專利名稱：一種以煙堿脫氫酶作為煙草加工輔助的酶制劑及制備、使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于煙草復(fù)烤前添加的提高煙草品級的酶制劑。
背景技術(shù)：
微生物、酶在煙葉生長、調(diào)制、陳化、加工和貯存期間起著非常重要的作用。19世 紀(jì)50年代中葉，人們就開始通過微生物或酶來改善煙葉、煙梗和煙草薄片質(zhì)量、生產(chǎn)香料 及降解煙堿，至今仍是一個(gè)熱門的研究課題。煙堿是普通煙草中的生物堿，俗稱尼古丁 (Nicotine)，作用于植物神經(jīng)、中樞神經(jīng)及運(yùn)動神經(jīng)末梢，先興奮，后抑制，其主要作用在于 它所產(chǎn)生的生理強(qiáng)度，該強(qiáng)度與煙堿含量成正比。隨著世界范圍反吸煙運(yùn)動的不斷深入和 消費(fèi)者對自身健康的更加關(guān)注，幾乎所有類型的巻煙產(chǎn)品都在向低焦油和低煙堿的淡味型 巻煙方向發(fā)展。國內(nèi)煙廠貯存的上部煙葉較多，一般因其煙堿含量較高，而不易用于煙葉配 方中，需要微生物或酶改善煙葉的醇化品質(zhì)。 通過微生物或酶來改善煙葉、煙梗和煙草薄片質(zhì)量、生產(chǎn)香料及降解煙堿。煙堿的 微生物降解中，所用的微生物不同，煙堿的分解途徑亦不同[程彪，等。煙草工業(yè)中微生物 和酶作用的控制與利用。煙草科技。1999,(3) :8 11]。煙堿的微生物代謝途徑主要有3 種①吡咯烷途徑，主要是假單孢桿菌、剌孢小克汗霉菌；②吡啶途徑，以氧化節(jié)桿菌為主； ③脫甲基途徑，主要是煙草植物和真菌。在這些不同的途徑中，不同的微生物有著不同的酶 系參與煙堿的代謝。其中對噬煙堿節(jié)桿菌和球形節(jié)桿菌降解煙堿的代謝途徑研究得比較清 楚[張彥東，等。微生物降解煙堿研究應(yīng)用進(jìn)展。煙草科技，2003， (12) :3 7]。
酶法在降解煙草煙堿方面甚于微生物法并具有可控制性，使得酶法成為降解煙堿 優(yōu)先關(guān)注的途徑。對煙堿具有降解能力的種類很多，培養(yǎng)基中煙堿和葡萄糖的存在可以提 高菌株的降煙堿活性，不同菌株在培養(yǎng)基中對煙堿的耐受能力也不相同[李梅云。煙堿的 微生物降解研究進(jìn)展。微生物學(xué)雜志，2006，26(3) :94 97]。艾繼濤等通過紫外誘變選育 得到煙堿脫氫酶高產(chǎn)菌株，產(chǎn)酶活力較出發(fā)菌株提高了 72. 2% [艾繼濤，等。紫外誘變降煙 堿菌對煙堿脫氫酶活力及煙堿含量的影響。安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006， 34 (14) :3281， 3290]。馬林 等利用基因工程技術(shù)也獲得高效表達(dá)煙堿脫氫酶的重組菌[馬林，等。煙堿脫氫酶基因的 原核表達(dá)及酶學(xué)特性研究。中國煙草學(xué)報(bào)，2007，(4) :60 64]。袁勇軍等研究了從土壤中 分離到一株能夠利用煙堿作為唯一碳源的細(xì)菌[袁勇軍，等。煙堿降解細(xì)菌的分離、鑒定及 其降解性能的初步研究。微生物學(xué)報(bào)，2005，45(2) :181 184]。并進(jìn)一步研究用于降解處 理煙草廢棄物中的煙堿，Ochrobactrumintermedium DN2菌株36h降解煙堿83. 83%，降解 過程符合Monod模型的零級反應(yīng)，動力學(xué)方程為C(t) = -46. 977t+2244. 7，r = 0. 9595 [袁 勇軍，等。利用DN2菌株對煙草工業(yè)廢棄物中的煙堿降解的工藝參數(shù)優(yōu)化。農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)， 2006， 22 (12) : 185 188]。陳洪等從從煙草上分離得到32株對試煙草有不同作用的微生物 菌株，優(yōu)選的煙葉微生物經(jīng)超臨界二氧化碳破壁，獲得較全面多酶體系對煙堿的處理評價(jià) 為①酶處理煙草煙堿的降低速度比自然陳化的提高了幾十倍至幾百倍；②在酶用量一定
4的條件下，煙堿的降低量隨著作用時(shí)間的延長而增大，③在作用時(shí)間一定的條件下，煙葉中 的煙堿含量與酶用量基本上呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即酶用量越大，煙葉中的煙堿含量越低[陳洪， 等。微生物酶法降解煙草總植物堿試驗(yàn)。煙草科技，2004， (4) :12 16]。但是，煙堿含量 太低，隨著全氮/煙堿、還原糖/煙堿比值的不同將會影響煙葉評吸結(jié)果。
在煙堿及煙堿脫氫酶的測定方式上，艾繼濤等是將培養(yǎng)液經(jīng)12000r/min離心 15min，取上清液0. 25mL，用0. 05mol/L HC1定容至100mL，分別在236nm， 259nm， 282nm 波長下測吸光度值。煙堿含量計(jì)算公式為Y二 (y+0. 0009) XO. 4/0. 3024，其中，y = OD259nm-0. 5X (OD236nm+OD282nm)。菌發(fā)酵酶活測定，是將搖瓶發(fā)酵液在4"下冷凍15000r/min 離心15min，沉淀菌體用磷酸緩沖液重懸浮，超聲波破碎。然后在fC下冷凍26000r/min離 心15min，上清夜即為酶液。在4. OmL比色皿中依次加入磷酸緩沖液(pH值為6. 85)2mL、靛 酚指示劑0. 2mL、煙堿液(濃度為0. Olmol/L)0. lmL、酶液0. 2mL，測定其在578nm下10min 內(nèi)的00578 變化。定義00578 每分鐘(lmin)減少0. 001所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力 單位，即U/mL培養(yǎng)液[艾繼濤，等。紫外誘變降煙堿菌對煙堿脫氫酶活力及煙堿含量的影 響。安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(14) :3281,3290]。馬林等則是將搖瓶發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心，超聲 波破碎得粗酶液，再用硫酸銨、透析和柱層析分離等進(jìn)行純化。以2，6-二氯苯靛酚為電子 接受體存在條件下，煙堿脫氫酶(NDH)催化煙堿脫氫生成6-羥基煙堿，通過測定2，6-二氯 苯靛酚在578nm處的吸光度的減少，以吸光度每分鐘減少0. 001所需要的酶量定義為一個(gè) 酶活力單位[馬林，等。煙堿脫氫酶基因的原核表達(dá)及酶學(xué)特性研究。中國煙草學(xué)報(bào)，2007， (4) :60 64]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是不改變片煙調(diào)制操作的原有工藝，即在新鮮煙草烘烤后，在復(fù)烤前 的加工過程中利用煙堿脫氫酶酶制劑，降解煙堿而達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)中提高煙草品質(zhì)的效 果。 本發(fā)明的目的通過以下方式實(shí)現(xiàn) ( — )本發(fā)明煙堿脫氫酶制劑 該制劑煙堿脫氫酶具有氧化一還原催化反應(yīng)降解煙草中煙堿的功能，其制劑酶活 力為150 250U/mL。 所述制劑煙堿脫氫酶的最佳酶活力為190U/mL。 所述制劑使用EDTA以除去酶源中帶來的金屬離子干擾。 ( 二 )制備本發(fā)明酶制劑的方法 (1)將煙堿脫氫酶粗品固體或液體用pH 7. 0緩沖液溶解或稀釋，前者質(zhì)量體積比 為lg : 20mL，后者體積比為lmL : 10mL， 3500r/min離心20min，取上清液，加入(NH4) 2S04， 使硫酸銨終濃度為62 % ，靜置24h后4°C 15000r/min離心30min，取上清液，補(bǔ)加濃度為 10% (W/V)的(朋4)2504過夜，再4" 15000r/min離心30min，收集沉淀、合并；
(2)用初始緩沖液用量的一半充分溶解沉淀后，加0. 1 % EDTA溶液補(bǔ)體積至原緩 沖液體積，靜置2h，離心，取上清液測定酶活力，多批次兌配，使酶活力為150 250U/mL，最 佳為190U/mL。 所述步驟(2)是在上清液中加入濃度0. 01%的蔗糖低聚物，上清液與蔗糖低聚物體積比為lOOmL : lmL，經(jīng)-8t:冷凍干燥濃縮8 10倍得濃縮酶制劑。本發(fā)明中，EDTA中文名為乙二胺四乙酸二鈉，是常用的絡(luò)合劑。 本發(fā)明中，以上煙堿脫氫酶粗品可購買市售商品酶產(chǎn)品或用相應(yīng)的產(chǎn)煙堿脫氫酶
微生物菌株發(fā)酵生產(chǎn)獲得。 制備酶制劑過程中，所用的pH 7. 0的Britton-Robinsion緩沖液詳見[印永嘉。 大學(xué)化學(xué)手冊。濟(jì)南山東科學(xué)出版社，1985]配制方法。改進(jìn)和調(diào)制成pH7. 0的方法參照 [劉士清，等。農(nóng)業(yè)生物環(huán)境中基礎(chǔ)酶技術(shù)研究法修建探討。農(nóng)機(jī)化研究，2008， (10) :162 166,175]使用。 (三)本發(fā)明測定煙堿脫氫酶的方法 該方法的測定依據(jù)是煙堿測定的經(jīng)典重量分析法，是《硅鎢酸重量分析法測定煙 堿純度》CORESTA第39號推薦方法[陳燕。硅鎢酸重量分析法測定定煙堿純度標(biāo)準(zhǔn)綜述。 煙草科技，1996， (3) :21]，進(jìn)一步改進(jìn)作為煙堿脫氫酶的酶活力測定方法，其步驟較簡單、 結(jié)果較準(zhǔn)確、耗費(fèi)也低。基本原理是在一定條件下，一分子硅鎢酸可與兩分子尼古丁定量結(jié) 合形成白色沉淀。反應(yīng)式如下 2C10H14N2+Si02 12W03 26H20 — Si02 12W03 7H20 2C10H14N2 I +19H20
本發(fā)明煙堿脫氫酶活力測定方法為 (1)將兩張質(zhì)地和大小相同的直徑D = 11cm定量濾紙精確稱重，濾紙A = W^濾 紙B = W3 ; (2)將lmL純度為95X的煙堿加入到lOOmL 0. lmol/L的硅鎢酸溶液振蕩5min后， 再加入lmL經(jīng)滅菌處理的待測樣品酶液，振蕩20min，用濾紙A過濾完成，將濾紙A并同附著 物一起置于ll(TC下烘烤6h干燥，準(zhǔn)確稱量A = W2， AA = W廠W丄； (3)將lmL純度為95%的煙堿注入到lmL待測樣品酶液中，混勻準(zhǔn)確計(jì)時(shí)振蕩
60min，到時(shí)加入lOOmL 0. lmol/L的硅鎢酸溶液振蕩20min后，用濾紙B過濾完成，將濾紙
B并同附著物一起置于ll(TC下烘烤6h干燥，準(zhǔn)確稱量B = W4， AB = W4-W3 ; 煙堿酶活力(U/mL或U/g) = [ ( A A_ A B) /162. 23] X 106/60 式中，煙堿分子式Q。HmN2，分子量162. 23， 60為反應(yīng)時(shí)間(min)。 煙堿酶活力單位定義為在上述條件下lmin煙堿量減少1 y moL所需的酶量定義
為l個(gè)酶活力單位。 酶活力測定時(shí)，將需檢樣品稀釋成適宜酶測定的稀釋倍數(shù)，所用緩沖液每lOOmL 中補(bǔ)加0. 3g Ca(N03)2和0. 3g MgS04作為基本的酶穩(wěn)定與激活劑，在檢測中釋放酶活性，并 計(jì)算檢測結(jié)果。 本發(fā)明為方便敘述將此測定方法稱為煙堿脫氫酶酶活力硅鎢酸重量測定法。 [OO31] (四)本發(fā)明酶制劑的使用方法 將煙堿脫氫酶制劑稀釋250倍作為片煙復(fù)烤前的第二次潤葉用水，其酶活力范圍 為0. 6 1. 0U/mL。 所述的使用方法進(jìn)一步是將190U/mL的濃縮煙堿脫氫酶制劑稀釋250倍作為片煙 復(fù)烤前的第二次潤葉用水，其最佳酶活力為0. 76U/mL。
本發(fā)明具有下述積極效果 為了在待調(diào)制發(fā)酵煙草中盡量不引入外物，特別避免微生物菌體，使發(fā)明產(chǎn)品在
6煙草醇化工藝中易控制和達(dá)到預(yù)期效果，應(yīng)用適量酶活力的煙堿脫氫酶酶制劑降解煙堿。加入絡(luò)合劑除去煙堿脫氫酶來源中所帶的金屬離子，使酶活力不顯示，以鈍化的形式穩(wěn)定存在，使產(chǎn)品具備較長的貯存期。 在產(chǎn)品的質(zhì)量控制檢測中，本發(fā)明以更簡便的測定煙堿脫氫酶方法來衡量制劑的煙堿脫氫酶活力。 片煙復(fù)烤流程包括煙葉解把、第一次潤葉、第二次潤葉、打葉、復(fù)烤及打包。本發(fā)明在不改變原煙草加工過程的狀態(tài)下，用制劑稀釋液代替第二次煙葉濕潤劑，使用簡易，能夠在片煙調(diào)制的實(shí)驗(yàn)研究中降低煙葉的煙堿量，起到提高煙草的安全性和改善煙草品級的作用。 本發(fā)明可以與其它煙草加工活性酶制劑配合使用，并作為其中的煙堿脫氫制劑部分。同時(shí)，本發(fā)明也可作為申請人"一種煙草品質(zhì)改善與提高的煙草加工活性復(fù)合酶制劑"的酶組分之一。


圖1為本發(fā)明煙堿脫氫酶粗品酶的制備工藝流程示意圖。 以下結(jié)合附圖通過具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，實(shí)施例包括但不限制其它實(shí)施方式。
具體實(shí)施例方式
( — )本發(fā)明制劑的制備及測定 煙堿脫氫酶可直接購買微生物發(fā)酵的產(chǎn)品?；蛘呃孟鄳?yīng)產(chǎn)煙堿脫氫酶菌株發(fā)酵產(chǎn)生，通過破細(xì)胞壁釋放和初步提取等得到粗制品。然后，以本發(fā)明方法進(jìn)行精制、除金屬離子和干燥濃縮等處理獲得煙堿脫氫制劑。 將煙堿脫氫酶粗品固體以W/V二 lg : 20mL或液體W/V二 lmL : 10mL的緩沖液溶解和稀釋，Britton-Robinsion緩沖液pH值為7. 0 ;3500r/min離心20min，取上清液，加入(朋4)2504，使硫酸銨終濃度為62%，靜置24h，然后4°C 15000r/min離心30min，取上清液，補(bǔ)加濃度為10% (W/V)的(朋4)2504過夜，再一次4" 15000r/min離心30min，收集沉淀、合并的沉淀用精制初始緩沖液用量的一半充分溶解后，用0. 1% EDTA溶液補(bǔ)體積至原緩沖液體積，靜置2h，離心得到上清液，測定上清液的酶活力，取多批次上清液進(jìn)行兌配，使制劑酶活力為150 250U/mL，可以進(jìn)一步兌配為190U/mL。 以上清液與蔗糖低聚物體積比為100mL : lmL，加入濃度0. 01 %的蔗糖低聚物，然后，經(jīng)_81:冷凍干燥濃縮8 10倍得濃縮酶制劑。 以上煙堿脫氫酶制劑活力測定方法采用發(fā)明內(nèi)容中所提出的"煙堿脫氫酶酶活力硅鎢酸重量測定法"。 使用時(shí)，將煙堿脫氫酶制劑稀釋250倍作為片煙復(fù)烤前的第二次潤葉用水，其酶
活力范圍為0. 6 1. OU/mL。使用的最佳酶活力為0. 76U/mL，即以190U/mL的濃縮煙堿脫
氫酶制劑稀釋250倍作為片煙復(fù)烤前的第二次潤葉用水， ( 二 )使用本發(fā)明煙堿脫氫酶制劑作為第二次潤葉用水的結(jié)果 以云85品種B2F(上橘二 )等級為處理對象，在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬煙葉片煙復(fù)烤
7醇化過程，考察活性濃縮酶制劑對醇化(自然發(fā)酵)前期的影響。煙堿脫氫酶制劑最佳酶活力190U/mL，故用自來水稀釋250倍，酶活力為0. 76U/mL，作為第二次潤葉用水，對照為相同量的自來水。打葉、復(fù)烤后，各個(gè)包裝500g煙葉，每個(gè)處理平行重復(fù)不少于3次，在相對濕度65%的室溫下自然醇化60天，分別制成煙絲混勻，取樣分析和巻成巻煙評吸。
常規(guī)分析結(jié)果主要是各處理的煙堿量與對照相比下降明顯，煙堿下降率3. 93% 8. 08%，引起其它結(jié)果有變化較小。 B2F等級煙堿量雖然下降明顯，在評吸中勁頭和剌激性減少，但煙堿存在量仍然在4以上，但雜氣等不好的品質(zhì)未有所大的改善。 對于品質(zhì)本身已經(jīng)較好的煙葉，僅從安全性降低煙堿量的單一指標(biāo)而論本發(fā)明制劑是降低煙堿量的良好酶制劑。
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權(quán)利要求
以煙堿脫氫酶作為煙草加工的輔助酶制劑，其特征是該制劑煙堿脫氫酶的酶活力為150～250U/mL。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以煙堿脫氫酶作為煙草加工輔助酶制劑，其特征是該制劑煙 堿脫氫酶的最佳酶活力為190U/mL。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的以煙堿脫氫酶作為煙草加工輔助酶制劑，其特征是該制劑 中有EDTA以使煙堿脫氫酶酶活性呈可逆的純化形式存在。
4. 一種制備權(quán)利要求1 3所述的煙堿脫氫酶作為煙草加工的輔助酶制劑的方法，包 括以下步驟(1) 將煙堿脫氫酶粗品固體或液體用PH 7.0緩沖液溶解或稀釋，前者質(zhì)量體積比為 lg : 20mL，后者體積比為lmL : lOmL， 3500r/min離心20min，取上清液，加入(NH4) 2S04，使 硫酸銨終濃度為62 % ，靜置24h后4°C 15000r/min離心30min，取上清液，補(bǔ)加濃度為10 % (W/V)的NH4)2S04過夜，再4°C 15000r/min離心30min，收集沉淀、合并;(2) 用初始緩沖液用量的一半充分溶解沉淀后，加0. 1% EDTA溶液補(bǔ)體積至原緩沖液 體積，靜置2h，離心，取上清液測定酶活力，多批次兌配，使酶活力為150 250U/mL，最佳為 190U/mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備煙堿脫氫酶的方法，其特征是在步驟(2)上清液中加入 濃度O. 01%的蔗糖低聚物，上清液與蔗糖低聚物體積比為100mL : lmL，經(jīng)-8t:冷凍干燥濃 縮8 10倍得濃縮酶制劑。
6. —種煙堿脫氫酶酶活力的測定方法，其特征是(1) 將兩張質(zhì)地和大小相同的直徑D = llcm定量濾紙精確稱重，濾紙A = Wp濾紙B =W3;(2) 將lmL純度為95%的煙堿加入到100mL 0. lmol/L的硅鎢酸溶液振蕩5min后，再 加入lmL經(jīng)滅菌處理的待測樣品酶液，振蕩20min，用濾紙A過濾，將濾紙A并同附著物一起 置于ll(TC下烘烤6h干燥，準(zhǔn)確稱量A = W2， AA = W廠Wi ;(3) 將lmL純度為95%的煙堿注入到lmL待測樣品酶液中，混勻準(zhǔn)確計(jì)時(shí)振蕩60min， 到時(shí)加入100mL 0. lmol/L的硅鎢酸溶液振蕩20min后，用濾紙B過濾，將濾紙B并同附著 物一起置于ll(TC下烘烤6h干燥，準(zhǔn)確稱量B = W4， AB = W4-W3 ;煙堿酶活力(U/mL或U/g) = [(AA-AB)/162. 23] X106/60 式中，162. 23為煙堿C1QH14N2的分子量，60為反應(yīng)時(shí)間(min);煙堿酶活力單位定義為在上述條件下lmin煙堿量減少liimoL所需的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的煙堿脫氫酶酶活力的測定方法，其特征是將需檢樣品稀釋成 適宜酶測定的稀釋倍數(shù)，所用緩沖液每100mL中補(bǔ)加0. 3g Ca(N03)2和0. 3g MgS04作為基 本的酶穩(wěn)定與激活劑。
8. 使用權(quán)利要求1 3所述的煙堿脫氫酶作為煙草加工輔助酶制劑的方法，其特征是 將煙堿脫氫酶制劑稀釋250倍作為片煙復(fù)烤前的第二次潤葉用水，其酶活力范圍為0. 6 1. OU/mL。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的使用煙堿脫氫酶作為煙草加工輔助酶制劑的方法，其特征是 將190U/mL的濃縮煙堿脫氫酶制劑稀釋250倍作為片煙復(fù)烤前的第二次潤葉用水，其最佳酶活力為0. 76U/mLc
全文摘要
一種以煙堿脫氫酶作為煙草加工輔助的酶制劑及制備、使用方法，屬于煙草復(fù)烤前添加的提高煙草品級的酶制劑。本發(fā)明將已知煙堿脫氫酶酶源進(jìn)行除雜精制，以EDTA絡(luò)合劑除去酶液中的金屬離子，使?jié)饪s原液中的酶不顯示酶活性，以利較長時(shí)間存放的鈍化形式穩(wěn)定存在，并以冰凍干燥法濃縮制備成為煙草活性添加劑，使用時(shí)用水稀釋替代片煙復(fù)烤時(shí)原有的第二潤葉用水，能較好降解煙草中的煙堿量，提高煙草的吸食安全性。
文檔編號C12Q1/32GK101775379SQ20101003918
公開日2010年7月14日 申請日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者何寶玉, 陳應(yīng)昆, 韓偉 申請人:云南萬芳生物技術(shù)有限公司