專(zhuān)利名稱(chēng)：一種鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鳥(niǎo)苷的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
鳥(niǎo)苷(guanosine)是嘌呤核苷類(lèi)物質(zhì)的一種，分子式C10H13N505，相對(duì)分子質(zhì)量283. 24，白色結(jié)晶性粉末，二水化合物為針狀結(jié)晶，110°C失水，熔點(diǎn)240°C (分解)，比旋光度-60°，能溶于稀礦酸、熱乙酸、稀堿(lg/33mL)，沸水，微溶于冷水(lg/1320mL)，不溶于醇、醚、氯仿和苯。鳥(niǎo)苷是一個(gè)多用途的核苷，作為核苷類(lèi)抗病毒藥物三氮唑核苷、無(wú)壞鳥(niǎo)苷和食品增鮮劑5’ -鳥(niǎo)苷酸的合成原料，其應(yīng)用前景不亞于肌苷。鳥(niǎo)苷在醫(yī)藥工業(yè)中作為很多高效藥物的中間體，可用于三氮唑核苷、無(wú)壞鳥(niǎo)苷、鳥(niǎo)三磷，氟鐵龍等藥物的生產(chǎn)，對(duì)皰疹、感冒病毒，抗肝炎等有十分確切的療效，目前人們對(duì)該類(lèi)藥品的認(rèn)識(shí)水平日益提高，鳥(niǎo)苷的需求也不斷增加。 目前鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法，酶水解RNA法，菌體自溶法和發(fā)酵法，由于化學(xué)合成法需要大量的有機(jī)溶劑，存在原料來(lái)源及環(huán)境污染等問(wèn)題在生產(chǎn)中極少試驗(yàn)。發(fā)酵法生產(chǎn)鳥(niǎo)苷從二十世紀(jì)六七十年代以來(lái)，關(guān)于發(fā)酵法生產(chǎn)鳥(niǎo)苷的研究報(bào)道越來(lái)越多，鳥(niǎo)苷發(fā)酵屬于嘌呤類(lèi)化合物的生產(chǎn)，其生物合成系統(tǒng)比較復(fù)雜，但許多微生物幾乎都有相同的生物合成和調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其中研究的比較詳細(xì)的有枯草芽孢桿菌和產(chǎn)氨短桿菌，在枯草芽孢桿菌中，從PRPP開(kāi)始經(jīng)十步反應(yīng)合成MP。由MP又分出兩條環(huán)形路線(xiàn)，一條經(jīng)XMP合成GMP，再還原生產(chǎn)頂P。另一條環(huán)路經(jīng)SAMP合成AMP，再回到MP。經(jīng)過(guò)詳細(xì)研究已經(jīng)清楚其反饋抑制和反饋?zhàn)瓒舻目刂茩C(jī)制。核苷酸的生物合成途徑有兩條，一條是利用葡萄糖等碳源和氮源，以5’ -磷酸核糖為出發(fā)物質(zhì)的全合成途徑，一條是由嘌呤堿基通過(guò)核糖基化及磷酸化而合成的補(bǔ)救途徑，但現(xiàn)有的鳥(niǎo)苷產(chǎn)量低、生產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種經(jīng)濟(jì)有效的鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)工藝，該工藝具有操作簡(jiǎn)便、投資少、鳥(niǎo)苷的產(chǎn)量大的特點(diǎn)。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是一種鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)工藝，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵和鳥(niǎo)苷提取步驟，菌種活化是指取_30±3°C下保藏的甘油種，解凍至室溫，吸取O. 1±0. 02ml接種于活化斜面，34±4°C恒溫靜置培養(yǎng)20_24h得工作種子。進(jìn)一步在上述鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)工藝中，所述的種子培養(yǎng)是指將載有工作種子的活化斜面接種至裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中(種子培養(yǎng)基是本領(lǐng)域常用的)，用紗布封口，140r/mon搖床上36±5°C振蕩培養(yǎng)8-10h得種子培養(yǎng)液。所述的發(fā)酵是取占搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基體積6-12%的種子培養(yǎng)液接入裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，220r/min，36±5°C振蕩培養(yǎng)60±5h ;所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基重量百分配比是味精1.0%、尿素O. 1%、蛋白胨2.0%、酵母粉2. O %、玉米漿水解液O. 5 %、磷酸二氫鉀O. 03 %、硫酸銨O. 01 %、硫酸鎂O. 01 %、碳酸鈣O. 05 %、氯化鈉O. I %、硫酸錳O. 01 %、氯化亞鐵O. 02 %、這些物質(zhì)重量比的誤差均為±10%。所述的發(fā)酵是取占5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的種子培養(yǎng)液接入5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，在5L發(fā)酵罐中裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基，通風(fēng)量5±lL/min，培養(yǎng)溫度36±5°C，轉(zhuǎn)速150±10rpm，養(yǎng)50土a ;所述5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基重量百分配比是味精1.0%、尿素O. I %、蛋白胨2. O %、酵母粉2.0%、玉米漿水解液10.0%、磷酸二氫鉀O. 03 %、硫酸銨
0.01%、硫酸鎂O. 01 %、碳酸鈣O. 05%、氯化鈉O. I %、硫酸錳O. 01 %、氯化亞鐵O. 02%，這些物質(zhì)的重量比誤差均為±10%。在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)自動(dòng)流加氨水溶液控制發(fā)酵液的pH=6.4±0.03。在發(fā)酵過(guò)程，如果泡多，可以通過(guò)消泡泵手動(dòng)或自動(dòng)加入已滅菌的泡敵數(shù)滴消泡，發(fā)酵開(kāi)始時(shí)流加玉米漿水解液，到45小時(shí)停止，所加玉米漿水解液的總量是培養(yǎng)基的10%。所述的鳥(niǎo)苷提取步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的技術(shù)。(泡敵是發(fā)酵過(guò)程中起泡時(shí)，為了防污染及有利于氧的傳遞而加入的物質(zhì)，通常泡敵就是本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的消泡劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明菌種活化就是將保藏狀態(tài)的菌種接入斜面培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，一般需要2-3代的活化過(guò)程，多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)是為了得到純而壯的培養(yǎng)物，即獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。因?yàn)楸４鏃l件往往和培養(yǎng)條件不一致，所以要活化，讓菌 種逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境。使用時(shí)取一支工作種再次轉(zhuǎn)活，按上述條件培養(yǎng)為斜面種后，接入種子液。為了獲的足夠多的活力強(qiáng)的菌液，必須進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)的關(guān)鍵點(diǎn)是把握好種子的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，在其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期進(jìn)行移種。這樣能保證種子的活力，縮短發(fā)酵的延滯期。生產(chǎn)菌的上游工程改造可以提高鳥(niǎo)苷的產(chǎn)量，但在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)其優(yōu)化代謝調(diào)控同樣對(duì)鳥(niǎo)苷的產(chǎn)量起著相當(dāng)大的影響，本發(fā)明可以使鳥(niǎo)苷產(chǎn)量提高25%以上。
具體實(shí)施例方式下面，將通過(guò)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行更加詳細(xì)的說(shuō)明。但以下這些實(shí)施例只是為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明而列舉的示例，本發(fā)明的范圍并不只局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例I (搖瓶發(fā)酵)菌種活化菌種活化就是將保藏狀態(tài)的菌種接入斜面培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),一般需要2-3代的活化過(guò)程，多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)是為了得到純而壯的培養(yǎng)物，即獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。因?yàn)楸４鏃l件往往和培養(yǎng)條件不一致，所以要活化，讓菌種逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境。本案例為取-30°C保藏的甘油種，快速解凍至室溫，吸取O. Iml接種于活化斜面，34°C恒溫靜置培養(yǎng)20-24h，作為工作種于10°C保存。使用時(shí)取一支工作種再次轉(zhuǎn)活，按上述條件培養(yǎng)為斜面種后，接入種子液。種子培養(yǎng)為了獲的足夠多的活力強(qiáng)的菌液，必須進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)的關(guān)鍵點(diǎn)是把握好種子的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，在其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期進(jìn)行移種。這樣能保證種子的活力，縮短發(fā)酵的延滯期。接一環(huán)生長(zhǎng)良好的活化斜面種至裝有25mL的種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，9層紗布封口，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上(140r/mon)，36°C振蕩培養(yǎng)8_10h。發(fā)酵搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的關(guān)鍵是環(huán)境培養(yǎng)條件嚴(yán)格控制，使各搖瓶的培養(yǎng)條件一致，不會(huì)因?yàn)榉胖玫奈恢貌煌斐善績(jī)?nèi)發(fā)酵液的培養(yǎng)條件不同，導(dǎo)致產(chǎn)苷水平不一致或體現(xiàn)不出發(fā)酵水平的差異。發(fā)酵前，取上述種子培養(yǎng)液以6-12%接種量(指占搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基體積6-12%的種子培養(yǎng)液)接入裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，220r/min，36°C振蕩培養(yǎng)60h。
搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配比味精I(xiàn). O %、尿素O. I %、蛋白胨2.0%酵母粉2. O %、玉米漿水解液O. 5%、磷酸二氫鉀O. 03%、硫酸銨O. 01 %、硫酸鎂O. 01 %、碳酸鈣O. 05%、氯化鈉
O.I %、硫酸錳0.01%、氯化亞鐵0.02%、玉米漿水解液5.0%。通過(guò)高效液相進(jìn)行檢測(cè)，與以往的數(shù)據(jù)比較，鳥(niǎo)苷產(chǎn)量提高27%。實(shí)施例2(5L罐發(fā)酵)按10%接種量將種子液接入5L自動(dòng) 控制發(fā)酵罐(發(fā)酵液溶氧自動(dòng)顯示。溫度和PH值自動(dòng)控制)中，裝液量3L，通風(fēng)量5L/min，培養(yǎng)溫度36°C，轉(zhuǎn)速150rpm。通過(guò)自動(dòng)流加氨水溶液控制PH值為6. 4 ± O. 03。發(fā)酵過(guò)程泡沫較多時(shí)，通過(guò)消泡泵手動(dòng)或自動(dòng)加入已滅菌的泡敵數(shù)滴即可迅速消泡，Oh流加玉米漿水解液，到45小時(shí)停止，總量為10%，50h停止發(fā)酵。發(fā)酵罐培養(yǎng)基配比味精I(xiàn). 0%，尿素O. I %，蛋白胨2.0%酵母粉2.0%玉米漿1.0%,磷酸二氫鉀O. 03%，硫酸銨O. 01 %，硫酸鎂O. 01 %，碳酸鈣O. 05%，氯化鈉O. I%硫酸錳O. 01 %，氯化亞鐵O. 02 %。通過(guò)高效液相進(jìn)行檢測(cè)，與以往的數(shù)據(jù)比較，鳥(niǎo)苷產(chǎn)量提高25%。實(shí)施例3(50L罐發(fā)酵)在搖瓶發(fā)酵及5L罐發(fā)酵可行的基礎(chǔ)上，進(jìn)行放大發(fā)酵。種子制備過(guò)程與實(shí)施例2相同。按10%接種量將種子液接入50L自動(dòng)控制發(fā)酵罐(發(fā)酵液D0、溫度、PH值、轉(zhuǎn)速自動(dòng)控制)，裝液量30L，通風(fēng)量8L/min，培養(yǎng)溫度36 °C，轉(zhuǎn)速200rpm，通過(guò)設(shè)定的pH值為6.4±0. I自動(dòng)控制氨水溶液的流加。發(fā)酵后期泡沫較多，通過(guò)消泡泵自動(dòng)加入已滅菌的泡敵消泡，Oh后流加玉米漿水解液，到45小時(shí)停止，總量為10%，約50h停止發(fā)酵。發(fā)酵罐培養(yǎng)基配比味精1.0%，尿素O. I %，蛋白胨2.0%酵母粉2.0%玉米漿1.0%,磷酸二氫鉀O. 03%，硫酸銨O. 01 %，硫酸鎂O. 01 %，碳酸鈣O. 05%，氯化鈉O. I%硫酸錳O. 01 %，氯化亞鐵0.02%。通過(guò)高效液相進(jìn)行檢測(cè)，與以往的數(shù)據(jù)比較，鳥(niǎo)苷產(chǎn)量提高26%。
權(quán)利要求
1.一種鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)工藝，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵和鳥(niǎo)苷提取步驟，其特征在于菌種活化是指取-30±3°C下保藏的甘油種，解凍至室溫，吸取O. 1±0. 02ml接種于活化斜面，34±4°C恒溫靜置培養(yǎng)20-24h得工作種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的種子培養(yǎng)是指將載有工作種子的活化斜面接種至裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，用紗布封口，140r/mon搖床上36 ±5°C振蕩培養(yǎng)8-10h得種子培養(yǎng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的發(fā)酵是取占搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基體積6-12%的種子培養(yǎng)液接入裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，220r/min，36 ±5°C振蕩培養(yǎng)60±5h ； 所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基重量百分配比是味精1.0%、尿素O. 1%、蛋白胨2.0%、酵母粉2. O %、玉米漿水解液O. 5 %、磷酸二氫鉀O. 03 %、硫酸銨O. 01 %、硫酸鎂O. 01 %、碳酸鈣O. 05%、氯化鈉O. I %、硫酸錳O. 01 %、氯化亞鐵O. 02%、這些物質(zhì)重量比的誤差均為+10% ο
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的發(fā)酵是取占5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的種子培養(yǎng)液接入5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，在5L發(fā)酵罐中裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基，通風(fēng)量5±lL/min，培養(yǎng)溫度36±5°C，轉(zhuǎn)速150± lOrpm，養(yǎng)50±2h ； 所述5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基重量百分配比是味精1.0%、尿素O. 1%、蛋白胨2.0%、酵母粉2. O %、玉米漿水解液10. O %、磷酸二氫鉀O. 03 %、硫酸銨O. 01 %、硫酸鎂O. 01 %、碳酸鈣O. 05 %、氯化鈉O. I %、硫酸錳O. 01 %、氯化亞鐵O. 02 %，這些物質(zhì)的重量比誤差均為+10% ο
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)工藝，其特征在于在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)自動(dòng)流加氨水溶液控制發(fā)酵液的pH = 6. 4±O. 03。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)工藝，其特征在于在發(fā)酵過(guò)程，通過(guò)消泡泵手動(dòng)或自動(dòng)加入已滅菌的泡敵數(shù)滴消泡，發(fā)酵開(kāi)始時(shí)流加玉米漿水解液，到45小時(shí)停止。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)工藝，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵和鳥(niǎo)苷提取步驟，其特征在于菌種活化是指取-30±3℃下保藏的苷油種，解凍至室溫，吸取0.1±0.02ml接種于活化斜面，34±4℃恒溫靜置培養(yǎng)20-24h得工作種子。該工藝具有操作簡(jiǎn)便、投資少、鳥(niǎo)苷的產(chǎn)量大的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P19/40GK102864193SQ20121032768
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者黃永嫦, 謝暢豐, 鄭凝堅(jiān), 馮今亮 申請(qǐng)人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司