專利名稱：熒光猝滅劑分子及其方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的吡啶基-異喹啉-二酮衍生物、制備這些衍生物的方法、包含新的 吡啶基-異喹啉二酮衍生物和(i)固相支持體或(ii)生物分子的綴合物、制備這些綴合物 的方法以及這些綴合物在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)中作為猝滅劑的用途。
背景技術(shù)：
熒光共振能量轉(zhuǎn)移(縮寫為FRET)，亦稱F^rster共振能量轉(zhuǎn)移(以其發(fā)現(xiàn)者 Theodor Foster命名)，是描述激發(fā)能從一個分子轉(zhuǎn)移到另一個分子而無需熒光和重新吸 收的機(jī)制。按照Fiirster理論，通過供體熒光偶極子與受體吸收偶極子的偶極子-偶極子耦 合進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移。因此，F(xiàn)RET現(xiàn)象總是非輻射能量轉(zhuǎn)移。在吸收某一波長的光后開始處于 電子激發(fā)態(tài)的供體發(fā)色團(tuán)(chromophor)可將能量非輻射地轉(zhuǎn)移至受體，而促使受體處于 其電子激發(fā)態(tài)。隨后，受體的電子激發(fā)態(tài)衰減以致進(jìn)而放出能量。FRET的效率取決于多個 可如下歸類的參數(shù)供體與受體之間的距離；供體發(fā)射光譜與受體吸收光譜的光譜重疊； 以及供體發(fā)射偶極矩和受體吸收偶極矩的相對取向。在常規(guī)FRET技術(shù)中，供體和受體均為熒光團(tuán)。因此，由供體熒光團(tuán)所吸收的某一 波長(吸收波長)的光的能量被轉(zhuǎn)移至受體。由于吸收了轉(zhuǎn)移的能量，促使受體成為電子 激發(fā)態(tài)，電子激發(fā)態(tài)隨后衰減，然后被轉(zhuǎn)移至受體的能量發(fā)射出某一特定波長(發(fā)射波長) 的光。與吸收波長相比，發(fā)射波長向更長的波長轉(zhuǎn)移。當(dāng)供體和受體由于發(fā)色團(tuán)的相互作 用而緊密靠近時(例如Ι-lOnm)，由于自供體到受體的FRET，因此主要觀察到受體發(fā)射。因 此，可通過供體熒光的減弱或受體熒光的增強(qiáng)來檢測FRET現(xiàn)象。在FRET的一種具體形式中，使用所謂的猝滅劑代替熒光受體(J.R.Lak0WiCZ， Principles of Fluorescence,第二版，Kluwer AcademicPlenum Publishers, New York, 1999)。猝滅劑是這樣一種分子它吸收自供體(亦稱報道分子(reporter))轉(zhuǎn)移的能量而 不再發(fā)光，故可猝滅熒光。因此，在報道分子-猝滅劑系統(tǒng)中，供體向猝滅劑轉(zhuǎn)移能量。因 此，供體返回基態(tài)，并產(chǎn)生猝滅劑的激發(fā)態(tài)。隨后，猝滅劑的激發(fā)態(tài)非輻射性衰減((黑)暗 猝滅劑)。在非輻射或暗衰減中，通過分子振動(熱)釋放出能量。因為探頭中猝滅劑的濃 度通常處于μ M以下的范圍，所以非輻射衰減的熱量太小，以致不能影響溶液的溫度。根據(jù) Forster方程式，這類熒光猝滅還取決于供體與受體間的距離。與上述FRET技術(shù)不同，不測 量受體的發(fā)射，只測量供體的發(fā)射發(fā)色團(tuán)彼此分得越開，得到的能量轉(zhuǎn)移越弱，致使供體 的熒光相應(yīng)地增強(qiáng)。直到最近幾年，猝滅劑一般都是熒光染料，例如作為報道分子的熒光素和作為 猝滅劑的羅丹明(FAM/TAMRA探頭)。最著名的猝滅劑之一為用來降低報道分子染料 (reporter dye)發(fā)射的TAMRA(四甲基-羅丹明)。由其性質(zhì)所致，TAMRA適于作為FAM(羧 基熒光素)、HEX(六氯熒光素)、TET(四氯-熒光素)、J0E(5' - 二氯-二甲氧基-熒光 素)和Cy3-染料(花青)的猝滅劑。然而，TAMRA的實用性有限，因為其寬大的發(fā)射光譜降低了其在多路復(fù)用(multiplexing)(當(dāng)同時使用兩個或更多個報道分子-猝滅劑探頭時)中的能力。它固有的 熒光產(chǎn)生背景信號，導(dǎo)致信號動力學(xué)減弱，因此，可能降低基于TAMRA的測定法的靈敏度。暗猝滅劑為這個問題提供了解決辦法，因為它們不占據(jù)發(fā)射帶寬。而且，暗猝滅劑 能夠多路復(fù)用。一種典型的暗猝滅劑是DABCYL (4- [ [4- (二甲基氨基)_苯基]_偶氮基]_苯 甲酸)，它常常與分子信標(biāo)聯(lián)用。DABCTL在380 530nm的范圍內(nèi)猝滅染料。因此，即使具 有較長波長發(fā)射的熒光團(tuán)(例如Cy3-染料)也可被DABCYL更好地猝滅。然而，DABCYL具 有不適當(dāng)?shù)奈兆V帶，與在480nm以上發(fā)射的熒光團(tuán)的重疊非常差。又一種非熒光染料為 Eclipse 猝滅劑 [ [2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮基]-苯胺，Epoch Biosciences, Inc. 的商標(biāo)，Corporation Delaware21720,23rd Drive NE, Suite 150，Bothell Washington 98021，USA)，它在530nm處吸收最大，并且有效猝滅從520nm到670nm的光譜。對上述暗猝滅劑的一種改進(jìn)為Black Hole猝滅劑，例如BHQ-1 ([ (4_ (2_硝 基-4-甲基-苯基)-偶氮基)-基-((2-甲氧基-5-甲基-苯基)-偶氮基)]-苯胺)和 BHQ-2(K4-(1-硝基-苯基)-偶氮基)-基-((2，5_ 二甲氧基-苯基)-偶氮基)]-苯胺) (均可獲自Biosearch Technologies, he.)，它們能夠猝滅整個可見光譜。這些非熒光受 體常用作熒光受體的替代物，目的是為了降低背景熒光并以此提高靈敏度。然而，已知的非熒光猝滅劑的缺點(diǎn)是其猝滅功效不足，這導(dǎo)致了高背景信號，進(jìn)而 又導(dǎo)致了信號動力學(xué)特征受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個目的是提供新的猝滅劑，優(yōu)選具有低背景信號和/或高猝滅 功效。此外，在一個優(yōu)選的實施方案中，它們可與生物分子或FRET的固相支持體偶聯(lián)。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)吡啶基-異喹啉-二酮衍生物以低背景信號和/或高猝滅功 效為特征。迄今為止，幾乎沒有文獻(xiàn)披露過這類物質(zhì)，而且其只是用于藥物應(yīng)用(J.Med. Chem. 1991，34，1871-1879)。此外，這類物質(zhì)的二苯基氨基衍生物和具有用于與生物分子或 固相支持體偶聯(lián)的官能團(tuán)的衍生物也不為本領(lǐng)域所知。因此，本發(fā)明涉及下式I的化合物
權(quán)利要求
1. 一種下式I化合物其中
2.權(quán)利要求1的化合物，其中Q為直鏈或支鏈、飽和或不飽和、取代或未取代的(2_(8烴鏈。
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中Y為羥基或羧基。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的化合物，其中R3和/或R4為_NR5H。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的化合物，其中R3和R4均為-ΝΙ 5Ι 6。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中&為取代或未取代的芳基。
7.權(quán)利要求5或6的化合物，其中取代或未取代的芳基為苯基或甲苯基。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的化合物，其中芳基為芳族的C6H5、C10H7或C14H9烴基殘基。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的化合物，其中R1和&中的一個為1-羥基-4-乙基-丁基 殘基或正戊酸殘基，而另一個為氫；且R5為4-甲苯基或苯基殘基。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的化合物，其中Y能夠與(i)固相支持體；或(ii)生物分丁纟口口。
11.一種制備下式II化合物的方法
12.—種綴合物，所述綴合物包含權(quán)利要求1-10中任一項的化合物和(i)固相支持體 或(ii)生物分子，其中所述化合物通過連接基團(tuán)Q與支持體或生物分子偶聯(lián)。
13.一種制備權(quán)利要求12的綴合物的方法，所述方法包括使權(quán)利要求1-10中任一項的 化合物與(i)固相支持體或(ii)生物分子結(jié)合。
14.權(quán)利要求1-10中任一項的化合物或權(quán)利要求12的綴合物作為熒光供體猝滅劑的 用途。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述綴合物在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)中用作猝滅劑。
全文摘要
一種熒光猝滅劑分子及其方法和用途。本發(fā)明涉及新的吡啶基-異喹啉-二酮衍生物、制備這些衍生物的方法、包含新的吡啶基-異喹啉二酮衍生物和(i)固相支持體或(ii)生物分子的綴合物、制備這些綴合物的方法以及這些綴合物在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)中作為猝滅劑的用途。
文檔編號G01N33/52GK102050813SQ20101053298
公開日2011年5月11日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日
發(fā)明者D·海因德爾, F·貝格曼, H-P·約澤爾, R·貝克特, R·赫爾曼, T·韋爾策爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司