘤；粒層細胞瘤；兩性胚細胞瘤；肝細胞瘤；汗腺腺瘤；小烏細胞腫瘤；間質細胞胂瘤；乳頭狀瘤；塞爾托利氏細胞腫瘤；鞘細胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉辨；原粒細胞病；肌痛；肌肉瘤；橫故肌瘤；橫紋肌肉瘤；室管膜瘤；神經(jīng)節(jié)瘤；神經(jīng)膠質瘤；成神經(jīng)管細胞瘤；腦膜瘤；神經(jīng)鞘瘤；成神經(jīng)細胞瘤；神經(jīng)上皮痗；神經(jīng)纖維瘤；神經(jīng)瘤；副神經(jīng)節(jié)瘤；副神經(jīng)節(jié)瘤nonchromaffin;血管角質瘤；嗜曙紅細胞增多類淋巴管增生；血管瘤硬化；多發(fā)性血管瘤；血管球瘤；血管內皮瘤；血管瘤；血管外皮細胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘸；松果體瘤；癌肉瘤；軟骨肉瘤；葉狀囊性肉瘤；纖維肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；淋巴瘤性白血??；脂肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；橫故肌肉瘤；肉瘤；贅生物；nerofibromatosis;和子宮頸發(fā)育異常，本發(fā)明的另一方面是使用本發(fā)明的材料和方法來防止和/或治療任何皮膚超增殖癥狀，包括牛皮褲和接觸性皮炎或者其他超增殖疾病.已經(jīng)證明牛皮褲和接觸性皮炎患者其身體病灶有升高的Ang-2活性;絡合刑(例如咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮,p-環(huán)糊精或羥丙基-p-環(huán)糊精)；填料；單糖；二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖，甘露糖，或糊精)；蛋白質(例如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白)；著色刑；矯味刑和稀釋刑；乳化刑；親水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷兩)；低分子量多肽；成鹽抗衡粒子(例如鈉)；防腐刑(例如氦化爺烷銨,苯甲酸，水楊酸，疏貢撒，苯乙醉，羥苯甲醋，羥苯丙酯，洗必太，山梨酸或過氣化氯)；溶刑(例如甘油，丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露糖醉或山梨糖醇)；懸浮刑；表面活性刑或濕潤刑(例如普流羅尼，PEG,脫水山梨糖醇酯，聚山梨酯類例如聚山梨酯20，聚山梨酯80，三辨基甲苯，氨丁三醇，卵磷脂，膽固醇，四丁酚搭)；穩(wěn)定增強刑(蔗糖或山梨醇)；緊張性增強刑(例如堿金屬鹵化物(優(yōu)選氣化鈉或氣化鐘，甘露糖醇，山梨糖醇)；運送栽體;稀釋刑；賦形刑和/或藥物佐刑(Remington'sPharmaceuticalSciences,第18板,A.R，Gennaro，編著，MackPublishingCompany,1990),根據(jù)例如想用的給藥途徑，送遞方式，和期望的刑量，本領域技術人員會確定最佳藥物組合物.參見，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,上文.這樣的組合物可以影響特異性結合刑的物理狀態(tài)，穩(wěn)定性，和體內釋放速度，和體內清除速度.藥物組合物中的主要賦形劑和栽體性質可以是含水的或非水的.例如，合適的賦形刑或栽體可以是注射用水，生理鹽水或人工腦脊號液,可能補充有腸胃外給藥組合物中常用的其他材料.中性緩沖鹽水或者與血清白蛋白混合的鹽水是另外的舉例的賦形刑.其他例示的藥物組合物含有大約pH7.0-8.5的Tris援沖液，或者大約pH4.0-5.5的乙酸援沖液，其可以進一步包括山梨糖醇或者合適的替代物.在本發(fā)明的一個實施方案中，可以通過將具有期望程度純度的選擇的組合物和任意的配藥制刑(Remington'sPharmaceuticalSciences,上文)混合成凍干塊狀物或水溶液而制備結合刑組合物儲存.此外，利用合適的賦形刑例如蔗糖可以將結合刑產物配制成凍干刑.可以選摔用于腸胃外給藥的藥物組合物.或者，可以選擇組合物用于吸入法或腸給藥例如口服，耳給藥，眼給藥，直腸，或陰道給藥.這樣的藥學可接受組合物的制備在本領域技術人員能力之內.給藥部位可接受的濃縮物中存在制刑成分，例如，使用緩沖液保持組合物為生理pH或者稍低的pH，一般在大約5至大約8的pH范圍內.當涉及腸胃外給藥時，本發(fā)明中使用的治療性組合物可以是無熱源的藥學可接受賦形刑中含有期望的特異性結合刑的腸胃外可接受水溶液，用于腸胃外注射的特別合適的賦形刑是無菌水，其中結合刑被配制成無菌的，等張的溶液，使當?shù)胤栏?而另一個制備涉及用一種提供產物緩蝕或持續(xù)性釋放然后通過貯存注射送遞的物質，例如可注射微球體，生物可降解顆粒，聚合物化合物(聚乳酸，聚乙醇酸)，小球，或脂質體，將期望的分子制成制刑.也可以使用透明質酸，它在循環(huán)中有推廣延長時間的作用.引入期望的分子的其他合適的方法包括可植入藥物送遞裝置另一方面，可以在水溶液，優(yōu)選生理可容緩沖液例如Hanks'溶液，ringer's溶液，或者生理緩沖鹽水中配制適合腸胃外給藥的藥物制刑.含水注射懸浮液可以含有提高懸浮液粘度的物質，例如羧甲基纖維素鈉，山梨糖醇，或葡聚糖.另外，可以將活性化合物懸浮液制備成合適的油注射懸浮液.合適的親油性溶刑或賦形劑包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸醣，例如油酸乙醋，三甘油脂，或脂質體.非脂質聚陽離子M聚合物可以用于送藥.任選地，懸浮液還可以含有合適的穗定刑或者提高化合物溶解度的試劑，制備出高濃縮溶液.在另一個實施方案中，藥物組合物可以配制成吸入法用藥.例如，可以將結合劑配制成吸入用干粉末刑.也可以用用于氣霧劑送藥的拋射刑配制多肽或核酸分子吸入用溶液.在另一個實施方案中，可以噴灑溶液.PCT申請No.PCT/US94/001875中進一步描述了肺給藥，它描述了肺給藥化學修飾的蛋白質.還涉及可以口服施用一些制刑.在本發(fā)明的一個實施方案中，使用或不使用象片刑和膠囊這樣的固體刑型是常規(guī)使用的那些栽體，能配制以這種方式給藥的結合刑分子.例如，設計膠嚢，當生物利用率最大并且系統(tǒng)之前降解最小時，在胃腸道的一點釋放制刑的活性部分.可以含有附加試刑以有利于結合刑分子的吸收.也可以使用稀釋刑，矯味刑，低熔點蠟，植物油，潤滑劑，懸浮刑，片刑崩解刑，和粘合刑.使用本領域技術人員公知的藥學可接受栽體也能將用于口服給藥的藥物組合物配制成適合口服給藥的劑型.這樣的栽體使藥物組合物被配制成患者攝食的片劑，丸刑，糖衣丸,膠嚢，液體，凝膠，糖漿，漿液，懸浮液，等.通過將活性化合物與固體賦形劑混合并且將得到的顆?；旌霞庸ぬ幚?任選地，在研磨之后)，獲得片劑或糖衣丸核心，能獲得口服使用的藥物制刑.如果期望，可以加入合適的輔助刑.合適的輔助劑包括碳水化合物或蛋白質，例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇，和山梨糖醇；來自玉米，小麥，稻，馬鈴審，或其他植物的淀粉；纖維素,例如甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，或羧甲基纖維素鈉；樹膠，包括阿拉伯膠和黃芪膠；和蛋白質，例如明膠和膠原.如果期望，可以加入崩解刑或增溶刑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮瓊脂，和海萊酸或者其鹽，例如藻酸鹽.糖衣丸心核可以與合適的包衣聯(lián)合使用，所述合適的包衣是例如濃糖溶液，它還可以含有阿拉伯膠，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，carbopolgel，聚乙二醇，和/或二氧化鈦，漆溶液，和合適的有機溶刑或溶刑混合物.可以向片刑或糖九刑包衣加入染料或顏料，用于產物識別或者表征活性化合物的量，即，刑量.可以口服使用的藥物制刑還可以包括明膠制成的適合推動的膠囊，以及明膠和包衣例如甘油或山梨糖醇制成的軟密封膠囊.適合推動的膠嚢可以含有與填料或粘合刑例如乳糖或淀粉，潤滑刑，例如滑石或硬脂酸鎂，和任選地，穩(wěn)定刑混合的活性成分.在軟膠囊中，活性化合物可以溶解于或懸浮于合適的液體中，例如脂肪油，液體，液體聚乙二醇，有或沒有穩(wěn)定刑.另一種藥物組合物可以含有與適合制備片刑的無毒賦形刑的混合物中有效量的結合劑.通過將片刑溶解于無菌水，或者其他合適的賦形刑中，可以制備單位刑量形式的溶液.合適的賦形刑包括但相比于，惰性稀釋刑，例如碳酸鈣，碳酸鈉或碳酸氫鈉，乳糖，或砩酸鉤；或粘合試刑，例如淀粉，明膠，或阿拉伯膠；或潤滑刑例如硬脂酸鎂，硬脂酸，或滑石.另外的藥物組合物對于本領域技術人員是顯然的，包括持續(xù)性釋放或緩釋送藥制刑中含有結合刑分子的制劑.配制各種各樣的其他持續(xù)性或緩釋送藥方式的技術，例如脂質體栽體，生物可降解微?；蛘叽罂仔∏蚝唾A存注射液，對于本領域技術人員也是公知的.參見，例如，PCT/US93/00829,它描述了用于送遞藥物組合物的大孔聚合物微粒的緩釋.持續(xù)性釋放制刑的另外的例子包括有形物品形式的半滲透聚合物基體,例如膜，或微膠囊.持續(xù)性釋放基體可以包括聚酯類，水凝膠，聚較酯(美國專利No.3,773,919，EP58,481)，L-谷氨酸和yL-谷氨酸乙醋的共聚物[Sidman等，Biopolymers，22:547-556(1983)]，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)[Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277，(1981)和aanger等，Chem.Tech.,12:98-105(1982)],乙酸亞乙基乙烯酯(Langer等，上文)或聚-D(-)-3-鞋基丁酸(BP133,988).持續(xù)性釋放組合物還包括脂質體，通過本領域公知的幾種方法制備.參見，例如，Eppstein等，Proc,Natl.Acad.Sci.(USA)，82:3688-3692(1985);EP36,676;EP88,046;EP143,949.用于體內施用的藥物組合物一般一定要滅菌.通過滅菌過濾膜滅菌過濾能實現(xiàn)這樣.將組合物凍干，在凍干和重新配制之前或之后可以實施利用這種方法的滅菌.用于腸胃外給藥的組合物可以以凍干形式或在溶液中儲存.另外，一般將腸胃外組合物置于具有滅菌入口的容器內，例如，帶有皮下注射針頭可穿透的塞子的靜脈溶液袋或小瓶.一旦配制了藥物組合物，可以在滅菌小瓶中貯溶液，懸浮液，凝膠，乳狀液，固體，或脫水或凍干粉末刑.可以以待用形式或者在給藥之前需要重新配置的形式(例如凍干的)貯存這樣的制刑.在具體的實施方案中，本發(fā)明涉及用于制備單刑量給藥單位的試刑盒.試刑盒可以各自含有盛有干燥的蛋白質的笫一容器和盛有含水制刑的第二容器兩者.本發(fā)明范圍內還包括包含單個或多個小室預裝注射器(例如液體注射器和凍干刑注射器)的試刑盒.治療上使用的藥物組合物的有效量取決于，例如，治療背景和主體，本領域技術人員明白用于治療的適當?shù)男塘克绞遣煌?，部分取決于送遞的分子，使用的結合刑分子的適應征，給藥途徑，和患者的大小(體重，體表面或器官大小)和狀況(年齡和一般的健康情況).因此，臨床醫(yī)師可以確定劑量并且改變給藥途徑，以獲得最佳治療效果.根據(jù)上面提到的因素，典型的刑量范圍是大約0.1mg/kg至最多大約100mg/kg或者更多，在其他實施方案中，刑量范閨可以是0，lmg/kg最多至100mg/kg;或者1mg/kg至最多大約100mg/kg;或者5mg/kg至最多大約100mg/kg,對于任何化合物，開始時在細胞培養(yǎng)物或者動物模型例如小鼠，大鼠，兔，狗，豬，或猴中能估計治療有效刑量.還可以使用動物模型來確定合適的濃度范圍和給藥途徑.然后利用這樣的信息來確定對人給藥的有用的刑量和途徑.考慮與需要治療的受試者相關的因素確定精確刑量.調節(jié)刑重和施用，提供足夠水平的活性化合物或者保持期望的作用.可以考慮的因素包括病態(tài)的嚴重性，受者的一般健康，受者的年齡，體重和性別，該藥的時間和次數(shù)，藥物聯(lián)合，反應靈敏性，對治療的反應.根據(jù)特定制刑的半壽期和清除率，可以每3-4天，每周，或者每兩周施用長效藥物組合物.給藥次數(shù)取決于使用的制刑中結合劑分子的藥物動力學參數(shù).一般地，施用組合物，直到用量達到期望的作用.因此，可以用單刑量，或隨時間多次給藥(以相同或不同濃度/刑量)，或者連續(xù)輸液，可以施用組合物，合適刑量的進一步精確給藥方案是常規(guī)制定的.通過使用適當?shù)男塘?反應數(shù)據(jù)，可以確定合適的劑量.藥物組合物的給藥途徑與已知方法相一致，例如口服，通過靜脈內，腹膜內，大腦內(薄壁組織內)，腦室內，肌內，眼內，動脈內，肝門內，病灶內途徑注射，骨拔內，鞘內，室內，經(jīng)皮，皮下，腹膜內，鼻內，腸內，局部，舌下，尿道，陰道，或者直腸方式，通過持續(xù)性釋放系統(tǒng)或者通過埋入裝置.期望時，通過大丸劑注射，或者通過輸液或者通過埋入裝置連續(xù)施用組合物.或者，另外，通過埋入其上已經(jīng)吸收或者包在其中有期望的分子的膜，海綿狀物質，或者其他合適的材料，可以局部施用組合物.當使用埋入裝置時，可以將裝置埋入任何合適的組織或器官，期望的分子的送遞可以通過擴散，隨時間釋放的大丸刑，或者連續(xù)給藥.在某些情況下，期望以來自體內的方式使用藥物組合物在這樣的情況下，使來自患者的細胞，組織，或器官接觸藥物組合物，其后接著將這些細胞，組織，和/或器官植回給患者.在另外的情況下，本發(fā)明的結合劑例如特異結合刑能通過埋入利用這里描述的方法經(jīng)基因工程處理表達和分泌多肽的細胞送遞.這樣的細胞可以是動物或人細胞，并且可以是自身的，異種的，或異基因的.任選地，細胞可以是無限增殖的.為了減小免疫應答機會，可以將細胞包在莢膜內，以避免周圍組織滲透.密封材料是生物相容的半滲透聚合物外殼或膜，它允許蛋白質產物釋放但是防止患者免疫系統(tǒng)或者周圍組織的其他有害因子對細胞的破壞.聯(lián)合治療在Ang-2病理的治療中，本發(fā)明的特異性結合刑可以與其他治療法聯(lián)合應用.這些其他療法包括，例如放射療法，化療藥物和其它生長因子.化療治療可以使用抗胂瘤藥物，包括，例如，烷基化試劑，包括氮芥，例如雙氣乙基甲胺，環(huán)磷酰胺，異磷跣胺，左旋溶肉瘤素和苯丁酸氮芥；亞硝基脲類，例如卡氮芥(BCNU),洛氮芥(CCNU)，和司莫司汀(甲基-CCNU);氮丙啶/甲基三聚氰胺例如三亞乙基三聚氛胺(TEM)，三胺疏磷，硫替哌(嚷替哌)，六甲基三聚氛胺(HMM，六甲蜜胺)；磺酸坑基酯，例如白消安；三喚類，例如達卡巴喚(DTIC);抗代謝物，包括葉酸類似物，例如甲氨嚷呤和曲美沙特，嘧啶類似物，例如5-氟尿嘧啶，氟去氧尿苷，吉西他濱，胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖孢苷)，5-氮雜胞苷，2，2'-二氣脫氧胞苷，嗜呤類似物，例如6-巰基嘌呤，6-疏代鳥嘌呤，疏唑嘌呤，2'-脫氧助間型霉素(噴司他丁)，赤型羥基壬基腺鄰呤(EHM)，磷酸象達拉濱，和2-氯脫氧腺苷(克拉屈濱，2-CdA);天然產物，包括抗有絲分裂藥物，例如紫杉醇，長春花生物堿，包括長春堿(VLB),長春新堿，和長春烯堿，脫乙?；仙即?，雌莫司汀，和鹽酸雌莫司?。籶pipodophylotoxins例如依托泊苦和替尼泊普；抗生素例如acti邁omycinD，乘毛審素(乘紅審素)，阿審素，二羥蒽二嗣，去甲柔毛莓素，博萊莓素，光輝審素(普卡審素)，絲裂審素C,和放線菌素；酶例如L-天冬酰胺酶；生物學反應修飾劑例如干擾素-a，IL-2，G-CSF和GM-CSF;各種藥物例如鉑復合物例如順鉑和卡鉑，蒽二酮類例如二羥蒽二輛，取代的脲例如雍基脲，甲基肼衍生物包括N-甲基肼(MIH)和甲千肼，腎上腺皮質抑制刑例如米托坦(o,p'-DDD)和安普米特；激素和拮抗刑包括腎上腺皮質激素甾族化合物拮抗刑例如強的松和等價物，地塞米松和安香米特；孕激素例如長效黃體酮，甲羥孕酮乙酸鹽和甲地孕酮乙酸鹽；雌激素例如己烯雌酚和乙炔基雌二醇等價物；抗雌激素例如他莫西芬；雄激素包括丙酸華丸和氟甲辛酮/等價物；抗雄激素例如氣他胺，促性腺素釋放激素類似物和抑那通；和非甾族抗雄激素例如氣他胺，和生長因子的聯(lián)合治療包括細胞因子，淋巴因子，生長因子，或者其他造血因子，例如M-CSF，GM-CSF，TNF,IL-l,IL-2，IL-3,IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL-14,IL-15,IL-16,IL-17,IL-18,IFN,TNFO，TNF1，TNF2，G-CSF，Meg-CSF,GM-CSF，血小板生成素，干細胞因子，和紅細胞生成素.其他成分包括已知的血小板生成素，例如Ang-l，-2，-4,-Y，和/或人Ang-樣多肽，和/或血管內皮生長因子(VEGF).生長因子包括血管生成素，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-3，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5,骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7,骨形態(tài)發(fā)生蛋白-8，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-10,骨形態(tài)發(fā)生蛋白-11，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-12，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-13，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-14，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15，骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IA,骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB，腦起源神經(jīng)營養(yǎng)因子，睫狀營養(yǎng)佳良因子，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體，細胞因子一誇導的嗜中性白細胞趨化因子1,細胞因子-誘導的嗜中性白細胞趨化因子2，內皮細胞生長因子，內皮素l，表皮生長因子，來自上皮的嗜中性白細胞誘引劑，成纖維細胞生長因子4，成纖維細胞生長因子5，成纖維細胞生長因子6，成纖維細胞生長因子7，成纖維細胞生長因子8,成纖維細胞生長因子8b,成纖維細胞生長因子8c,成纖維細胞生長因子9，成纖維細胞生長因子10,酸性成纖維細胞生長因子，堿性成纖維細胞生長因子，得自神經(jīng)膠質細胞系的嗜中性細胞因子受體-1，得自神經(jīng)膠質細胞系的嗜中性細胞因子受體-2,生長相關蛋白質，生長相關蛋白質-1，生長相關蛋白質-2，生長相關蛋白質-3，肝素結合表皮生長因子，肝細胞生長因子，肝細胞生長因子受體，胰島素-樣生長因子I，胰島素-樣生長因子受體，胰烏素-樣生長因子II，胰島素-樣生長因子結合蛋白，角質形成細胞生長因子，白血病抑制因子，白血病抑制因子受體-l，神經(jīng)生長因子，神經(jīng)生長因子受體,神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4，胎盤生長因子，胎盤生長因子2，得自血小板的內皮細胞生長因子，得自血小板的生長因子，得自血小板的生長因子A鏈，得自血小板的生長因子AA，得自血小板的生長因子AB，得自血小板的生長因子B鏈，得自血小板的生長因子BB，得自血小板的生長因子受體-1，得自血小板的生長因子受體-2，pre-B細胞生長刺激因子，干細胞因子，干細胞因子受體，轉化生長因子-1，轉化生長因子-2，轉化生長因子-1.2，轉化生長因子-3，轉化生長因子-5，潛伏型轉化生長因子-1，轉化生長因子-1結合蛋白I，轉化生長因子-l結合蛋白II，轉化生長因子-l結合蛋白III，肺瘤壞死因子受體I型，腫瘤壞死因子受體II，尿激酶型纖溶酶原激活劑受體，血管內皮生長因子，及其嵌合蛋白和生物學或免疫學活性片段.免疫治療免疫治療一般依賴定向并破壞癌細胞的免疫效應子細胞和分子的使用.免疫效應子可以是，例如，識別靶細胞表面上的一些標記的本發(fā)明的特異結合刑.單獨的抗體可以用作治療的效應子或者它可以補充其他細胞來實際實施細胞殺傷.抗體也可以偶聯(lián)藥物或毒素(化療藥物，放射性核素，蓖麻毒A鏈，霍亂毒素，百日咳毒素，等)，因此可以只作為把向試刑.根據(jù)本發(fā)明，通過免疫療法可以將Ang-2的突變形式靶向于本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物.特別考慮本發(fā)明的抗體組合物可以與結合Ang-2把向治療的治療方法聯(lián)合應用.已經(jīng)證明被動免疫療法對于抗多種癌癥特別有效.參見，例如，W098/39027.下面的實施例只是為了詳細說明的目的，而不應該認為在任何方面限制本發(fā)明的范圍，實施例1病理組織和正常組織中Ang-2表達利用原位雜交檢查正常和病理組織中Ang-2表達.通過逆轉錄醉-PCR從人或鼠胎兒肺cDNA擴增人(GenbankAccessionNumber:AF004327，核普酸1274-1726)和鼠(GenbankAccessionNumber:AF004326,核苷酸1135-1588)Ang-2序列的片段，克隆到質粒pGEM-T中，并且通過測序證實.使用"P-UTP和RNA聚合酶從線性化質粒模板轉錄"P-標記反義RNA探針.甲S^固定化的石蠟包埋的組織塊切成5微米，并且收集在帶電栽玻片上.原位雜交之前，組織用0.2MHCL,接著用蛋白酶K消化，并且用三乙醇胺和乙酸肝進行乙?；饔?55TC下切片與放射性標記探針雜交過夜，然后進行RNA醉消化，并且在大約0.1XSSC在55TC下高嚴謹性洗滌，將栽玻片浸入KodakNTB2乳刑中，4TC下暴露2-3周，顯影，并且復染色.在黑暗區(qū)和標準照明下檢查切片，同時評價形態(tài)學和雜交信號.結果表明正常產后人，Ang-2表達限于包含血管發(fā)生脈管系統(tǒng)的少數(shù)組織，例如卵巢，胎盤，和子宮.在正常成年人心臟，腦，腎，肝，肺，狹腺，脾，肌肉，扁桃體，胸腺，閑尾，淋巴結，膽嚢，前列腺或睪丸和子宮中沒有可檢測的Ang-2表達.在五周大小的小鼠(而不是成年猴子或人)，腎顯示直小管中顯著的Ang-2表達.為了確定這種表達是不是胚胎發(fā)育遣留的，使用鼠Ang-2探針和上述條件對最大一年齡大小的小鼠源的腎反復進行這項實驗.在新生兒發(fā)育期發(fā)現(xiàn)Ang-2表達降低，但是一年齡小鼠的腎中仍然明顯.亊實上對試驗的所有腫瘤類型檢查了Ang-2表達，包括，原發(fā)性人腫瘤，例如結腸癌(5例)，乳房癌(10例)，肺癌(8例)，惡性膠質瘤(l例)，轉移性人腫瘤，例如乳房癌(2例)，肺癌(2例)，和卵巢癌(2例)，已經(jīng)轉移到腦，和嚙齒動物腫瘤模型例如C6(大鼠神經(jīng)膠質瘤)，HT29(人結腸癌)，Colo-205(人結腸癌)，HCT116(人結腸癌)，A431(人表皮樣瘤)，A673(人橫故肌肉瘤)，HT1080(人纖維肉瘤)，PC-3(人前列腺癌)，B16F10(鼠黑素瘤)，MethA(鼠肉瘤)，和Lewis肺癌.另外，對反應VEGF的生長到Matrigel栓中的新血管和早產視網(wǎng)膜病小鼠低氣癥模型檢查Ang-2表達.實施例2重組mAng-2蛋白和兔多克隆抗-Ang-2抗血清的產生使用全長人Ang-2的PCR引物，通過PCR(ClontechAdvantagePCRKit,Cat.#K1905-01)從鼠15日胚胎DNA文庫(Marathon-Ready-cDNA,Cat.#;7459-1,Clonetech,Inc.)獲得全長的，帶組氨酸標記的Ang-2cDNA.使用FuGENE6轉染試刑(Roche,Cat.#;1814443)將PCR產物連接至CMV啟動子表達栽體中，將得到的質粒轉染到HT1080人纖維肉瘤細胞(得自ATCC)中.通過G418選擇分離穩(wěn)定的克隆.抗組氨酸標記和蛋白印跡篩選表達mAng-2-his的克隆.從這些細胞的條件培養(yǎng)基(C.M.)純化重組的mAng-2多肽.通過兩步層析方法純化含fflAng-2-His的C.M.簡言之，通過添加pH9.5的Tris緩沖液將條件培養(yǎng)基滴定到約20niM的終濃度.此外，加入去污刑CHAPS至大約5mM的終濃度.然后將C.M.直接加至陰離子交換柱Q-sepharoseff(Pharmacia).然后用含有大約50mMNaCl的大約10mMTrispH8.0洗滌柱.用含有大約350mMNaCl和大約5mMCHAPS的10mMTrispH8.0以單個步碟洗脫重組的Ang-2-His.將Q-sepharose柱的洗脫物調節(jié)至大約4mM咪唑，并且加至固定化的金屬親和柱(Ni-NTAsuperflow[Qiagen]).用含有大約5nMCHAPS和大約100mM咪唑的PBS洗脫結合的蛋白.然后將洗脫物濃縮至大約1.0mg/ml，然后用PBS透析，通過SDS-PAGE考馬斯亮藍染色測量mAng-2-His的純度大于90X.用大約0.2mgmAng-2/注射免疫兔，以產生抗體.用1:1的大約1mLHunter'sTiterMax(Sigma)和mAng-2注射兔.四周后，每只兔接受重復注射或加強；此后兩周，接受下一次加強，在笫7周，取出血清，評估對mAng-2的滴度.如果血清滴度高，連續(xù)6周每周取出50mL產物血液.然而，如果血清滴度低，對兔進行一次賴外的加強，從笫9周開始連續(xù)6周每周取出50mL產物血液.連續(xù)六周取血后，讓兔休息6周.如果需要更多血清，最后一次取血后一個月對兔再進行一次加強.使用中和ELISA(描迷于下文)，觀察來自兩只兔5254和52"的抗-mAng-2兔多克隆抗血清對mAng-2:Tie2相互作用的中和.實施例3評價Ang-2抗體的分子測定進行分子測定(親和力ELISA，中和作用ELISA，和BIAcore)評價結合Ang-2和相關家族成員的直接抗體，以及抗體對Ang-2:Tie-2相互作用的作用.下面詳細描述這些體外和基于細胞的測定.A.親和力ELISA為了最初篩選侯選抗-Ang-2抗體，使用純化的人Ang-2(R&DSystems,Inc;目錄號623-AN;Ang-2以2個截短型的混合物被提供)或鼠Ang-2多肽(如上所述制備).為了證實結合測試，從用全長人Ang-2DNA轉染的人293T細胞的條件培養(yǎng)基獲得人Ang-2并且在含有大約50微克/毫升牛血清白蛋白(BSA)的無血清Dulbecco's修飾的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng).使用微量滴定板，向每個孔加入大約100微升/孔Ang-2，并且將板溫育大約2小時，然后用含有大約0.l%Tween-20的砩酸緩沖鹽水(PBS)將板沖洗四次.然后對于每孔用250微升的大約5%BSA的PBS溶液封閉各孔，板在室溫下溫育大約2小時.溫育之后，棄除過量的封閉溶液，向孔中加入大約100微升的各種侯選抗-Ang-2抗體，稀釋系列開始濃度是大約40毫微摩爾，然后在含有大約1。/。BSA的PBS中系列稀釋4倍.培養(yǎng)板然后在室溫下溫育過夜.溫育之后，用含有大約0.1%Tween-20的PBS沖洗平板.將沖洗又重復四次，然后向每孔加入在含有1%BSA的PBS中以1:5000預先稀釋的山羊抗-人IgG(Fc)-HRP(PierceChemicalCo.，catalog#31416)大約100微升.培養(yǎng)板在室溫下溫育大約l小時，然后在含有大約0.1%Tween-20的PBS沖洗平板五次，然后每孔加入大約100微升的TMB(3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺液體底物體系；SigmaChemicalCompany,St.Louis,Mo.，目錄號T8665)底物，并且將培養(yǎng)板溫育大約5-15分鐘直到顯示藍色.然后在分光光度計上在大約370nm讀取吸光度.B.中和作用ELISA根據(jù)對于親和力ELISA所描迷的制備結合了人Ang-2多肽的微量滴定板.在含有大約IXBSA和大約1nMTie-2(以Tie-2-Fc分子提供，其中Tie-2部分只含有該分子的可溶性胞外部分；R&DSystems,目錄號313-TI)的PBS溶液中以4倍稀釋度從1000nM至0.2pM滴定侯選抗-Ang-2抗體.向各孔加入大約100微升的抗體/Tie-2溶液之后，培養(yǎng)板在室溫下溫育過夜，然后用含有大約0.1%Tween-20的PBS清洗五次.沖洗之后，每孔加入大約100微升的抗-Tie-2抗體(PharmingenInc.,catalog#557039)，最終濃度達到大約1微克/毫升，培養(yǎng)板在室溫下溫育大約1小時.接著，以含有大約1%BSA的PBS中以1:10，000的稀釋度每孔加入大約100微升山羊抗-小鼠一IgG-HRP(PierceChemicalCO.,catalog#31432).培養(yǎng)板在室溫下溫育大約1小時，然后用含有大約0,1%Tween-20的PBS清洗五次.然后每孔加入大約100微升的TMB底物(如上所述)，使得顯色.然后在分光光度計上在大約370n邁讀取吸光度.C.親和力BIAcore使用PBS和0.005%P20表面活性刑(Biacore，Inc.)作為洗脫緩沖液在BIAcore2000(Biacore,Inc.,Piscataway，N.J.)上進行各種侯選Ang-2抗體的親和力分析，使用AmineCouplingKit(Biacore,Inc.)根據(jù)供應商建議的方法通過伯胺基團將重組蛋白質G(Repligen,Needham,Mass.)固定到研究級CM5傳感器芯片(Biacore,Inc.)上.通過首先將大約100Ru的各種侯選抗-Ang-2抗體捕獲到固定的蛋白質G，然后以50微升/分鐘的流速向結合的抗體表面注射各種濃度的(0-100nM)的huAng-2或邁Ang-2三分鐘，進行結合分析.應用BIA求值3.1計算機程序(Biacore,Inc.)測定抗體結合動力學參數(shù)，包括k.(締合作用速度常數(shù))，kd(離解作用速度常數(shù))和KD(離解平衡常數(shù)).離解平衡常數(shù)越低，表明抗體對Ang-2的親和力越大.實施例4通過噬苗體展示產生完全的人Ang-2抗體按照以下方案，通過對人Ang-2多舦(RandDSystemsInc.，catalog623-AN)淘選TargetQuest嗟菌體展示Fab文庫(TargetQuest,Inc.)而產生完全的人抗體.通過兩種方法將人Ang-2固定在聚苯乙烯磁珠表面(1)4*0下以50ug/ml直接包被Ang-2過夜；和(2)通過山羊抗Ang-2抗體4X:下以50ug/邁l間接捕獲過夜.用PBS中的2%乳(MPBS)封閉珠表面.預選人Fab噬菌體文庫，以去除與未包被的磁珠或山羊抗-Ang-2抗體反應的噬菌體克隆，然后在室溫下用噬菌體文庫溫育Ang-2包被的磁珠過夜.噬菌體結合步驟之后，用含有大約0.IXTween20的MPBS洗滌表面6次，然后用含有大約0.IXTween20的PBS洗滌6次，然后用PBS洗涂兩次.首先用大約100ug/ml人Tie2-Fc(RandDSystems,Minneapolis，MN)，然后用大約100mM三乙醇胺洗脫結合的噬菌體.將洗脫的噬菌體感染至大煬桿菌TGI細胞，擴增，并且回收進行下一輪篩選.通過進行更嚴格的洗滌和減少榆入噬菌體的數(shù)目在連續(xù)的輪次中增加選擇壓力.進行3輪選擇后，鑒定18個獨特的Ang-2結合Fab克隆，使用上文所迷的ELISA親和力測定進行檢測，幾乎所有的克隆都被識別為人Ang-2，小鼠Ang-2和大鼠Ang-2.這些噬菌體的大約10X也結合人Ang-1.按照下文所述將這些克隆轉化為IgGl抗體，為了獲得其它獨特的噬菌體，使用相同文庫但略有不同的方案進行第二輪篩選.在此方案中，在大約4"C下在Nuncmaxisorp免疫管中將人Ang-2鋪于pH9.6的NaHC03緩沖液中過夜.分別在1、2和3輪淘選中平鋪約1.5，0.74和0.3ug/ml的Ang-2.用PBS中的大約2X乳(MPBS)封閉免疫管表面，然后在大約4ml2XMPBS中用來自上文提到的相同噬菌體展示文庫(TargetQuest)的約2萬億個噬菌體顆粒(文庫中的大約50拷貝的每種獨特的噬菌體)溫育.噬菌體溫育步驟之后，用PBS加大約IXTween20洗滌表面20次，然后用PBS洗滌20次.用luMhAng-2或luM人Tie2(RandDSystems,如上文所述)洗脫結合的噬菌體.將洗脫的噬菌體感染至大腸桿菌TGI細胞(與噬菌體文庫一起提供)，擴增，并且回收進行下一輪篩選.通過PCR擴增與hAng-2或Tie2結合的所有噬菌體，鑒定16個獨特的Ang-2結合Fab克隆，并且通過限制性消化分析這些克隆.對每個克隆的DNA進行測序.用互補引物擴增每個噬菌體的每個重鏈可變區(qū)的編碼序列.設計引物以在可變區(qū)的5，末端摻入Hindl11位點，Xbal位點，Kozak序列和信號序列(翻譯的肽為MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC;SEQIDNO:69)，而將BsmBI位點加在PCR產物的3，末端上.作為如何克隆重鏈的一個例子，用添加信號序列的最后7個氨基酸的引物2248-21(GTGGTTGAGAGGTGCCAGATGTCAGGTCCAGCTGGTGCAG;SBQIDNO:70)和將BsmBI位點加在可變區(qū)末端的2502-31(ATTACGTCTCACAGTTCGTTTGATCTCCAC;SEQIDNO:71)擴增克隆544的模板噬苗體DNA(SeqIDNo.19).使用將9個氨基酸加至信號肽(AQLLGLLLL;SEQIDNO:73)的引物2148-98(CCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTATTGTGGTTGAGAGGTGCCAGAT;SEQIDNO:72)，然后使用2502-31,然后使用2489-36(CAGCAGAAGCTTCTAGACCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGG;SEQIDNO:74)和2502-31擴增得到的產物.引物2489-36從5'至3'添加HindIII位點，Xbal位點，Kozak序列和信號序列的前6個氨基酸.用XbaI和BsmBI消化PCR產物，然后克隆到含有人IgGl恒定區(qū)的哺乳動物表達栽體中.該栽體含有SV40啟動子和DHFR選擇.來自每個噬菌體的輕鏈是k或)i類型.對于每種輕鏈，設計互補引物，以便從從5'至3'添加HindIII位點，Xbal位點，Kozak序列和信號序列(如上文所述)，將具有無錯誤編碼區(qū)的那些鏈克隆為全長產物，作為一個例子，用添加信號序列的最后7個氨基酸的引物2627-69(GTGGTTGAGAGGTGCCAGATGTGACATTGTGATGACTCAGTCTCC;SEQIDNO:75)和在終止密碼子之后添加Sail位點的引物2458-54(CTTGTCGACTTATTAACACTCTCCCCTGTTGjSEQIDNO:76)擴增作為全長編碼區(qū)的噬菌體克隆536的輕鏈(SeqIDNO.11).然后如前所述分別用與引物2458-54配對的類外的5，引物，2148-98和2489-36擴增PCR產物，完成信號序列和克隆位點的最終添加.將全長輕鏈作為XbaI-SalI片段克隆至上文所述的哺乳動物表達栽體中.與天然人恒定區(qū)序列相比，某些k克隆在它們的恒定區(qū)中具有錯誤.為了糾正這些差異，用編碼理想k恒定區(qū)和噬菌體來源的可變區(qū)的DNA進行重疊PCR.這些克隆也克隆為如上文所述的XbaI-SalI片段.當k可變區(qū)與它們的恒定區(qū)獨立進行克隆時，將BsmBI位點添加至PCR產物的3，末端.用Xbal和BsmBI消化PCR產物后，將k鏈可變區(qū)克隆至含有人k恒定區(qū)的表達栽體中.采用磷酸鈣轉染試劑盒(InvitrogenCorp.)，一般根據(jù)制造商建議的程序將來自每個轉化的噬菌體的成對輕鏈和重鏈構建體共轉染至CHO細胞中.轉染后14-16小時更換培養(yǎng)基，將細胞傳代至組織培養(yǎng)皿中，用于按照制造商的推薦在大約48小時后進行選擇.通過HT選擇大約3周而分離轉染的細胞，此時用胰蛋白酶消化轉染的CHO細胞集落，并且合并至轉染細胞的"合并物"中.48小時后收集小規(guī)模條件培養(yǎng)基，并且使用抗人Fc抗體、抗人k抗體或抗人k抗體，通過蛋白印跡分析抗體產生.然后使用標準組織培養(yǎng)無菌技術，在選擇壓力下傳代選擇的細胞群，直到獲得足夠的細胞，接種4個850cm2的滾瓶，每個滾瓶中接種2x107個存活細胞，并且使用DMSO制備冷凍的儲備細胞系.接種后，將細胞維持在裝有補加了谷氨酰胺和非必須氨基酸的含大約IOX血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco/BRL,Inc)中.將細胞維持大約2-3天，直到達到約80X的細胞鋪滿度.此時將滾瓶中的培養(yǎng)基更換為補加了谷氨酰胺和非必須氨基酸的無血清培養(yǎng)基混合物(50仰MEM，5MF12，Gibco).7天后收獲條件培養(yǎng)基，添加新鮮的無血清培養(yǎng)基，用于一次或兩次類外的收獲.采用標準程序，通過蛋白G親和層析直接從條件培養(yǎng)基純化抗體.采用低pH(約pH3)緩沖液完成從蛋白G柱的洗脫，此后用lMTris，pH8.5中和洗脫的抗體蛋白，然后用lOkD分子量截斷離心濃縮器濃縮.然后將濃縮的抗體儲液緩沖交換到PBS中.產生了31種抗體，每一種由兩條重鏈和兩條輕鏈(K或"組成，命名見下表2.表2抗體重鏈抗體輕鏈526HC*526kappa528HC*531HC*531lambda533HC*533lambda535HC*535lambda536HC*536kappa537HC*537lambda540HC*540lambda543HC*543kappa544HC*544kappa545HC*545lambda546HC*546lambda551HC*551kappa553HC*553kappa555HC*555kappa558HC558kappa559HC559lambda565HC*565kappaFl-C6HCF1-C6lambda表2(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>*按此處描述，測定與hAng-2,mAng-2,和hAng-l的結合.以下四個表列出了從噬菌體轉化至全長IgGl抗體的n個抗-Ang-2抗體的重鏈和輕鏈(K和X)的序列和SEQIDNos.用VBASE數(shù)據(jù)庫，采用Kabat等在SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NIH公開號91-3242jU.S.Dept.HealthandH,nServices,5thed，)中描述的技術預測單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDRs),將Fab區(qū)與數(shù)據(jù)庫中具有最接近的種系序列(見http:〃www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/restricted/ALIGNMENTS.html)的序列進行比對，然后肉眼比較所述序列.每個可變區(qū)(重鏈或輕鏈)的CDRs如表7所示.表3重鏈可變區(qū)抗體HC序列526HC(SEQIDNO.1)EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKOLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGPYAYWGQGTLVTVSS528HC(SEQIDNO.3)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGVVGDFDWLSFFDYWGQGTLVTVSS531HC(SEQIDNO.5)EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGHPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTNTAYMELTSLTSDDTAVYYCARDREDTAMVFNYWGQGTLVTVSS533HC(SEQIDNO.7)EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSS535HC(SEQ1DN0.9)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGHPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAFSPFTETDAFDIWGQGTMVTVSS536HC(SEQIDNO.11)EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSOSTlYYADSVKGRFnSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSS537HC(SEQIDNO.13)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIP1LGIANYAQKFQGRVT1TADKSTSTAYMELSGLGSEDTAVYYCARGSSDAAVAGMWGQGTLVTVSS540HC(SEQIDNO.15)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASQGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPILG1ANYAQKFQGRVTITADKFTSTAYMELSSLGSEDTAVYYCARAVPGTEDAFDIWGQGTMVTVSS543HC(SEQIDNO.17)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCK八SGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRnPILG!ANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPYYDFWSGPGGMDVWGQGTTVTVSS544HC(SEQIDNO.19)QVQLVQSOAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGHPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFESGYWGDAPDIWGQGTMVTVSS545HC(SEQIDNO.21)QVQLQESCJGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGPVDFDYGDYAIDYWGQGTLVTVSS546HC(SEQIDNO.23)EVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFHSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKETISFSTFSGYFDYWAQGTLVTVSS70<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>537lambda(SEQIDNO.14)QSVLTQPPSVSAAPGQDVT1SCSGNNSNIGNNYVSWYQQVPGTAPKLLVYDNHKRPSGISDRFSGSKSDTSATLDITGLQPGDEADYyCGTWDTSLSANWVFGGGTKLTVL540lambda(SEQIDNO.16)QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGANYVSWYQQLPGTAPKLLIYNNNKRPSGIPDRFSGSKSDTSATLGrrGLQTGDEADYYCGAWDSSLSASWVFGGGTKLTVL545lambda(SEQIDNO.22)QSVLTQPSSVSGAPGQRVTISCTGQSSN1GAGYDVHWYQQFPGRAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQPEDEADYYCQSYDSRLSGSVFGGGTKLTVL546lambda(SEQIDNO.24)QSVLTQPSSVSEAPRQRVTISCSGSASNIGANGVSWYHQVPGK八PRLLLSHDGLVTSGVPDRLSVSKSGTSASLAISGLHSDDEGDYYCAVWDDSLNAVVFGGGTKLTVL559lambda,IDNO.34)QSALTQPPSASGSPGQSITISCTGTNSDIGSYPFVSWYQRHPGKAPKLLIYDVSNRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEGDYYCSSFTMNSFV1FGGGTKLTVLF卜C6lambda(SEQIDNO.38)QSVLTQPPSVSEAPRQRVTISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDDSLSGWVFGGGTKLTVLFB1-A7lambda(SEQIDNO.40)NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSGGGIGSSFVHWFQQRPGSSPTTVfFMWQRPTOVP加PSAAiDTSSSSASLTWGlTAE加ADyYCQSSHSTAVVFGGGTKLTVLFD-B2lambda(SEQIDNO.42)NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIATNYVQWYQQRPGSSPATVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDTSSNSASLTISGLTTEDEADYFCQSYGDNNWVFGGGTKLTVLGID4lambda(SEQIDNO.50)NFMLTQPHSVSESPGKTVIIPCTRSSGSIASNYVQWYQKRPGSAPS1VYEDKQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYNSRGVMFGGGTKLTVLGC1E8lambda(SEQIDNO.52>NFMLTQPHSVLESAGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGTSPTNVIFEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTJSGLKTEDEADYFCQSYDSNIWVFGGGTKLTVLHlC12lambda(SEQIDNO,54)QSVLTQPPSVSAAPGQKVT1SCSOSSSNIGNNYVSWYQHLPGTAPKLUYGNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIAGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGSLVFGGGTKLTVLIF-IC10lambda(SEQIDNO.58)NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSGGS1ASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLT1SGLKTEDEADYYCQSYDSSTWVFGGGTKLTVLIK-2E2lambda(SEQIDNO.60)QSALTQPASVSGSPGQSrnSCTGTSSDVOGYNYVSWFQQHPGKAPKLMIYKVNNRPSGLSN鵬GSQSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLGFGGGTKLTVL74表6<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表7Ang-2抗體的重鏈(HC)和輕鏈(LC)的互補決定區(qū)(CDRs)<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>Ab559LC22-3759-79卯-101Ab565HC26-3650-6696-115Ab565KC23-3650-5889-訴AbFl-C6HC26-3650-6696-H0AbFl-C6LC22-3658-7889-101AbFBl-A7HC26-3650-6696-"2AbFBl-A7LC22-3658-8091-101AbFD-B2HC26-3852-69101-112AbFD-B2LC22-3658-809卜l01AbFE-B7HC50-6696-U2AbFE-B7KC234054-6293-102AbFJ-GUHC26-3650-669"15AbW-GllKC23'4155-6394-103八bFK-E3HC26-3650-66AbFK-E3KC234054-6293-102AbG1D4HC26-3650-6696-110AbG1D4LC22-3658-8091-101AbGC1E8HC26-3650-6696"13AbGClE8U:22-3658-8091-101AbHlC12HC26^365"696"112AbHlC12LC22-3658-7889-102AbIA1-1E7HC26'3650-6595-U3AbIA1-1E7KC23-3650-5889-訴AblF-IC10HC26-3751-6696-102AblF-lC10LC22-3658-8091-101Ab1K-2E2HC26-3650-6696413AbIK-2E2IX22-3759-7990-101AblP-2C11HC26-3650-6696"12AblP-2CI1KC23-3549-5788-97采用親和和中和ELISA(如上文實施例3所述)以及BIAcore中和測定(如上文實施例3所述)檢驗17種抗體和陰性對照IgGl(稱作asRDBl)，以確定它們的親和力、中和和特異性能力，結果見下表(表778)，并且使用標準程序計算.表8Ang-2抗體EC50s和IC50shAng'2mAng-2hAng.l抗體1CS0(nM)EC鄰(nM)ICSO(nM)EC鄰(nM)IC鄰(nM)EC鄰(nM)Ab536O.訴0.0050.050.011".6530Ab5650.260.26無抑制Ab5460.371.09無抑制Ab5430.5，0.24無抑制Ab5330.30.08無抑制Ab5370.560.62無抑制Ab5400.701.53無抑制Ab5440.97"223.32Ab5451.040.021.300.058.312Ab5281.370.73無抑制AbGID41.390.60訴.48Ab5511.412.88無抑制Ab5531.471.41無抑制Ab5261.830.27243.15Ab5312.151.67無抑制Ab5552.211.76無抑制Ab5352.812.45無抑制RDBI無抑制無抑制無抑制無抑制無抑制無結合采用上迷BIAcore分析，評估兩種抗體，克隆536和克隆545.按上迷對于BIAcore測定的描述確定抗體結合，較低的KDS表示較高的78親和力，結果報道于下表9.<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>實施例5釆用抗-Ang-2抗體的療效研究在小鼠中檢驗蛋白G純化的兔抗Ang-2多克隆抗體的藥代動力學.用多克隆抗-Ang-2兔抗體處理24只小鼠(lmg/小鼠).在注射抗體后的以下時間點處死4只受治療的動物l小時，6小時，l天，3天，7天和14天.結果表明，總的兔IgG在血清中具有大約19天的循環(huán)半衰期，而總IgG的抗-Ang-2IgG成分具有大約8天的半襲期.為評估療效，在異種移植后1,5，6,7,8,12，13,14,15，和18天后，腹膜內給予攜帶A431腫瘤異種移植物的小鼠(10只動物/組)10刑(每刑約10mgIgG/小鼠)蛋白G純化的抗-mAng-2多克隆抗體.在第0,7，15和21天，測量體重，所述體重不受處理的影響.通過重復測量ANOVA，結果表明，與未免疫純化的多克隆抗血清(10mglgG/小鼠/劑)和栽體(PBS)對照相比，抗-Ang-2多克隆抗體抑制A431腫瘤異種移植物大約50X的生長，p-O.008.為檢驗完全的人單克隆抗-Ang-2抗體的體內效力，用抗Ang-2抗體克隆533，537或544，或PBS或人IgGl-k陰性對照腹膜內處理攜帶A431腫瘤異種移植物的小鼠(10只動物/組).笫一劑給予大約420ug蛋白/小鼠，下三次給藥時每次給予大約"0ug蛋白/小鼠，下四次給藥時每次給予大約55ug蛋白/小鼠，每只小鼠總共給予8刑.每周兩次記錄腫瘤體積和體重.研究末，處死動物，收集它們的血清用于通過ELISA測重抗體水平.從所有組收集腫瘤和正常組織.如圖1所示，抗-Ang-2處理組和對照組的肺瘤生長有顯著差異.與對照組相比，所有三種抗-Ang-2處理都抑制腫瘤生長(在所有處理中，重復測重3種抗體的AN0VA，p<.005vs.hlgGl對照).相反，對照組中的肺瘤以更高的速度繼續(xù)生長).實施例6表位定位將全長(氨基酸1H95),N-末端(氡基酸1-254)和C-末端(氨基酸255-495)人Ang-2(hAng-2)蛋白質克隆到帶有C-末端6xHis標記的CMV-驅動噴乳動物表達栽體中.將三個得到的構建體加栽體對照物瞬時表達到293T細胞中，然后從感染的細胞收集條件培養(yǎng)基，并且通過6xHisELISA和蛋白質印跡估計培養(yǎng)基中Ang-2的表達水平.根據(jù)下面的方案通過ELISA,通過它們結合人hAng-2的三種版本的能力，測定抗-Ang-2抗體和肽抗體的結合表位每孔用100微升條件培養(yǎng)基包被高結合96-孔測定板，并且在37t:下溫育1小時.吸出條件培養(yǎng)基，室溫下每孔用200微升5XBSA的PBS溶液封閉平板1小時.然后吸出封閉溶液.以1微克/毫升1XBSA的PBS溶液每孔加入100微升抗體，肽抗體，或Tie2-Fc，并且室溫下溫育1小時.用200微升0.1%Tween的PBS溶液將孔洗滌四次.每孔加入100微升肌P-偶聯(lián)的山羊抗-人IgG或山羊抗-小鼠IgG,并且室溫下溫育"分鐘，然后用200微升0.IXTween的PBS溶液將孔洗滌四次.然后每孔加入100微升TMB底物.在370nm下讀取0.D..圖2a，圖2b，和困2c給出結果.序列表<110〉AMGENINC.<120〉血管生成素-2的特異結合劑<130>A-722A<140>未確定<141>2002-10-11<150>US60/328,604<151>2001-10-11<160>76<170〉Patentlnversion3.1<210〉1〈211〉123<212〉PRT<213>人<400>1GluValGinLeuValGluSerGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530GlyMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlalieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnAlaLysAsnSerUuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspLeuLeuAspTyrAsplieLeuThrGlyProTyrAlaTyr100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>2<211〉112<212〉PRT<213>人<400>2AsplieValMetThrGinSerProLeuSerLeuProValThrProGly151015GluProAlaSerlieSerCysArgSerSerGinSerUuUuHisSer202530AsnGlyTyrAsnTyrLeuAspTrpTyrLeuGinLysProGlyGinSer354045ProGinUuUulieTyrUuGlySerAsnArgAlaSerGlyValPro505560AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrUuLyslie65707580SerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysMetGinAla859095LeuGinThrProProThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105110<210〉<211><212><213>3123PRT人<400〉3GinValGinLeuValGinSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerTyr202530AlalieSerTrpValArgGinAlaProGlyGinGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlylielieProliePheGlyThrAlaAsnTyrAlaGinLysPhe505560GinGlyArgValThrlieThrAlaAspGluSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgGlyValValGlyAspPheAspTrpUuSerPhePheAspTyr100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer120115<210>4<211〉107<212〉PRT<213〉人<400〉4SerTyrGlu1015ThrAlaSerlieThrCysSerGlyAspLysLeuGlyTyrThrTyrThr202530SerTrpPheGinGinLysProGlyGinSerProValLeuValliePhe354045GinAspPheLysArgProSer.GlylieProGluArgPheSerGlySer505560AsnSerGlyAsnThrAlaThrLeuThrlieSerGlyThrGinAlaMet65707580AspGluAlaAspTyrTyrCysGinAlaTrpAspSerThrThrAlaVal859095ValPheGlyThrGlyThrLysValThrValLeu100105〈210〉5<211>120<212>PRT<213>人<400>5GluValGinLeuValGinSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer1015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerTyr202530AlalieSerTrpValArgGinAlaProGlyGinGlyUuGluTrpMet354045GlyGlylielieProlieLeuGlylieAlaAsnTyrAlaGinLysPhe505560GinGlyArgValThrlieThrAlaAspLysSerThrAsnThrAlaTyr65707580MetGluLeuThrSerLeuThrSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspArgGluAspThrAlaMetValPheAsnTyrTrpGlyGin100105GlyThrLeuValThrValSerSer120110115<210〉6<211〉111<212>PRT<213>人<400>6GinSerValLeuThrGinProProSerValSerAlaAlaProGlyGin51015LysValThrValSerCysSerGlySerSerSerAsnlieGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045lieTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlylieProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlylieThrGlyLeuGin65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerAlaPheTrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105<210〉7<211〉122<212〉PRT<213>人<400>7GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGly1510110ValValGinProGlyArg15SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530GlyMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerTyrlieSerSerSerGlySerThrlieTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnAlaLysAsnSerUuTyr65707580LeuGinMetAsnSerUuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspLeuLeuAspTyrAsplieLeuThrGlyTyrGlyTyrTrp100105110GlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210〉8<211>106<212>PRT<213〉人<400>8SerTyrGluLeuThrGinProProSerValSerValSerProGlyGin151015ThrAlaArglieThrCysSerGlyAspAlaLeuProLysGinTyrAla202530TyrTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProValLeuVallieTyr354045LysAspSerGluArgProSerGlylieProGluArgPheSerGlySer505560SerSerGlyThrThrValThrLeuThrlieSerGlyValGinAlaGlu65707580AspGluAlaAspTyrTyrCysGinSerAlaAspSerSerHisValVal859095PheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105<210><211><212〉<213>9121PRT人<400>9GinValGin1LeuValGinSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer51015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerTyr202530AlalieSerTrpValArgGinAlaProGlyGinGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlylielieProliePheGlyThrAlaAsnTyrAlaGinLysPhe505560GinGlyArgValThrlieThrAlaAspLysSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaAlaPheSerProPheThrGluThrAspAlaPheAsplieTrpGly10010511086GinGlyThrMetValThrValSerSer115120<210>10<211〉112<212>PRT<213〉人<400〉10GinSerVal11015LysValThrlieSerCysSerGlySerAsnSerAsnlieGlyAsnAsn202530PheValSerTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045ValTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlylieProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlylieThrGlyLeuGin65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerAlaAlaGluValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105110<2!0><211><212〉<213>11122PRT人<400>11GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyArg151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyi202530GlyMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyUuGluTrpVal354045SerTyrlieSerSerSerGlySerThrlieTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnAlaLysAsnSerLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspLeuLeuAspTyrAsplieLeuThrGlyTyrGlyTyrTrp100105110GlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>12<211>112<212〉PRT<23>人<400>12AsplieValMetThrGinSerProLeuSerLeuProValThrProGly151015GluProAlaSerlieSerCysArgSerSerGinSerLeuLeuHisSer202530AsnGlyTyrAsnTyrLeuAspTrpTyrLeuGinLysProGlyGinSer354045ProGinLeuLeulieTyrLeuGlySerAsnArgAlaSerGlyValPro505560AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLyslie65707580SerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysMetGinGly859095ThrHisTrpProProThrPheGlyGinGlyThrLysLeuGlulieLys100105110■<210〉13<211>11988<212>PRT<213>人<400>13GinValGinLeuValGinSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerTyr202530AlalieSerTrpValArgGinAlaProGlyGinGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlylielieProlieLeuGlylieA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IDNO.12中的單氨基酸取代，其中所述單氨基酸取代位于CDR1、CDR2和CDR3的任意一個中，3.權利要求1或2的分離的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體.4.權利要求1-3的分離的抗體，其中所迷抗體是完全的人抗體.5.藥物組合物，包含權利要求4的分離的抗體和藥學可接受制刑.6.編碼權利要求l-4的任一項的抗體的核酸分子.7.包含權利要求6的核酸分子的栽體.8.分離的宿主細胞，包含權利要求7的栽體.9.包含權利要求1-4的任一項的抗體的偶聯(lián)物.10.制備抗體的方法，包括(a)用至少一種權利要求6的核酸分子轉化宿主細胞；(b)在所述宿主細胞中表達核酸分子；和(c)分離所述抗體，其中所述宿主細胞不是人細胞.11.權利要求1-4的任一項的抗體在制備用于抑制不期望的血管發(fā)生的藥物中的用途.12.權利要求1-4的任一項的抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途.13.權利要求1-4的任一項的抗體在制備用于調節(jié)或抑制血管生成素-2活性的藥物中的用途.14.權利要求1-4的任一項的抗體在制備用于治療以下病癥中的至少一種的藥物中的用途血漿滲漏，血管滲透性，眼新血管病，成血管瘤，血管瘤，炎性疾病，慢性炎性紊亂，子宮內膜異位，腫瘤性疾病，骨相關疾病，或者牛皮癬.15.權利要求1-4的任一項的抗體和化療藥物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途.全文摘要本發(fā)明涉及血管生成素-2的特異結合劑。具體地，本發(fā)明公開了結合血管生成素-2的特異結合劑，如完全的人抗體。還公開了所述抗體的重鏈片段，輕鏈片段和CDRs，以及制備和使用所述抗體的方法。文檔編號C12N15/13GK101671393SQ200910160129公開日2010年3月17日申請日期2002年10月11日優(yōu)先權日2001年10月11日發(fā)明者J·D·奧利納申請人:安姆根有限公司