專利名稱：：由腦組織獲得的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的制作方法1.引言本發(fā)明涉及編碼了由腦組織獲得的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的核酸序列、由其大量生產(chǎn)的基本純的蛋白質(zhì)，肽片段或衍生物、以及針對(duì)BDNF蛋白質(zhì)，肽片段或衍生物的抗體。此外，本發(fā)明涉及一些基因，它們是新定義的BDNF/NGF基因族的成員，以及它們的基因產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及含有有效量的BDNF基因產(chǎn)物或者針對(duì)BDNF基因產(chǎn)物的抗體的藥物組合物，并涉及診斷和治療各種神經(jīng)疾病和功能紊亂、包括早老年性癡呆癥(Alzheimer′sdisease)和帕金森病(Parkinson′sdisease)的方法。特別是，本發(fā)明的BDNF基因產(chǎn)物在多巴胺能神經(jīng)元疾病如帕金森病和感覺(jué)神經(jīng)元疾病以及視網(wǎng)膜退化性疾病的診斷和治療中具有價(jià)值。2.發(fā)明的背景2.1.在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展中神經(jīng)細(xì)胞的死亡以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用在脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的許多地方，早期發(fā)育過(guò)程中所具有的神經(jīng)元比成年動(dòng)物所具有的要多得多。早期發(fā)育階段的特征是自然出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞死亡的高低起伏(CarrandSimpson，1978，J.Comp.Neurol.，182727-740;Cowan等人，1984，Science2251258-1265)。發(fā)育中的神經(jīng)元的存活、分化和成熟可以受環(huán)境或“后天”的因素調(diào)節(jié)的，而不是受嚴(yán)格的先天性遺傳基因程序控制的。例如，小雞胚胎的實(shí)驗(yàn)處理表明，在小雞發(fā)育的早期移植或摘除諸如肢芽或眼睛這樣的外周“靶區(qū)”會(huì)分別引起該被增大或減小靶區(qū)附近的感覺(jué)神經(jīng)元、交感神經(jīng)元、付交感神經(jīng)元或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目的相應(yīng)增加或減少(Hamburger，1934，J.Exp.Zool.68449;HollydayandHamburger，1976，J.CompNeurol.，170311-321;LandmesserandPilar，1976，J.Cell.Biol.，68357-374)。一個(gè)靶區(qū)只能支持有限數(shù)目的神經(jīng)元，所以發(fā)育過(guò)程的一個(gè)正常組成部分可能刪除過(guò)量的神經(jīng)元以便和靶組織的“神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)”能力相適應(yīng)。發(fā)現(xiàn)和分離出目前被稱之為神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的蛋白質(zhì)導(dǎo)致了一種分子學(xué)假設(shè)，說(shuō)明靶組織是怎樣能夠調(diào)節(jié)使該組織存活并神經(jīng)支配該組織的神經(jīng)元的數(shù)目的(Levi-Montalcini等人，1968，PhysiolRev.，48524-569;ThoenenandBarde，1980，PhysiolRev.，601284-1335)。現(xiàn)已明確，至少在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元靶組織合成并釋放有限量的各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)分子，這些分子對(duì)于特定類型神經(jīng)元的生存是至關(guān)重要的(KorschingandThoenen，1983，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.803513-3516;Heumann等人，1984，EMBOJ.33183-3189;SheltonandReichardt，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.817051-7955;KorschingandTheonen，1985，Neurosci.Lett.54201-205)。2.2神經(jīng)生長(zhǎng)因子神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)最突出的特征就是這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)分子，并在體外和體內(nèi)已被表明，它對(duì)于小雞和大鼠早期發(fā)育期間交感神經(jīng)元的神經(jīng)嵴產(chǎn)生的感覺(jué)神經(jīng)元的生存是必不可少的(Levi-MontalciniandAngeletti，1963，Develop.Biol.7653-659;Levi-Montalcini等人，1968，physiol.Rev.48524-569)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，向正在發(fā)育的小雞胚胎中注射提純的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)會(huì)引起脊柱感覺(jué)神經(jīng)元和交感神經(jīng)元的大量增生和肥大(Levi-MontalciniandBooker，1960;Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46373-384;Hamburger等人，1981，J.Neurosci.160-71)。相反，通過(guò)對(duì)新生大鼠每天注射抗NGF抗體以去除或隔離內(nèi)源性NGF會(huì)伴隨引起交感神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重破壞(Levi-MontalciniandBooker，1960，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46384-391;Levi-Montalciniand.Angeletti.1966，pharmacol.Rev.18619-628)。甚至在發(fā)育的更早期，通過(guò)向子宮注射抗體或者通過(guò)母體抗體被動(dòng)的經(jīng)胎盤的轉(zhuǎn)移而接觸NGF抗體，也表明會(huì)引起神經(jīng)嵴產(chǎn)生的感覺(jué)神經(jīng)元如脊神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)元和脊內(nèi)側(cè)三叉神經(jīng)元的大量損失(Goedert等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.811580-1584;GorinandJohnson，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.765382-5386)。直至最近，幾乎所有對(duì)NGF的研究都集中于它在外周神經(jīng)系統(tǒng)中的作用，而現(xiàn)在似乎是NGF也影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特定神經(jīng)元叢的發(fā)育和保持(Thoenen等人，1987，Rev.physiol.Biochem.pharmacol.109145-178;WhittemoreandSeiger，1987，BrainRes.Rev.12439-464)成年雄小鼠下頜下腺中大量NGF蛋白質(zhì)的意外發(fā)現(xiàn)(Cohen，1960，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46∶302-311)，以及，更早的在蛇毒中發(fā)現(xiàn)高水平的NGF(CohenandLevi-Montalcini，1956，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.42∶571-574)意外地提供了足夠量的NGF，以允許對(duì)NGF進(jìn)行生理學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)以及最近的分子生物學(xué)(即NGF和它的受體的分子克隆)研究。成年雄性小鼠唾液腺中大量的NGF的功能仍然不知道;但似乎是這種豐富的NGF來(lái)源在外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育或維持方面不會(huì)起任何作用。在受NGF敏感神經(jīng)元(那些顯示出依賴NGF而生存、具有高親和能力的NGF受體并能使NGF內(nèi)化并能高特異性地逆行轉(zhuǎn)運(yùn)NGF的神經(jīng)元)支配的靶組織中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，NGF穩(wěn)定狀態(tài)的可測(cè)定水平極其低，其范圍是每克組織幾微微克或毫微克，相比之下在成年雄性小鼠唾液腺組織中含量要高出千倍以上。在血清中還未發(fā)現(xiàn)任何可覺(jué)察到的NGF含量，因此NGF似乎不是一種循環(huán)的生長(zhǎng)因子或激素(Suda等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75∶4042-4046)。除了在鼠下頜下腺中大量NGF來(lái)源的重要發(fā)現(xiàn)之外，敏感，可靠和有效的生物測(cè)定的發(fā)展在闡明NGF的生物學(xué)和生化學(xué)方面也起了很大的作用。發(fā)育雞胚胎中的背側(cè)根神經(jīng)節(jié)DRG就是被表明是在體外對(duì)NGF應(yīng)答的基本神經(jīng)元類型之一。在血漿凝塊中，E8-E12雞DRG的移出培養(yǎng)物，以及最近的雞背側(cè)根神經(jīng)節(jié)(DRG)的分離的神經(jīng)元富集培養(yǎng)物被表明在NGF活性的生物測(cè)定(如在純化過(guò)程中)和NGF生物學(xué)體外研究方面是非常有用的(Levi-Mon-talciniet.al.，1954，CancerRes.4∶49-57;Levi-MontalciniandAngeletti1963，Develop.Biol.1∶653-659;Greene，1977，Develop.Biol.58∶96;ibid58∶106)。從單獨(dú)一個(gè)雞胚胎中可以解剖出四十多個(gè)DRG，致使在很多實(shí)驗(yàn)室中廣泛利用。除了可獲得大量的NGF蛋白質(zhì)和有效的NGF測(cè)定體系外，非常有助于我們理解NGF生物學(xué)特性的第三個(gè)主要因素就是能夠相對(duì)容易地在豚鼠、兔子、羊等動(dòng)物中培養(yǎng)NGF的抗體;看起來(lái)小鼠的NGF是高度致免疫的，Cohen(1960，proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46∶302-311)培養(yǎng)出了他已經(jīng)從鼠下頜下腺中純化的NGF的抗體，并且他與Levi-Montalcini和Booker一起表明(1960，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46∶384-391)。當(dāng)每天給新生鼠施用這些抗體時(shí)會(huì)引起交感神經(jīng)節(jié)的破壞，或者說(shuō)“免疫交感神經(jīng)破壞”(Levi-MontalciniandAngeletti，1966，Pharmacol.Rev.18∶619-628)。充裕的NGF蛋白質(zhì)可以允許通過(guò)比較常規(guī)的蛋白質(zhì)化學(xué)方法確定其基本序列(AngelettiandBradshaw，1971，Proc.Natl.Acad.Sci.68∶2417-2420)目前通過(guò)使用基本上是規(guī)范的分子生物學(xué)方法，根據(jù)可得到的小鼠NGF的蛋白質(zhì)序列，設(shè)計(jì)合適的寡聚核苷酸探針，已經(jīng)從許多種動(dòng)物物種，包括小鼠(Scottetal.，1983，Nature302∶538-540)人(Ullrichetal，1983，Nature303∶821-825)，牛和雞(Meieretal.，1986.EMBO.J.5∶1489-1493)，以及大鼠(Whittemoreetal.，1988，J.Neurosci.Res.，20∶402-410)中克隆去NGF基因、可獲得充足的NGF也大大地促進(jìn)了對(duì)NGF受體的研究，最終導(dǎo)致了人和大鼠NGF受體的分子克隆(Johnsonetal.，1986，Cell，47∶545-554;Radeke.etal.，1987，Nature325∶593-597)?，F(xiàn)在已經(jīng)非常清楚NGF不是一種普遍存在的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。正如體外和體內(nèi)研究所確定的那樣，在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，NGF似乎不是副交感神經(jīng)元、神經(jīng)基板產(chǎn)生的感覺(jué)神經(jīng)元或腸神經(jīng)元的生存因子。而且，盡管運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的確在發(fā)育過(guò)程中似乎確定表現(xiàn)出至少一種NGF受體的低親合形式(Raivichetal.，1985，EMBOJ.4∶637-644)，但是NGF似乎也不是這些發(fā)育中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的一種生存因子(Oppenheim，1982.J.Comp.Neurol210∶174-189)。NGF對(duì)于這些神經(jīng)元類型不起作用，促使去探索其他的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，尤其是能夠維持脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和/或睫狀神經(jīng)節(jié)中的交感神經(jīng)元生存的因子。2.3.其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在過(guò)去十年中，有許多關(guān)于在很多種不同組織的提取物中和在很多不同細(xì)胞類型的條件培養(yǎng)基中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的報(bào)導(dǎo)。不過(guò)幾乎在所有的報(bào)導(dǎo)中，由于這種活性物質(zhì)的極小量，即每克組織的微微克到毫微克的范圍之間存在，這些活性成份的進(jìn)一步純化和特征分析被阻止不前。再者，盡管對(duì)于外周神經(jīng)元已經(jīng)建立了適當(dāng)?shù)纳餃y(cè)定方法，但是設(shè)計(jì)出用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的可靠的，可重復(fù)的和特異的測(cè)定方法仍然懸而未決。雖然各類型的外周神經(jīng)元以分散的，容易分離的神經(jīng)節(jié)形式存在，但中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元在其分布中總是高度不均一的。因此，在識(shí)別和富集特定種類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元時(shí)需要特異的標(biāo)記物。產(chǎn)生這種標(biāo)記物的方法中，如針對(duì)細(xì)胞表面或細(xì)胞骨架成份的抗體或特異性組織學(xué)染劑的進(jìn)展是非常有限的。因此，要對(duì)那些(ⅰ)不如NGF豐富，(ⅱ)難于測(cè)定，和(ⅲ)不能以足以進(jìn)行抗體生產(chǎn)的量獲得的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行表征，已經(jīng)證明是一種極其困難的過(guò)程。2.3.1.腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)與神經(jīng)生長(zhǎng)因子的比較在培養(yǎng)有大鼠C-6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的“條件培養(yǎng)基”中已識(shí)別出能夠在體外維持胚胎雞背側(cè)根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元生存的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性(Bardeetal.，1978，Nature274∶818)。這種活性不能被小鼠NGF的抗體所抵消，表明在這種條件培養(yǎng)基中存在著另外一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。之后，又有報(bào)導(dǎo)在正常成年大鼠腦的星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)物中(Lindsay，1979，Nature282∶80-82;Lindsayetal.，1982，BrainRes.243∶329-343)和在發(fā)育中的及成年大鼠腦的提取物中(Barde.etal.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77∶1199-1203)以及在發(fā)育中的和成熟雞脊柱索的提取物(LindsayandPeters，1984，Neurosci.12∶45-51)中存在有不能被NGF抗體阻斷的相似活性。不過(guò)均沒(méi)有分離或識(shí)別出這種活性因子，而且所發(fā)現(xiàn)的活性歸于相同還是不同的因子仍然是一個(gè)問(wèn)題。使用豬腦做為起始材料，Barde等人(1982，EMBOJ.1∶549-553)報(bào)導(dǎo)了一種目前稱之為腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的因子，這種因子似乎對(duì)由E10/E11雞胚胎得到的背側(cè)根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的存活有促進(jìn)作用，發(fā)現(xiàn)這種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性存在于一種高堿性的蛋白質(zhì)中(等電點(diǎn)，PI＞10.1)，它在硫酸十二烷基鈉(SDS)凝膠電泳中表現(xiàn)為一個(gè)12.3KD分子量的單一遷移譜帶。這種純化因子估計(jì)是1.4×106，但是產(chǎn)量非常低，1.5公斤豬腦中僅提純得到大約1μg的BDNF。再者，由于純化過(guò)程的最后一步是制備凝膠電泳，由于存在有殘余的硫酸十二烷基鈉(SDS)，BDNF活性不能夠完全地重新恢復(fù)活性(Barde.andThoenen，1985，in“HormonesandCellRegulation，”，Vol.9，Dumont.etal.，eds.ElsevierSciencePublishers，PP.385-390)。已經(jīng)注意到BDNF的這種強(qiáng)堿性和分子大小非常類似于NGF的單體，BDNF似乎具有不同于NGF的已知的性質(zhì)的特性，因?yàn)?a)在雞背側(cè)根神經(jīng)節(jié)的生物測(cè)定中，NGF的抗體對(duì)于BDNF的生物學(xué)活性沒(méi)有明顯的影響，(b)BDNF和NGF的作用似乎是疊加的;以及(c)不象NGF，發(fā)現(xiàn)BDNF對(duì)于E12雞交感神經(jīng)元的存活沒(méi)有影響。除此以外，在用腦提取物的早期研究中發(fā)現(xiàn)，這種來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性似乎比與NGF相關(guān)的活性在發(fā)育的更后期對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元起作用。運(yùn)用在一種多陽(yáng)離子基質(zhì)如聚賴氨酸或聚鳥氨酸上培養(yǎng)的雞胚胎神經(jīng)元的分離培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)BDNF對(duì)多于30%的E10-11(胚胎期10或11天)背側(cè)根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的存活起支持作用，但是看起來(lái)，對(duì)于E6同樣神經(jīng)元的生存沒(méi)有什么影響(Bardeetal.，1980，Proc.Natl.Acad.U.S.A.77∶1199-1203Supra)。在相似條件下，NGF支持30-40%的E6DRG神經(jīng)元的存活。有趣的是，后來(lái)發(fā)現(xiàn)當(dāng)在一種用細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白層覆蓋的基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)，NGF和BDNF二者都支持來(lái)自胚胎期E6-E12雞胚胎大約50%的DRG神經(jīng)元的存活。(Lindsayetal.，1985，Develop.Biol.112∶319-328)。在后來(lái)的研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NGF和BDNF二者都以飽和濃度存在時(shí)，其作用是相加的。Levi-Montalicni對(duì)于NGF的神經(jīng)元特異性早期研究(1966，TheHarveyLectures60∶217-259)指出，即使對(duì)于感覺(jué)神經(jīng)元NGF也不是一種普遍存在的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，因?yàn)椋瑢?duì)于雞的某些顱感覺(jué)神經(jīng)節(jié)，尤其是第十顱神經(jīng)的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元，NGF似乎沒(méi)有作用。后來(lái)體內(nèi)研究(Johnsonetal.，1980，Science210∶916-918;Pearsonetal.，1983，Develop，Biol.96∶32-36)表明，在胚胎發(fā)生過(guò)程中NGF的缺乏對(duì)于大鼠的大多數(shù)顱感覺(jué)神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元的存活沒(méi)有影響，而同樣的處理可以大大地減少了由神經(jīng)脊得到的感覺(jué)神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元的數(shù)目。更為詳細(xì)的體外研究(LindsayandRohrer，1985，Develop.Biol.112∶30-48，DaviesandLindsay，1985，Develop.Biol.111∶62-72;Lindsayetal.，1985，J.Cell.Sci.Suppl.3∶115-129)清楚地表明，NGF對(duì)于大多數(shù)的神經(jīng)脊產(chǎn)生的感覺(jué)神經(jīng)元的存活有支持作用，但對(duì)于由神經(jīng)基板得到的顱感覺(jué)神經(jīng)元的存活沒(méi)有明顯的作用。對(duì)于與NGF明顯不同的BDNF神經(jīng)元特異性的最早論證是在體外證明了純化的BDNF對(duì)于E6，E9或E12，雞胚胎的神經(jīng)基板得到的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中分離出的感覺(jué)神經(jīng)元的40-50%有支持其存活的作用(Lindsayetal.，1985，J.Cell.Sci.Supp.3∶115-129)。無(wú)論是用NGF本身或者與BDNF的結(jié)合，NGF這些神經(jīng)元沒(méi)有明顯的作用。后來(lái)在移出培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)BDNF似乎對(duì)于其他神經(jīng)基板產(chǎn)生的感覺(jué)神經(jīng)節(jié)，包括巖神經(jīng)節(jié)，膝狀神經(jīng)節(jié)和腹處側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)的軸空長(zhǎng)出和存活具有支持作用(Davies.etal.，1986，J.Neurosci.6∶1987-1904)，而這此神經(jīng)節(jié)中沒(méi)有一個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)NGF敏感。在上述所有研究中NGF的抗體對(duì)于所觀察到的BDNF活性沒(méi)有影響，除了對(duì)來(lái)自外周神經(jīng)節(jié)的培養(yǎng)神經(jīng)元有影響外，發(fā)現(xiàn)BDNF能刺激由鵪鶉神經(jīng)脊培養(yǎng)出的細(xì)胞神經(jīng)元的分化和生長(zhǎng)。(Kal-cheimandGendreau，1988，Develop.BrainRes.41∶79-86)。在本發(fā)明之前，由于不能夠產(chǎn)生足夠量的用于免疫接種的BDNF，阻止了生產(chǎn)抗BDNF的抗體，以便在它們對(duì)神經(jīng)元群的作用上與抗NGF抗體相比較，也無(wú)法進(jìn)行BDNF/NGF交叉中和實(shí)驗(yàn)。不過(guò)用BDNF進(jìn)行的兩項(xiàng)最近研究(Kalcheimetal.，1987，EMBOJ.62871-2873;HoferandBarde，1988.Nature331∶261-262)已經(jīng)表明了BDNF在鳥PNS發(fā)育中的一個(gè)生理作用。如果將一個(gè)機(jī)械屏障置于卵中E3/E4DRG(胚胎3天或4天的背側(cè)根神經(jīng)節(jié))和神經(jīng)管中它們的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)靶之間，觀察到許多背側(cè)根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元死亡(KalcheimandLeDouarin，1986，Develop.Biol.116∶451-466)。據(jù)推測(cè)這種神經(jīng)元的死亡是由于缺乏一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(神經(jīng)管)產(chǎn)生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。之后發(fā)現(xiàn)連接到一種昆布氨酸覆蓋的唾液腺膜(Sialasticmembrane)上的BDNF可以防止這種細(xì)胞的死亡(Kalcheimetal.，1987.EMBOJ.6∶2871-2873)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)把BDNF注射到發(fā)育中的鳥蛋中可以減少在結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中自然出現(xiàn)的細(xì)胞死亡，而NGF不具有這種作用(HoferandBarde，1988，Nature331∶261-262)。BDNF除了對(duì)神經(jīng)脊和神經(jīng)板來(lái)源的外周感覺(jué)神經(jīng)元有影響外，還發(fā)現(xiàn)它對(duì)發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元的存活有支持作用。Johnson等人(1986，J.Neurosci6∶3031-3938)提供數(shù)據(jù)表明BDNF對(duì)由E17大鼠胚胎培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活有支持作用。這和以前的研究所顯示的由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞靶區(qū)制備的腦組織提取物和條件培養(yǎng)基對(duì)這些神經(jīng)元的生長(zhǎng)有支持作用是一致的(McCafferyetal.，1982，Ex.BrainRes.48∶37-386;Sarthyetal.，1983，J.Neurosci.3∶2532-2544;Turneretal.，1983，Dev.BrainRes.6∶77-83).除了在培養(yǎng)基中對(duì)發(fā)育中的神經(jīng)元的生存有影響外，BDNF還顯示出對(duì)于培養(yǎng)成熟的外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元有作用。雖然成熟的感覺(jué)神經(jīng)元似乎不需要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可在體外維持3或4周，但是BDNF以及NGF已表明在培養(yǎng)基中刺激成熟的大鼠DRG神經(jīng)元的軸突再生(Lindsay，1988，J.Neurosci.8∶2394-2405)。而且在成熟大鼠視網(wǎng)膜的培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)BDNF可以促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的生存和軸突的伸長(zhǎng)(Thanosetal.，1989，Eur.J.Neurosci.1∶19-26)NGF和BDNF的生物學(xué)效應(yīng)的比較見(jiàn)表Ⅰ。表ⅠBDNF和NGF生物學(xué)活性的比較＊存活＊＊外周神經(jīng)系統(tǒng)BDNFNGF(ⅰ)E6雞背側(cè)根神經(jīng)節(jié)-++E10雞背側(cè)根神經(jīng)節(jié)-++E12雞交感神經(jīng)元-++(ⅱ)E6-E12雞背側(cè)根神經(jīng)節(jié)++++E6-E12雞結(jié)狀神經(jīng)節(jié)++-E12雞交感神經(jīng)元-++E12雞睫狀神經(jīng)節(jié)--(Lindsayetal.，1985，Supra.)(ⅲ)E3-E14雞頸靜脈神經(jīng)節(jié)+/++++背內(nèi)側(cè)-三叉神經(jīng)節(jié)+/++++巖神經(jīng)節(jié)+/++-膝狀神經(jīng)節(jié)+/++-腹外側(cè)-三叉神經(jīng)節(jié)++-前庭神經(jīng)節(jié)--中腦神經(jīng)節(jié)++-(Daviesetal.，1986Supra)(Bardeetal.，1987.prog.BrainRes.，71∶185-189).中樞神經(jīng)系統(tǒng)(ⅰ)E17鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞++-(Johnsonetal.，1986，J.Neurosci.6∶3031-3038)＊按照出版物日期先后順序;體外試驗(yàn)的效果。＊＊無(wú)存活(-);中等存活(+);良好存活(++)。2.3.2腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的神經(jīng)靶已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)節(jié)的感覺(jué)神經(jīng)元是由兩個(gè)截然不同的，過(guò)渡的胚胎結(jié)構(gòu)即神經(jīng)嵴和神經(jīng)基板之一發(fā)育而來(lái)。神經(jīng)嵴似乎可以產(chǎn)生自主神經(jīng)節(jié)和脊神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)節(jié)即背側(cè)根神經(jīng)節(jié)(DRG)的神經(jīng)元和衛(wèi)星細(xì)胞，已經(jīng)使用由LeDouarin設(shè)計(jì)的鳥/雞嵌合體移植體系研究了神經(jīng)嵴和神經(jīng)基板對(duì)腦神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)節(jié)形成所起的作用(LeDoua-rin，1973，DevelopBiol.20∶217-222;Noden，1978，Develop.Biol.67∶313-329;NarayananandNarayanan，1980，AnatRec.196∶71-82;Ayer-LeLievreandLeDouarin，1982，Develop.Biol.94∶291-310;D′Amico-MaratelandNodem，1983，Am.J.Anat.166∶445-468)。正如Lindsay等人所指出的(1985，J.Cell.Sci.Supp.3∶115-129)，目前相信，至少對(duì)于鳥類來(lái)說(shuō)，第七，第九和第十腦神經(jīng)的末梢神經(jīng)節(jié)(分別為膝狀神經(jīng)節(jié)，巖神經(jīng)節(jié)和結(jié)狀神經(jīng)節(jié))的神經(jīng)元和第八腦神經(jīng)的前庭聽(tīng)神經(jīng)結(jié)合體的神經(jīng)元只是由神經(jīng)基板產(chǎn)生的。第五腦神經(jīng)的三叉神經(jīng)節(jié)包含有源于神經(jīng)嵴和神經(jīng)板的神經(jīng)元(在上下頜葉的腹外側(cè)板上神經(jīng)基板產(chǎn)生的神經(jīng)元占優(yōu)勢(shì))，而所有腦神經(jīng)節(jié)的衛(wèi)星細(xì)胞都被發(fā)現(xiàn)是源于神經(jīng)嵴的。通過(guò)使用脊神經(jīng)和腦神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)元的移出物和分離的神經(jīng)元富集培養(yǎng)物進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由神經(jīng)嵴來(lái)源的感覺(jué)神經(jīng)元對(duì)NGF有反應(yīng);相反，由神經(jīng)基板產(chǎn)生的神經(jīng)元(包括三叉神經(jīng)節(jié)腹外側(cè)部分的神經(jīng)元和前庭神經(jīng)節(jié)、膝狀神經(jīng)節(jié)，巖神經(jīng)節(jié)和結(jié)狀神經(jīng)節(jié)的全部神經(jīng)元群)在整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)NGF基本上沒(méi)有應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)照它們的需要和對(duì)NGF的應(yīng)答所表現(xiàn)出的差別，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)基板和神經(jīng)嵴產(chǎn)生的感覺(jué)神經(jīng)元(表Ⅰ)對(duì)BDNF的存活和軸突促進(jìn)活性都是敏感的(Lindsay，etal.，1985，J.Cell.Sci.Supp.3∶115-129;Lindsayetal.，1985，Develop.Biol.112∶319-328;Kal-cheimandGendreau.1988.，(Develop.BrainRes.41∶79-86)。Tebar和Barde(1988，J.Neurosci.8∶3337-3342)研究了放射性標(biāo)記的BDNF對(duì)雞胚胎背側(cè)根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的結(jié)合參數(shù);他們的研究結(jié)果與有兩類BDNF受體存在是一致的。一類對(duì)BDNF表現(xiàn)出高親合性，而另一類則表現(xiàn)出低親和性。在交感神經(jīng)元中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)高親和性受體。Barde等人對(duì)BDNF已知的神經(jīng)元靶進(jìn)行了進(jìn)一步的論述(1987，Prog.BrainRes.71∶185-189)。在本發(fā)明之前，由于缺乏專對(duì)BDNF特異的核酸或抗體探針，細(xì)胞合成BDNF的鑒定一直不是一件容易的事情，企圖制備BDNF的多克隆或單克隆抗體一直沒(méi)有成功。這種在獲得抗體方面的失敗阻礙了BDNF的分子克隆化、在體內(nèi)去除發(fā)育中的BDNF神經(jīng)元之生理學(xué)效應(yīng)的測(cè)定、運(yùn)用免疫測(cè)定法對(duì)組織中BDNF的定量測(cè)定，以及運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)BDNF的定位。表ⅡBDNF應(yīng)答和非應(yīng)答神經(jīng)元＊概況A應(yīng)答神經(jīng)元Ⅰ在以下各處的源于神經(jīng)嵴的雞感覺(jué)神經(jīng)元。(a)背側(cè)根神經(jīng)節(jié)(b)頸靜脈神經(jīng)節(jié)(c)背內(nèi)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)(d)中腦三叉神經(jīng)節(jié)＊＊Ⅱ在以下各處的源于外胚層基板的雞感覺(jué)神經(jīng)元(a)結(jié)狀神經(jīng)節(jié)(b)前庭神經(jīng)節(jié)(c)巖神經(jīng)節(jié)(d)膝狀神經(jīng)節(jié)(e)腹外側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)Ⅲ大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞B不應(yīng)答神經(jīng)元Ⅰ雞和大鼠的交感神經(jīng)元Ⅱ雞副交感睫狀神經(jīng)元＊來(lái)自Bardeetal.，1987，Prog.BrainRes.71∶185-189＊＊見(jiàn)Daviesetal.，1986，Nature319∶497-499.3.本發(fā)明的概述本發(fā)明涉及編碼了腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的核酸順序，由其大量生產(chǎn)的基本純化的蛋白質(zhì)，肽片段或衍生物和針對(duì)BDNF蛋白質(zhì)、肽片段、或衍生物的抗體。本發(fā)明首次使制備足夠量的BDNF成為可能，以致能夠生產(chǎn)抗BDNF的抗體和保證BDNF的診斷和治療應(yīng)用。在本發(fā)明的各種實(shí)施例中，BDNF核酸、蛋白質(zhì)、肽、衍生物或本發(fā)明的抗體可以用于各種神經(jīng)疾病的紊亂的診斷和治療方法中，尤其是用于感覺(jué)神經(jīng)疾病和視網(wǎng)膜退化的診斷和治療中。而且，在本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，BDNF核酸或BDNF基因產(chǎn)物可以用于診斷和治療成神經(jīng)細(xì)胞瘤腫瘤，帕金森氏病和阿爾茨海默氏病(早老性癡呆)。在本發(fā)明的其他一些具體實(shí)施例中，BDNF基因產(chǎn)物也可以用來(lái)促進(jìn)植入物結(jié)合到神經(jīng)組織內(nèi)，或者，用于促進(jìn)由于創(chuàng)傷、梗死、感染或手術(shù)后引起損傷后的神經(jīng)再生。本發(fā)明還涉及到含有有效量的BDNF基因產(chǎn)物或者作為另一種選擇含有針對(duì)BDNF基因產(chǎn)物的抗體的藥物組合物，這種組合物可用于診斷或治療各種神經(jīng)疾病和紊亂。另外通過(guò)給出BDNF完整的核苷酸序列，本發(fā)明可以對(duì)BDNF和NGF基因進(jìn)行比較，籍以識(shí)別出同源區(qū)，并且定義一種BDNF/NGF基因族。因此，本發(fā)明涉及到一種BDNF/NGF基因族其他成員的識(shí)別方法。在某一個(gè)具體的實(shí)施例中，本發(fā)明的該方法用于識(shí)別BDNF/NGF基因族的一種新的，非NGF，非BDNF的成員。本發(fā)明進(jìn)一步提供根據(jù)所公開(kāi)的方法和他們的基因產(chǎn)物鑒定出的BDNF/NGF基因族中的其他成員。3.1.縮略語(yǔ)及定義BDNF是腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子hBDNF人的腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子CAT膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶CNS中樞神經(jīng)系統(tǒng)DRG背側(cè)根神經(jīng)節(jié)EDTA乙二胺四乙酸NGF神經(jīng)生長(zhǎng)因子PBS磷酸鹽緩沖的鹽水PCR聚合酶鏈反應(yīng)PNS外周神經(jīng)系統(tǒng)SDS硫酸十二烷基鈉Tris三羥甲基氨基甲烷4.附圖的說(shuō)明圖1豬的前體BDNFcDNA的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列.在這個(gè)圖中表示了兩個(gè)重迭c(diǎn)DNA克隆的完整順序。底部劃線的是由微定序(表Ⅲ)得到的肽順序。底部劃雙線表示N-糖基化下僅有的一致順序。成熟BDNF序列的起點(diǎn)以雙克拉(Carat)標(biāo)記。圖2NGF和BDNF之間的順序比較。在相同位置上有兩個(gè)以上氨基酸的區(qū)域已經(jīng)標(biāo)出。該順序的成熟蛋白質(zhì)的第一個(gè)氨基酸起始并且在終止密碼子之前的最后一個(gè)氨基酸結(jié)束。五十一個(gè)氨基酸為BDNF和各種NGFs所共有的(Schwarz.etal.，1989，J.Neuro-chem.52∶1203-1209)，包括6個(gè)半胱氨酸殘基。圖3大腸桿菌(EcoRI)切割的人、猴、大鼠、小鼠、狗、牛、兔、雞和酵母基因組DNA，與32P-標(biāo)記的NGF和BDNF探針雜交后的Southem印跡的放射自顯影照片。圖4Northern印跡分析。取每種組織20μg總量的RNA置于每條通道上，并與32P-標(biāo)記的cRNA小鼠BDNF探針進(jìn)行雜交。注意用腦組織在大約1.45KB處可以看到一個(gè)強(qiáng)的信號(hào)，而用其他七種被分析的組織則沒(méi)有。圖5人的BDNFcDNA序列和推斷的氨基的順序，以及豬、鼠和雞的DNA序列的比較。圖6BDNF的表達(dá)質(zhì)粒pCMVI-pBDNF。圖7(a)運(yùn)用一系列的抗血清稀釋液，進(jìn)行抗血清與B5肽結(jié)合的ELISA測(cè)定結(jié)果。(b)各種抗血清1500的稀釋液與50ngBDNF結(jié)合的定量測(cè)量。圖8對(duì)用BDNF處理的(陰影線條)和對(duì)照組(實(shí)線條)的前側(cè)中腦培養(yǎng)物中的酪氨酸羥化酶進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。圖9由前側(cè)中腦組織培養(yǎng)物攝取的多巴胺。添加BDNF的培養(yǎng)物以陰影線表示;而對(duì)照組培養(yǎng)物以實(shí)線條表示。圖10(a)在前腦膽堿能神經(jīng)元培養(yǎng)物中，BDNF膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的影響。(b)用150ng/ml和NGF，以每孔260，000個(gè)細(xì)胞(黑條)或每孔150，000個(gè)細(xì)胞(陰影線條)的密度對(duì)前腦膽堿能神經(jīng)元培養(yǎng)物進(jìn)行處理。對(duì)用NGF處理和未處理細(xì)胞中的膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)免疫陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行比較。圖11CAT酶活性度量的變化與前腦膽堿能神經(jīng)元培養(yǎng)物中BDNF濃度的函數(shù)關(guān)系，CAT酶活性大小以每分鐘被催化底物的微微摩爾數(shù)計(jì)算。圖12用(a)表皮生長(zhǎng)因子，或者(b)BDNF對(duì)星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物以大約60%的融合率進(jìn)行處理42小時(shí)，然后與[3H]甲基胸腺嘧啶脫氨核苷一起進(jìn)行保溫培養(yǎng)，測(cè)定相對(duì)于EGF和BDNF濃度的3H結(jié)合量。圖13與BDNF/NGF探針RIB/2C雜交的EcoRI切割的雞、小鼠、大鼠的Southern印跡圖。NGF和BDNF基因組的EcoRI片段的位點(diǎn)分別以N和B表示。圖14NGF和BDNF與BDNF/NGF族中新成員的順序比較，這種新成員是運(yùn)用Box3/Box4引物通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)從小鼠DNA中識(shí)別出的，所說(shuō)的Box3/Box4引物是一種新的基因[這里被表示為M3/4]，也被稱之為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)，只表示編碼鏈的順序和推斷出的相對(duì)于成熟小鼠NGF和成熟豬，大鼠，小鼠，或人BDNF排齊的氨基酸順序。破折線(--)表示NGF中缺失一個(gè)密碼子的位點(diǎn)，這種缺失被用來(lái)使相對(duì)于BDNF和M3/4的排列最佳化。斜體字母表示氨基酸順序和/或保守的氨基酸取代物的配對(duì)物。圖15由各種人類腫瘤得到的細(xì)胞系中制備的RNA與BDNF人探針雜交后進(jìn)行的Northern印跡反應(yīng)。圖16海馬神經(jīng)元中BDNF-mRNA水平的去極化作用。(a)在有50mMKCl存在的情況下，BDNF-mRNA在海馬神經(jīng)元起初培養(yǎng)物中表達(dá)的時(shí)間過(guò)程。從0.5×106個(gè)細(xì)胞中提取總的細(xì)胞RNA，使其乙醛酸化并在1.3%的瓊脂凝膠上通過(guò)電泳進(jìn)行分析(Biziere，K.andCoyle，T.，Neurosci.，1978，Lett.8∶303;McGeeretal.，1978，BrainRes.139∶381)。將轉(zhuǎn)移到HybondN濾紙上的RNA和通過(guò)體外完全(run-off)轉(zhuǎn)錄制備的對(duì)小鼠BDNF有特異性的32P-標(biāo)記cRNA探針(特異活性，109cpm/μg)進(jìn)行雜交。兩條上譜帶(4和1.5KB)與BDNF-mRNA相對(duì)應(yīng);BDNF的這兩條譜帶(4Kb和1.5Kb)是RNAseA-抗性的，并且代表了兩種不同的轉(zhuǎn)錄，不過(guò)兩種轉(zhuǎn)錄似乎以相似的方式被調(diào)節(jié)，下面部分(700bp)代表在RNA提取之前加到樣本內(nèi)的10pg的短時(shí)間的BDNF-mRNA恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn)液。(b)鈣依賴性。將神經(jīng)元分別在正常培養(yǎng)基(cM)無(wú)鈣的修飾培養(yǎng)基(-Ca)或含有10μM硝苯吡啶的培養(yǎng)基(NIF)中培養(yǎng)3小時(shí)，標(biāo)明(+K)的加50mMKCl。圖17鉀和卡因酸對(duì)海馬神經(jīng)元中NGF-mRNA含量的增加。將神經(jīng)元在對(duì)照培養(yǎng)基(C)中或在有50mMKCl(K+)或有25μM卡因酸(KA)存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3小時(shí)。提取RNA并且通過(guò)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(11)測(cè)定NGF-mRNA的含量，其數(shù)值是平均數(shù)±SEM(n＝6)圖18卡因酸作用的劑量反應(yīng)曲線。將海馬神經(jīng)元在有各種不同濃度卡因酸存在的情況下培養(yǎng)3小時(shí)，提取RNA并且用如圖16所述的方法進(jìn)行分析，數(shù)值代表三次實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±SEM。圖19經(jīng)卡因酸處理后BDNF-和NGF-mRNA含量增加的時(shí)間歷程。在腹膜內(nèi)注射卡因酸(12mg/Kg)后所標(biāo)示的時(shí)間(以小時(shí)計(jì))上從海馬(a)或腦皮層(b)中提取總的細(xì)胞RNA，并按照?qǐng)D16所說(shuō)的方法進(jìn)行分析。在注射卡因酸后90分鐘注射單獨(dú)一次劑量的安定(10mg/Kg)[BDNF的這兩條譜帶(4Kb和1.5Kb)是RNAseA-抗性的，并且代表了兩種似乎以相似方式調(diào)節(jié)的不同轉(zhuǎn)錄](méi)。圖中表示了對(duì)應(yīng)于1.5KbBDNF-mRNA(0)和1.3KbNGF-mRNA(0)的測(cè)定值。對(duì)于4KbBDNF-mRNA也觀察到類似的增加現(xiàn)象。所給數(shù)值代表3至4次實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。圖20抗驚厥藥對(duì)卡因酸誘導(dǎo)的BDNF-mRNA表達(dá)的影響。對(duì)大鼠腹膜內(nèi)注射安全(10mg/Kg)(DZ);在注射卡因酸(12mg/Kg)(+KA)或生理鹽水(對(duì)照)之前15分鐘注射MK-801(1mg/Kg)(MK)或氨基酮(20mg/Kg)(KET)。三小時(shí)后用海馬組織按圖16所述的方法制備總RNA。數(shù)值代表3次實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。圖21中隔細(xì)胞的培養(yǎng)A-F。培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間歷程的階段對(duì)照顯微照相，將細(xì)胞按照說(shuō)明書中所述方法以1.3×(105)個(gè)細(xì)胞/cm2的密度置于平板上，保持在5HS/NS中。記錄時(shí)間為節(jié)1(A，B)，2(C，D)和4(E，F(xiàn))天。用細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物來(lái)識(shí)別細(xì)胞群，AchE組織化學(xué)染色的神經(jīng)元(G，H)和NGF-受體免疫陽(yáng)性神經(jīng)元(Ⅰ)。標(biāo)尺長(zhǎng)度(Scalebar)＝25μm。圖22根據(jù)AChE細(xì)胞數(shù)目比較分離的中隔細(xì)胞對(duì)BDN或NGF處理的響應(yīng)情況。A比較對(duì)BDNF(25ng/ml)NGF(50ng/ml)或者對(duì)二者以不同分布密度結(jié)合的響應(yīng)。(B)比較膽堿能神經(jīng)元對(duì)不同BDNF或NGF濃度范圍(0-50ng/ml)的響應(yīng)。獲得這些結(jié)果所用的細(xì)胞要在含有血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)11-12天的時(shí)間。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表6-9次測(cè)定值的均數(shù)±SEM。圖23直條圖表示向分離的中隔細(xì)胞培養(yǎng)物中推遲加入BDNF或NGF所產(chǎn)生的效果。將BDNF(50ng/ml)或NGF(50ng/ml)在推遲5-6小時(shí)(+12)，5天(-5/+7)或7天(-7/+5)后加入到分離的細(xì)胞培養(yǎng)物中。將培養(yǎng)物保持12天。根據(jù)AChE陽(yáng)性組織化學(xué)染色對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。所得結(jié)果以4到5次測(cè)定值的均數(shù)±S.E.M表示。圖24直條圖表示BDNF或NGF對(duì)NGF-受體免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的調(diào)節(jié)能力。運(yùn)用11000的單克隆抗體192-IgG稀釋液對(duì)NGF-受體進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)(immunoslating)，將分離的中隔細(xì)胞以1.3×(105)個(gè)細(xì)胞/cm2的密度進(jìn)行平板培養(yǎng)并連續(xù)處理12天。在飽和劑量的NGF和不同劑量范圍的BDNF(0-100ng/ml)之間進(jìn)行比較。所得結(jié)果是同等于4的均值±S.E.M.圖25中隔膽堿能神經(jīng)元對(duì)BDNF(A)和NGF(B)的CAT誘導(dǎo)活性的劑量反應(yīng)曲線。將培養(yǎng)物涂覆于聚鳥氨酸和昆布氨酸覆蓋的6mm孔上并在5HS/N3中保持12天。在涂覆后5-6小時(shí)將細(xì)胞與BDNF或NGF接觸。每3天在更換培養(yǎng)基時(shí)更換一次這些因子。所得結(jié)果代表5-6次測(cè)定值的平均值±S.E.M.圖26BDNF和NGF對(duì)AChE酶活性的劑量響應(yīng)的影響。將大鼠的中隔膽堿能神經(jīng)元在含有血清的并且加入激素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)12天。按照?qǐng)D25所述的方法用BDNF(空方框表示)和NGF(實(shí)框表示)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。所得結(jié)果是同等于6-9的平均值±S.E.M.。未處理培養(yǎng)物中的AChE活性是16.4±2nmol/小時(shí)/孔。圖27由BDNF和NGF誘導(dǎo)的CAT酶活性增加的時(shí)間歷程。以密度為2.3×(105)個(gè)細(xì)胞/cm2涂覆的并在含有血清和加入激素和外源性因子的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞進(jìn)行一定時(shí)間的CAT活性激活。在涂覆5-6小時(shí)后將這些細(xì)胞初次和BDNF(空方框表示)或NGF(實(shí)方框表示)接觸。所得結(jié)果代表處理培養(yǎng)物和未處理培養(yǎng)物中所能測(cè)活性的百分比(n＝6)，BDNF12天n＝3)。圖28比較神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)BDNF誘導(dǎo)CAT酶活性能力的影響。將中隔細(xì)胞以2.3×(105)個(gè)細(xì)胞/cm2的密度平板培養(yǎng)。在培養(yǎng)5-6小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成一種不含血清或一種含血清但都含有如本發(fā)明書中詳細(xì)說(shuō)明的1%N3的培養(yǎng)基。為了進(jìn)一步減少星形細(xì)胞數(shù)目在24小時(shí)期間加入胞嘧啶阿拉伯糖苷(1μM)。然后將培養(yǎng)物保持12天。所得結(jié)果代表4次測(cè)定值的均值±S.E.M.圖29直條圖表示BDNF或NGF處理對(duì)高親合性膽堿攝入水平的影響。在以密度為1.3×(105)個(gè)細(xì)胞/cm2涂覆后對(duì)培養(yǎng)了11天的細(xì)胞進(jìn)行膽堿攝入。在整個(gè)培養(yǎng)期間有BDNF(50ng/ml)和NGF(50ng/ml)存在。數(shù)據(jù)代表BDNF的5次測(cè)定以及NGF的10次測(cè)定值的平均值±S.E.M.圖30用胰蛋白酶和蛋白內(nèi)切酶Arg-C對(duì)人腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行酶切割，得到的35S-標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDSpage鑒別。圖31通過(guò)DRG生物測(cè)定法比較由蛋白內(nèi)切酶切割的CHO-hBDNF和未處理的CHO-hBDNF的圖解說(shuō)明。在0到5之間計(jì)分評(píng)價(jià)軸突的生長(zhǎng)情況，5分代表最大生物活性。圖32在培養(yǎng)基中9天后用酪氨酸羥化酶(TH)的單克隆抗體染色的E14大鼠前側(cè)中腦細(xì)胞的分離培養(yǎng)物的相襯顯微照相(A)和光亮背景(B.C)顯微照相。A和B，對(duì)同一區(qū)域的相襯和光亮背景攝影表明在這些培養(yǎng)物中TH+神經(jīng)元很少。在含有很多由光亮圖像代表的軸索神經(jīng)元的區(qū)域中只發(fā)現(xiàn)一個(gè)TH+神經(jīng)元(箭頭所指)。通過(guò)形態(tài)學(xué)研究或GFAP染色(沒(méi)有表示出)顯然沒(méi)有多少非神經(jīng)元細(xì)胞。C.在含有大約98個(gè)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)光亮相圖像細(xì)胞的區(qū)域中，顯示了兩個(gè)TH+神經(jīng)元(小箭頭所指)光亮區(qū)域照片，標(biāo)尺＝1001M。圖33E14大鼠前側(cè)4腦細(xì)胞的6天培養(yǎng)物的高倍顯微攝影它表示了TH+神經(jīng)元的各種不同形態(tài)，有些有大量的軸突生長(zhǎng)和非常精細(xì)的生長(zhǎng)錐體(A.B)。培養(yǎng)物的制備和染色按照?qǐng)D32的說(shuō)明所描述的進(jìn)行。標(biāo)尺＝25μM。圖34BDNF以與劑量有關(guān)的方式對(duì)培養(yǎng)周期長(zhǎng)于3天以后在培養(yǎng)基中的TH+多巴胺能的中腦神經(jīng)元的存活有明顯的促進(jìn)作用。A有BDNF(黑色直條)或沒(méi)有BDNF(空白直條)維持的E14大鼠前側(cè)中腦培養(yǎng)物中TH+神經(jīng)元的數(shù)目的比較。在被處理的培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)第2天一次加入BDNF(50ng/ml)。在第3天時(shí)對(duì)照培養(yǎng)物和實(shí)驗(yàn)處理培養(yǎng)物之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異，但是，在第8天用BDNF處理的培養(yǎng)物中TH+神經(jīng)元的數(shù)目比對(duì)照培養(yǎng)物高1.8倍。其數(shù)值是兩份同樣樣本的平均值。BBDNF增加TH+神經(jīng)元存活的作用是與劑量有關(guān)的。對(duì)沒(méi)有BDNF的培養(yǎng)基或含有在第2天加入BDNF而增加濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天后，測(cè)定一種培養(yǎng)基中TH+神經(jīng)元的數(shù)目。CNGF對(duì)TH+神經(jīng)元的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。為了確定BDNF的特異性，培養(yǎng)物還在有或沒(méi)有NGF(50ng/ml)存在的條件下培養(yǎng)8天，并分析其TH+細(xì)胞，在第6天或第8天檢查培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)在第2天加入的NGF并不增加培養(yǎng)基中TH+神經(jīng)元的生長(zhǎng)。所得結(jié)果為兩個(gè)培養(yǎng)皿的平均值。圖35與在第2天單獨(dú)一次加入BDNF比較，重復(fù)劑量的BDNF還會(huì)進(jìn)一步增加TH+神經(jīng)元的生長(zhǎng)。按照本說(shuō)明書的描述制備培養(yǎng)物，從CosM5細(xì)胞上清液中純化重組體人BDNF，將培養(yǎng)物在第2天時(shí)一次加入(SA;點(diǎn)畫直條表示)BDNF(50ng/ml)進(jìn)行處理，或者在第1，2，4，6和8天時(shí)用重復(fù)劑量的BDNF(50ng/ml)進(jìn)行處理(MA-多次加入;實(shí)體直條表示)，或在沒(méi)有BDNF的情況下生長(zhǎng)(對(duì)照;空白直條表示)。在所標(biāo)示的時(shí)間上把培養(yǎng)基固定并染色以測(cè)定TH免疫反應(yīng)活性。通過(guò)多次加入加強(qiáng)BDNF使得在第11天TH+神經(jīng)元數(shù)目比對(duì)照組高2.7倍，而11天后在一次加入BDNF情況下看到的最大增加量不到對(duì)照組的兩倍。所得結(jié)果，幾次實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)是兩個(gè)樣本的平均值。圖36BDNF的推遲加入不能像在第2天加入BDNF時(shí)同樣程度地增加TH+神經(jīng)元的數(shù)目。除外源性BDNF的加入時(shí)間不同外，按照本說(shuō)明書所述制備培養(yǎng)物。將所有培養(yǎng)物在第2天轉(zhuǎn)換到不含血清的培養(yǎng)上并且以一次加入的方式，在第2天，第5天或第七天(CD2，CD5，CD7)時(shí)加入BDNF(50ng/ml，豬腦BDNF)。在培養(yǎng)第6，8，10天時(shí)，在一式兩份的培養(yǎng)物中測(cè)定TH+神經(jīng)元的數(shù)目。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在第2天時(shí)一次加入BDNF導(dǎo)致在第10天時(shí)TH+神經(jīng)元的數(shù)目比對(duì)照組高3倍，如果推遲BDNF的加入，在第5天加入時(shí)，在第10天觀察到TH+神經(jīng)元數(shù)目超過(guò)對(duì)照組，但是不到兩倍，而且隨著更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，用藥組和對(duì)照組之間TH+細(xì)胞數(shù)的差別也不會(huì)進(jìn)一步增大。對(duì)照組用空白直條表示;在第2天加入BDNF組用點(diǎn)畫直條表示;在第5天加入BDNF組用實(shí)心直條表示;在第7天加入BDNF組用陰影斜線直條表示。圖37BDNF對(duì)海馬培養(yǎng)物中高親和性GABA攝入量的劑量依賴響應(yīng)。將部分純化的nBDNF(從CosM5上清液中離心純化)以不同稀釋濃度加入到培養(yǎng)物中。發(fā)現(xiàn)1×10-2稀釋度的BDNF對(duì)E8雞背側(cè)根神經(jīng)節(jié)有最大的軸突促進(jìn)活性。在體外BDNF處理8天后測(cè)定高親和性3H-GABA的攝入量。圖38BDNF可防止MPP+對(duì)培養(yǎng)的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)毒害作用。按照在圖1說(shuō)明中描述的方法從E14大鼠胚胎中制備培養(yǎng)物。在離體24小時(shí)后將培養(yǎng)基換成無(wú)血清的配方。培養(yǎng)3天后，將培養(yǎng)基分裝到四組6個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中。一組做為對(duì)照組，其他組分別加入(ⅰ)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子;10ng/ml(牛腦bFGF;Boerhinger-Mannheim);(ⅱ)小鼠NGF，50ng/ml;或(ⅲ)BDNF，50ng/ml將培養(yǎng)物再保持24小時(shí)后，把每組中的三個(gè)培養(yǎng)皿與1μMMPP+(生物化學(xué)研究有限公司，Natick，MA)接觸48小時(shí)。在總共6天的實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將所有的平皿進(jìn)行TH的免疫反應(yīng)活性測(cè)定，并測(cè)定每組的TH+細(xì)胞數(shù)目。給出的數(shù)據(jù)代表MPP+處理后的在未經(jīng)MPP+處理的相似培養(yǎng)物中TH+神經(jīng)元數(shù)目的百分比計(jì)算的TH+神經(jīng)元數(shù)目。所有數(shù)值都是三份相同培養(yǎng)物平均值+s.e.m.5.本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明涉及編碼了腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的核酸序列，以及用這些核酸序列大量生產(chǎn)的BDNF蛋白質(zhì)，肽片段和衍生物。另外，本發(fā)明涉及BDNF的藥物組合物和治療用途，首次為臨床運(yùn)用提供了產(chǎn)生足夠量的基本上是純化的BDNF的生產(chǎn)方法。本發(fā)明還涉及到針對(duì)BDNF或其片段的抗體，并提供了制備足夠免疫原的方法。而且，通過(guò)比較BDNF和NGF的核酸順序，本發(fā)明還提供識(shí)別BDNF和NGF核酸順序中的同源區(qū)的方法，從而定義一種BDNF/NGF基因族;本發(fā)明提供一種用于識(shí)別和分離這種基因族的其他成員的方法。為了清楚地描述本發(fā)明而不是為了限制，本發(fā)明可以按照下列幾個(gè)部分?jǐn)⑹?ⅰ)BDNF的純化(ⅱ)BDNF的生物測(cè)定(ⅲ)BDNF蛋白質(zhì)的微定序(ⅳ)BDNF編碼DNA的克隆(ⅴ)BDNF的表達(dá)(ⅵ)BDNF基因和蛋白質(zhì)(ⅶ)抗-BDNF抗體的產(chǎn)生(ⅷ)BDNF/NGF基因族其他成員的識(shí)別(ⅸ)本發(fā)明的用途(ⅹ)藥物組合物5.1.腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的純化為了識(shí)別BDNF編碼核酸，可以從組織中獲得微克量的BDNF蛋白質(zhì)，使能測(cè)定可以用來(lái)設(shè)計(jì)寡聚核苷酸探針的氨基酸順序。這種極少量的BDNF蛋白質(zhì)實(shí)際限制了可被測(cè)定的氨基酸序列的量。可以按照Barde等人(1982，EMBOJ.1∶549-553)或Hofer和Barde(1988，Nature331∶261-262)所描述的方法從豬腦中制備BDNF。BDNF的制備最好按照下面所提供的實(shí)施例中所給出的詳細(xì)方案進(jìn)行，但并不受其限制;該技術(shù)中的譜通技術(shù)人員在使用時(shí)會(huì)設(shè)想出各種修改。用于BDNF的含量稀少，在純化過(guò)程中最好使用大約6公斤的腦組織。將腦組織在磷酸鈉緩沖液中勻漿，該緩沖液磷酸鈉的濃度大約為0.2M;并且pH大約為6，含有1mMEDTA和1mM新鮮加入的甲苯磺酰氟，使得腦組織與溶液的比例大約為1公斤腦組織比2升緩沖液。然后可以用鹽酸調(diào)節(jié)混合物的pH到大約4，之后，將混合物在4℃下攪拌2小時(shí)，再將混合物在20，000g下離心25分鐘。離心之后，收集上清液，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至大約6.0，然后再和1升(每6公斤腦組織)已經(jīng)用0.1M磷酸鈉平衡到pH6.0的預(yù)先膨脹的羥基甲基纖維素一起攪拌。用總量為大約20升的0.1M磷酸鈉pH6緩沖液洗幾次后，將漿液倒入一個(gè)柱子中，并且含有0.13MNaCl的相同緩沖液沖洗，最好過(guò)夜。然后將通過(guò)BDNF敏感生物測(cè)定(見(jiàn)下面5.2部分)識(shí)別的活性部分用含有0.5MNaCl的磷酸鹽緩沖液洗脫，并且接著用大約5升pH6.8的5mM磷酸鉀透析幾次。將透析過(guò)的組分加于一個(gè)羥磷灰石柱子上，該柱的床體積大約是每公斤被處理的腦組織用20ml;在加入樣本之前應(yīng)當(dāng)用5mMpH6.8的磷酸鉀將羥磷灰石柱子預(yù)平衡，然后用pH都大約為6.8的線性梯度500ml5mM磷酸鉀至500ml的700mM磷酸鉀對(duì)該柱子洗脫。BDNF活性應(yīng)當(dāng)在大約500mM磷酸鉀附近被最佳地洗脫。將收集的活性組分調(diào)整到一個(gè)大約700mM磷酸鉀的最終摩爾濃度，并且將其加到一個(gè)用pH6.8的700mM磷酸鉀溶液平衡過(guò)的(pheny-sepharose)柱子(床容積為每6Kg被處理的腦組織大約5ml)上。用大約40ml相同的緩沖液沖洗后，可用0.1MpH6.8的磷酸鉀洗脫BDNF活性物，接著用蒸餾水對(duì)BDNF活性物透析，并凍干。用一種含有0.1%SDS但最好不含有巰基乙醇的SDS-凝膠電泳樣本緩沖液溶解該凍干的物質(zhì)，并將其加于一種由線性梯度的10-25%丙烯酰胺組成的SDS凝膠上。電泳分離完成之后，用Coomassie蘭對(duì)凝膠染色大約10分鐘，然后脫色大約20分鐘。取出遷移到細(xì)胞色素C標(biāo)記物水平的帶段并通過(guò)電泳方法從凝膠中洗脫出來(lái)?？梢园凑誛eber和Kuter(1971，J.Biol.Chem.246∶4504-4509)所述的方法基本上去掉SDS。應(yīng)當(dāng)注意的是SDS的去除通常是不完全的。Hofer和Barde.(1988，Nature331261-262)的方法改進(jìn)了用于對(duì)BDNF進(jìn)行微定序的純化步驟，并且不利用凝膠電泳做為純化過(guò)程的最后一步。5.2.腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生物測(cè)定根據(jù)本發(fā)明可以使用任何定性或定量表示BDNF活性的方法。這樣一些生物測(cè)定法在識(shí)別和/或測(cè)定天然的或重組的BDNF活性時(shí)是有用的?？梢允褂迷摷夹g(shù)中已知的任何一種BDNF生物測(cè)定技術(shù)。例如如Barde等人所述(1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77∶1199-1203)在BDNF測(cè)定中可以使用雞胚胎背側(cè)根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元。例如運(yùn)用該技術(shù)中已知的分離技術(shù)采集6到14天，最好10到12天的雞胚胎背側(cè)根神經(jīng)節(jié)，并立即置于一個(gè)小體積的F14培養(yǎng)基中(用GIBCOF-12粉末按照Vogel-等人，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69∶3180-3184那樣進(jìn)行添加而制備)，這種培養(yǎng)基在分離結(jié)束時(shí)換成含有大約0.1%胰蛋白酶的無(wú)Ca2+和Mg2+磷酸鹽緩沖液(PBS)。在37℃培育20分鐘后，將該神經(jīng)節(jié)離心分離，并用含有大約10%(體積/體積)熱失活馬血清的F14介質(zhì)沖洗兩次，然后利用一個(gè)小直徑(大約1mm)的硅化巴斯德氏(Pasteur)吸管通過(guò)輕輕研磨成粉(大約吸10-15次)來(lái)分離這些神經(jīng)節(jié)。然后，最好將細(xì)胞懸浮液通過(guò)40μM孔徑的尼龍篩以去掉剩余的組織塊。然后將細(xì)胞懸浮液置于一塑料組織培養(yǎng)皿上預(yù)培養(yǎng)大約210分鐘，在這期間，大部分非神經(jīng)元細(xì)胞會(huì)粘附在該塑料面上，而富集了神經(jīng)元的細(xì)胞群留在懸浮液中。再將細(xì)胞稀釋成每毫升培養(yǎng)基(最好是添加了10%vol/vol的熱失活馬血清和抗菌素的F14培養(yǎng)基)中含有大約5×103個(gè)細(xì)胞的濃度，然后置于聚鳥氨酸或者，最好是聚鳥氨酸/昆布氨酸覆蓋的組織培養(yǎng)皿中(見(jiàn)下面)。作為另一個(gè)可選擇的方法，但并不局限于此，在某些場(chǎng)合下，最好采用NGF相對(duì)不敏感的BDNF生物測(cè)定方法，而不用那些在一定條件下對(duì)BDNF和NGF有響應(yīng)的測(cè)定系統(tǒng)，如前所述的DRG系統(tǒng)。這種相對(duì)BDNF-特異的系統(tǒng)包括視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)物以及來(lái)源于神經(jīng)基板的神經(jīng)元培養(yǎng)物?？梢愿鶕?jù)Johnson等人(1986，J.Neursci6∶3031-3038)所述的方法培養(yǎng)產(chǎn)期的視網(wǎng)膜細(xì)胞。例如，可以從產(chǎn)期的動(dòng)物中取出視網(wǎng)膜(對(duì)于大鼠來(lái)說(shuō)，這里的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)期的”是指胎令17天一直到出生后48小時(shí)內(nèi)的產(chǎn)后幼鼠，用無(wú)鈣和鎂的磷酸鹽緩沖鹽柱(PBS)沖洗，然后在大約0.05%到0.1%胰蛋白酶的PBS中于37℃下保溫大約15分鐘，在蛋白水解酶水解后，將視網(wǎng)膜在會(huì)有大約10%(體積/體積)熱失活馬血清的F14培養(yǎng)基(F14-HS)中沖洗，然后在少量(大約1-10ml)的新鮮F14-HS中通過(guò)輕輕地用管吸取來(lái)分離視網(wǎng)膜?？墒刮捶蛛x的組織沉淀，然后將剩余的細(xì)胞和培養(yǎng)基吸出進(jìn)行培養(yǎng)。或者，根據(jù)本發(fā)明也可以使用包括神經(jīng)基板產(chǎn)生細(xì)胞的BDNF生物測(cè)定方法如Daviesetal.，(1986，J.Neurosci6∶1897-1904)所描述，可以例如將三叉神經(jīng)節(jié)的前側(cè)部分胚胎腦神經(jīng)移出物或前庭神經(jīng)節(jié)，膝狀神經(jīng)節(jié)，巖神經(jīng)節(jié)或結(jié)狀神經(jīng)節(jié)用培養(yǎng)介質(zhì)覆蓋的膠原凝膠中進(jìn)行培養(yǎng)，或者按照Barde等人(1980，Proc.Natl.Acad.Sci77∶1199-1203)的方法使其分離。由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)將生長(zhǎng)底物由聚鳥氨酸換成昆布氨酸-聚鳥氨酸后，對(duì)于BDNF的應(yīng)答特性會(huì)增加10倍(Bardeetal.，1987，Prog.BrainRes.71∶185-189);BDNF的測(cè)定最好在含有昆布氨酸的底物上進(jìn)行。培養(yǎng)基表層的制備可以通過(guò)下列方式進(jìn)行，如(ⅰ)用一種聚鳥氨酸的滅菌溶液在培養(yǎng)基表層上覆蓋大約8-10小時(shí)(ⅱ)用滅菌水沖洗幾次;和(ⅲ)用一種在PBS中濃度大約為25μg/ml的昆布氨酸覆蓋培養(yǎng)基表面大約2個(gè)小時(shí)(John-sonetal.，1986，J.Neurosci.6∶3031-3038)。在本發(fā)明所使用的任何生物測(cè)定系統(tǒng)中，可以運(yùn)用該技術(shù)中已知的方法來(lái)建立BDNF的劑量響應(yīng)曲線。使用分離的雞感覺(jué)神經(jīng)節(jié)測(cè)定法，用濃度大約為5ng/ml的純化BDNF可得到半數(shù)最大生存率，而用濃度為10-20ng/ml的純化BDNF可以得到最大生存率(Bardeetal.，1987，Prog.BrainRes.71∶185-189)。5.3.腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子蛋白質(zhì)的微定序可以對(duì)由腦制備的BDNF蛋白質(zhì)進(jìn)行定序，但是，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是由于這種蛋白質(zhì)極稀少的量，以致不大可能可靠地得到大部分的BDNF蛋白質(zhì)順序，可以直接對(duì)這種蛋白質(zhì)定序，或者先通過(guò)任何一種蛋白酶或該技術(shù)中已知的其他物質(zhì)包括但不限于，金黃葡萄球菌V8(StaphylocoocusaureusV8)，胰蛋白酶，和溴化氰進(jìn)行切割?？梢愿鶕?jù)Hewick等人(1981，J.Biol.Chem.256∶7990-7997)和Hun-kapillar等人(1983，MethodsEnzymol.91∶227-236)的方法在一種氣相顯微定序儀上通過(guò)自動(dòng)Edman降解來(lái)對(duì)肽定序。然后根據(jù)Lottspeich的方法(1985，Chromatography326∶321-327)進(jìn)行苯基硫乙內(nèi)酰脲氨基酸檢測(cè)?？梢詼y(cè)定出氨基酸序列的重疊片段，并且用來(lái)推斷更長(zhǎng)的鄰接的氨基的延伸。5.4.腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-編碼DNA的克隆由于BDNF的稀少，實(shí)際上不能夠使用標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)克隆BDNF基因。例如，如果使用現(xiàn)有的蛋白質(zhì)序列來(lái)制備一個(gè)互補(bǔ)的標(biāo)記寡聚核苷酸探針，并且用這種探針對(duì)由被推測(cè)的組織得到的cDNA庫(kù)進(jìn)行篩選來(lái)合成BDNF，那么陽(yáng)性克隆的數(shù)目可能會(huì)極少極少。本發(fā)明提供了一種克隆BDNF基團(tuán)的組合步驟，包括純化適量的BDNF蛋白質(zhì)，對(duì)BDNF蛋白質(zhì)微定序產(chǎn)生寡聚核苷酸探針，構(gòu)建一個(gè)cDNA庫(kù)，根據(jù)得到的BDNF氨基酸序列進(jìn)行放大，最后選擇BDNF基因。在本發(fā)明的這種方法中，放大步驟最好采用通過(guò)聚合鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行組織核酸序列的放大(Saikietal.，1985，Science，230∶1350-1354)以便增加可用于克隆的BDNF序列的數(shù)目。對(duì)這種優(yōu)選方法的詳細(xì)描述如下首先，可以使用從純化BDNF蛋白質(zhì)中得到的氨基酸順序來(lái)推斷用于聚合酶鏈反應(yīng)中的寡聚核苷酸引物，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，其中幾個(gè)核酸三聯(lián)體可能對(duì)同一氨基酸有特異性，所以對(duì)一個(gè)給定氨基酸順序應(yīng)當(dāng)合成幾個(gè)寡聚核苷酸，以便提供幾種可能的核苷酸序列的組合，所得到的這些寡聚核苷酸被稱之為簡(jiǎn)并引物。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)需要有義鏈及反有義鏈引物。因此，可以使用一種與BDNF氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的簡(jiǎn)并寡聚核苷酸引物做為一條DNA鏈的引物，而可以使用與常見(jiàn)DNA序列同源的第二種引物，如mRNA的多腺苷尾部反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的胸腺嘧啶脫氨核苷殘基段作為第二條DNA鏈的引物，這些引物就可以用于用假定含有BDNF編碼序列的核酸模板的聚合酶鏈反應(yīng)，該模板比如是基因組DNA，或者最好是由假定合成BDNF的組織中得到mRNA制備的cDNA。可以通過(guò)電泳分析DNA反應(yīng)產(chǎn)物，以確定DNA反應(yīng)產(chǎn)物是否具有與所需的BDNF基因尺寸相近的分子大小，最好是通過(guò)核苷酸順序分析測(cè)定。不過(guò)，由于在PCR過(guò)程中使用了兩個(gè)簡(jiǎn)并引物，很可能增加了放大不是編碼BDNF的核酸序列，優(yōu)選的方法是只使用一種簡(jiǎn)并引物，即對(duì)應(yīng)于準(zhǔn)確BDNF序列的其他引物。為了識(shí)別準(zhǔn)確BDNF序列，可以用由純化BDNF蛋白質(zhì)確定的氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并型的有義和反有義兩種寡聚核苷酸引物。利用BDNF編碼核酸做為模板在PCR反應(yīng)中使用這些引物而產(chǎn)生的DNA反應(yīng)產(chǎn)物，應(yīng)當(dāng)是一種編碼了用于設(shè)計(jì)這兩個(gè)引物的氨基酸延伸的核酸片段，而且其大小是可以預(yù)測(cè)的(例如以最大計(jì)，是氨基酸殘基數(shù)目乘以堿基對(duì)的長(zhǎng)度3)。將DNA反應(yīng)產(chǎn)物的順序分析與已知的氨基酸順序進(jìn)行比較以確定所放大的核酸序列真正編碼了BDNF肽片段。盡管可以使用該技術(shù)中已知任何一個(gè)核酸定序方法，但是最好使用雙脫氧核苷酸鏈終止方法(Sangeretal.，1979.Prac.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72∶3918-3921)?？梢岳眉兓z或者最好是克隆的DNA反應(yīng)產(chǎn)物來(lái)完成定序，然后可以將DNA反應(yīng)產(chǎn)物的順序用于設(shè)計(jì)一種與準(zhǔn)確BDNF編碼序列對(duì)應(yīng)的寡聚核苷酸引物。這種引物可以和一個(gè)第二種引物，它可以是簡(jiǎn)并引物，一起使用以增加BDNF序列的數(shù)量，使之超過(guò)由開(kāi)始測(cè)定的準(zhǔn)確順序的片段所代表的量。例如，但不是限制有義鏈引物可以對(duì)應(yīng)于準(zhǔn)確“BDNF核苷酸”序列，而反有義引物可以是一種與可能存在于該編碼片段的下游如在cDNA中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA的多腺苷尾部的序列區(qū)域同源的簡(jiǎn)并引物。然后必須使用一種相似的方法來(lái)重新得到該被定序片段的上游順序，例如反有義鏈引物可以是與該定序片段上游的BDNF序列區(qū)，如利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶加在cDNA5′端的5′多腺苷尾部區(qū)域同源的簡(jiǎn)并引物。因此，整個(gè)BDNF基因或mRNA的順序可能是相似的?？梢允褂迷摷夹g(shù)中已知的任何方法克隆DNA反應(yīng)產(chǎn)物。該技術(shù)中已知的大量載體一宿主系統(tǒng)都可以使用?？梢允褂玫妮d體包括，但不局限于，粘性質(zhì)粒(Cosmids)，質(zhì)?；蛐揎棽《?，但是載體系統(tǒng)必須與所用宿主相容。這樣一些載體包括，但不局限于，噬菌體如入一衍生物，或質(zhì)粒如pBR322，pUC或Bluescript(注冊(cè)商標(biāo))(Stratagene)質(zhì)粒衍生物?？梢酝ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)染感染、電擊穿等方法將重組體分子插入到宿主細(xì)胞中。將BDNF基因插入到一個(gè)可以用來(lái)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、或感染合適的宿主細(xì)胞的克隆載體當(dāng)中，以產(chǎn)生許多這種基因序列的復(fù)制品。這可以通過(guò)將DNA片段連接到一個(gè)帶有互補(bǔ)粘性末端的克隆載體中完成。但是，如果在克隆載體中不存在用于構(gòu)造DNA片段的互補(bǔ)限制位點(diǎn)，就要通過(guò)酶學(xué)方法對(duì)DNA分子的末端進(jìn)行修飾，最好是將限制核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)插入到聚合酶鏈反應(yīng)中所用的寡聚核苷酸引物中，以促進(jìn)向載體內(nèi)的插入。或者也可以通過(guò)將核苷酸序列(接頭)連接到DNA末端上以產(chǎn)生任何所需位點(diǎn);這些被連接的接頭可以包括專門化學(xué)合成的編碼了限制核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的寡聚核苷酸。另一種方法是同聚體的形式修飾被切割的載體和BDNF基因。在一些特定的實(shí)施例中，對(duì)其有已經(jīng)摻入一種分離BDNF基因，cDNA或合成DNA序列的重組DNA分子的宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化能夠產(chǎn)生該基因的許多復(fù)制品。因此，可以通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從轉(zhuǎn)化體中分離重組DNA分子以及必需時(shí)從被分離的重組DNA中收回所插入基因的方法來(lái)大量地獲得這種基因。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，只要產(chǎn)生出一種由cDNA得到的編碼BDNF的克隆，就可以利用該技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法分離出要編碼BDNF的基因組克隆。例如可以從BDNF克隆中制備出一種標(biāo)記的核酸探針，并且用例如Benton和Davis(1977.Science196∶180)用于篩選噬菌體庫(kù)和Grunstein和Hogness(1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72∶3961-3965)用于篩選質(zhì)粒庫(kù)的方法通過(guò)核酸雜交法，用它來(lái)篩選基因組DNA庫(kù)。根據(jù)該技術(shù)中熟知的方法通過(guò)限制片段圖法和順序測(cè)定方法對(duì)重新得到的克隆進(jìn)行分析。再者，運(yùn)用根據(jù)本發(fā)明獲得的序列，可以從一個(gè)cDNA庫(kù)中識(shí)別出其他的cDNA克隆。5.5腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因的表達(dá)可以將用于編碼一種BDNF蛋白質(zhì)或其中一部分的核苷酸順序插入到一個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，也就是說(shuō)插入到一個(gè)含有轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯插入蛋白編碼序列所必需元件的載體中。必需的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯信號(hào)也可以由天然的BDNF基因和/或它的側(cè)區(qū)提供。也可以使用各種不同的宿主-載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)這樣蛋白編碼序列。這些系統(tǒng)包括但不局限于感染有病毒(如，牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)、病毒(如桿狀病毒等)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng);微生物如含有酵母載體的酵母菌，或用噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA或粘性質(zhì)粒(Cosmid)DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，這些載體表達(dá)元件的強(qiáng)度和特異性各不相同，根據(jù)所采用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用一些合適的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯元件中的任何一種?？梢赃\(yùn)用上述將DNA片段插入到載體中的任何一種方法來(lái)構(gòu)造含有一種由適當(dāng)轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯控制信號(hào)和蛋白編碼序列組成的嵌合基因的表達(dá)載體。這些方法可以包括體外重組DNA和合成技術(shù)以及體內(nèi)重組技術(shù)(遺傳重組)。可以通過(guò)一個(gè)第二核酸順序的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得BDNF蛋白質(zhì)或肽在一種用該重組DNA分子轉(zhuǎn)化了的宿主中進(jìn)行表達(dá)。例如可以通過(guò)任何該技術(shù)中已知的啟動(dòng)子/強(qiáng)化因子元件來(lái)控制BDNF的表達(dá)。用來(lái)控制BDNF表達(dá)的啟動(dòng)子包括，但不限于，SV40早期啟動(dòng)區(qū)(BernoistandChambon;1981，Nature290∶304-310)，存在于Rous肉瘤病毒的3長(zhǎng)末端重復(fù)處的啟動(dòng)子(Yamamoto.et.al.，1980，Cell，22∶787-797)，皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagneretal.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78∶144-1445)，金屬硫堇(metallothionine)基因的調(diào)節(jié)序列(Brinsteretal.，1982，Nature296∶39-42);原核表達(dá)載體如β-乳胺酶(lactamase)啟動(dòng)子Villa-Kamaroff，etal.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75∶3727-3731)，或tac啟動(dòng)子(DeBoeretal.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80∶21-25)，并見(jiàn)“Usefulproteinsfromrecombinantbacteria”-(來(lái)自重組細(xì)菌中的有用蛋白質(zhì)一文，ScientificAmerican，1980，242∶74-94，含有藍(lán)曙紅合成酶啟動(dòng)子區(qū)的植物表達(dá)載體(Herrera-Estrellaetal.，Nature303∶209-213)或在椰菜花斑病病毒35sRNA啟動(dòng)子(Gardneretal.，1981.Nucl.AcidsRes.9∶2871)和用于光合酶核酮體二磷酸鹽羧化酶的啟動(dòng)子(Herrera-Estrellaetal.，1984，Nature310115-120);由酵母菌或其他真菌中得到的啟動(dòng)子元件如Gal4啟動(dòng)子，ADC(乙醇脫氫酶)啟動(dòng)子，PGK(磷酸甘油激酶)啟動(dòng)子，堿性磷酸酶啟動(dòng)子，以及下列呈現(xiàn)組織特異性并已被用于突變(trans-genie)動(dòng)物中的動(dòng)物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，在胰腺泡細(xì)胞中具有活性的彈性蛋白酶Ⅰ基因控制區(qū)(swiftetal.，1984，Cell.38∶639-646;Ornitzetal.，1986，Cold.SpringHarborSymp.QuantBiol.，50∶399-409;MacDonald，1987，Hepatology7∶425-515)，在胰腺β細(xì)胞中具有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，1985，Nature315∶115-122)，在淋巴細(xì)胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl.etal.，1984，Cell38∶647-658∶Adamesetal.，1985，Nature318∶533-538;Alexanderetal.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶1436-1444)，在睪丸細(xì)胞乳腺細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞中具有活性的小鼠乳腫瘤病毒控制區(qū)(Lederetal.，1986，Cell.45∶485-495)，在肝臟中具有活性的白蛋白基因控制區(qū)(Pinkeretal.，1987.Genes，andDevel.1∶268-276)，在肝臟中具有活性的α-胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlaufetal.，1985，Mol.Cell.Biol.5∶1639-1648;Hammeretal.，1987.，Science235∶53-58);在肝臟內(nèi)具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelseyetal.，1987，GenesandDevel.1∶161-171)，在骨髓細(xì)胞中具有活性的β-珠蛋白基因控制區(qū)(Mogrametal.，1985，Nature315338-340;Kolliasetal.，1986，Cell.46∶89-94);在腦的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中具有活性的髓磷脂堿性蛋白質(zhì)基因控制區(qū)(Readhead.etal.，1987.Cell.48∶703-712);在骨骼肌中具有活性的肌漿球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(Sani，1985，Nature314∶283-286)，在下丘腦中具有活性的促性腺釋放激素基因控制區(qū)(Masonetal.，1986，Science234∶1372-1378)?？梢酝ㄟ^(guò)三種通用的方法來(lái)識(shí)別含有BDNF基因插段的表達(dá)載體(a)DNA-DNA雜交法，(b)有或沒(méi)有“標(biāo)記物”基因功能和(c)插入序列的表達(dá)。在第一種方法中，運(yùn)用由一個(gè)插入BDNF基因同源的序列組成的探針，通過(guò)DNA-DNA雜交可以檢測(cè)到某個(gè)表達(dá)載體中有插入外部基因的存在。在第二種方法中，根據(jù)某些由于在載體中插入外部基因而引起的“標(biāo)記物”基因的功能(例如，胸苷激酶活性，對(duì)抗菌素的抗性，轉(zhuǎn)化表現(xiàn)型，桿狀病毒中咬合體的形成等)的存在與否可以用來(lái)識(shí)別和選擇該重組體載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果將BDNF基因插入到載體的標(biāo)記物基因序列中，就可以通過(guò)該標(biāo)記物基因功能的消失來(lái)識(shí)別含有BDNF插入段的重組體，在第三種方法中，通過(guò)測(cè)定由重組體表達(dá)的外源基因產(chǎn)物可以識(shí)別重組體表達(dá)載體。例如，這種測(cè)定可以根據(jù)如前面5.2部分所說(shuō)的生物測(cè)定系統(tǒng)中BDNF基因產(chǎn)物的物理或功能特性而進(jìn)行。一旦識(shí)別和分離出一種特定的重組DNA分子，就可以運(yùn)用該技術(shù)中已知的幾種方法使其繁殖。只要建立一個(gè)合適的宿主系統(tǒng)和生長(zhǎng)條件，就可以大量地制備和繁殖重組表達(dá)載體。如前所述，表達(dá)載體包括，但不局限于下列載體或其衍生物人和動(dòng)物病毒如牛痘病毒或腺病毒;昆蟲病毒如桿狀病毒，酵母載體;噬菌體載體(例如，λ)，以及質(zhì)粒和粘性質(zhì)粒(Cosmid)，DNA載體，現(xiàn)只列出了少數(shù)名稱。另外，可以選擇一種可以調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)的或者以所需的特定方式修飾和處理該基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。由某種啟動(dòng)子開(kāi)始的表達(dá)在某種誘導(dǎo)物存在下可以得到提高;因此，對(duì)于一種遺傳工程制備的BDNF蛋白質(zhì)的表達(dá)是可以進(jìn)行控制的。而且，各種宿主細(xì)胞對(duì)于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯和轉(zhuǎn)譯后的加工和修改(例如，糖基化、切割)具有特征性和特異性的機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以保證對(duì)被表達(dá)的外部蛋白質(zhì)進(jìn)行所需要的修改和加工。例如可以運(yùn)用在細(xì)菌系統(tǒng)中的表達(dá)來(lái)產(chǎn)生一種非糖基化的核心蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在酵母中的表達(dá)將產(chǎn)生一種糖基化的產(chǎn)物。運(yùn)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)可以保證異種BDNF蛋白質(zhì)的“天然”糖基化。再者不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可以在不同程度上進(jìn)行處理加工反應(yīng)如水解切割。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，可以將編碼早期前BDNF的DNA克隆到pCMV質(zhì)粒中去，進(jìn)行放大，然后用來(lái)通過(guò)磷酸鈣方法(ChenandOkayama，1987.Mol.Cell.Biol.7∶2745-2752)轉(zhuǎn)染Cos細(xì)胞;再?gòu)募?xì)胞培養(yǎng)基中收集BDNF活性物(見(jiàn)下面的實(shí)施例部分10)5.5.1.被表達(dá)的基因產(chǎn)物的識(shí)別和純化一旦識(shí)別出一種表達(dá)BDNF基因的重組體，就應(yīng)對(duì)其基因產(chǎn)物進(jìn)行分析。這可以通過(guò)根據(jù)該產(chǎn)物的物理或功能特性的測(cè)定來(lái)完成。一旦識(shí)別出該BDNF蛋白質(zhì)，就可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法包括色譜法[例如離子交換色譜、親和色譜和大小篩選柱色譜法)，離心法、差異容解度或通過(guò)任何其他用于純化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法使其純化和分離?？梢赃\(yùn)用任何已知的BDNF測(cè)定方法，包括但不局限于，雞胚胎背側(cè)根神經(jīng)節(jié)法，產(chǎn)期大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞法或神經(jīng)基板產(chǎn)生的神經(jīng)元法來(lái)評(píng)價(jià)其功能性特性。重要的是由于用來(lái)從腦組織中制備BDNF的方法中包括有制備凝膠電泳過(guò)程，做為最后的步驟，因而所產(chǎn)生的BDNF由于存在殘余的SDS其活性是不完全的(BardeandThoenen;1985)見(jiàn)“激素和細(xì)胞調(diào)節(jié)(HormonesandCellRegulation)”Vol.9.Dumontetal.，eds.，ElsevierSciencePublishers，pp.385-390)。對(duì)照之下，本發(fā)明可以分離從重組核酸分子產(chǎn)生的并且不含有SDS的BDNF，因此具有完全的活性。舉例說(shuō)明，但不限于此，可以運(yùn)用本發(fā)明的抗-BDNF抗體(如下面11部分中所說(shuō)的作用于豬BDNF的B5-33氨基酸片段的抗體)通過(guò)免疫沉淀法或親和色譜來(lái)收集重組BDNF，從而制備不含去污劑的全活性的BDNF。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，可運(yùn)用如，蛋白內(nèi)切酶Arg-C將前期前BDNF通過(guò)酶學(xué)方法轉(zhuǎn)化成有活性的成熟BDNF(見(jiàn)下面的實(shí)施例部分17)。5.6腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因和蛋白質(zhì)利用前面所述以及下面實(shí)施例6和9中所述的方法，可以測(cè)定出下列這些核酸序列，并且可推斷出它們的相應(yīng)氨基酸順序。已經(jīng)測(cè)定出豬BDNF，cDNA序列，并在圖1中進(jìn)行了描述，已測(cè)定出人基因組cDNABDNF序列，在圖5中進(jìn)行了說(shuō)明，圖5還表示了從豬、大鼠和雞中制備的DNA序列。這些序列或它們的功能等同物中的每一種都可以用于本發(fā)明。另外，本發(fā)明涉及從豬、牛、貓、鳥、馬或犬、以及靈長(zhǎng)類動(dòng)物和任何有BDNF活性存在的其他種類動(dòng)物中分離的BDNF基因和蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及到含有至少10個(gè)核苷酸的BDNF核酸的亞序列單位，這種亞序列單位包含有BDNF序列的可雜交部分，這部分可用于如核酸雜交測(cè)定法，Southern和Northern印跡分析等。本發(fā)明根據(jù)圖1和5所給出的氨基酸序列，還提供了BDNF蛋白質(zhì)及其片段和衍生物，或者它們功能上的等同物，本發(fā)明還提供BDNF蛋白質(zhì)的含有抗原決定簇或具有功能活性的片段或衍生物。這里所說(shuō)的功能活性是指在對(duì)已知的BDNF功能的測(cè)定，如雞胚胎DRG測(cè)定中，具有肯定的活性。例如，可以通過(guò)提供功能上等同分子的取代，增加或去掉某些成份來(lái)改變圖1和5中所述的核酸順序。由于核苷酸編碼序列的簡(jiǎn)并性，在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可以采用其他的編碼了基本上相同于如圖1和5，所描述氨基酸序列的DNA順序。這些序列包括但不局限于含有如圖1和5所描述的被各種不同密碼子取代而改變了的全部或部分BDNF基因的核苷酸序列，這些由部分BDNF基因組成的核苷酸序列編碼了該序列內(nèi)的一種功能上等同的氨基酸殘基，從而產(chǎn)生一個(gè)小小的改變。同樣，本發(fā)明的BDNF蛋白質(zhì)或其片段或衍生物包括，但不限于那些含有基本上如圖1和5所描述的全部或部分氨基酸序列包括那些含有序列內(nèi)的殘基被功能上等同的氨基酸殘基取代后產(chǎn)生輕微改動(dòng)的變化序列做為基本氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其片段，衍生物，例如該序列中的一種或幾種氨基酸殘基可以被功能上等同的具有相似極性的另外一種氨基酸所取代，而引起一個(gè)輕微的變化。取代該序列中某個(gè)氨基酸的取代物可以從該氨基酸所屬類中的其他一些成員中選擇。例如非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本發(fā)明的范圍還包括那些在轉(zhuǎn)譯過(guò)程中或之后通過(guò)如糖基化、蛋白水解切割、連接到一個(gè)抗體分子或其他細(xì)胞配體上等而進(jìn)行不同修飾的BDNF蛋白質(zhì)或其片段或衍生物。另外，可以在體外或體內(nèi)使一種給定BDNF發(fā)生突變，以產(chǎn)生和/或破壞轉(zhuǎn)譯，起始，和/或終止序列，或引起編碼區(qū)的變化和/或形成新的限制核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)或破壞已存在的位點(diǎn)，以促進(jìn)行體外進(jìn)一步的修飾，可以使用該技術(shù)中已知的任何一種誘變技術(shù)，包括但不限于體外位點(diǎn)型誘變(Hutchinson，etal.，1978，J.Biol.Chem.253∶6551)，運(yùn)用TAB(注冊(cè)商標(biāo))接頭(Pharmacia公司)等5.7.產(chǎn)生抗腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的抗體根據(jù)本發(fā)明，可以使用BDNF蛋白質(zhì)或其片段或衍生物做為免疫原來(lái)產(chǎn)生抗-BDNF抗體。以前試圖產(chǎn)生一種抗-BDNF的免疫應(yīng)答一直未能成功，可能是因?yàn)榭傻玫降募兓疊DNF量很少，通過(guò)給出利用蛋白合成重組技術(shù)(根據(jù)本發(fā)明的BDNF核酸序列)來(lái)相對(duì)大量生產(chǎn)BDNF蛋白質(zhì)的方法，便解決了BDNF量不足的問(wèn)題。為了進(jìn)一步改進(jìn)產(chǎn)生一種抗-BDNF免疫應(yīng)的可能性，可以對(duì)BDNF的氨基酸序列進(jìn)行分析以識(shí)別與增強(qiáng)致免疫性有關(guān)的分子部分。例如可以根據(jù)Hopp和Woods的方法(1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78∶3824-3828)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，以識(shí)別表面抗原決定簇，這種方法已被成功地用于識(shí)別肝炎B表面抗原的抗原肽?；蛘?，可對(duì)來(lái)自不同種動(dòng)物的推斷的BDNF氨基酸序列進(jìn)行比較，識(shí)別其相對(duì)非一同源區(qū);這些非同源區(qū)極有可能在各種不同種類的動(dòng)物中是致免疫的。為了制備作用于BDNF的單克隆抗體，可以使用任何通過(guò)培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞系來(lái)生產(chǎn)抗體分子的方法。例如最初由Kohler和Milstein建立的雜交瘤方法(1975，Nature256495-497)，以及三組瘤(Trioma)方法，人B-細(xì)胞雜瘤方法(Kozboretal.，1983，Immunology，Today.4∶72)，和制備人單克隆抗體的EBV-雜交瘤方法(Cole.etal.，1985，見(jiàn)“單克隆抗體和腫瘤治療(Monoclonal.AutibodiesandCancerTherapy”，AlanR.Liss.Inc.pp.77-96)和類似方法都屬于本發(fā)明的范圍。有治療用途的單克隆抗體可以是人單克隆抗體?；蛉?小鼠(或其他種類)嵌合體單克隆抗體。可以通過(guò)該技術(shù)中已知的許多方法的任何一種來(lái)制備人單克隆抗體(例如Tengetal.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80∶7308-7312;Kozhoretal.，1983Immunology.Today4∶72-79;Olssonetal.，1982，Meth.Enzymol.92∶3-16)?？梢灾苽湟环N含有一個(gè)具有人恒定區(qū)的小鼠抗原結(jié)合區(qū)的嵌合體抗體分子(Morrisonetal.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81∶6851.Takedaetal.，1985，Nature314∶452)?？梢允褂迷摷夹g(shù)中已知的各種方法來(lái)生產(chǎn)BDNF抗原決定簇的多克隆抗體。為了生產(chǎn)抗體，可以通過(guò)注射BDNF蛋白，或其片段或衍生物來(lái)免疫各種宿主動(dòng)物，包括但不限于兔子、大鼠、小鼠等?？梢愿鶕?jù)宿主的種類使用各種佐劑來(lái)增加免疫學(xué)應(yīng)答，包括但不限于弗氏佐劑(Freund′s)(完全和不完全)，無(wú)機(jī)凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，復(fù)合多元醇(pluronicPolyols)，聚陰離子劑(Polyanions)肽，油乳劑鑰孔形血花青苷(Keyholelim-pethomocyanins)，二硝基苯酚，和可能有用的人佐劑如BCG(卡介菌)和細(xì)小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvam)?？梢酝ㄟ^(guò)已知方法來(lái)制備BDNF抗原決定簇的抗體分子克隆?？梢圆捎弥亟MDNA方法(見(jiàn)，如，Maniatisetal.，1982，mole-cularcloning，AlaboratoryManual，ColdSpringHarborLabo-ratory，coldSpringHarborNewYork)來(lái)構(gòu)造用于編碼單克隆抗體分子或其抗原結(jié)合區(qū)的核酸序列?？梢酝ㄟ^(guò)已知方法來(lái)純化抗體分子，例如，免疫吸收法或免疫親和色譜法，象HPLC(高效液相色譜)這樣的色譜方法，或者它們的結(jié)合使用等?？梢酝ㄟ^(guò)已知方法產(chǎn)生含有該分子的特異基因型的抗體片段。例如，這種片段包括但不限于可能通過(guò)對(duì)抗體分子進(jìn)行胃蛋白酶消化而產(chǎn)生的F(ab′)2片段;可以通過(guò)去掉F(ab′)2片段上的二硫化物橋而產(chǎn)生的F(ab′)片段，和通過(guò)用木瓜蛋白酶和一種還原劑處理該抗體分子而產(chǎn)生的2Fab或Fab片段。實(shí)施部分11對(duì)作用于BDNF蛋白質(zhì)B5-33肽段的多克隆抗血清的制備方法進(jìn)行了描述。5.8.BDNF/NGF基因族其它成員的識(shí)別對(duì)編碼BDNF的基因的序列分析以及對(duì)其氨基酸序列的推斷揭示了這種蛋白質(zhì)與NGF在結(jié)構(gòu)上有很多相似之處(圖2)。成熟BDNF的基本序列以及一般結(jié)構(gòu)和對(duì)前體蛋白的可能加工方式有力地說(shuō)明NGF和BDNF基因是從一個(gè)共同的原始基因演變而來(lái)，在成熟多肽的區(qū)域內(nèi)，如果為了更好地配對(duì)在NGF序列中只摻入三個(gè)間隙，就會(huì)有總共51個(gè)氨基酸與以往知道的來(lái)自許多種動(dòng)物的NGFS以及豬與人的BDNF相同。這些相同氨基酸包括6個(gè)半胱氨酸殘基，這說(shuō)明NGFs和BDNF在二級(jí)結(jié)構(gòu)上是非常相似的。再者，可以發(fā)現(xiàn)4個(gè)具有6個(gè)或更多氨基的組成的片段，在這些片段中，來(lái)源于上面列舉的所有種類動(dòng)物中的NGFs和豬BDNF或者相同，或者其差別不超過(guò)一個(gè)保守氨基酸置換。因此，有理由認(rèn)為NGF和BDNF似乎是同一基因族中密切相關(guān)的成員。通過(guò)利用一種以前未預(yù)料到的在NGF和BDNF之間存在強(qiáng)同源性的保留片段存在的方法，可以合理地尋找BDNF/NGF基因族中的其他成員，例如，可以通過(guò)從各種不同的核酸序列中選擇那些與BDNF和NGF同源的順序，并且，從這些選擇的序列中進(jìn)一步識(shí)別那些還含有與NGF和BDNF非同源核酸序列的順序，來(lái)識(shí)別BDNF基因族中的其他成員。該術(shù)語(yǔ)“非同源”可以解釋為指在會(huì)有至少大約6個(gè)鄰接的核苷酸的區(qū)域中，至少大約2個(gè)核苷酸與NGF和BDNF序列不同。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例提供下列方法，針對(duì)上面描述的并在下面表Ⅲ中列出的4個(gè)保留片段(“基因盒”)中每一個(gè)，合成一系列含有至少18個(gè)核甘酸的簡(jiǎn)并寡聚核苷酸探針代表了在6個(gè)鄰接密碼子上存在于NGF或BDNF中的氨基酸的所有可能的編碼序列。根據(jù)對(duì)成熟多肽的氨基末端進(jìn)行編號(hào)(使得前體BDNF的His134被當(dāng)作成熟蛋白質(zhì)中Hisl處理)，4個(gè)基因盒的特征如下(按照人成熟蛋白質(zhì)編號(hào);DNA順序如圖1所示。表ⅢDNA順序基因盒1NGFGly10-Ser19587-616BDNFGly8-Ser17基因盒2NGFLys50-Cys58713-739BDNFLys50-Cys58基因盒3NGFGly67-Asp72764-781BDNFGly67-Asp72基因盒4NGFTrp99-Cys110863-898BDNFTrp100-Cys111可以使用由表Ⅲ所列基因盒的序列對(duì)得到的合成寡聚核苷酸做為引物，通過(guò)從可能感興趣的來(lái)源(RNA或DNA)得到的PCR序列進(jìn)行放大。這可以包括從任何能夠表達(dá)一種與BDNF或NGF密切相關(guān)多肽的真核生物類中得到mRNA或cDNA或基因組DNA。通過(guò)進(jìn)行少至6個(gè)PCR反應(yīng)(即一種由基因盒1得到的引物與一個(gè)來(lái)自基因盒2的引物之間的反應(yīng);基因盒1與基因盒3的反應(yīng);基因盒1與基因盒4的反應(yīng);基因盒2與基因盒3的反應(yīng);基因盒2與基因盒4的反應(yīng)，基因盒3與基因盒4的反應(yīng))，能夠測(cè)定出一種在NGF和BDNF之間共有上述4個(gè)保留序列片段中任何兩個(gè)片段的基因或基因產(chǎn)物。如果你選擇對(duì)每一個(gè)基因盒合成幾個(gè)不同的簡(jiǎn)并引物，則還能夠運(yùn)用一個(gè)合理小數(shù)目的PCR反應(yīng)來(lái)進(jìn)行全面篩選。還能夠通過(guò)改變?cè)趩?dòng)PCR反應(yīng)中使用的雜交條件的嚴(yán)格性，來(lái)增加或減少未知基因與NGF或BDNF間核苷酸序列的相似程度。如果對(duì)以前未知的BDNF/NGF基因族成員的一個(gè)片段進(jìn)行成功地放大，則可以對(duì)這個(gè)片段進(jìn)行分子克隆和定序，并可以用來(lái)做為一種探針以分離完全的cDNA或基因組克隆，這又能測(cè)定該未知基因完全的核苷酸序列，分析它的表達(dá)，并且生產(chǎn)其蛋白產(chǎn)物以用于功能性分析。上述方法已被用來(lái)識(shí)別一種與BDNF和NGF都相關(guān)的新基因，并且在下面的實(shí)施例13中進(jìn)行了描述。另外，本發(fā)明還提供了利用BDNF/NGF序列的同源性來(lái)鑒別雖是BDNF/NGF基因族成員但在自然界中可能不存在的新的重組分子。舉例說(shuō)明但不限于此，可以根據(jù)本發(fā)明構(gòu)造一種既含有NGF基因部分又含有BDNF基因部分的重組分子。這種分子能夠表現(xiàn)出與BDNF和NGF二者相關(guān)連的特性并且?guī)?lái)一種新的生物活性，包括興奮劑與拮抗劑，還可以利用BDNF和NGF的基本序列運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬來(lái)預(yù)測(cè)出該分子的分級(jí)結(jié)構(gòu)(HoppandWoods，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78∶3824-3828);按照三級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能間的相關(guān)性可以設(shè)計(jì)出BDNF/NGF嵌合體重組基因。同樣，可以構(gòu)造出含有任何一種或幾種BDNF/NGF基因族成員一部分的嵌合體基因，包括第13部分所述的新成員。5.9.本發(fā)明的用途本發(fā)明涉及到BDNF的核酸序列和由它產(chǎn)生的基本純化的蛋白質(zhì)，肽片段或衍生物，可以首次大量地生產(chǎn)足夠用于診斷和治療的BDNF。同樣，做為本發(fā)明的一個(gè)結(jié)果，還首次獲得了抗-BDNF的抗體，和BDNF核酸探針，它們可以用于實(shí)際診斷和治療學(xué)中，雖然在本發(fā)明的一些特定實(shí)施例中可以用交叉種類的BDNF，在大多數(shù)場(chǎng)合下，用于診斷和治療目的時(shí)，最好使用來(lái)源于同種生物的BDNF基因或基因產(chǎn)物。5.9.1診斷應(yīng)用本發(fā)明涉及到編碼BDNF的核酸，和由其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，肽段或衍生物，以及作用于BDNF蛋白質(zhì)，肽或衍生物的抗體，因而可以用來(lái)診斷可能與BDNF表達(dá)型或改變有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病和失調(diào)。在本發(fā)明的各種具體實(shí)施方案中，可以將BDNF基因及相關(guān)的核酸序列和亞序列，包括互補(bǔ)序列，用于診斷雜交檢測(cè)法中?？梢詫DNF核酸序列或它的含有大約15個(gè)核苷酸的亞序列用來(lái)作為雜交探針。運(yùn)用雜交測(cè)定法可以檢查預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)控與BDNF表達(dá)的改變有關(guān)的病因、失調(diào)、或疾病狀態(tài)，尤其是引起感覺(jué)神經(jīng)元損傷和視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性的病因。這種疾病和病因包括但不限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷、梗死、感染、退化性神經(jīng)疾病，惡性腫瘤、或手術(shù)后改變包括但不限于早老性癡呆(Alzheimer′sDisease)，帕金森氏病(Parkinson′sDisease)亨廷頓舞蹈病(HuntingtonsChorea)和視網(wǎng)膜退化性疾病。例如，可以對(duì)病人組織樣本的總RNA進(jìn)行檢查以確定BDNFmRNA的存在，其中BDNFmRNA數(shù)量的減少則表示有神經(jīng)元的變性。在成神經(jīng)細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞中已經(jīng)識(shí)別出相對(duì)高含量的BDNFmRNA(詳見(jiàn)下面的第14部分);因此，在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，利用BDNF核酸探針檢測(cè)到mRNA的增加可以用來(lái)診斷成神經(jīng)細(xì)胞瘤腫瘤。大多數(shù)組織合成的BDNF含量水平非常低。使得BDNFmRNA成為一種特別有用的腫瘤標(biāo)記。在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，可以運(yùn)用針對(duì)BDNF蛋白質(zhì)、肽段，或衍生物的抗體來(lái)診斷神經(jīng)系統(tǒng)的疾病和失調(diào)，尤其是包括感覺(jué)失調(diào)和視網(wǎng)膜退化的疾病。以及前面所列舉的那些疾病和功能失調(diào)。例如可以將本發(fā)明的抗體用于利用需要進(jìn)行這種檢查的病人的組織樣本的原位雜交方法中，在另一個(gè)實(shí)施例中，可以將本發(fā)明抗體運(yùn)用于western印跡反應(yīng)分析中以檢測(cè)和/或測(cè)定組織或體液樣本中BDNF的存在。對(duì)在ELISA和Western印跡反應(yīng)中與BDNF結(jié)合的本發(fā)明抗體的描述見(jiàn)下面的第11部分。在本發(fā)明的另一些實(shí)驗(yàn)例中，可以運(yùn)用BDNF蛋白質(zhì)、肽片段或衍生物來(lái)診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾病和失調(diào)，在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，但不限于此，可以利用標(biāo)記的BDNF蛋白質(zhì)或肽片段來(lái)識(shí)別表達(dá)BDNF受體的組織或細(xì)胞，以便識(shí)別BDNF受體表達(dá)的異常，因而識(shí)別出可能存在的對(duì)BDNF的組織或細(xì)胞應(yīng)答的異常。5.9.2.治療應(yīng)用本發(fā)明涉及編碼了BDNF的核酸，以及由其產(chǎn)生的蛋白、肽片段或衍生物，并涉及針對(duì)BDNF蛋白、肽或衍生物的抗體，它可以用于治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病和機(jī)能失調(diào)，這些疾病與機(jī)能失調(diào)是與BDNF表達(dá)方式的改變有關(guān)或者可以因與BDNF或抗BDNF抗體接觸而受益。在本發(fā)明的各種不同具體實(shí)例中，BDNF蛋白、肽片段或衍生物可以對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)因外傷、外科手術(shù)、局部缺血、感染、新陳代謝疾病、營(yíng)養(yǎng)性缺乏、惡性生長(zhǎng)或有毒制劑而受損的患者給藥，本發(fā)明特別可通過(guò)施用有效治療量的BDNF蛋白或肽片段或衍生物來(lái)治療那些感覺(jué)神經(jīng)元或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生損傷的情況。在本發(fā)明各個(gè)具體實(shí)施方案中，BDNF可以對(duì)已經(jīng)切開(kāi)的感覺(jué)神經(jīng)元局部給藥、包括但不限于在背側(cè)根神經(jīng)節(jié)的或在以下任何組織中的神經(jīng)元膝、巖部和有節(jié)神經(jīng)節(jié);第八顱神經(jīng)的前庭聽(tīng)覺(jué)集合體;三叉神經(jīng)中心的與下頜有關(guān)的上頜葉的腹外側(cè)極點(diǎn);以及中腦三叉神經(jīng)核，可以通過(guò)吸附到一個(gè)能植入到要給藥神經(jīng)附近的膜上，例如硅橡膠膜上，而將BDNF相關(guān)肽或BDNF蛋白給患者施用，本發(fā)明也可用于例如促進(jìn)糖尿病引起神經(jīng)病患者的恢復(fù)，如復(fù)合性單神經(jīng)病。在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，BDNF蛋白或其肽片段或衍生物，能用于治療先天性的或神經(jīng)變性的機(jī)能失調(diào)，包括但不限于早老性癡呆帕金森疾病，Parkinson-Plus綜合癥(其中帕金森癥狀是由多巴胺能神經(jīng)元變性引起的)，例如進(jìn)行性核上麻庳(Steele-Richardson-Olszewski綜合癥)，橄欖體腦橋小腦萎縮(OPCA)，shy-Drager綜合癥(多系統(tǒng)萎縮)以及Guamanianparkinsonism癡呆綜合癥以及亨廷頓舞蹈病，特別是，本發(fā)明可用于治療先天性或與感覺(jué)神經(jīng)機(jī)能障礙及視網(wǎng)膜變性疾病有交的神經(jīng)變性產(chǎn)生的機(jī)能失調(diào)癥，例如，本發(fā)明的BDNF蛋白或肽片段或衍生物可用于治療有視網(wǎng)膜退化的遺傳性痙攣下身麻庳(Kjellin和Barnard-Scholz綜合癥)，視網(wǎng)膜炎色素病，Star-gardt病癥，Usher綜合癥(并有先天性耳聾的視網(wǎng)膜炎色素病)，Refsum綜合癥(視網(wǎng)膜炎色素病、遺傳性耳聾以及多神經(jīng)病)，提及的僅僅是少數(shù)。以視網(wǎng)膜變性或其它感覺(jué)功能障礙相結(jié)合為特征的各種綜合癥的主要病因很可能是在于BDNF合成或反應(yīng)能力的缺陷。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，在治療早老性癡呆癥和/或帕金森癥中，施用BDNF蛋白或肽片段或由其衍生的衍生物可以與外科的組織植入相結(jié)合使用。正如下面12和18節(jié)所討論的BDNF可以用于以劑量有關(guān)的方式(圖34)促進(jìn)多巴胺能黑質(zhì)神經(jīng)元的存活，支持了用BDNF來(lái)治療CNS多巴胺能神經(jīng)元的機(jī)能失調(diào)，包括，但不限于帕金森病(特別是按照下面21節(jié)給出的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)表明，BDNF可用于阻止由MPP引起的神經(jīng)性中毒，MPP是與誘發(fā)帕金森狀綜合癥有相關(guān)的)。此外，已觀察到BDNF可維持CNS膽堿能神經(jīng)元的存活(下面，12和16節(jié))，特別是維持底前腦膽堿能神經(jīng)元的存活，這表明了BDNF可用于治療涉及膽堿能神經(jīng)元的機(jī)能失調(diào)癥，包括，但不限于，早老性癡呆癥。已經(jīng)表明，約35%的患有帕金森癥的病人遭受早老性癡呆癥型的癡呆;可以證明按本發(fā)明所產(chǎn)生的BDNF是治療這種綜合癥有用的單一制劑。同樣，按本發(fā)明所產(chǎn)生的BDNF從治療角度來(lái)看可以用于治療結(jié)合有唐氏(Down)綜合癥的早老性癡呆癥。按本發(fā)明產(chǎn)生的BDNF可用于治療各種癡呆癥以及先天性學(xué)習(xí)機(jī)能失調(diào)，還發(fā)現(xiàn)，BDNF似乎具有抑制星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生，支持了利用BDNF在CNS中縮小疤痕形成(例如，在外科，外傷或梗死之后)以及在治療星形神經(jīng)膠質(zhì)導(dǎo)致的CNS腫瘤中使用BDNF，在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，BDNF可用于向上調(diào)節(jié)NGF受體的表達(dá)，從而可以對(duì)需要這種治療的患者在NGF之前或NGF同時(shí)施用BDNF是有利的。如下面15節(jié)中的例舉說(shuō)明的那樣，施用紅藻氨酸會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)元、包括海馬神經(jīng)元以及皮層神經(jīng)元中BDNF表達(dá)的增加(以及較少程度的NGF的表達(dá))。已觀察到(下面15節(jié))抑制非-NMDA受體阻斷了這種的紅藻氨酸為中介的BDNF表達(dá)的增加。因此，可以在體內(nèi)或體外通過(guò)施用紅藻氨酸或相關(guān)化合物或氨基甲酰膽堿、組胺或緩激肽、或它們的發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)或體外具有同樣效果的有關(guān)化合物或者通過(guò)非-NMDA谷氨酸受體的興奮劑或者能增加或模擬己酰膽堿、組胺或緩激肽作用的其它藥物來(lái)誘導(dǎo)本發(fā)明BDNF和BDNF相關(guān)肽的表達(dá)。NGF表達(dá)的誘導(dǎo)也可以通過(guò)施用紅藻氨酸或相關(guān)分子或非NMDA受體的興奮劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的另一方案中，BDNF蛋白、肽片段或衍生物可與其它胞質(zhì)結(jié)合使用以達(dá)到所需的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性效果。例如，但不限于此，按照本發(fā)明，BDNF可以與NGF或與骨骼肌肉提取物一起使用以在感覺(jué)神經(jīng)元的生長(zhǎng)中起到協(xié)同促進(jìn)作用，其中協(xié)調(diào)性解釋為BDNF蛋白、肽片段或衍生物與一個(gè)第二種藥劑相結(jié)合的效果要大于單獨(dú)使用任何一種同樣量的物質(zhì)的效果。預(yù)見(jiàn)得到，BDNF會(huì)與其它有待詳細(xì)描述的CNS衍生的肽因子一起在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大量神經(jīng)元亞群的生長(zhǎng)、發(fā)展和存活中起協(xié)同作用。還預(yù)見(jiàn)到，基于BDNF分子的所有特征，可能發(fā)展出新的肽片段，衍生物或BDNF突變體，它們能起B(yǎng)DNF的某些或全部生物功能的拮抗物的作用，這種BDNF拮抗物在選抗性消除感覺(jué)神經(jīng)元，例如，在治療慢性疼痛綜合癥中是有用的。在本發(fā)明的另一些方案中，針對(duì)BDNF蛋白或其肽片段或衍生物的抗體可以對(duì)患有各種神經(jīng)機(jī)能失調(diào)和疾病并需要這種治療的患者服用。例如患有BDNF產(chǎn)生過(guò)多的患者會(huì)需要這種治療?？?BDNF抗體可用于阻止感覺(jué)神經(jīng)元的異常再生，(例如，手術(shù)后)，或者如上面所討論的用于慢性疼痛綜合癥的治療中。依靠在成神經(jīng)細(xì)胞瘤組織中發(fā)現(xiàn)的BDNFmRNA的高含量，BDNF有可能起成神經(jīng)細(xì)胞瘤的一種autocrine鐘瘤生長(zhǎng)因子的作用;因此，在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，施用抗-BDNF抗體進(jìn)行治療以達(dá)到腫瘤的消退。5.10.藥物組合物本發(fā)明的活性組合物，可以包含BDNF基因產(chǎn)物的全部或部分BDNF基因產(chǎn)品、包括蛋白、由其產(chǎn)生的肽片段或衍生物，或包含針對(duì)BDNF蛋白、肽片段或衍生物的抗體(或抗體片段)，或者包含BDNF和一種第二藥劑，如NGF或骨骼肌肉提取物的結(jié)合物，它可以在任何無(wú)菌的生物相容的藥物載體、包括但不限于鹽水，緩沖鹽水、葡萄糖和水中進(jìn)行給藥。BDNF蛋白、肽片段或衍生物可以包括基本上如圖1或圖5中所描述的氨基酸序列或其亞序列;最好用特別是包括如圖1所示的全部或由從大約氨基酸134到約氨基酸252部分組成的氨基酸序列或功能上相當(dāng)?shù)男蛄械腂DNF蛋白，因?yàn)?，這種亞序列被認(rèn)為包含了BDNF分子的功能部分。BDNF可以由任何合適的動(dòng)物種類的相應(yīng)于BDNF基因的序列得到，包括，但不限于，人、豬、鼠、雞、牛、狗、綿羊、山羊、貓、兔等等。在治療一種具體的功能失調(diào)或疾病中，有效的BDNF蛋白、肽片段、衍生物或抗體用量決定于該功能失調(diào)或病癥的性質(zhì)，并能夠通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)來(lái)測(cè)定。如有可能，首先在體外，例如在前面描述過(guò)的BDNF生物測(cè)試系統(tǒng)中，然后在人體試驗(yàn)以前在有用的動(dòng)物模型系統(tǒng)中確定本發(fā)明藥物組合物的劑量-響應(yīng)曲線是可取的。本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方案中，基于體外的數(shù)據(jù)，在促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)元存活中有效的一個(gè)藥物組合物應(yīng)提供一個(gè)5-25ng/ml之間、最好在10-20ng/mlBDNF之間的局部BDNF蛋白濃度。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，在促進(jìn)多巴胺能或膽堿能神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活中有效的一個(gè)藥物組合物可以提供一個(gè)約在10ng/ml和100ng/ml之間的局部BDNF蛋白濃度。引入的方法包括但不限于皮內(nèi)的、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下的、口服以及鼻內(nèi)的方式。此外，將本發(fā)明的藥物組合物通過(guò)適當(dāng)途徑、包括腦室內(nèi)和鞘內(nèi)注射而引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)是可取的;腦室內(nèi)注射可以通過(guò)一種腦室內(nèi)導(dǎo)管例如接到儲(chǔ)液器、如一種Ommaya儲(chǔ)液器的導(dǎo)管而易于實(shí)施。另外，將本發(fā)明的藥物組合物局部給藥到需要治療的區(qū)域也是可取的;也可以通過(guò)例如，但不限于，在外科手術(shù)期間通過(guò)注射、藉助于導(dǎo)管或藉助于植入物而局部注入，所述植入物是多孔的、非多孔的或膠質(zhì)的材料，包括膜，如硅橡膠膜，或纖維。本發(fā)明也提供通過(guò)脂質(zhì)體，微?；蛭⒛z囊，而給藥的含有BDNF蛋白、肽片段或衍生物的藥物組合物。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，使用這種組合物以達(dá)到BDNF和BDNF相關(guān)產(chǎn)品的持續(xù)釋放是有用的。預(yù)計(jì)也有可能把主動(dòng)產(chǎn)生BDNF、BDNF相關(guān)物質(zhì)、BDNF對(duì)抗物、或抗BDNF抗體的細(xì)胞導(dǎo)入到需要增加或減少BDNF濃度的區(qū)域中。6.從豬腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子cDNA的分子克隆以及特征。在組織中極稀少量的BDNF蛋白排除了使用標(biāo)準(zhǔn)方法克隆BDNF基因。取而代之的是利用DNA放大工藝將有限量的蛋白序列數(shù)據(jù)擴(kuò)大，其法如下(ⅰ)由公斤量的豬腦中純化微克量的BDNF(ⅱ)通過(guò)蛋白質(zhì)微量定序技術(shù)分析純化的BDNF并確定了一條36氨基酸殘基組成的氨基酸序列。(ⅲ)基于在(ⅱ)中確定的氨基酸序列，合成一些寡核苷酸并在利用豬上丘cDNA作為模板的聚合酶的鏈反應(yīng)作為引物使用來(lái)放大編碼了規(guī)定氨基酸片段的DNA。(ⅳ)對(duì)(ⅲ)的DNA反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定序，并且(ⅴ)合成相應(yīng)的寡核苷酸引物，并用于用豬上丘CDN的聚合酶鏈反應(yīng)，以產(chǎn)生代表編碼了原始的36氨基的片段序列的BDNFmRNA上游以及下游DNA的重疊片段，這樣，豬BDNF完全的編碼區(qū)已分子克隆在兩個(gè)重疊片段中。這些步驟每一個(gè)的詳細(xì)細(xì)節(jié)，以及BDNF基因的進(jìn)一步表征列于下面6.1.材料和方法6.1.1豬腦BDNF的純化通過(guò)基本上與Hofer和Barde(1988，Nature.331.261-262)所提出的一樣的方法來(lái)完成豬腦BDNF的提純。使用Ultra-Turrax均化器，在pH6.0，含有1mMEDTA的0.2M磷酸緩沖液中，新鮮加入甲苯磺酰氟(1mM)，按1Kg豬腦2升緩沖液的比例，均化6Kg豬腦，用1NHCl將上清液pH調(diào)到pH4.0，并在4℃攪拌2小時(shí)，在20，000xg下離心25分鐘后，合并相當(dāng)于3Kg腦的上清液(用1NNaOH調(diào)到pH6.0)，與1升已用pH6.0的0.1M磷酸鈉平衡過(guò)的預(yù)膨脹的羧基-甲基-纖維素?cái)嚢?小時(shí)。用總體積為20升的pH6.0的0.1M磷酸鈉沖洗二次后，將漿料倒進(jìn)柱內(nèi)，并且含有0.13MNaCl的同樣緩沖液洗滌過(guò)夜。用含有0.5MNaCl的磷酸鹽緩沖液洗脫活性組分，然后對(duì)2×5升的pH6.8的5mM磷酸鉀溶液進(jìn)行透析。將由處理2×3Kg原料所得到的透析組分加到一個(gè)130ml床體積的羥基磷灰石柱上，該柱預(yù)先已用pH6.8、5mM磷酸鉀的溶液平衡過(guò)。然后用由500ml、5mM和500ml、700mM磷酸鉀(兩者pH都是6.8)所組成的線性梯度液提洗柱子，在約500mM磷酸鉀附近洗脫BDNF活性物(參閱Barde等人，1982，EMBOJ.1549-553)。通過(guò)加入1.0M磷酸鉀，將收集的活性組分調(diào)節(jié)到700mM的最終磷酸鉀濃度，并加到用pH6.8的700mM磷酸鉀平衡過(guò)的5ml苯基-瓊脂糖柱上。用40ml同樣的緩沖液洗滌后，用0.1M磷酸鉀、pH6.8的溶液洗脫BDNF活性物，并對(duì)蒸餾水透析和凍干。在加到含有線性(不是指數(shù)性)梯度10-25%丙烯酰胺的SDS-凝膠上以前，將凍干物料溶解于含有0.1%SDS而沒(méi)有硫基乙醇的SDS-凝膠電泳試樣的緩沖液中，按Barde等人(1982，EMBOJ.1∶548-553)所述那樣進(jìn)行。在電泳分離完成后，將凝膠用考馬斯蘭短暫地染色(10分鐘)，脫色20分鐘，切下遷移到細(xì)胞色素C水平上的帶段，并從凝膠中電泳洗脫。按Barde等人(1982，EMBO，J.1549-553)所述，去除SDS。通向BDNF微定序分析的最后純化步驟有所改變(按照Hofer和Barde1988，Nature331∶261-262)，不使用凝膠電泳作為純化的最后步驟。6.1.2蛋白定序分析對(duì)BDNF或者直接進(jìn)行序列分析(用氨基酸分析測(cè)定為55微微摩爾，最初得到的40微微摩用于氨基末端的組氨酸)或如下被切開(kāi)按下面方法切開(kāi)5-10μgBDNF(由5個(gè)不同制劑得到)V8將1μgS.aureusV8(Miles)加到pH8.0，含有10%乙腈的0.2M碳酸銨中的5μgBDNF(總體積50μl)中并在室溫下保溫過(guò)夜。胰蛋白酶將1μgTPCK處理過(guò)的胰蛋白酶(牛胰，Sigma型ⅩⅢ)加到在含有10mMCaCl2的Tris-HCl(0.1M，pH8.0)的8μgBDNF中(總體積40μl)并在37℃保溫過(guò)夜。溴化氰(CNBr)用10%(W/V)CNBr的70%(VV)甲酸(最終濃度)，將10μgBDNF在室溫下保溫3小時(shí)(總體積60μl)。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，加入500μl水后，將樣品在高速真空器中濃縮到50μl。和5μlβ-巰基乙醇一起加入50μlTris-HCl(1.0M，pH8.0)，并在37℃將樣品保溫過(guò)夜。在加入5μl碘代甲烷后，在高速真空器上蒸發(fā)樣品至干。在CNBr分裂后發(fā)現(xiàn)必需對(duì)BDNF還原和烷基化通過(guò)HPLC和Swank-MunkresSDS-凝膠電泳(Swank和Munkres，1971，Anal.Bio-chem.39∶462-477)發(fā)現(xiàn)，不還原就得不到片段。這表明在BDNF中有二硫化橋鍵存在，并且被安排得使切開(kāi)不會(huì)引起游離的肽。全部分裂后，干樣品再懸浮在0.1%三氟乙酸(TFA)中并加到一個(gè)反相C8微孔(microbore)HPLC柱上，(Applied.Biosystems公司提供)，用60分鐘的0-60%在0.1%TFA中的乙腈梯度，按0.1ml/分速度洗脫肽。用一Waters441紫外檢測(cè)器在214nm上檢測(cè)。按照Hewick(1981，J.Biol.Chem.256∶7990-7997)和Hunkapillar(1983，MethodsEnzymol.91∶227-236)，通過(guò)在氣相微定序儀(470型，AppliedBiosystems)上通過(guò)自動(dòng)Edman降解這些肽來(lái)定序。PTH氨基酸的檢測(cè)是按照Lottspeich(1985.J.Chroma-togr.326∶321-327)的描述進(jìn)行的。6.1.3.DNA模板的制備按照Herrmann和Frischauf(1987，MethodsEnzymol.152∶180-183)的方法分離豬的基因組DNA。由6g豬腦上丘樣品制得總RNA以制備cDNA，在當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)獲得組織樣品，進(jìn)行分離并在液氮中冷凍。使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Okayama等人，1987，MethodsEnzymol154∶3-28)以提取RNA。使用了以A，C或G作為端3′核苷酸(Oligo3，用于匹配一個(gè)3′聚一A延伸段并含有BamHI、EcoRiI和PstI識(shí)別位點(diǎn))的CGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTT引物混合物，用Moloney鼠白血病病毒的反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄80μg總的RNA(BRL，按照制造商的說(shuō)明，除了加入1μlRNasin并刪除放線菌素D.有所不同)。6.1.4.聚合酶鏈反應(yīng)按照Saiki等人(1985，Science230∶1350-1354)所描述的方法進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。6.2.結(jié)果和討論6.2.1.蛋白微定序分析結(jié)果蛋白微定序分析結(jié)果列于表Ⅳ表Ⅳ實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的BDNF肽序列N-端HSDPARRGELSVV8XVTAADKKTAVDV8KVPVSKGQLKQYFYECNBrXGGTVTVLEKVP(V)(S)CNBrGYTKEGXRGIXRGI胰蛋白酶(T)AVDMSGGTVTVLEK胰蛋白酶ALTMDSK.合并序列VTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYE，下面劃線的氨基酸代表了由在PCR中使用的寡核苷酸引物編碼的序列;參閱6.1.2節(jié)。這些氨基酸序列的四個(gè)鄰接段是用Edman降解法測(cè)定的，而這4個(gè)鄰接段又可用于推斷代表約三分之一完整氨基酸序列的36個(gè)氨基酸序列。6.2.2.寡核苷酸的合成以及用PCR來(lái)獲得編碼一個(gè)氨基酸片段的DNA?；诜謩e鄰近上面6.2.1節(jié)所描述的具有36個(gè)氨基酸殘基片段的氨基端和羧基端末端的6個(gè)氨基酸段的編碼序列，化學(xué)合成二個(gè)完全簡(jiǎn)并的聚17寡核苷酸引物。特別是，化學(xué)合成二個(gè)獨(dú)立的基于序列AADKKT(有義)和KQYFYE(反有義)(在表Ⅲ中，下面劃線的)的聚17寡核苷酸[相應(yīng)于全部可能的密碼子并被稱為oligol(寡1)和oligo2(寡2)]混合物，并將150微微摩的每種引物加到1μg豬基因組DNA模板中。按照制造商(GeneAmp(商標(biāo))Perkin-ElmerCetus)的說(shuō)明，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行35次放大循環(huán)。在94℃變性1分鐘，引物在45℃退火2分鐘，并在72℃將引物延伸2分鐘。從3%瓊脂糖凝膠(用溴化乙錠染色)中切割出該預(yù)定大小(101bp)的DNA帶，并按Innis等人(1988，Proc.Natl.Acad.Sic.U.S.A85∶9436-9440)，所描述的那樣進(jìn)行不對(duì)稱放大，使不論是Oligol或Oligo2都超過(guò)100倍。6.2.3.cDNA片段的核苷酸序列通過(guò)雙脫氧核苷酸鏈終止方法(Sanger等人，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72∶3918-3921)使用32P末端-標(biāo)記的寡核苷酸1和2作為引物對(duì)所得的有義和反有義DNA片段進(jìn)行定序分析。所觀察到的核苷酸序列僅含有一個(gè)末被鏈終止密碼子中斷的開(kāi)放式閱讀框架，對(duì)這開(kāi)放式閱讀框架所推斷的氨基酸序列與對(duì)豬BDNF的這一區(qū)域所測(cè)定的實(shí)際氨基酸序列是完全一致的。6.2.4.完整豬BDNFcDNA的克隆豬BDNF的完整編碼區(qū)被分子克隆在二個(gè)重疊片段中。為了制取BDNFcDNA的3′部分(相對(duì)于有義鏈)合成一種含有準(zhǔn)確的有義鏈BDNF序列的自上述區(qū)域內(nèi)的21個(gè)堿基的聚30寡核苷酸引物，用作為“有義引物”這引物的核苷酸序列是Oligo4(寡4)即(5′)AAACTAGTCGACGGCAGTGGACATGTCGGG(3′)(下面劃線的表示對(duì)應(yīng)于BDNF從圖1中643位置到663位置的有義鏈，編碼了氨基酸序列Thr-Ala-Val-Asp-Met-Ser-Gly(Gly密碼子的最初二個(gè)堿基)。還包括了在這一引物5′端的另外9個(gè)核苷酸以提供方便的SpeI和SalI限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)供分子克隆用，一個(gè)三褶的變性聚31寡核苷酸引物被設(shè)計(jì)成與前面是cCNA有義鏈的任何一個(gè)核苷酸(T，G或C)的聚A延伸段是互補(bǔ)的，并含有限制性核酸內(nèi)切酶BamHI、EcoRI和PstI的識(shí)別位點(diǎn)。這種“反有義”引物(寡3)的序列是(5′)cGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTTX(3′)，其中X＝A，C或G。該合成的寡核苷酸引物是用于通過(guò)PCR而放大由上述豬上丘cDNA制劑的序列。具體地說(shuō)，3′放大的DNA是通過(guò)在PCR反應(yīng)中使用10μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，150微微摩的有義引物(Oligo4)和150微微摩Oligo3(寡3)作為反有義引物而制得的。對(duì)放大的DNA產(chǎn)品進(jìn)行Southern印跡分析，切割給出具有32P-末端標(biāo)記的寡核苷酸AAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACGG(寡5，在下面描述的5′反應(yīng)中作為反有義引物，并含有BamHI和PstI的識(shí)別序列)，雜交倍號(hào)的帶段，用玻璃乳(glassmilk)方法[基因Clean(商標(biāo)，用EcoRI和SalI消化，克隆入BluescriptSK+質(zhì)粒(strata-gene)]提取，并進(jìn)行序列分析。為了獲得BDNF編碼序列的其余部分(上游或5′部分)，按上所述制備cDNA，并利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶將多-A尾端加到5′端上。每個(gè)含有12個(gè)接續(xù)的T殘基延伸段的三個(gè)31-聚寡核苷酸的同樣混合物被用于給出與這些添加的多-A尾端互補(bǔ)的引物。合成一種獨(dú)特的、含有與BDNF編碼序列的互補(bǔ)鏈相對(duì)應(yīng)的17個(gè)堿基的并具有限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和PstI識(shí)別位點(diǎn)的30-聚寡核苷酸引物。這種引物的序列是(5′)AAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACGG(3′)(上面的寡5，下面劃線的表示與BDNF編碼序列從圖1位置709到693的有義鏈互補(bǔ)的區(qū)域);這相當(dāng)于編碼了氨基酸序列Pro(密碼子的最后一個(gè)堿基)-Val-Ser-Lys-Gly-Glu的一段。將該引物加到多-A為尾端的cDNA上，并如上一樣，通過(guò)PCR進(jìn)行放大。用PstI切割反應(yīng)產(chǎn)物并克隆進(jìn)Bluesoript載體中，用雙脫氧核苷酸鏈終止方法測(cè)定核苷酸序列。6.2.5.豬BDNFcDNA的核苷酸序列由重疊的豬BDNFcDNA克隆所測(cè)定的組合核苷酸序列與所推斷的氨基酸序列一起示于圖1。該序列包括一個(gè)252氨基酸多肽的開(kāi)放式閱讀框架。根據(jù)在同一閱讀框架中開(kāi)始36堿基對(duì)的上游，有二個(gè)相鄰的鏈終止密碼子(TAG-TGA)，識(shí)別出起始因子，Met密碼子(ATG)。通過(guò)對(duì)純化蛋白直接序列分析而測(cè)得的豬BDNF的氨基終端相當(dāng)于這種多肽的殘基His134。因此，該定序分析的數(shù)據(jù)表明，成熟的BDNF是由前體多肽通過(guò)加工而產(chǎn)生的。殘基His134是緊跟序列Arg-Val-Arg-Arg。這樣一些由一個(gè)堿性氨基酸殘基接著-中性殘基然后二個(gè)更加堿性的殘基組成的序列被表明是前體多肽蛋白水解加工的靶位點(diǎn)。成熟的BDNF被推斷的氨基酸序列預(yù)示出了一種帶堿性電荷(pI＝9.99)的具有119個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(分子量為13511道爾頓)，其性質(zhì)與上面通過(guò)二維凝膠電泳分離后進(jìn)行生物活性因子測(cè)定所表征的BDNF相一致。通過(guò)蛋白微定列分析所測(cè)定的部分BDNF的氨基酸序列(總數(shù)為64個(gè)氨基酸殘基)與由cDNA克隆的核苷酸序列所推斷的氨基酸序列(在圖1中下面劃線的)完全相同。前體多肽的序列與至少按二步處理是相一致的首先，一個(gè)大概18個(gè)殘基的信號(hào)肽可以從氨基末端切割，接著在Arg133和His134之間分裂以放出成熟的多肽。如果這模式是正確的，則前體可以規(guī)定為preproBDNF。7.實(shí)施例BDNF基因是不同于在各種脊椎動(dòng)物種類中的NGF基因7.1材料和方法7.1.1.NGF和BDNFDNA探針的制備一種含有編碼了成人NGF的合成基因的質(zhì)粒，含有正常人NGF，其編碼序列具有少量保守的密碼子取代物以引入合宜的限制性核酸內(nèi)切酶分裂位點(diǎn)，這種質(zhì)粒是由英國(guó)Biotechnologies股份有限公司購(gòu)得。合成一對(duì)18-聚寡核苷酸引物使得可以通過(guò)PCR而放大這種基因的一個(gè)270堿基對(duì)片段，相當(dāng)于氨基的殘基9-111的編碼區(qū)。為了制得一種標(biāo)記的DNA探針，使用32P-dCTP進(jìn)行10次循環(huán)的PCR反應(yīng)。通過(guò)同樣方法制得BDNF探針，不同的是使用豬的基因組DNA作為原始模板來(lái)進(jìn)行放大，并且被放大的片段相當(dāng)于成熟BDNF的氨基酸28到111的編碼區(qū)。合成一種相當(dāng)于氨基酸106-111區(qū)域的互補(bǔ)鏈(反有義)引物，并具有序列(5′)ACATACACAGGAAGTGTC(3′)。對(duì)氨基酸殘基28-33[(5′)GCAGTGGACATGTCGGGT(3′)]區(qū)制備一種有義鏈寡核苷酸引物。用這兩個(gè)探針在嚴(yán)格條件下在68℃2×SSC中進(jìn)行southern印跡雜交(Southern，1975，J.Mol.Biol.98∶503-517)。7.1.2.由不同種類動(dòng)物得到的BDNF基因的序列分析上面所描述的，插入成熟的豬BDNF的氨基酸28-111編碼區(qū)的同樣的兩個(gè)18-聚寡核苷酸，被用作引物以在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下，放大豬、兔、雞和人的基因組DNA的252堿基對(duì)片段，而對(duì)所得DNA反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)雙脫氧核苷酸鏈終止方法(Sanger等人，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72∶3918-3921)進(jìn)行定序分析。在某些情況下，切割出放大DNA的帶段并在瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行提取，在定序分析以前再放大。在另一些情況下再放大并不是必需的。7.2.結(jié)果和討論在本發(fā)明之前，僅從豬中純化了BDNF蛋白。最重要的是要明確證明BDNF并不就是豬神經(jīng)生長(zhǎng)因子的β亞基(β-NGF，或這里簡(jiǎn)稱為NGF)，其純化和分子克隆至今尚未報(bào)導(dǎo)過(guò)。尤其關(guān)鍵的是因?yàn)檫^(guò)去所報(bào)導(dǎo)的豬BDNF的物理性質(zhì)實(shí)際上與各種動(dòng)物種類得到的β-NGF單體的性質(zhì)是相同的。對(duì)豬BDNF缺乏中和抗體和以前缺乏對(duì)豬BDNF的氨基酸或核苷酸序列的情報(bào)，使得不可能測(cè)定在BDNF和NGF之間的確切關(guān)系?？梢韵胂螅贐DNF和NGF之間所觀察到的生物活性的區(qū)別可能，例如，只是反映出在豬和某些其它動(dòng)物品種(如小鼠)之間NGF的差別，或者可能由于不同組織中(如豬腦與小鼠唾腺比較)NGF蛋白分子有差別的修飾引起的，或者由于豬腦純化期間在某些步驟中無(wú)意引入該蛋白的修飾引起的。如果發(fā)現(xiàn)BDNF明顯地不同于NGF，則測(cè)定BDNF是否存在于其它物種之中，特別是人中，是極有意義的。在本發(fā)明之前，對(duì)這一點(diǎn)得不到任何的情報(bào)，因?yàn)锽DNF僅從一個(gè)物種中被純化出來(lái)。在各種粗提取物和條件介質(zhì)中存在的明顯不同于NGF的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性活性，并不暗示存在一種相同于或基本等同于豬BDNF的物質(zhì)。預(yù)測(cè)的豬BDNF氨基酸序列與許多動(dòng)物種類(人、牛、quinea、豬、鼠、雞和蛇)已知的NGF序列的比較表明，與NGF彼此之間比較，BDNF是較少地與任何脊椎動(dòng)物NGF緊密關(guān)聯(lián)(圖2)。成熟BDNF最初結(jié)構(gòu)的一個(gè)顯著特點(diǎn)是它與NGF的相似性;在NGF序列中僅引入3個(gè)間隙優(yōu)化匹配的情況下，51個(gè)同一性對(duì)不同NGF(從蛇到人和BDNF是共同的(圖2)。重要的是，這些同一性包括了全部6個(gè)半胱氨酸殘基。雖然BDNF的二硫化物橋接的確切排列至今還不知道，但明顯的是，這種橋接是存在的(表Ⅲ，說(shuō)明)。在BDNF中發(fā)現(xiàn)的3個(gè)色氨酸和2個(gè)苯基丙氨基酸也在NGF中的同樣位置上被發(fā)現(xiàn)。我們也注意到，在哺乳動(dòng)物NGF和BDNF中的同樣位置上有6個(gè)天門冬氨酸殘基(在BDNF的7個(gè)中)和7個(gè)纈氨酸(9個(gè)中)。這5個(gè)氨基酸引起這種蛋白質(zhì)之間大約一半的氨基酸同一樣。相反，在BDNF和所有的NGF之間具有一些顯著的區(qū)別除了已提及的三個(gè)間隙以外，在所有NGF中還有21個(gè)位置，在這些位置上氨基酸都是一樣的，但在BDNF中是不同的。大多數(shù)BDNF的前體序列與NGF無(wú)關(guān)，有兩個(gè)例外，BDNF的推斷的分泌信號(hào)序列表明有5個(gè)氨基酸同一性(18個(gè)氨基酸中)以及與小鼠NGF信號(hào)序列的總的明顯的相關(guān)性，在該序列中已證明，切開(kāi)發(fā)生在轉(zhuǎn)譯起始蛋氨酸后的18位置上發(fā)現(xiàn)的丙氨酸殘基后(Edwards等人，1988.Mol.Cell.Biol.9∶2456-2464)。似乎很可能是，在BDNF18位置上也被發(fā)現(xiàn)的丙氨酸代表了一個(gè)用于取下BDNF信號(hào)序列的潛在的切割位點(diǎn)。與NGF的其它相似性開(kāi)始于唯一的N-糖基化同樣序列(圖1中下面有雙線的)，相當(dāng)于天門冬氨酸126。這個(gè)天門冬氨酸是位于產(chǎn)生成熟BDNF的切割位點(diǎn)前的8氨基酸。在幾種NGF中也發(fā)現(xiàn)同樣的排列，以及序列Arg-X-Basic-Arg作為該前體的最后4個(gè)氨基酸(Schwarz等人，1989J.Neurochem，52∶1203-1209)。各種脊椎類動(dòng)物的互有區(qū)別的基因編碼了NGF和BDNF的證據(jù)是通過(guò)由分子克隆的人NGF和豬BDNF制備DNA探針、并用由限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI消化的基因組DNA進(jìn)行Southern印跡雜交而獲得的。對(duì)以下來(lái)源的基因組DNA進(jìn)行分析人、猴、大鼠、小鼠、狗、牛、兔、雞以及酵母。用EcoRI消化DNA，并在兩個(gè)一樣的濾器上，用一個(gè)32P-標(biāo)記的人NGF探針和一個(gè)豬BDNF探針，通過(guò)Southern印跡進(jìn)行分析。在被試驗(yàn)的所有有機(jī)體中，除了酵母外，用每個(gè)探針都觀察到單獨(dú)一個(gè)帶段。在多數(shù)情況下，這些在任何一種有機(jī)體中與NGF和BDNF探針雜交的帶段具有不同的電泳遷移率，雖然在某些情況下(如小鼠DNA)，雜交到NGF和BDNF探針的EcoRI片段具有接近同樣的大小，并在所采用的電泳條件下不能被分辯(圖3)。由豬、鼠、雞、和人得到的基因組DNA通過(guò)PCR放大成熟BDNF的部分編碼序列并測(cè)定該核苷酸序列。由豬基因組DNA放大的區(qū)域的DNA序列分析正好肯定了同豬腦cDNA得到的分子克隆所得到的序列結(jié)果。對(duì)這252堿基對(duì)片段的鼠、人和雞BDNF基因組序列(圖5)也進(jìn)行了測(cè)定。值得注意的是，在鼠和人中，對(duì)至少氨基酸28到111區(qū)域所推斷的氨基酸序列是與豬BDNF的序列相同，雖然在不同動(dòng)物種類中觀察到一些核苷酸的差別(例如，在密碼子的第三位置的保守變化)。在雞中，在這一區(qū)域內(nèi)觀察到單獨(dú)一個(gè)氨基酸的取代;與哺乳動(dòng)物BDNF中的蛋氨酸比較，而在雞中該成熟蛋白的第61殘基是賴氨酸。序列數(shù)據(jù)，和上面所描述的Southern印跡雜交試驗(yàn)一起，給出了明確的證據(jù)，證明BDNF被一個(gè)高度保留的、不同于編碼NGF的基因所編碼。8.實(shí)例BDNFRNA在神經(jīng)元組織對(duì)照非神經(jīng)元組織中的表達(dá)8.1.材料和方法8.1.1.RNA的制備按照Okayama等人(1987，MethodsEnzymol.154∶3-28)方法由成熟雌性小鼠中提取全RNA。簡(jiǎn)而言之，將凍組織在5.5M硫氰酸胍中均化，離心溶胞產(chǎn)物以除去碎片，上清液放到調(diào)節(jié)到密度為1.51g/ml的三氟乙酸銫的墊上。在SW27型的振蕩桶回轉(zhuǎn)器(swingingbucketroter)(Beckmann)中，以125，000xg的轉(zhuǎn)速離心24小時(shí)后，將RNA重新懸浮，用乙醇和8M乙酸銨沉淀并在-70℃下貯存。按照Lehrach等人(1977，Biochemistry16∶4743-4751)的方法在1.3%瓊脂糖-甲醛凝膠上進(jìn)行電泳。將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond-N，Amersham)并在1ml含有50%甲酰胺的2×SSC中，使用32P-cRNA小鼠BDNF探針(107cpm，參閱下面)。在62℃雜交過(guò)夜。在0.1×ssc中，在65℃下洗滌60分鐘，洗滌后，斑點(diǎn)用0.1μg/mlRNAseA(pharmacia)在室溫下保溫60分鐘，該薄膜在-70℃暴露(用增強(qiáng)屏)48小時(shí)。8.1.2.cRNA探針的制備用2個(gè)單獨(dú)的BDNF寡核苷酸篩選小鼠腦cDNA庫(kù)，分離出雙陽(yáng)性克隆(double.positiveclones)并亞克隆到BluescriptSK+質(zhì)粒(stratagene)的EcoRI位點(diǎn)中。測(cè)定了相當(dāng)于豬序列的核苷酸350到829(見(jiàn)圖1)的核苷酸序列。在這序列中，在鼠和豬BDNF之間發(fā)現(xiàn)總共只有4個(gè)氨基酸差別，這表明在豬和鼠BDNF之間這一區(qū)域明顯程度的保守性。使用這種模板和T3聚合酶(promega)制備單股RNA探針，這種探針的特異活性度為108cpm/μg。8.2結(jié)果和討論用Northern印跡分析來(lái)評(píng)估BDNFmRNA在神經(jīng)元組織與非神經(jīng)元組織中表達(dá)的對(duì)照。使用鼠組織進(jìn)行Northern印跡分析，可以比豬組織更快地處理RNA的提取。在腦(圖4)和脊柱索(數(shù)據(jù)未列出)中，在約1.45kb處，32P-cRNA探針檢測(cè)到一個(gè)單獨(dú)的信號(hào)。重要的是，在任何其他組織，包括腎、腸、肺、肝、脾、心和肌肉都沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)(圖4)。如果豬mRNA的大小類似乎鼠的，則示于圖2的cDNA序列代表了80%以上的完整mRNA序列。說(shuō)明BDNF生理學(xué)特性的一個(gè)重要的觀察結(jié)果是，編碼這種蛋白質(zhì)的mRNA僅僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)、而在7種非CNS組織中未被發(fā)現(xiàn)。BDNFmRNA不但在全腦(圖4)中發(fā)現(xiàn)，而且也在脊柱索和上丘中發(fā)現(xiàn)(示于圖1的序列完全由上丘cDNA模板得出)。這些資料支持了這樣的想法，即BDNF是靶衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子以及BDNF-應(yīng)答神經(jīng)元或者是CNS固有的或者與CNS結(jié)構(gòu)直接相連系。事實(shí)上，迄今已知對(duì)BDNF應(yīng)答的所有神經(jīng)元或者伸進(jìn)CNS，如背側(cè)根神經(jīng)節(jié)或顱感覺(jué)神經(jīng)節(jié)(Lindsay等人，1985，Dev.Biol.112∶319-328;Davies等人，1986，J.Neurosci.6∶1897-1904)，或者是CNS神經(jīng)元，像視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Johnson等人，1986，J.Neurosci.6∶3031-3038)。很清楚，還需要進(jìn)行詳細(xì)的研究來(lái)調(diào)查CNS中合成BDNF位點(diǎn)的確切分布，但已清楚，在許多非CNS組織中發(fā)現(xiàn)的BDNFmRNA的分布是非常不同于NGFmRNA的分布(Heumann等人，1984，EMBOJ.3∶3183-3189;Shelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81∶7951-7955)。9.實(shí)例人和大鼠BDNF基因的分子克隆和表征9.1.材料和方法9.1.1基因組DNA和cDNA庫(kù)在λ-ZAPⅡ的成人視網(wǎng)膜cDNA庫(kù)是由Stratagene公司得到，在EMBL3/SP6/T7的人胎盤基因組DNA庫(kù)由Clon-tech公司得到。在λgt11的人胎腦cDNA庫(kù)由Clontech公司得到。在EMBL3/sp6/T7的大鼠基因組DNA庫(kù)由Clontech公司得到。通過(guò)Sau3A限制性核酸內(nèi)切酶部分消化基因組DNA而制備兩個(gè)基因組庫(kù)并連結(jié)到載體的BamHI位點(diǎn)。在λ-ZAPⅡ的大鼠腦cDNA庫(kù)是由Stratagene公司得到。9.1.2.BDNFDNA探針的制備在使用人基因組DNA的PCR反應(yīng)中，使用上面節(jié)7.1.1中所描述的同樣的寡核苷酸引物制備32P-標(biāo)記的BDNFDNA探針，以放大人BDNF的殘基28-111的編碼區(qū);同樣地，使用大鼠基因組DNA作為PCR模板，制得大鼠BDNF-特異的32P-標(biāo)記的探針。9.1.3.庫(kù)篩選按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Benton和Davis，1977，Science196∶180-182;Maniatis等人，1978，Cell，15687-701)在有硫酸葡聚糖的50%，甲醛和Denhardt溶液中，在42℃進(jìn)行雜交，篩選入噬菌庫(kù)。濾器在42℃下在50%甲酰胺、5×ssCPE、10%Denhardt溶液、0.5mg/ml鮭(Salmon)精子DNA，0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖中被預(yù)雜交。雜交是在同樣緩沖液中進(jìn)行，不同的是Denhardt溶液是2%，鮭精子DNA為0.1mg/ml，并省去SDS和硫酸葡聚糖。雜交以后，在68℃洗滌濾器，人BDNF探針被用于篩選人基因組DNA和視網(wǎng)膜cDNA庫(kù);大鼠BDNF探針被用于篩選大鼠基因組DNA和腦cDNA庫(kù)。使用上面在7.1.1節(jié)所描述的方法而制備的人和大鼠NGF探針也用來(lái)篩選庫(kù)。9.2.結(jié)果和討論從每個(gè)庫(kù)至少對(duì)670，000個(gè)噬菌體進(jìn)行了篩選，考慮到陽(yáng)性人克隆被認(rèn)為是那些與人BDNF探針雜交而不與上述人NGF探針雜交的克隆。由人和大鼠兩庫(kù)中以一個(gè)與用每單倍體基因組一個(gè)拷貝表達(dá)BDNF基因相一致的頻率獲得BDNF基因克隆。對(duì)大鼠和人的這兩個(gè)基因庫(kù)，篩選了幾乎一百萬(wàn)噬菌體。由大鼠基因組庫(kù)中得到3個(gè)陽(yáng)性的，而從人基因組庫(kù)得一個(gè)。從人視網(wǎng)膜和大鼠腦cDNA庫(kù)中得到的陽(yáng)性克隆是以一個(gè)與基因表達(dá)水平很低相一致的頻率被得到的;在大鼠腦cDNA中，在670，000中，識(shí)別出2個(gè)陽(yáng)性的;在人視網(wǎng)膜cDNA庫(kù)中，在670，000克隆中識(shí)別出一個(gè)陽(yáng)性的。從人胎腦中所制備的商業(yè)性cDNA庫(kù)中的670，000個(gè)中沒(méi)有檢測(cè)到陽(yáng)性克隆。使用代表如上面7.1.2節(jié)所測(cè)定的來(lái)自人和大鼠BDNF編碼區(qū)域內(nèi)的準(zhǔn)確序列的合成寡核苷酸引物對(duì)人BDNFcDNA和基因組克隆進(jìn)行核苷酸定序分析。所得到的最長(zhǎng)人cDNA克隆具有一個(gè)約1.6-1.8kbp的插入物，正如所預(yù)料的，含有如上面下2節(jié)所描述的，在由人基因組DNA直接放大后被確定的該部分人BDNF的準(zhǔn)確序列。這種cDNA(圖5)克隆的詳細(xì)的序列分析揭示了一個(gè)編碼了一種247氨基酸多肽的開(kāi)放式閱讀框架，類似于、但不相同于豬BDNF的全長(zhǎng)度的前體。在相當(dāng)于成熟BDNF多肽的區(qū)域內(nèi)(即從His134密碼子到鏈終止密碼子)，在所推斷的氨基酸序列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差別;在豬和人之間的所有核苷酸取代對(duì)編碼持異性而言都是保守的取代。推斷的BDNF前體多肽的其余部分表明了有些氨基酸序列在人與豬之間是有差別的，最明顯的是，在人BDNF基因中沒(méi)有在豬中看到的6個(gè)接續(xù)的Ser密碼子中的5個(gè)，導(dǎo)致一個(gè)稍短一些的多肽(247對(duì)照252個(gè)氨基酸)。在載體EMBL3中所制備的庫(kù)，在10-23Kbp之間，具有一些外源DNA的插入物。在被詳細(xì)分析的人基因BDNF克隆中確切的插入物大小未被確定，但是該克隆含有單獨(dú)一個(gè)與用于篩選庫(kù)的標(biāo)記的BDNF探針雜交了的約4Kbp的EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶片段，根據(jù)使用上面所述的豬BDNF探針進(jìn)行人基因組DNA的Southern印跡雜交法的結(jié)果，這片段具有預(yù)期的大小。利用合成的寡核苷酸在人克隆上進(jìn)行定序分析，該寡核苷酸代表了從噬菌體DNA模板引發(fā)DNA合成的cDNA序列。推斷的人BDNF前體的編碼序列的順序被發(fā)現(xiàn)與人cDNA克隆中的一樣，不同的是在prepro區(qū)的一個(gè)單獨(dú)的核苷酸取代相當(dāng)于在圖5中核苷酸785上一個(gè)用蛋氨酸(ATG)取代纈氨酸(GTG)的氨基酸的取代。這種變化在人基因組中可以反映一個(gè)多態(tài)性。如同在人NGF基因情況下，在推斷的人preproBDNF的編碼序列內(nèi)，沒(méi)有檢測(cè)到插入序列。大鼠cDNA序列數(shù)據(jù)也示于圖5。10.實(shí)例重組體BDNF的表達(dá)10.1材料和方法10.1.1.BDNF表達(dá)載體的制備相當(dāng)于豬preproBDNF的序列，是通過(guò)在用1μg豬基因組模板的PCR反應(yīng)中使用寡核苷酸引物(每個(gè)150微微摩)ATAATCTAGATGACCATCCTTTTCCTT(有義)，ATAATCTAGACTATCTTCCCCTCTTAAT(反有義)，(每個(gè)引物有一添加的xbaI位點(diǎn))而制備的。放大反應(yīng)是按照所述進(jìn)行，不同的是退火溫度是50℃。用xbaI消化以后，放大的DNA被連接到質(zhì)粒pCMV1的xbaI位點(diǎn)中以產(chǎn)生PCWV1-PBDNF-1(-表示圖6中的有義取向并相當(dāng)于表Ⅴ中的cos+)，該質(zhì)粒通過(guò)電擊穿(electroporation)而引入XL-1細(xì)菌。10.1.2BDNF在COS細(xì)胞中的表達(dá)用xbaI和PstI從陽(yáng)性克隆(用寡5雜交法檢查，圖2)中切下PCMV1-PBDNF質(zhì)粒DNA。所得產(chǎn)物的大小使我們可以測(cè)定插入物的取向，這兩個(gè)質(zhì)粒都用于通過(guò)磷酸鈣方法(Chen等人，1987，Mol.Cell.Biol.72745-2752)來(lái)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，24小時(shí)后收集生長(zhǎng)培養(yǎng)基。用上面詳細(xì)討論過(guò)的雞胚背側(cè)根神經(jīng)節(jié)生物測(cè)定法測(cè)試BDNF活性。10.2結(jié)果和討論E8小雞脊椎感覺(jué)神經(jīng)元放在試驗(yàn)板上(每孔6，000個(gè))，保溫24小時(shí)，在24小時(shí)計(jì)數(shù)(Lindsay等人，1985，Develop.Biol.112∶319-328)。數(shù)值是三次測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。以1ng/ml的濃度使用BDNF和NGF，在這濃度用任一因子都觀察到最大的存活率。COS+是指用含有以有義取向的BDNF插入物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;COS-是指用含有反有義取向BDNF插入物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。COS是指沒(méi)有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在稀釋度高于120，無(wú)論用COS-或COS的條件培養(yǎng)基都看不到高于對(duì)照的存活。在所有不用NGF實(shí)驗(yàn)中，使用一種單克隆的抗NGF抗體(Korsching等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80∶3513-3516)，其濃度為1μg/ml。如表Ⅴ所示，只有從以有義取向載有PCMV1-pBDNF質(zhì)粒的COS細(xì)胞的培養(yǎng)物中所得到的培養(yǎng)基才伴隨有高于對(duì)照值的雞感覺(jué)神經(jīng)元存活率。因此，該重組體BDNF是生物活性的。再者，加入由豬腦分離出來(lái)的BDNF并不使感覺(jué)神經(jīng)元的存活明顯高于由單獨(dú)重組體BDNF得到的存活水平，這表明重組體BDNF能夠使BDNF受體飽和。還觀察到如果與NGF一起使用，重組體BDNF對(duì)促進(jìn)雞感覺(jué)神經(jīng)元的存活具有疊加或協(xié)同作用。表Ⅴ培養(yǎng)的小雞感覺(jué)神經(jīng)元的存活COS培養(yǎng)基(最終稀釋度)1∶201∶501∶200COS+2，510±2632，833±171COS-211±16COS250±87BDNF+COS+2，516±209NGF+COS+5，770±72單獨(dú)BDNF2，718±42411.實(shí)例BDNF抗體的產(chǎn)生11.1材料和方法一種命名為血清4的BDNF特異多克隆抗血清，是在一種NZ白兔中通過(guò)用合成肽免疫接種而產(chǎn)生的。11.1.1肽合成和連接到載體上一個(gè)命名為B5的包含有34個(gè)氨基酸殘基的肽，是用通常方法合成的。它具有以下的氨基酸序列，相當(dāng)于成熟BDNF的33個(gè)殘基(示于圖1中完整的豬preproBDNF序列的殘基153-185)，需要時(shí)在氨基末端具有另外一個(gè)半胱氨酸殘基(以斜體表示)，使得可以使用間-順丁烯二酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酸亞胺(MBS)而連接到載體蛋白上Gys-Val-Thr-Ala-Ala-Asp-Lys-Lys-Thr-Ala-Val-Asp-Met-Ser-Gly-Gly-Thr-Val-Thr-Val-Leu-Glu-Lys-Val-Pro-Val-Ser-Lys-Gly-Gln-Leu-Lys-Gln-Tyr。使用雙-重氮基聯(lián)苯胺(BDB)，將B5肽連接到牛血清的清蛋白上。通過(guò)將46mg聯(lián)苯胺-HCl(對(duì)-二氨基二苯-HCl，由Sigma公司購(gòu)得)溶解于9.0ml0.2NHCl中制得新鮮的BDB。將35mgNaNO2溶解于1.0ml水中并加到該聯(lián)苯胺溶液，在4℃攪拌1小時(shí)。將21mgBSA溶解于3.0ml的0.16M硼酸鹽、0.13MNaCl，pH9.0的溶液中。將大約15mgB5肽溶解在pH0.0的1.5ml硼酸鹽-NaCl緩沖液中。將肽溶液加到BSA溶液中并放在冰中。將1.0mlBDB加入BSA-肽溶液中，在攪拌下，于4℃保溫反應(yīng)混合物2小時(shí);檢測(cè)其pH值，需要時(shí)加入少量0.5MNaOH以保持在9.0的范圍。在加入0.2ml1%苯酚-緩沖液反應(yīng)終止。過(guò)量試劑通過(guò)對(duì)磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)滲析而除去。11.1.2.免疫接種按照下面所描述的方法進(jìn)行對(duì)總共6只兔子免疫接種;兔1和4-使用BDB，將肽B5，在其C-末端連接到BSA;兔2和3-使用MBS，將肽B5，在其N-末端連接到BSA;兔5和6-將肽B5與粉末狀硝基纖維素混合。在所有的情況下，第一次免疫接種使用在0.5mlPBS加上0.5ml完全弗氏(Freund)助劑和1mg免疫原(對(duì)兔5和6是100μgB5/500μg硝基纖維素)。這種混合物是在背上多個(gè)部位被皮下注射的。第二次免疫接種是在三星期后進(jìn)行，與第一次一樣，不同的是使用不完全弗氏助劑代替完全弗氏助劑。其后以4-6星期的間隔進(jìn)行加強(qiáng)注射。將免疫接種后一星期的兔子放血，通過(guò)酶連接的免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA)定期檢查杭血清與純B5肽的結(jié)合。11.1.3.結(jié)合到BDNF的抗體的檢測(cè)將在水中的100μg抗原(B5肽)加到在微滴板上的孔中并讓它干燥過(guò)夜，然后短暫地用水洗滌，用100μg1%明膠在室溫下阻斷30分鐘。用蒸餾水洗滌孔三次，然后加入100μg抗血清，并在4℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后將孔在PBS/0.05%TritonX-100中洗滌三次，之后，將100μg的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗-兔免疫測(cè)定樣品(1/1000稀釋度)加到孔中并在室溫保溫3小時(shí)。洗滌孔兩次，加入100μgABTS溶液[將10mgABTS(Sigma)溶解在10ml0.1M檸檬酸鈉(pH＝4.0)加10μgH2O2的溶液中。]并保溫約5分鐘，直到顯色。加入10μg1%NaN3，使反應(yīng)停止。樣品用水稀釋到1∶5并在415nm測(cè)量其光密度。11.2結(jié)果和討論由兔4得到的抗血清(血清4)表明有最高的滴定度(圖7a)，并被用于以后的實(shí)驗(yàn)中。由血清4得到的抗體通過(guò)用硫酸銨沉淀被部分純化，在攪拌下對(duì)部分抗血清中慢慢加入等體積的飽和硫酸銨，將溶液再攪拌15分鐘，然后在2，000xg的轉(zhuǎn)速下離心。沉淀在50%飽和的硫酸銨中洗滌二次，然后再溶解于體積相當(dāng)于原來(lái)血清體積的PBS中。對(duì)幾次更換的PBS進(jìn)行透析而除去硫酸銨。透析后的溶液按1.0ml體積分成等分，并使用高速真空器speed-vac進(jìn)行凍干。將血清4抗體的樣品再懸浮在0.5ml水中并通過(guò)ELISA用肽B5測(cè)試其反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)稀釋度達(dá)14，000還可以反應(yīng)。通過(guò)按上面所描述的免疫兔子的方法產(chǎn)生相當(dāng)于豬BDNF的一個(gè)33氨基酸片段的合成肽(B5)的多克隆抗體。對(duì)合成肽顯示最高滴定度的血清4，表明通過(guò)ELISA與由豬腦純化的BDNF有反應(yīng)性(圖7b)。通過(guò)免疫印跡法也檢測(cè)出弱的反應(yīng)性(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示出)。但是，在對(duì)雞胚背側(cè)根神經(jīng)節(jié)感覺(jué)神經(jīng)元的生物測(cè)試中抗血清不能阻斷BDNF的活性。12.實(shí)例BDNF的新的生物作用下面的觀察表明，BDNF能夠(ⅰ)保持CNS多巴胺能神經(jīng)元的存活并誘發(fā)它完全區(qū)別的狀態(tài)，(ⅱ)保持CNS膽堿神經(jīng)元的存活;以及(ⅲ)抑制星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生。BDNF的這些生物作用以前未曾描述過(guò)。因?yàn)槎喟桶纺艿纳窠?jīng)元、膽堿能神經(jīng)元以及星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、每一個(gè)都可能與神經(jīng)的疾病和機(jī)能失調(diào)有關(guān)系。所以可以證明BDNF在治療涉及這些細(xì)胞群體的神經(jīng)病理學(xué)中是有用的。12.1材料的方法12.1.1培養(yǎng)多巴胺能黑質(zhì)神經(jīng)元的方法由胚胞約13天-胚胞約15天的不同時(shí)期的大鼠胚腦中剖割出前側(cè)的中腦。一般，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用2升。該剖割物溶液有以下的組成NaCl，136.8mM，KCl，2.7mM，Na2HPO4.7H2O，8.0mM，KH2PO4，1.5mM，葡萄糖，6mg/ml，以及BSA0.1mg/ml，pH7.4。制備這些溶液并通過(guò)0.2μM多孔濾器過(guò)濾消毒。剖割是在非滅菌條件下進(jìn)行的。一旦從所有的腦中切割下組織，該方法的其余步驟都是在無(wú)菌條件下進(jìn)行。組織碎片放在一個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中并用好的剪刀將其切碎。2ml含有0.125%胰蛋白酶的F-12營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基加到組織上，并在37℃保溫。在結(jié)束這保溫期時(shí)，將DNAseI加到該漿料中，使其最終濃度為80ng/ml。進(jìn)行另一個(gè)同樣的培養(yǎng)，然后將組織漿料加到8.0ml含有補(bǔ)充有2mM谷氨酰胺、6mg/ml葡萄溏，5單位/ml青霉素，5mg/ml鏈霉素和7.5%胎牛血清(FCS)的最小基本培養(yǎng)基(MEM)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在桌面離心機(jī)(tabletopcentrifuge)中，在室溫下，以500轉(zhuǎn)/分速度離心樣品5分鐘。吸出培養(yǎng)基，在細(xì)胞沉淀中加入2ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基。一支有1mm開(kāi)孔的火拋光吸管用于搗碎細(xì)胞8次。使其余的組織碎片通過(guò)重力沉淀下來(lái)，取出小部分上層清液;通過(guò)在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)確定細(xì)胞數(shù)。測(cè)定細(xì)胞密度后，細(xì)胞按50，000/cm2的密度平放在組織培養(yǎng)平板上。培養(yǎng)平板是在剖割的前一天制備的。組織平板(24孔，2cm2/孔)用多鳥氨酸(分子量為30，000-70，000g/mol)，0.5mg/ml，在室溫，預(yù)涂覆3小時(shí)。平板用水充分洗滌，接著，用5μg/ml的小鼠昆布氨酸在室溫下處理3小時(shí)。然后如前一樣用水洗滌平板，并在含有5%CO2;95%空氣的潮濕氣氛下;在有生長(zhǎng)培養(yǎng)基存在的條件下，在37℃保溫過(guò)夜。在第二天除去平板上的培養(yǎng)基并再放入新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。一旦細(xì)胞平鋪在培養(yǎng)平板上，細(xì)胞就放入設(shè)定在37℃和5%CO2/95%空氣下的恒濕箱中保持24小時(shí)。培養(yǎng)基換成具有以下組成的無(wú)血清配方(SFM)Basal.Eagle培養(yǎng)基和含有葡萄糖(33mM)、谷氨酰胺(2mM)，NaHCO3(15mM)，HEPES(10mM)，的營(yíng)養(yǎng)混合物F-12，按1∶1(體積∶體積)比例的一處混合物，加有胰島素(25μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(100μg/ml)，腐胺(60μM)，黃體酮(20nM)、亞硒酸鹽(30nM)、青霉素(5μ/ml)、鏈霉素(5mg/ml和T3(30nM)。在某些實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)第2天，培養(yǎng)基換成SFM后，在培養(yǎng)基中加入純化的BDNF。用于培養(yǎng)多巴胺能神經(jīng)元的溶液是用取自Milli-Q試劑水系統(tǒng)的水制備的。組織培養(yǎng)基配方是通過(guò)Gibco實(shí)驗(yàn)室(SantaClara，Cali-fornia)得到的，胎牛血清(批號(hào)43N1086)和小鼠昆布氨酸也由那里得來(lái)。全部其它培養(yǎng)基組成都是從SigmaChemical(st.LouisMo)購(gòu)得，而且是細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試級(jí)。多鳥氨酸和DNAseI也是從Sigma得到。胰蛋白酶是由Worthington(Freehold.NJ)得到，批號(hào)為3667。商購(gòu)化學(xué)試劑是分析純的，購(gòu)自BakerChemical(Phillipsburg.NJ.)在這些試驗(yàn)中所用的BDNF是按照Barde等人(1982，上述)的方法，由Y.A.Barde博士從豬腦中純化的。12.1.2.前中腦培養(yǎng)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)都是新鮮制備固定溶液，對(duì)酪氨酸羥化酶(TH)的染色，固定劑是4.00%多聚甲醛的Sorenson磷酸鹽緩沖液。Soren-son緩沖液是通過(guò)在0.2MNa2HPO4原儲(chǔ)液中加入0.2MKH2PO4溶液直到pH達(dá)到7.3。然后將多聚甲醛加到溶液中并短暫地加熱，使之溶解，在使用前冷卻至室溫。在開(kāi)始步驟時(shí)，通過(guò)輕輕吸取從培養(yǎng)皿中移去培養(yǎng)基，并輕輕地將適當(dāng)?shù)墓潭ㄈ芤杭拥矫笾?。室溫保?0分鐘，接著在輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)下，在Sorenson磷酸鹽緩沖液中洗滌三次，每次5分鐘，然后，在室溫，在輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)下，將細(xì)胞在急冷溶液中培養(yǎng)30分鐘。要對(duì)TH染色的培養(yǎng)物的急冷溶液是由含2%標(biāo)準(zhǔn)馬血清的Sorenson磷酸鹽緩沖液組成。接著，培養(yǎng)物是在滲透化緩沖液中，在室溫和輕微轉(zhuǎn)動(dòng)下，保溫30分鐘，對(duì)于要TH染色的培養(yǎng)物，該溶液由含0.2%皂苷和1.5%標(biāo)準(zhǔn)馬血清的Sorenson緩沖液組成。接著滲透化步驟，培養(yǎng)物在有初生抗體存在下在4℃保溫過(guò)夜，抗大鼠TH的抗體是小鼠的單克隆同型抗體IgG2a。它是在10mMNaPO4、50mMNaCl、0.2%皂苷、pH7.5的溶液中，以40μg/ml被使用的。在初生抗體保溫后，培養(yǎng)物在適宜的滲透化緩沖液中洗滌五次，每次15分鐘，下一步，培養(yǎng)物與結(jié)合到生物素上的次生抗體，即生物素化的馬抗-小鼠IgG一起培養(yǎng)。這次培養(yǎng)是在室溫下，在輕轉(zhuǎn)動(dòng)下進(jìn)行2小時(shí)。接著與上面描述過(guò)相同地進(jìn)行洗滌，然后將培養(yǎng)物在有預(yù)先形成的抗生物素蛋白-生物素化的馬蘿卜過(guò)氧化酶(horseradishperoxidase)絡(luò)合物(ABC試劑，Vectorlaboratories，Burlingame，CA)存在下培養(yǎng)，該絡(luò)合物按照制造商的方法制備的。在室溫和輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)下保溫30分鐘后，培養(yǎng)物如上面所述那樣進(jìn)行洗滌。接著，將培養(yǎng)物與pH7.3，含有0.5mg/ml二氨基聯(lián)苯胺和0.01%過(guò)氧化氫的55mMTris-Cl一起培養(yǎng)。使反應(yīng)產(chǎn)物的展開(kāi)進(jìn)行2-5分鐘。之后，移去溶液，用冰冷的PBS洗滌培養(yǎng)物幾次，然后確定陽(yáng)性細(xì)胞/cm2的數(shù)目。多聚甲醛和戊二醛是FlukaChemical中得到。含有標(biāo)準(zhǔn)血清(用作阻斷劑)、生物素化，親和一純化的抗-免疫球蛋白、抗生物素蛋白DH、和生物素化HRP-H的Vectastain藥盒是由Vectorlaboratories中購(gòu)得。二氨基聯(lián)苯胺是由BRL(Gaithersberg，MD得到)。12.1.3.用于測(cè)量在前側(cè)中腦培養(yǎng)物中3H-多巴胺攝取量的方法。按照DalToso等人(1988，J.Neurosci.8733-745)所描述過(guò)的，并稍加修改進(jìn)行3H-多巴胺(3H-DA)的攝取。攝取緩沖液具有以下組成;NaCl136.8mM，KCl，2.7mM，Na2HPO47H2O，8.0mM，KH2PO4，1.5mM，葡萄糖，5.0mM，CaCl21.0mM、MgSO4，1.0mM，抗壞血酸，0.1mM，伏降寧，0.1mM、pH7.4。需要時(shí)在攝取緩沖液中可加入5.0μM苯托品甲磺酰酯(BZT)。細(xì)胞用預(yù)熱(37℃)的攝取緩沖液洗滌一次，并在每2cm2孔中放置0.4ml攝取緩沖液。然后在37℃，將培養(yǎng)物預(yù)保溫5分鐘，在這預(yù)保溫結(jié)束時(shí)，加入0.1ml在攝取緩沖液中的3H-DA(250nm，40Ci/mMol)，使3H-DA在緩沖液中的最終濃度為50nM。培養(yǎng)物在37℃保溫15分鐘，接著在4℃用攝取緩沖溶液洗滌4次，每次0.5ml。同樣用冰冷的PBS(10mMNaPO4;150mM，NaClpH7.6)再洗滌二次。在最后一次洗滌完成后，在細(xì)胞中按0.2ml/2cm2孔加入0.5NNaOH，并在室溫下放置2小時(shí)，然后收集NaOH提取物，用10ml的“ultimagold”閃爍液體在閃爍計(jì)數(shù)器(Packard.Ls.500TD)中計(jì)數(shù)。攝取率定義為在有5μMBZT存在時(shí)攝取被廢除。一般來(lái)說(shuō)，這代表了所觀察到的總攝取的70-90%。3H-DA由NEN(Boston，MA)得到?？箟难猁}，優(yōu)降寧、BZT和葡萄糖都是由Sigma(St.Louis;MO)得到。ultimagold閃爍液體是由Packard(Sterling.VA)購(gòu)得。12.1.4產(chǎn)生底前腦膽堿能神經(jīng)元培養(yǎng)物的方法底前腦膽堿能細(xì)胞的最初培養(yǎng)物是由胚胎期17天的大鼠中產(chǎn)生。具體地說(shuō)，用于本研究的膽堿能的神經(jīng)元是從中間隔核和布羅卡氏(Broca)對(duì)角帶的核中產(chǎn)生的。這種神經(jīng)元群體最初伸向海馬。分離的混合培養(yǎng)物(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì))是由以下方法產(chǎn)生的，剖割隔區(qū)不帶四周的組織，并從胎腦中移出。集中這種組織塊，用剪刀剪碎，用12.5%胰蛋白酶在37℃處理20分鐘。胰蛋白酶通過(guò)在平板培養(yǎng)基[Dulbecco改性的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，含有1%青毒素和鏈霉素，5%馬血清和1%N3，一種激素添加劑]中稀釋而失活。通過(guò)用火拋光的巴斯德(pasteur)吸管研磨被消化的組織碎片制備一種單細(xì)胞懸浮液。分離的細(xì)胞在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)，并以適當(dāng)?shù)拿芏绕戒佋谄桨迮囵B(yǎng)基中。平鋪5-6小時(shí)后，在培養(yǎng)物中加入試驗(yàn)配位體，細(xì)胞在體外生長(zhǎng)10天，每隔3天換一次培養(yǎng)基。12.1.5.膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶測(cè)定法在處理期以后，細(xì)胞或者用于膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的酶測(cè)定，或者按以下方法進(jìn)行對(duì)CAT的免疫組織化學(xué)染色。CAT的單克隆抗體是從BoehringerMannheimBiochemicalCo.購(gòu)得，并在別處已表征過(guò)。在試驗(yàn)期結(jié)束時(shí)，用DMEM將細(xì)胞沖洗兩次。培養(yǎng)物用一個(gè)兩步法固定;在10分鐘的保溫期間，在50μlDMEM中加入50μl4%多聚甲醛。移去這種溶液，再放置100μl、4%多聚甲醛并在室溫繼續(xù)保溫30分鐘。固定后，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗三次，通過(guò)與皂苷(0.5mg/ml)一起保溫30分鐘而進(jìn)行滲透化。用PBS洗滌三次而除去去污劑，加入5%標(biāo)準(zhǔn)兔血清的阻斷溶液30分鐘。將最初的抗體按1∶3的稀釋度加入到1%標(biāo)準(zhǔn)的兔血清，然后除去阻斷溶液，培養(yǎng)物在4℃保溫過(guò)夜，用PBS洗滌除去含有最初抗體的溶液，通過(guò)Vectastain“ABC”方法檢測(cè)結(jié)合的免疫球蛋白。二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物(DAB)用作過(guò)氧化物酶反應(yīng)的基質(zhì)，該反應(yīng)一般要進(jìn)行1-5分鐘。用0.1Mtris-HCl(PH7.2)沖洗培養(yǎng)物兩次而使反應(yīng)停止。培養(yǎng)物貯存在pH7.6、含有0.15MNaCl、42%甘油和0.15%Zephiran(PierceChemicalCo.，Rockville，IL)的50mMtris中，溫度在4℃。12.1.6.產(chǎn)生純化的星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的方法主要按照McCarthy和Devellis(McCarthyK.D.和Devellis，J.1980，J.Cell.Biol.85∶890-902)的方法由出生后1-2天的大鼠海馬中制備純化的神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物。從5個(gè)幼畜中取出海馬并用剪刀剪碎。將組織塊于37℃下在2ml0.125%的胰蛋白酶中消化20分鐘。用平板培養(yǎng)基[10%胎牛血清Gibco.DMEM.0.5%青霉素(5000mcg/ml)和0.5%谷氨酰胺)稀釋而使蛋白酶失活。通過(guò)將消化的組織碎片流經(jīng)一狹窄的巴斯德吸管而制備一個(gè)單細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞在900rpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘而沉淀，再懸浮在平板培養(yǎng)基中，然后在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。單細(xì)胞懸浮液分到3個(gè)75cm2的組織培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞生長(zhǎng)到約有80%連生。然后將細(xì)胞通過(guò)胰蛋白酶化方法進(jìn)行分培養(yǎng)，該方法類似于上面剛剛描述的方法。對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)并按10000細(xì)胞/0.9cm2的密度平鋪。12.2.結(jié)果12.2.1.BDNF對(duì)前側(cè)中腦培養(yǎng)物中的酪氨酸羥化酶的影響按上面12.1.2節(jié)所述的免疫細(xì)胞化學(xué)染色被用于測(cè)量BDNF對(duì)一些酪氨酸羧化酶(TH)陽(yáng)性細(xì)胞(圖8)的影響。在BDNF刺激的前側(cè)中腦細(xì)胞培養(yǎng)物中，到第8天觀察到高于對(duì)照200%的最大增加。在BDNF-刺激的培養(yǎng)物中在培養(yǎng)3天時(shí)觀察到極少量的增加。12.2.2.BDNF對(duì)由前側(cè)中腦培養(yǎng)物攝取的多巴胺攝取物的影響如上面12.1.3節(jié)中所描述的那樣，按照DalTaso等人(1988，J.Neurosci.8733-745)稍加改變的方法測(cè)量3H-多巴胺(3H-DA)的攝取量。在BDNF刺激前側(cè)中腦培養(yǎng)物中到培養(yǎng)第8天觀察到多巴胺攝取量稍有增加(圖9)12.2.3.BDNF對(duì)由前腦膽堿能神經(jīng)元表達(dá)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的影響圖10(a)描述了體外生長(zhǎng)期12天后BDNF對(duì)一些CAT陽(yáng)性細(xì)胞的影響。當(dāng)EC50計(jì)算為10ng/ml時(shí)，加100ng/mlBDNF，觀察到CAT細(xì)胞數(shù)增加5.9倍。作為一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，每孔為260，000(黑線條)或150，000(陰影線條)的培養(yǎng)物用NGF按同樣方法處理(圖10(b))。每孔260，000細(xì)胞的密度相當(dāng)于用于BDNF研究的密度。這種CAT免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的增加與以前所報(bào)導(dǎo)的相類似。通過(guò)測(cè)量CAT酶活性(F.Fonnum;J.Neurochemistry1975，24∶407-409)測(cè)定了對(duì)BDNF在膽堿能神經(jīng)元上作用的能力。圖11描述了用BDNF處理所產(chǎn)生的CAT變化。在這種情況下，用100ng/mlBDNF達(dá)到增加1.8倍而EC50計(jì)算為61ng/ml。12.2.4BDNF或EGF對(duì)星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的影響已經(jīng)證明，Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)各種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽具有高親和力的受體。這樣，星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠應(yīng)答由神經(jīng)產(chǎn)生的信號(hào)。由于這個(gè)理由以及因?yàn)棰蛐托切文z質(zhì)細(xì)胞在其初生培養(yǎng)物中代表了細(xì)胞組成，因而試驗(yàn)了BDNF對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞可能有的直接作用。在加入生長(zhǎng)因子以前，將細(xì)胞體外保持4天以使它們達(dá)到約60%連生，然后用EGF或BDNF處理42小時(shí)。在培養(yǎng)的最后18小時(shí)，在培養(yǎng)基中有[3H]甲基胸苷存在。EGF的作用示于圖12(a)。正如以前所報(bào)導(dǎo)過(guò)的，發(fā)現(xiàn)EGF對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞是促有絲分裂的。觀察到在10ng/mlEGF下有最大的應(yīng)答，EGF引起[3H]甲基胸苷的摻入量增加5.2倍。圖12(b)描述了BDNF對(duì)[3H]甲基胸苷摻入量的影響。對(duì)BDNF的應(yīng)答似乎是兩相的極低的劑量(0.1ng/ml)引起胸苷摻入量輕微的增加;而大于1ng/ml的BDNF劑量卻抑制[2H]甲基胸苷的摻入。BDNF的劑量在5ng/ml時(shí)，引起24%的抑制，表明在處理期間膠質(zhì)細(xì)胞增育速度的降低。12.3.討論這些體外實(shí)驗(yàn)清楚地表明，BDNF支持發(fā)育中大鼠黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元的存活或誘導(dǎo)它的完全區(qū)別狀態(tài)，這些已通過(guò)染色酪氨酸羥化酶以及在由胚大鼠中腦得到的這些神經(jīng)元培養(yǎng)物中的多巴胺攝取量所表明。因?yàn)檫@些是在帕金森病中的變性神經(jīng)元，所以BDNF極有可能通過(guò)降低神經(jīng)元的損失或通過(guò)增加酪氨酸羥化酶的量(在多巴胺合成中的限速酶)或可能通過(guò)兩者而在帕金森病中具有治療能力。再者，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)一樣，BDNF看來(lái)對(duì)大鼠底前腦的膽堿能神經(jīng)元的存活具有影響，這已通過(guò)大鼠胚中間隔核和布羅卡氏對(duì)角帶核培養(yǎng)物中增加的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)染色，增加的CAT活性和增加的乙酰膽堿脂酶染色所表明。因此，單獨(dú)BDNF或與NGF一起使用，BDNF在治療影響底前腦的膽堿能神經(jīng)元的疾病或機(jī)能失調(diào)癥、如早老性癡呆癥中可能是有用的。13.實(shí)例BDNF/NGF基因族中一種新基因的鑒別根據(jù)NGF和BDNF之間氨基酸序列的保守性(基因盒1-4見(jiàn)5.8節(jié))，通過(guò)利用用簡(jiǎn)并寡核苷酸的PCR來(lái)鑒別NGF/BDNF基因系中的新成員的方法，通過(guò)測(cè)定這種引物對(duì)是否能夠用于放大由幾種動(dòng)物種類的基因組DNA所得的NGF和BDNF兩種基因序列而首次進(jìn)行試驗(yàn)。然后這種方法被用于鑒別這樣一種新基因，該基因與NGF和BDNF共享在被指出的具有同源性的所有四個(gè)基因盒中的同源性。13.1材料和方法13.1.1.聚合酶鏈反應(yīng)PCR主要是按上面節(jié)6中所描述的進(jìn)行13.2.結(jié)果13.2.1由基因組DNA得到的NGF和BDNF兩個(gè)序列的放大合成簡(jiǎn)并型合成寡核苷酸引物，相當(dāng)于在NGF和BDNF之間氨基酸序列保守性的部分因盒1和基因盒2(參閱上面5.8節(jié))，并用于用大鼠基因組DNA作模板的PCR反應(yīng)中。確切引物的序列如下簡(jiǎn)并性位置，在寡核苷酸合成步驟中包括有2個(gè)或多個(gè)堿基的混合物，在括弧中表示;下面有劃線的斜體字表明具有多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶分裂位點(diǎn)的尾端，這些位點(diǎn)在隨后的克隆步驟中便于與載體的連接;A＝腺嘌呤，G＝鳥嘌呤，C＝胞嘧啶，T＝胸腺嘧啶，N＝A，G，G，T的混合物)基因盒1(有義)，引物1B5′-GACTCGAGTCGACTCGGTGTG(C，T)GACAG(C，T)(A，G)T(C，T，A)AG-3′基因盒2(反有義)，引物2C5′-CCAAGCTTCTAGAATTCCA(C，T)TT(N)GT，(C，T)TC(A，G)(A，T)A(A，G)AA(A，G)，TA(C，T)TG-3′將300ng的每種簡(jiǎn)并引物混合物加到在100μl用于PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物中的500ng大鼠)基因組DNA中。進(jìn)行35次循環(huán)，每一次包括在94℃保溫1分鐘，在43℃保溫2分鐘，在72℃保溫2分鐘，無(wú)論是BDNF或NGF基因，使用這些引物的PCR放大產(chǎn)物的預(yù)期大小是175個(gè)堿基對(duì)，包括兩個(gè)17-聚的“尾端”(下有劃線的)，包括它們?cè)趦?nèi)是便于下面的克隆步驟。在8%聚丙烯酰胺/5%甘油凝膠上反應(yīng)混合物的電泳產(chǎn)生了該預(yù)料尺寸，175bp的放大DNA的主帶。13.2.2.在各種物種的基因組DNA中與BDNF/NGF探計(jì)互補(bǔ)序列的檢測(cè)通過(guò)電泳淋洗將175bp帶由丙烯酰胺凝膠上洗脫，在與第一次相同的反應(yīng)條件下，進(jìn)行7次循環(huán)的第二次PCR反應(yīng)中進(jìn)一步放大，不同的是dGTP、dATP和TTP的濃度每個(gè)都降低到50μM，并用α-32P-dCTP示蹤物代替沒(méi)有標(biāo)記的dCTP。在分選尺寸柱上進(jìn)行色譜分析從反應(yīng)組成中分離出該輻射標(biāo)記的DNA產(chǎn)物。在用EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶消化后，并在EcoRI-消化的基因組DNA上通過(guò)Southern雜交方法而對(duì)硝基纖維進(jìn)行印跡后，這種被稱為“R1B/2C”(用于由引物1B和2C放大的大鼠DNA)的探針，然后被用于檢測(cè)在各種脊椎動(dòng)物類基因組DNA中的互補(bǔ)序列(在圖13顯示了大鼠)、小鼠和雞的結(jié)果)，結(jié)果示于圖13。含有NGF和BDNF序列的基因組DNA的EcoRI片段的大小是利用輻射標(biāo)記的人NGF和BDNF探針、在并行的一些印跡上對(duì)照測(cè)定的，這些探針是從克隆基因通過(guò)PCR而制備的。NGF和BDNF基因組的EcoRI片段的位置分別示于圖13的N和B。一個(gè)相類似分析的結(jié)果示于圖3，像使用豬BDNF探針一樣使用人BDNF探針?biāo)玫南嗟韧慕Y(jié)果示于圖3。如上所指出的，NGF和BDNF探針，每個(gè)被雜交到不同脊椎動(dòng)物基因組DNA的單獨(dú)一個(gè)EcoRI片段上。例如在大鼠DNA中，BDNF探針檢測(cè)出一個(gè)約8.8kb的帶段，而NGF探針檢測(cè)出一個(gè)約10.4kb的帶段。如在圖13所看出的那樣，在被試驗(yàn)的每個(gè)物種(所示數(shù)據(jù)是對(duì)雞、小鼠和大鼠)中，R1B/2C探針都雜交到一個(gè)與由NGF探針?biāo)b定的帶段不能區(qū)別的DNA帶上，以及雜交到一個(gè)與由BDNF探針?biāo)b定的帶段不能區(qū)分的DNA帶上(在小鼠中，NGF和BDNF基因組EcoRI片段具有同樣的電泳遷移率，相當(dāng)于約11.5-12.0Kp)。這證明簡(jiǎn)并寡核苷酸引物1B和2C能夠用于放大由NGF和BDNF這兩個(gè)基因得來(lái)的序列。值得注目的是，在某些情況下，在用R1B/2C探針雜交的基因組Southern印跡中觀察到一些另外的帶。例如，在EcoRI-消化的小鼠基因組DNA中至少觀察到兩個(gè)另外的既不相當(dāng)于NGF，也不相當(dāng)于BDNF的帶。(分別為約19.0Kb和1.5kb的X1X2)，同樣，在雜交到大鼠DNA中，觀察到至少兩個(gè)另外的帶(分別為約7.3和1.2kb的X1，X2)，在雞DNA中至少有一個(gè)(X，約為2.6kb)。在有些情況下也能觀察到在本圖中沒(méi)有被明顯標(biāo)記的中外一些帶。這些不屬于NGF或BDNF的帶的出現(xiàn)表明有可能存在該基因族的其它成員。同樣，利用其它系列的引物對(duì)和基因組DNA模板發(fā)現(xiàn)了明顯不同于已知含有BDNF和NGF基因序列的帶，(數(shù)據(jù)未列出)。13.2.3.與BDNF和NGF相關(guān)的新基因的鑒別與NGF和BDNF相關(guān)的新基因可以通過(guò)利用簡(jiǎn)并寡核苷酸引物的PCR來(lái)鑒別，這種假說(shuō)的一個(gè)特定實(shí)驗(yàn)是利用基因盒3和4(參閱上面5.8節(jié))的引物以及用小鼠基因組DNA作模板而進(jìn)行的。合成具有以下序列的簡(jiǎn)并引物基因盒3(有義)5′-GGGGATCCGCGGITG(T，C)(C，A)GIGGIAT(T，C，A)GA-3′基因盒4(有義)5′-TCGAATTCTAGATIC(T，G)IAT(A，G)AAIC(T，G)LCCA-3′(G＝鳥嘌呤，A＝腺嘌呤，C＝胞嘧啶，T＝胸腺嘧啶，I＝次黃苷;在寡核苷酸中在單一位置上的多于一個(gè)堿基的混合物示于括弧中)。注意到，在某些與一個(gè)密碼子的第三個(gè)(變位)堿基對(duì)應(yīng)的位置用3次黃苷，讓遺傳密碼簡(jiǎn)并。也有可以使用四個(gè)通常的DNA堿基混合物，而不用次黃苷，用這樣一些引物已得到基本相同的結(jié)果。用簡(jiǎn)并的基因盒3/基因盒4引物對(duì)，由在小鼠DNA中的基因組NGF和BDNF序列的PCR預(yù)料會(huì)放大一個(gè)約90bp的片段。使用上面所示的引物，進(jìn)行4個(gè)退火溫度為45℃的PCR循環(huán)，接著進(jìn)行49℃退火溫度的31個(gè)循環(huán)。通過(guò)凝膠電泳分析產(chǎn)物，觀察到一個(gè)該預(yù)料大小的主帶。在小鼠中，NGF基因在盒3和盒4之間的區(qū)域中含有一個(gè)HindⅡ限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)，而BDNF基因在這一區(qū)域中含有一個(gè)teh酶Apal切割位點(diǎn)。因此，HindⅡ和Apal對(duì)PCR放大產(chǎn)物的消化預(yù)料會(huì)從主要產(chǎn)物帶中消除NGF和BDNF序列。但是，當(dāng)PCR產(chǎn)物用這兩個(gè)限制性酶消化到接近完全時(shí)，則發(fā)現(xiàn)在放大的DNA中持續(xù)有一個(gè)抗消化帶。這就表明，除了NGF和BDNF基因以外，已放大了至少有一個(gè)新的基因。13.2.4.BDNF/NGF基因族中新成員的表征抗-消化的PCR產(chǎn)物從凝膠上洗脫，并在不對(duì)稱的PCR反應(yīng)中用作模板，在該反應(yīng)中存在的任一個(gè)原始的簡(jiǎn)并引物的量高于另一個(gè)引物100倍摩爾。這種不對(duì)稱放大，可生產(chǎn)出適合于通常鏈終止方法進(jìn)行定序分析的單股DNA模板。該新基因(這里命名為“M3/4”，但也被稱為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3)的序列分析是通過(guò)位于盒3和盒4之間的一個(gè)確切引物和在基因轉(zhuǎn)錄文本3′-端的多-A(多聚腺苷酸)序列之間的序列，使用快速放大cDNA末端“(RACE)的方法(由M.A.Frohman.M.K.Dush，和G.R.Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.858998-9002;(1988))，進(jìn)行PCR放大而進(jìn)一步發(fā)展的。DNA定序分析結(jié)果揭示了一種新基因已放大，這種基因包括了一種開(kāi)放式閱讀框架，它能夠編碼一種不同于NGF和BDNF二者，但在氨基酸序列中又與兩者有密切關(guān)系的多肽(圖14)。這種新基因編碼了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的初步證明是通過(guò)用Nathern印跡雜交測(cè)定它在大鼠組織中表達(dá)的方式而得到的。這種分析表明，新基因在腦組織中的表達(dá)要比在任何其它被測(cè)試的組織要強(qiáng)得多。13.3討論如上所示(圖13)，通過(guò)使用盒1和2的引物、用大鼠基因組DNA作模板(R1B/2C)的PCR放大而獲得的DNA探針，除了雜交到那些已知在所測(cè)試的每個(gè)物種的EcoRI-消化的DNA中含有NGF和BDNF基因序列的帶上以外，還雜交到新帶上。對(duì)小鼠基因組DNA，使用一種對(duì)于用盒3和盒4引物放大的新基因有用的放射性標(biāo)記的探針(M3/4)進(jìn)行一個(gè)相似的分析。在每一種情況下，M3/4探針雜交到EcoRI-消化的基因組DNA的一個(gè)單獨(dú)的主帶上，它是不同于已知含有BDNF和NGF序列的帶。應(yīng)注意到，通過(guò)與M3/4探針雜交而觀察到的小鼠、大鼠和雞的基因組DNA的EcoRI片段，在每種情況下，都與通過(guò)與R1B/2C探針雜交而得到的新帶中的一個(gè)相吻合。這些帶在鼠DNA中是19.0kb的EcoRI片段(圖14中的Ⅺ)，在大鼠DNA中是7.3kb的片段(圖14中的Ⅺ)，以及在雞DNA中是2.6kb的帶(在圖14中的Ⅹ)。這表明由大鼠的DNA、使用1B/2C引物對(duì)以及從小鼠的DNA、使用3/4引物對(duì)放大了同樣的基因部分。因此至少有一個(gè)新基因顯然與NGF和BDNF同亨在前面被指出的具有同源性的所有四個(gè)基因盒中的同源性。在NGF、BDNF和該基因族的其它成員(如“M3/4”也被稱為NT-3)之間同源基因盒的概念在這里主要按基本氨基酸序列以及鑒別該族中新基因的方法來(lái)表示的。但是，很重要的是，在這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上、在它們與特異受體的相互作用上，以及對(duì)具有潛在治療價(jià)值的新分子的合理設(shè)想上多半具有另外的聯(lián)系。例如，在NGF中有6個(gè)Cys殘基而且所有這6個(gè)殘基已被表明包括在二硫化物鍵中。從最N-末端到最C-末端來(lái)數(shù)Cys1-cys6，已經(jīng)知道二硫化物橋接包括Cys1-Cys4、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6。全部6個(gè)Cys殘基被保留在NGF和BDNF之間，而且3個(gè)Cys殘基在至今被定序的“M3/4”中的位置正好與NGF和BDNF的Cys4、Cys5、Cys6一樣排列。這就使人想到，該基因族全部成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能是緊密相關(guān)的，并主要由保留的Cys殘基決定。應(yīng)當(dāng)注意到，對(duì)BDNF和NGF所指出的同源基因盒包括了這6個(gè)Cys殘基中的5個(gè)(Cys1在盒1，Cys2在盒2，Cys3在盒3，Cys5和Cys6在盒4)。這支持了這樣的想法，即這些Cys殘基和它們緊接的“鄰居”在決定這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的一般結(jié)構(gòu)中起著重要作用。對(duì)每個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與高親和性受體特異相互作用的結(jié)構(gòu)決定子，大概存在于每個(gè)分子的獨(dú)特部分。因此，可以在已描述的四個(gè)同源盒的任何一處，或在分子的其它處，通過(guò)基因族成員之間的重要組合(例如，通過(guò)體外重組、或者通過(guò)直接基因合成)產(chǎn)生新的嵌合基因。這樣的嵌合蛋白由于保留了Cys殘基和其它氨基酸殘基很可能具有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但會(huì)具有新的生物性質(zhì)。例如一種BDNF/NGF嵌合蛋白由于能與BDNF和NGF二種受體相互作用可以是雙功能的。嵌合蛋白由于二聚作用和其它物理-化學(xué)性質(zhì)，也可以不同于母體分子。嵌合蛋白還能起任何一個(gè)母分子的對(duì)抗物作用。基于用于適應(yīng)折疊的關(guān)鍵性“核心”區(qū)的知識(shí)加上對(duì)該區(qū)域與受體的特異性相互作用所需要的信息，可以用BDNF/NGF的活性片段來(lái)設(shè)計(jì)該族的其它新的成員。新的族成員(如“M3/4”)與已知的族成員通過(guò)比較可以用于揭示有助于引導(dǎo)尋找BDNF/NGF基因族其它成員的同源性基因盒。例如“M3/4”與BDNF的比較揭示了某些有用的同源基因盒。特別有意義的一個(gè)同源基因盒是含有第四個(gè)被保留的Cys殘基，唯一沒(méi)有在過(guò)去所指出的盒1-4中的Cys殘基。實(shí)際上存在相當(dāng)長(zhǎng)的完全相同的片段或者存在由BDNF和“M3/4”共有的保守氨基酸取代，其中包括了這種Cys殘基，即His-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys-(Arg或Lys)-Thr(Thr或Ser)-Gln-(Ser或Thr)-Tyr-Val-Arg-Ala-Leu-Thr。在這種區(qū)域內(nèi)，可以選擇至少兩個(gè)同源基因盒用于合成有用的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物(即His-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys對(duì)一個(gè)18-聚引物只需要96次簡(jiǎn)并，或?qū)σ粋€(gè)17-聚引物是48次簡(jiǎn)并;Tyr-Val-Arg-Ala-Leu-Thr，也會(huì)是一個(gè)有用的基因盒)。14.實(shí)例BDNF在成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)的增加14.1.材料和方法14.1.1.細(xì)胞系CHP100，CHP126，CHP134，CHP234，LAN1，LAN5NB9、SY5Y、Y79、F01、BU2、H01、HL60和COL320是保存在FredAlt博士實(shí)驗(yàn)室中的細(xì)胞系，F(xiàn)redAlt博提供了在圖15中Northern印跡中所使用的RNA。全部細(xì)胞系都是人腫瘤的細(xì)胞系。CHP100是一種神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞系;CHP126;CHP134，CHP234，LAN1、LAN5，NB9和SY5Y是成神經(jīng)細(xì)胞瘤的細(xì)胞系;Y79是一種成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的細(xì)胞系;F01，BU2，H01是黑素瘤細(xì)胞系，HL60是一種前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系;COL320是一種神經(jīng)內(nèi)分泌結(jié)構(gòu)癌細(xì)胞系。14.1.2.RNA的制備基本按上面8.1.1節(jié)所描述的那樣制備RNA并使用一種全長(zhǎng)的人cDNA探針進(jìn)行Northern印跡分析。10μg全RNA放在用于產(chǎn)生圖15的Northern印跡凝膠的每一通道中，除了在LAN1中的RNA被較輕地載帶以及對(duì)SYS-Y使用了1微克多(A)+RNA。14.2結(jié)果圖15描述了雜交到由各種人細(xì)胞系得到的RNA試樣盤上的BDNF探針的Northern印跡分析的結(jié)果。在CHP234和LAN5細(xì)胞系中檢測(cè)了大量雜交到BDNF探針上的RNA，發(fā)現(xiàn)在CHP126和CHP134的量較低。所有的陽(yáng)性系都是由人的成神經(jīng)細(xì)胞瘤中產(chǎn)生的。15實(shí)例BDNF-和NGF-mRNA在大鼠海馬中的活性-依賴調(diào)節(jié)關(guān)系是由非-NMDA谷氨酸為中介的15.1材料和方法15.1.1.用紅藻氨酸處理大鼠大鼠在腹膜內(nèi)注射紅藻氨酸12mg/Kg量在90分鐘，常常施用苯甲二氮(安定)以抑制廣泛的活性發(fā)作。如圖19所示，在紅藻氨酸之后給予的安定，并不會(huì)干擾BDNF-和NGF-mRNA含量的進(jìn)一步增加。與在紅藻氨酸之后給予安定的動(dòng)物相比較，沒(méi)有接受安定的大鼠顯示出在紅藻氨酸之后3小時(shí)，在海馬中BDNF-和NGF-mRNA含量的相似增加。15.1.2.海馬培養(yǎng)物的制備海馬是從E17天的鼠胚中制備的，剖割出來(lái)置于37℃下在沒(méi)有鈣或鎂離子、但含有10mM葡萄糖、1mg/ml清蛋白、6μg/mlDNAase和1mg/ml木瓜蛋白酶的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中保溫20分鐘。用沒(méi)有木瓜蛋白酶的該溶液洗滌后，用一支火拋光的巴斯德吸管將海馬細(xì)胞小心地離解。低速離心以收集細(xì)胞，再懸浮在加有10%胎牛血清的DMEM中，并平鋪在預(yù)先用多-DL-鳥氨酸(0.5mg/ml)和昆布氨酸(5μg/ml)涂覆的塑料培養(yǎng)皿(0.5×106細(xì)胞/35mm)中。平鋪3小時(shí)后，培養(yǎng)基換成沒(méi)有血清的、但含有按Brewer和Cotman(BrainRes.497∶65，1989)所描述的添加劑、但刪去谷氨酸的培養(yǎng)基。神經(jīng)元在培養(yǎng)基中直至3個(gè)星期仍保持存活，并通常在平鋪后第7天用于實(shí)驗(yàn)。15.1.3.RNA的放大按照Chomcynski和Sacci(Anal.Biochem.1987，162∶156-159)所描述的，由0.5×106細(xì)胞，在加入一種縮短的NGFcRNA回收標(biāo)準(zhǔn)物(30fg)后，提取全細(xì)胞RNA。NGFmRNA和cRNA是在一合并的單一試管反轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈反應(yīng)(RT/PCR)中進(jìn)行共放大，該試管含有1/5提取的RNA，1×RT/PCR緩沖液(10mMTris-HClpH8.3，50mMKCl，1.5mMMgCl20.1mg/ml明膠，0.1%TritonX-100)，0.25mMdNTP，0.1μM每種5′和3′引物，5URNasin(Promega)，3.2UAMV-反轉(zhuǎn)錄酶(LifeScience)和2UTaq聚合酶(Genofit)，其總體積為25μl。混合物用無(wú)機(jī)油覆蓋，并在41℃保溫30分鐘。60秒鐘加熱到92℃，引物在55℃退火60秒鐘以及引物在72℃延展60秒鐘。該放大產(chǎn)物(對(duì)NGFmRNA是203bp，而對(duì)回收標(biāo)準(zhǔn)物是153bp)在一個(gè)3%Nusieve/瓊脂糖為3∶1的凝膠(FMC.Bioproducts)上分離，在HybondN加上膜(Amersham)進(jìn)行堿-印跡分析并所述(HeumannR.和Thoenen，H.，1986，J.Biol.Chem.261;9246;Lindhold等人，1988，J.Biol.Chem.26316348)進(jìn)行雜交，為了絕對(duì)鑒定，已知量的體外轉(zhuǎn)錄NGFmRNA和回收標(biāo)準(zhǔn)物在平行的反應(yīng)中被共放大。近來(lái)，由Wang等人(PNAS86;9717-9721，1989)描述了一個(gè)類似的方法。15.2結(jié)果和討論BDNF和NGF都是一個(gè)基因族的成員，具有約50%氨基酸的同一性(Leibrock等人，1989，Nature，341149)。這些分子具有嚴(yán)格保留區(qū)域。在這些區(qū)域中含有6個(gè)半胱氨酸殘基，很可能與這些分子的對(duì)其生物活性是必需的三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。但是，在BDNF和NGF中也有一些決定了它們不同的神經(jīng)元特異性的不同區(qū)域(Lindsay等人，1985，Dev.Biol112∶319;Johnson等人，1986，J.Neurosci.6∶3031;Hofer.M.和Barde，Y.1988，Nature331∶261;Rodriguez-Tebar等人，1989，Dev.Biol.136∶296)。而且，這兩個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性分子之間的區(qū)別也由它們的合成位置表明。NGF在外周(Korsching，S.和Thoenen，H.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80∶3513;Ebendal等人，1983，Exp.CellRes.148∶311;Heumann等人，1984，EMBOJ.3∶3183;Dhelton，D.L.和Reichardt，L.F.，1984，.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81∶7951)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)(Korsching等人，1985，EMBO.J.4∶1389;Shel-ton，D.L.和Reichardt，L.F.1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83∶2714;Whittemore等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83817;Large等人，1986，Science234352)兩者中被表達(dá)。由NGF-應(yīng)答神經(jīng)元神經(jīng)支配的密度反映了相應(yīng)靶組織中的NGF的含量(Korsching，S.和Thoenen，H.1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80∶3513;Ebendal等人，1983，Exp.CellRes.148∶311;Heumann等人，1984，EMBOJ.3∶3183;Dhelton，D.L.和Reichardt，L.F.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.s.A.81∶7951;korsching等人，1985，EMBOJ.4∶1389;Shelton，D.L.和.Reichardt，L.F.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83∶2714;Whittemore等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83∶817;Large等人，1986，Science234∶352)。與NGF對(duì)照，BDNF主要在神經(jīng)元的CNS中表達(dá)，并且BDNF-mRNA的含量顯著高于NGF-mRNA的含量，例如，在海馬中約50倍。在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，NGF是由各種非-神經(jīng)元細(xì)胞的類型所合成(Bandtlow等人，1987，EMBOJ.6∶891)，而在腦中，正如由就地雜交所證明的，它主要是位于神經(jīng)元(Rennert，P.D.和Heinrich，G.，1986，Biochem.Biophys.Res.Commun.138∶813;Ayer-LeLievre等人，1988，Science240∶1339;Whittemore等人，1988，J.Neurosci.Res.20403)，然而，所培養(yǎng)的1型呈膠質(zhì)細(xì)胞也已表明產(chǎn)生顯著量的NGF(Lindsay，R.M.1979，Nature282∶80;Furukawa等人，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.142395)。神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)在腦中合成NGF的相對(duì)作用至今尚不知道。由于BDNF-和NGF-mRNA兩者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中占優(yōu)勢(shì)的表達(dá)。我們研究了這兩個(gè)mRNA的含量是否受神經(jīng)元活性所影響，如果是這樣，則其傳遞介質(zhì)很可能與調(diào)節(jié)有關(guān)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)系列中，我們從胚胎大鼠(E17)海馬中制備神經(jīng)元培養(yǎng)物。如圖16a中所示，用高鉀(50mM)液對(duì)海馬神經(jīng)元去極化，導(dǎo)致BDNF-mRNA的增加。在增加高鉀濃度后3和6小時(shí)之間達(dá)到了最大含量，這種由鉀為中介的BDNF-mRNA的增加可以通過(guò)從培養(yǎng)基中除去鈣離子而受到抑制并且它也因鈣通道阻斷劑利心平(nifedipin)而抑制鈣注入面降低(圖16b)。因?yàn)樗玫暮ｑR培養(yǎng)物由呈現(xiàn)不同的傳遞介質(zhì)和受體表達(dá)方式的神經(jīng)元的混合群體組成，我們研究了各種生理的和合成的受體興奮劑對(duì)BDNF-和NGF-mRNA表達(dá)的影響。列于表Ⅵ的結(jié)果表明了在全部被試驗(yàn)的物質(zhì)中，紅藻氨酸、一種谷氨酸鹽的受體興奮劑(Monagham等人，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29365)，在馬神經(jīng)元中產(chǎn)生的BDNF-mRNA增加量最大。對(duì)照之下，其它的分子，如碳酰膽堿(一種蕈毒鹼受體興奮劑)以及在更少程度上的組胺和舒緩激肽，對(duì)BDNF-mRNA提高較少，但也有明顯量(表Ⅵ)。因?yàn)樵诤ｑR神經(jīng)元中NGF-mRNA的含量是非常低的，所以我們建立了一個(gè)適宜于測(cè)定NGF-mRNA變化的定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法。用這個(gè)方法，我們發(fā)現(xiàn)，在海馬神經(jīng)元中通過(guò)鉀和紅藻氨酸也可以增加如BDNF-mRNA、NGF-mRNA的含量(圖17)。如圖18所示，用約25μM紅藻氨酸在海馬神經(jīng)元中得到BDNF-mRNA的最大增加量。紅藻氨酸濃度的再增加導(dǎo)致BDNF-mRNA含量的減少，這極可能反映了高濃度紅藻氨酸對(duì)海馬神經(jīng)元的毒性作用(圖18)。對(duì)各種中樞神經(jīng)元，在使用興奮性氨基酸谷氨酸鹽的類似物后，以前已報(bào)導(dǎo)過(guò)(Choi等人，1987，J.Neurosci.7∶357，RothmanS.M.和Olney，J.W.1987;TrendsNeurosci.10∶299;Choi.D.W.1988.Neuron1∶623)有一種谷氨酸鹽受體-中介的神經(jīng)中毒。但是為增強(qiáng)BDNF-和NGF-mRNA在海馬神經(jīng)元中的表達(dá)所必需的紅藻氨酸濃度可以清楚地與導(dǎo)致神經(jīng)中毒的濃度分開(kāi)。為了更詳細(xì)地研究紅藻氨酸的作用，我們研究了BDNF-mRNA的增加是否會(huì)被任何已知的谷氨酸鹽受體對(duì)抗物阻斷(Monaghan等人，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol29∶365)，犬尿喹啉酸，一種廣譜的谷氨酸鹽受體的對(duì)抗物，以及CNQX，一種非NMDA受體的競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑(Monaghan等人，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29∶365)完全阻斷了在海馬神經(jīng)元中紅藻氨酸引導(dǎo)的BDNF-mRNA的增加(表Ⅶ)。另一方面，專門阻斷NMDA受體的MK801，在阻斷這些神經(jīng)元中的BDNF-mRNA的升高中無(wú)效。而且，NMDA本身并不改變BDNF-mRNA的含量(表Ⅵ)。這表明紅藻氨酸通過(guò)它的受體直接起作用而且其作用并不是歸于釋放內(nèi)生的谷氨酸(它也作用于NMDA受體)。因此可以斷定，紅藻酸在體外通過(guò)非-NMDA谷氨酸受體而提高BDNF-mRNA。表Ⅵ各種受體興奮劑對(duì)BDNF-mRNA在培養(yǎng)神經(jīng)元中的表達(dá)的影響加入物對(duì)照的%沒(méi)有100±5碳酰膽堿(50μM)220±25碳酰膽堿(50μM+阿托品(10μM)85±15煙堿(100μM)110±7組胺(50μM)150±12血清素(100μM)95±6多巴胺(100μM)115±7降腎上腺素(25μM)75±10物質(zhì)P(1μM)85±9生長(zhǎng)激素抑制素(1μM)110±8緩激肽(1μM)155±15紅藻氨酸(25μM)1365±70NMDA(25μM)105±10表Ⅶ不同谷氨酸受體的對(duì)抗物對(duì)紅藻氨酸誘導(dǎo)的BDNF-mRNA表達(dá)的影響加入物對(duì)照的%沒(méi)有100±60紅藻酸(25μM)1250±60犬尿喹啉酸(1mM)70±6犬尿喹啉酸(1mM)+紅藻氨酸(25μM)84±7CNQX(10μM)109±6CNQX(10μM)+紅藻氨酸(25μM)105±7MK-801(5μM)96±5MK-801(5μM)+紅藻氨酸(25μM)1130±80為評(píng)估我們體外觀察結(jié)果的生理學(xué)意義，我們研究了在體內(nèi)是否也進(jìn)行著類似的機(jī)理。我們按12mg/Kg量的紅藻氨酸處理重180-200g的成年兩種性別的Wistar大鼠。在不同時(shí)間周期后，我們通過(guò)Northern印跡分析測(cè)定了在海馬和皮質(zhì)中BDNF-和NGF-mRNA的變化。圖19表明，紅藻氨酸誘發(fā)了在兩個(gè)腦區(qū)域中BDNF-和NGF-mRNA含量的增加。BDNF-mRNA的增加明顯大于NGF-mRNA中的增加。而且，在紅藻氨酸給藥后長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)的時(shí)間里，mRNA的量仍然增加。BDNF-和NGF-mRNA變化的時(shí)間進(jìn)程表明，在海馬中達(dá)到最大增加是在紅藻氨酸給藥后約3小時(shí)(圖19)。很有興趣地注意到，C-for-mRNA的增加先于海馬中BDNF-和NGF-mRNA的增加;這兩種現(xiàn)象可能是有因果關(guān)系的，正如最近表明的損傷后的坐骨神經(jīng)情況一樣(Hengerer等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87.3899)。而且，與海馬中的增加相比較，在大腦皮層中BDNF-和NGF-mRNA兩者的增加有一個(gè)延遲，這表明導(dǎo)致BDNF和NGF加強(qiáng)表達(dá)的信號(hào)是由海馬傳播到其它的腦區(qū)域。這種觀察結(jié)果與以前的報(bào)導(dǎo)(Morgan等人，1987，Science237∶192)是一致的，該報(bào)導(dǎo)表明由驚厥劑(Convulsant)戊四唑誘發(fā)的C-fos的增加首先在海馬中發(fā)生然后再在皮層發(fā)生。在前面的研究給出了NMDA受體與海馬mRNA例如NGFI-A(Cole等人，1989，Nature340∶474)的調(diào)節(jié)有關(guān)的證明后，我們?cè)傺芯縉MDA受體對(duì)抗物MK801和氯胺酮(Ketamine)是否能阻斷體內(nèi)BDNF-和NGF-mRNA的增加。然而，肯定了我們體外的結(jié)果，MK801，并不抑制紅藻氨酸引導(dǎo)的海馬BDNF-mRNA的增加，雖然它有效地抑制了由NMDA受體活化引起的發(fā)作(圖20)。最有可能這種NMDA受體活化是由紅藻氨酸釋放內(nèi)生的谷氨酸引起的(Biziere，K.和Coyle，T.，Neurosci，1978，Lett.，8∶303;McGeer等人，1978，Brain.Res.139∶381)。同樣，海藻氨酸處理后在海馬中NGF-mRNA的增加既不被MK801阻斷也不被氯胺酮阻斷。在一個(gè)過(guò)去的研究(Gall.C.M.和IsacksonP.J.1989，Science245∶758)中，它表明，引起邊緣發(fā)作的電解損傷提高了大鼠海馬中的NGF-mRNA。然而，本發(fā)明用MK801和紅藻氨酸所得的結(jié)果表明了在誘導(dǎo)發(fā)作和增加BDNF和NGF的表達(dá)之間的明顯無(wú)關(guān)。在紅藻氨酸注射以前用苯甲二氮(安定)處理大鼠，完全阻斷了大鼠海馬中BDNF-和NGF-mRNA的增加(圖20)。苯甲二氮對(duì)BDNF-和NGF-mRNA增加的阻斷效應(yīng)最有可能是由于通過(guò)抑制GABAergic系統(tǒng)而抑制神經(jīng)元活性引起的。但是在紅藻氨酸給藥90分鐘后(即抽搐開(kāi)始后約30分鐘);BDNF-和NGF-mRNA的增加不再被苯甲二氮所阻斷，這表明一個(gè)相當(dāng)短的增加活性期會(huì)足以開(kāi)始導(dǎo)致兩個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子的mRNA表達(dá)增加的級(jí)聯(lián)過(guò)程。本發(fā)明表明，非-NMDA受體可以與海馬中BDNF-和NGF-mRNA的調(diào)節(jié)有關(guān)，因此這種調(diào)節(jié)機(jī)制與過(guò)去Cole等人(Cole等人，1989，Nature，340474)描述的調(diào)節(jié)機(jī)制區(qū)別開(kāi)來(lái)，Cole描述的機(jī)制斷定，編碼早期基因的海馬mRNA似乎是通過(guò)谷氨酸受體的NMDA-亞型(subtype)被調(diào)節(jié)。已有報(bào)導(dǎo)，紅藻氨酸對(duì)神經(jīng)元的某些作用也能夠由谷氨酸受體的使君子氨酸(quisqualate)型所引導(dǎo)(MOnaghan等人，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29∶365)。總之，本研究表明，神經(jīng)元活性調(diào)節(jié)了在大鼠海馬和皮層中編碼了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子BDNF和NGF的mRNA的含量。在所有被試驗(yàn)的物質(zhì)中，通過(guò)對(duì)非-NMDA谷氨酸受體起作用的紅藻氨酸在體內(nèi)和在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物中提高了BDNF-和NGF-mRNA兩者。相形之下，在外周，沒(méi)有證據(jù)說(shuō)明在非神經(jīng)元細(xì)胞中的NGF合成是由通常的傳導(dǎo)物質(zhì)或由神經(jīng)支配(NGF應(yīng)答)的神經(jīng)元所釋放的神經(jīng)肽來(lái)調(diào)節(jié)的(Barth等人，1984，J.Cell.Biol.99∶839;Hellweg等人，1988，Exp.CellRes.179∶18)。BDNF主要在CNS中表達(dá)，在使用谷氨酸作為神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)的中心通道和表明具有比較豐富BDNF-和NGF-mRNA的區(qū)域之間至少有部分的重疊(Hofer等人，EMBOJ.在印刷中;Managham等人，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29∶365)。特別是如就地雜交所表明的，NGF-mRNA的分配(Hofer等人，EMBO.J.在印刷中)和由海馬、大腦皮層和小腦中的放射自顯影照片中所見(jiàn)到的紅藻氨酸受體(Monaghan等人，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.29∶365)之間有明顯的相似性。觀察結(jié)果和谷氨酸是CNS中調(diào)節(jié)BDNF-和NGF-mRNA的生理傳導(dǎo)物質(zhì)的解釋是一致的。例16腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子提高培養(yǎng)基中大鼠膈膽堿能神經(jīng)元的存活及分化功能16.1.原料及方法16.1.1.分離細(xì)胞的制備及細(xì)胞培養(yǎng)條件將妊娠7天的大鼠(Sprague-Dawley)解剖，使其體內(nèi)的中隔區(qū)與周圍的組織分開(kāi)，將組織片段合并在一起，用Ham氏F-10溶液洗滌三次，然后，將它轉(zhuǎn)移到35mm組織培養(yǎng)皿上并將它弄碎，通過(guò)用0.25%胰蛋白酶將該組織在37℃下培養(yǎng)20分鐘，從而形成一個(gè)單細(xì)胞懸浮液，通過(guò)在含有50μg/ml1型(Sigma公司)脫氧核糖核酸酶生長(zhǎng)介質(zhì)中，在室溫下培養(yǎng)5分鐘，使胰蛋白酶失活以后，接著通過(guò)將這些片段反復(fù)通過(guò)巴斯德吸管的狹窄頂部將這些細(xì)胞分離，然后將該分離細(xì)胞以500xg速率離心45秒，除去上清液，并兩次離心，將松散的細(xì)胞沉淀，再次懸浮于生長(zhǎng)介質(zhì)中，并與之結(jié)合，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)量，最后，將該細(xì)胞放入事先已涂覆聚鳥氨酸(10μg/ml)和昆布氨酸(10μg/ml)的6毫米小孔中，在培養(yǎng)24小時(shí)后，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞排除臺(tái)盼藍(lán)的能力，檢測(cè)該細(xì)胞的存活力。用于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)組成培養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)介質(zhì)，5HS/N3是在Dulbeuo的改性Eagle化介質(zhì)(DMEM)中含有5%(體積/體積)馬血清(GibCo)，1%N3添加物(體積/體積)(Romijn等人，1982，Dev.BrainRes.2583-589)，0.5%(體積/體積)谷氨酰胺(200mM，GibCo)和0.25%(體積/體積)青霉素-鏈霉素(分別為10，000單位/ml，10，000mcg/ml，GibCo)。在放置5到6小時(shí)以后，用一種含有1%N3添加物，0.5%谷氨酰胺和0.25%青霉素和鏈霉素的DMEM取代該生長(zhǎng)介質(zhì)，從而制得富集神經(jīng)元的培養(yǎng)物，在這兩種條件下，用胞嘧啶阿拉伯糖苷進(jìn)行處理(1μM，24小時(shí))來(lái)限制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。16.1.2.膽堿能轉(zhuǎn)乙酰酶活性的測(cè)定用100μlPBS將該細(xì)胞沖洗兩次從培養(yǎng)物中除去生長(zhǎng)介質(zhì)，通過(guò)一次凍-熔循環(huán)并在pH為6.7，含有200mMNaCl和0.25%(體積/體積)TritonX-10050mMKH2PO4緩沖液中在37℃下培養(yǎng)15分鐘，將該細(xì)胞溶解。取出兩微升細(xì)胞溶解產(chǎn)物，并根據(jù)微量-Fonnum方法(Fonnum，F(xiàn)，1975.J.Neurochem.24∶407-409)測(cè)定其CAT活性。最終的底物組合物由在50mMNaH2PO4(pH7.4)緩沖溶液中的0.2mM[14C]乙酰輔酶A(NEN;54.4mCi/mmol)300mMNaCl，8mM溴化膽堿，20mM乙二胺四乙酸和0.1mM新斯的明組成。在這些酶和底物濃度下，該酶促反應(yīng)延持90-120分鐘，通過(guò)在測(cè)試期間加入CAT活性特異抑制物，N-羥乙基-4-(1-萘乙烯基)吡啶姆(HNP)，對(duì)膽堿轉(zhuǎn)乙酰酶誘導(dǎo)的特異性進(jìn)行測(cè)試(White，H.L和Cavallito，C.J.1970，J.Neurochem.17∶1579-1589)。16.1.3.乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的測(cè)試用有一些改進(jìn)的Potter法(Potter，L.T.，1967，J.PharmacologyandExperimentalTherapeutics，156∶500-506)和Johnson與Russell法(Johnson，C.D.和RussellR.L.1975，Anal.Biochem.64∶229-238)測(cè)定存在于在該細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的AChE的含量。將在含有200mMNaCl和0.25%(體積/體積)TritonX-100的50mMKH2PO4緩沖液(pH6.7)中制備的溶胞產(chǎn)物與在50mMKH2PO4(PH7.0)中的[3H]碘化乙酰膽堿(NENNET-113，73.3mCi/毫摩爾)，愛(ài)普把嗪(0.1mM)相結(jié)合在37℃下培養(yǎng)15分鐘以后，通過(guò)加入100μl終止緩沖溶液使反應(yīng)終止，該終止緩沖溶液含有1M氯乙酸，0.5MNaOH和2.0MNaCl。在有1.0(10-6)M新斯的明存在的條件下，測(cè)定出具體的AChE活性。16.1.4.高親和性膽堿攝取量的測(cè)定基本上用Vaca和Pilar1979年的方法(Vaca，K.和Pilar，G.，1979，J.Gen.Physiol.73605-628)通過(guò)高親和性”依賴Na+的機(jī)制測(cè)量膽堿攝取量，用100μlHam氏F-10溶液將該細(xì)胞洗滌一次，然后再用100μlTyrodes溶液沖洗，再用含有25mM鉀的Tyrodes溶液引起的去極化作用10分鐘以后，將該細(xì)胞與在常用的含Na+或Li+的Tyrades中的[3H]膽堿(NEN，NET-109，0.11μM，86.7Ci/mmol)一起在室溫下培養(yǎng)20分鐘。用PBS沖洗該細(xì)胞兩次，使攝取反應(yīng)終止，通過(guò)用100微升，含有1N甲酸的冷丙酮將該培養(yǎng)物培養(yǎng)至少20分鐘將所累積的膽堿提取出來(lái)，然后收取其所溶部分并計(jì)數(shù)，總含量與和Na+無(wú)關(guān)的膽堿吸收量之差就是具體的膽堿吸收量。16.1.5乙酰膽堿酯酶的組織化學(xué)染色用改進(jìn)的Geneser-Jensen和Blackstadt染色法(1971，Z，Zell-forsch.114∶460-481)對(duì)乙酰膽堿酯酶進(jìn)行組織化學(xué)染色來(lái)鑒別膽堿能細(xì)胞，該培養(yǎng)基在4%多聚甲醛中固定化后，在有以下組成的AChE底物溶液存在下，將該細(xì)胞在4℃下培養(yǎng)5-6天，該底物溶液由在50mM乙酸鹽緩沖溶液中(PH5.0)的4mM碘化乙酰硫代膽堿，2mM硫酸銅，10mM甘氨酸和10μg/ml明膠組成。如前所述(Hartikka，J.和Hefti，F(xiàn).，1988，J.Neruosci.8∶2967-2985)實(shí)現(xiàn)了多反應(yīng)產(chǎn)物的目視觀察。16.1.6NGF-受體的免疫組織化學(xué)染色用DMEM將培養(yǎng)物洗滌兩次，然后用4%多聚甲醛固定，用一種含有5%牛血清蛋白，0.02%TritonX-100和5%蔗糖pH為7.4的磷酸鈉緩沖微處理該細(xì)胞3-4小時(shí)(HartikkaJ.和Hefti，F(xiàn).1988，J.Neurosci，8∶2967-2985)，用單克隆抗體192-IgG檢測(cè)(Taniuchi，M.和Johnson.E.1985.J.Cell.Biol.101∶1100-1106;Chandler等人，1984.J.Biol.Chem.259∶6882-6889)并在含有5%馬血清的緩沖溶液中以1∶1000的稀釋度檢測(cè)NGF-R，用該稀釋的抗體將該培養(yǎng)物在4℃培養(yǎng)15-18小時(shí)，用生物素化的馬抗小鼠IgG(1∶200載體)對(duì)結(jié)合的小鼠免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)，用3′，3′-二氨基聯(lián)苯胺作為結(jié)合過(guò)氧化物酶的底物來(lái)識(shí)別該免疫反應(yīng)性細(xì)胞。16.1.7.BDNF和NGF的純化根據(jù)以前公開(kāi)的方法(Barde等人，1982，EMBO.J.1∶549-553;Lindsay等人，1985。Dev.Biol.112∶319-328)對(duì)由豬腦中提取的BDNF，以及由雄性小鼠下頜下腺提取的NGF進(jìn)行提純，用于這些研究的重組BDNF以前已被詳細(xì)說(shuō)明(Maisonpierre等人1990，Science.247∶1446-141)16.2結(jié)果在涂覆聚鳥氨酸-昆布氨酸的孔上，中膈細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生了精細(xì)的軸突生長(zhǎng)物，這些細(xì)胞中有許多細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)顯現(xiàn)出一種特征的神經(jīng)元相-明亮體(圖21A和B)，連續(xù)的神經(jīng)軸突生長(zhǎng)物導(dǎo)致細(xì)胞間接觸范圍在體外第二天到第4天以后，增加(比較圖21c，D和E、F)正如由存在無(wú)光澤的相-暗的細(xì)胞所表明的那樣，甚至在4天以后，在該培養(yǎng)物中仍然只有極少量的非神經(jīng)元細(xì)胞，為了分析BDNF對(duì)培養(yǎng)基中的中膈膽堿能神經(jīng)元存活的影響，對(duì)AChE進(jìn)行組織化學(xué)染色以及多NGF-受體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，圖21G、H顯示了AChE陽(yáng)性神經(jīng)元的典型形態(tài)，圖21I中顯示了幾種NGF-受體陽(yáng)性神經(jīng)元。如圖22A所示在胚胎大鼠膈細(xì)胞的低密度培養(yǎng)基(細(xì)胞濃度在66，700，-133，300細(xì)胞/cm2之間)中BDNF引起AChE陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量增加2.4倍。在相同的細(xì)胞密度下，NGF的影響要稍小些(1.9倍)由于發(fā)現(xiàn)BDNF和NGF均能導(dǎo)致在膈細(xì)胞培養(yǎng)基中AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的增加，這就促使我們?nèi)z測(cè)這兩種因子是否作用于相似或不同的神經(jīng)元群。如圖22A中第三條所示，同時(shí)加入飽和量的BDNF和NGF并不引起比單獨(dú)用其中任何一種所看到的AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目更大的增加。就神經(jīng)元的存活而言，這些結(jié)果告訴我們，大鼠膈細(xì)胞培養(yǎng)物中應(yīng)答B(yǎng)DNF或NGF的膽堿能神經(jīng)元必定是很大程度上重疊的神經(jīng)群體。BDNF對(duì)AChE陽(yáng)性神經(jīng)元存活的影響取決于被生長(zhǎng)細(xì)胞的密度(圖22A)，在高鋪放密度時(shí)(200，000-266，000細(xì)胞/cm2)，不論單獨(dú)的BDNF或BDNF與NGF相結(jié)合均能使表達(dá)AChE的神經(jīng)元數(shù)量增加，這可能是由于提高了內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性含量，或者是由于更高細(xì)胞密度出現(xiàn)的細(xì)胞與細(xì)胞接觸增加引起的存活促進(jìn)作用。在細(xì)胞密度低時(shí)，AChE陽(yáng)性細(xì)胞量以BDNF濃度的函數(shù)形式而增加。在濃度為10ng/ml時(shí)，觀察到最大響應(yīng)，此時(shí)的AChE陽(yáng)性細(xì)胞/孔數(shù)量從對(duì)照值169.2±12.9增加到處理過(guò)的培養(yǎng)物中的388.0±26.2(增加2.5倍)。比較起來(lái)，50ng/ml時(shí)，觀察到對(duì)NGF的最大反應(yīng)，此時(shí)AChE陽(yáng)性細(xì)胞/孔從121.0±7.6增加到231.7±12.9(增加1.9倍)。對(duì)于BDNF和NGF，其響應(yīng)曲線中的平穩(wěn)段似乎均是穩(wěn)定的，因?yàn)楫?dāng)劑量高達(dá)100ng/ml時(shí)，AChE陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目沒(méi)有下降。很顯然，在低密度培養(yǎng)物中，BDNF和NGF均能增加用AChE組織化學(xué)法檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)，這種增加有可能是由于解救了在無(wú)生長(zhǎng)因子存在的培養(yǎng)基中膽堿能細(xì)胞的死亡，由于補(bǔ)充了前體細(xì)胞，或由于誘導(dǎo)了膽堿能標(biāo)志物AChE。為了區(qū)分出這些可能性，在一系列總共維持12天的培養(yǎng)物中進(jìn)行了一些延緩添加的試驗(yàn)(圖23)，將一組在鋪放后處理5-6小時(shí)的培養(yǎng)物在BDNF或NGF存在下保持12天，而第二組培養(yǎng)物在前5天沒(méi)有生長(zhǎng)因子，而在最后7天用BDNF或NGF處理(-5/+7)，比較這兩種培養(yǎng)物時(shí)，5天后加入NGF或BDNF的反應(yīng)與一直在生長(zhǎng)因子存在下生長(zhǎng)的細(xì)胞的完全相似(比較圖23中的實(shí)心的條利側(cè)陰影線的)。但是BDNF或NGF僅于最后5天(-7/+5)存在的第三組培養(yǎng)物的結(jié)果明顯地有差別，在這些條件下，不論NGF還是BDNF均不能提高AChE陽(yáng)性細(xì)胞量。在其它的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將膈神經(jīng)元與NGF或BDNF只接觸3-4天就足以使AChE酶活性有大量的增加，從而可以通過(guò)AChE染色法檢測(cè)這些細(xì)胞。因此，在“-7/+5”培養(yǎng)物中沒(méi)有得到AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的可察覺(jué)的增加并非是由于與生長(zhǎng)因子接觸的時(shí)間太短，不足以誘發(fā)AChE陽(yáng)性細(xì)胞。在體內(nèi)(Montero，C.和Hefti，F(xiàn).1988，J.Neurosci.8∶2986-2999;Higgins等人，1989，Neuron.3∶247-256)以及在體外，人們均已發(fā)現(xiàn)，NGF能調(diào)節(jié)其自身受體的含量(以mRNA和蛋白質(zhì)含量計(jì))。由于發(fā)現(xiàn)在膈細(xì)胞培養(yǎng)物中BDNF在膽堿能表現(xiàn)型的誘導(dǎo)及細(xì)胞存活力方面產(chǎn)生與NGF類似的作用，因此，我們對(duì)BDNF調(diào)節(jié)NGF-受體含量(用TgG-192免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目表示)的可能性進(jìn)行了測(cè)試。在濃度為10ng/ml時(shí)，如圖24所示，BDNF使NGF-受體免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增加了3倍。有趣的是，當(dāng)濃度更高時(shí)(25-100ng/ml)，BDNF的作用逐漸地不顯著起來(lái)，因此，該例子中的劑量響應(yīng)與用來(lái)檢測(cè)BDNF對(duì)這些培養(yǎng)物中其它參數(shù)(例如AChE陽(yáng)性細(xì)胞量)影響所觀察到的劑量響應(yīng)明顯不同。用濃度為50ng/ml的NGF處理該細(xì)胞作為一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果，它使陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增加了3倍。因此根據(jù)IgG-192染色結(jié)果，BDNF在向上調(diào)節(jié)NGF-受體的表達(dá)方面與NGF的作用基本相等。除了影響細(xì)胞存活力以外，我們還對(duì)BDNF提高膽堿能表型特征的可能性進(jìn)行了研究。在在有濃度不斷增加直至50ng/ml的BDNF存在的條件下，我們發(fā)現(xiàn)膈細(xì)胞物中CAT活性呈線性增加，如圖25所示，該響應(yīng)特性在參照值的1.8倍處達(dá)到飽和。在用NGF平行進(jìn)行的培養(yǎng)物中，CAT活性的誘導(dǎo)作用在濃度為25ng/ml處達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，其數(shù)量比照值增加3.4倍，當(dāng)濃度是足以產(chǎn)生飽和響應(yīng)的濃度的3倍時(shí)，對(duì)BDNF和NGF的響應(yīng)仍然沒(méi)有出現(xiàn)明顯下降，用BDNF或NGF誘導(dǎo)CAT活性均不會(huì)影響與[N-羥乙基-4(1-萘乙烯基)吡啶姆]HNP無(wú)關(guān)的轉(zhuǎn)化酶活性。由于BDNF和NGF均能引起膈細(xì)胞培養(yǎng)物中的CAT活性增加，。因此，我們研究了同時(shí)用這兩種因子處理時(shí)的響應(yīng)(表Ⅷ)，在進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用了兩種BDNF濃度，5和25ng/ml，它們各使CAT活性增加1.4倍和2.6倍，當(dāng)NGF(50ng/ml)(單獨(dú)使用它就能使酶活性增加2.8倍)與BDNF結(jié)合起來(lái)使用時(shí)，CAT活性的水平至少產(chǎn)生一個(gè)疊加的效應(yīng)(表Ⅷ)。在所用的BDNF濃度下，因NGF而引起的疊加作用使酶活性比參照值分別凈增加4.2倍和5.4倍，所測(cè)得的值實(shí)際上要比疊加還要稍高些。表Ⅷ同時(shí)加入BDNF和NGF對(duì)CAT活性的影響濃度(ng/ml)CAT活性%對(duì)照值(pmol/Hr/孔/對(duì)照物561.3±34.8-NGF(50)1546.3±89.7280BDNF(5)768.0±25.4140BDNF(25)1470.1±66.2260NGF(50)+BDNF(5)2767.6±177.2490NGF(50)+BDNF(25)3742.0±669.3670在所指出濃度的營(yíng)養(yǎng)因子存在下，將膈細(xì)胞在5HS/N3中生長(zhǎng)12天后，如前所述地測(cè)定CAT活性，數(shù)值代表了4-5次測(cè)定值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(S.E.M)。對(duì)于用BDNF處理后的生物響應(yīng)是由于以依賴于BDNF的方式釋放內(nèi)源性NGF而引起的可能性進(jìn)行了試驗(yàn)。為了研究這個(gè)問(wèn)題，用了一種NGF的單克隆抗體(抗體27/21，korsching和Thoenen，1983)來(lái)阻塞任何一種與NGF有關(guān)的響應(yīng)。如表Ⅸ所示，NGF對(duì)CAT活性的作用因抗-NGF而大大降低了，而由BDNF誘導(dǎo)的響應(yīng)基本上未受影響，但值得注意的是，與未處理的對(duì)照相比，在單獨(dú)用抗-NGF處理的培養(yǎng)物中的CAT活性的基礎(chǔ)水平降低了20%。不管如何，在膈細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到因BDNF而使CAT活性的增加，看來(lái)是一種直接的作用，而不是由于內(nèi)源性NGF的增加等中介而間接起作用的。表Ⅸ抗-NGF對(duì)NGF和BDNF誘導(dǎo)CAT酶活性能力的影響CAT活性濃度(ng/ml)(pmol/HR/孔)%對(duì)照值對(duì)照物517.53±3.2-BDNF(25)1021.6±106.1197NGF(50)1139.0±99.1220參照物+抗-NGF418.7±27.081BDNF+抗-NGF819.2±68.8158NGF+抗-NGF551.0±27.0107在所指示濃度的營(yíng)養(yǎng)因子存在下，在5HS/N3中生長(zhǎng)12天后，收集這些膈細(xì)胞[鋪放濃度為2.3(105)細(xì)胞/cm2]。按在實(shí)驗(yàn)方法部分中所述的方法測(cè)定CAT活性，數(shù)值代表了6次測(cè)定值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。對(duì)AChE活性和CAT活性一起受BDNF或NGF協(xié)調(diào)地調(diào)節(jié)的可能性進(jìn)行了試驗(yàn)(圖26)。對(duì)照CAT活性濃度直至50ng/ml，AChE對(duì)BDNF或NGF的劑量響應(yīng)特性似乎與線性增加的該酶活性的響應(yīng)是完全相同的。與未處理的對(duì)照相比，NGF和BDNF在該濃度下分別使AChE活性增加274%和234%。對(duì)于BDNF或NGF誘導(dǎo)CAT活性增加的時(shí)間進(jìn)程也進(jìn)行了研究(圖27)，在用50ng/mlBDNF處理過(guò)的培養(yǎng)物中，CAT活性在3天內(nèi)增加到參照值的170%，這種增加一直持續(xù)到第6天，在剩下的試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，CAT活性在高于對(duì)照值2.5倍時(shí)達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)。相比之下，CAT對(duì)NGF(50ng/ml)的響應(yīng)變得更快，在3天內(nèi)，其誘導(dǎo)量即達(dá)到參照值的2.5倍，CAT活性的增加繼續(xù)呈線性，在12天后，其值達(dá)到參照值的3.2倍以上。在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)了一段時(shí)間的星形細(xì)胞已表明還合成了除NGF外的多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性(Lindsay，R.M.1979，Nature282∶80-82;Lindsay等人，1982，Brain.Res.243∶329-343;Alderson等人，1989，Dev.Brain.Res.48∶229-241)。雖然我們已經(jīng)排除了，我們現(xiàn)在對(duì)BDNF的觀察結(jié)果是通過(guò)NGF含量的增加為媒介而間接起作用的，可能性，但可以設(shè)想，BDNF可以通過(guò)調(diào)節(jié)其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)(特別是在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中)，而間接起作用，為了分析非神經(jīng)無(wú)細(xì)胞可能影響B(tài)DNF對(duì)膈細(xì)胞培養(yǎng)物中CAT活性的作用的可能性，我們?cè)诨旌仙窠?jīng)膠質(zhì)-神經(jīng)元培養(yǎng)物中與神經(jīng)元富集培養(yǎng)物中膽堿能神經(jīng)元對(duì)BDNF的響應(yīng)進(jìn)行比較(圖28)，在神經(jīng)元富集培養(yǎng)物中，CAT活性對(duì)BDNF的響應(yīng)呈現(xiàn)一種鐘形曲線;在BDNF劑量為5ng/ml時(shí)，其增加量達(dá)到最大，而當(dāng)BDNF濃度為25ng/ml時(shí)，酶的活性有顯著下降(P＞0.001，將BDNF濃度為15ng/ml的與濃度為25ng/ml的相比)。與圖25中顯示的結(jié)果相類似，在匯合神經(jīng)膠質(zhì)層存在下，CAT對(duì)BDNF的響應(yīng)呈線性的，這種狀態(tài)一直持續(xù)到BDNF濃度為25ng/ml。25ng/ml是試驗(yàn)中所用的最高劑量。在有非神經(jīng)元細(xì)胞存在時(shí)，需要用更高水平的BDNF才能使CAT活性獲得與在經(jīng)過(guò)類似處理的神經(jīng)元富集培養(yǎng)過(guò)程中所獲得的等同的增加。盡管如此，在有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或沒(méi)有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞存在的條件下BDNF在膈膽堿能神經(jīng)元中最大刺激CAT活性的能力是基本相同的。根據(jù)CAT和AChE活性，很顯然，在提高膽堿能表現(xiàn)型標(biāo)志方面，BDNF和AGF起著相似作用。為了對(duì)此作進(jìn)一步研究，將BDNF對(duì)與Na+有關(guān)的，高親和性膽堿攝取量的影響與NGF的進(jìn)行比較(圖29)，在50ng/mlBDNF存在下生長(zhǎng)12天的細(xì)胞能累積的膽堿量是未處理參照物的3.8倍。在平行的培養(yǎng)過(guò)程中，NGT(25ng/ml)能引起膽堿累積量增加2.3倍。16.3討論與BDNF對(duì)外周神經(jīng)元所產(chǎn)生的作用相比(Barde等人1982，EMBO.J.1∶549-553;Lindsay等人，1985，Dev.Biol.112∶319-328;Davies等人，1986，J.Neurosci.6∶1897-1904;Hofer，M.和Barde，Y.，1988，Nature331∶262-262)，BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元特異性尚未被很好地描述，至今唯一已知有響應(yīng)的CNS神經(jīng)元是在E17大鼠視網(wǎng)膜培養(yǎng)物中被首次識(shí)別的Thy-1陽(yáng)性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的一種小的亞群，(Johnson等人，1986，J.Neurosci.6∶3031-3038)。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)BDNF對(duì)外殖體培養(yǎng)物中對(duì)成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響(Thanos等人，1989，Eur.J.Neuro1∶19-26)。在這項(xiàng)研究中，我們表明，BDNF增中了由大鼠胚胎中膈培養(yǎng)出的膽堿能神經(jīng)元的存活力(AChE組織化學(xué)染色法表明)，而且也增加了各種膽堿能表現(xiàn)型標(biāo)志物表達(dá)力，即增加了AChE和CAT的酶活性的高親和性膽堿的攝取量。此外，還發(fā)現(xiàn)BDNF增加了NGF受體在膈細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)。在起始的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)BDNF使E17膈細(xì)胞培養(yǎng)物中的AChE陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目增加大約2倍。與用NGF時(shí)(Hartikka，J.和Hefti，F(xiàn).，1988，J.Neurosci.8∶2967-2985)一樣，這種作用在低細(xì)胞密度時(shí)最明顯，有趣的是，同時(shí)加入NGF和BDNF，并不會(huì)使AChE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比單獨(dú)用任何一種生長(zhǎng)因子所達(dá)到的水平有進(jìn)一步增加這一結(jié)果相當(dāng)有力地表明，BDNF和NFGF主要對(duì)相同的膈膽堿能神經(jīng)元群體起作用。如以前對(duì)NGF所報(bào)導(dǎo)的那樣(Hefti等人，1985，Neuros-cience1∶55-68)，BDNF在細(xì)胞濃度較高的培養(yǎng)物中并不能提高膽堿能神經(jīng)元的存活力，當(dāng)一部分細(xì)胞被放置后，發(fā)現(xiàn)在高細(xì)胞濃度時(shí)的膽堿能神經(jīng)元存活力要比低細(xì)胞濃度時(shí)更高，即使在沒(méi)有任何神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子存在的條件下也是如此。對(duì)這種現(xiàn)象有幾種可能的解釋，這些解釋包括細(xì)胞之間接觸的增加，因非神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量增加而產(chǎn)生的有利影響;或者內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性高于成比例的增加。根據(jù)后一種可能性，我們發(fā)現(xiàn)由于向未處理的高密度培養(yǎng)物中加入過(guò)量的抗-NGF僅減少了20%的基本CAT活性，故沒(méi)有明顯增加內(nèi)源性NGF的跡象。在這些培養(yǎng)物中，內(nèi)源性NGF能使CAT活性增加3、4倍之多。如同在蛋白質(zhì)和mRNA含量中看到的那樣，目前有許多報(bào)導(dǎo)指出，NGF能夠向上調(diào)節(jié)它自己的受體在培養(yǎng)的神經(jīng)元上和體內(nèi)的表達(dá)。在這項(xiàng)研究中，我們用單克隆抗體IgG-192去檢測(cè)NGF-受體，這種單克隆抗體已經(jīng)在大鼠感覺(jué)神經(jīng)元和大鼠腦中被表征(Taniuchi，M，和Johnson，E.，1985，J.CellBiol.101∶1100-1106)，結(jié)果一方面證實(shí)了Hartikka和Hefti的發(fā)現(xiàn)，即通過(guò)測(cè)得IgG-192免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目的增加而表明NGF能在膈細(xì)胞培養(yǎng)物中提高其受體的水平。除此以外，我們還發(fā)現(xiàn)，BDNF能使IgG-192免疫陽(yáng)性細(xì)胞增加3倍以上，對(duì)BDNF的響應(yīng)是兩個(gè)階段的，因?yàn)樵跐舛容^高時(shí)，在濃度范圍為25-100ng/ml時(shí)，BDNF不能引起像在濃度為10ng/ml時(shí)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的增加，有趣的是，這種形式的劑量響應(yīng)特別與用BDNF引起AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目增加時(shí)所看到的劑量響應(yīng)特性十分不同，在后一種情況下，濃度較高時(shí)BDNF的最大作用不會(huì)降低。值得注意的是，最近已發(fā)現(xiàn)低親和性NGF受體也會(huì)以類似的親和力與BDNF結(jié)合，這說(shuō)明NGF和BDNF的低親和性受體可能是相同的(Rodriguez-Tebar等人.1990，BindingofBrain-DerivedNeurotrophicFac-tortotheNerveGrowthFactor-ReceptorNeuron.4，487-492)。BDNF和NGF在誘導(dǎo)AChE活性方面是等價(jià)的發(fā)現(xiàn)表明BDNF和NGF作用機(jī)理上可能的相似性，盡管我們還發(fā)現(xiàn)BDNF能將膽堿能神經(jīng)元存活力提高到與NGF相類似的程度，但BDNF對(duì)CAT酶活性的影響仍不如NGF那么大。在幾次實(shí)驗(yàn)中，用BDNF對(duì)CAT的最大誘導(dǎo)范圍在1.8-2.6倍之間，而用NGF時(shí)通常觀察到3倍以上的數(shù)值。因此，BDNF和NGF雖然在作用機(jī)理上會(huì)存在一些相似之處，但在它們各自受體的表達(dá)和調(diào)節(jié)上，以及將這些受體與誘導(dǎo)CAT活性所必需的第二種信使通道耦合方面，很有可能存在細(xì)小的差別。由BDNF或NGF產(chǎn)生的CAT活性誘導(dǎo)水平之間的差別可能代表了調(diào)節(jié)途徑有差別的假設(shè)，進(jìn)一步為時(shí)間過(guò)程的研究結(jié)果所支持。培養(yǎng)的膈神經(jīng)元對(duì)BDNF發(fā)生響應(yīng)，CAT活性一直增加到第6天，在第6天，響應(yīng)呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)。對(duì)照之下，NGF響應(yīng)特性中CAT活性誘導(dǎo)過(guò)程則顯示出一個(gè)從第3天到第12天的持續(xù)的線性增加。在用BDNF處理的培養(yǎng)物中，CAT活性誘導(dǎo)的增加在第6天停止，可能表示或者BDNF受體或者該響應(yīng)途徑中的一種所需成分表達(dá)發(fā)生了變化。假定在12天后的高密度培養(yǎng)過(guò)程中測(cè)得的膽堿能神經(jīng)元(AChE陽(yáng)性神經(jīng)元)的數(shù)量與內(nèi)源性BDNF或NGF無(wú)關(guān)，則不同神經(jīng)元細(xì)胞的死亡不太可能導(dǎo)致這兩種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)CAT活性的時(shí)間過(guò)程的不同。在最初的，用BDNF處理前腦低部膽堿能細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)基本的細(xì)胞類型即神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)并沒(méi)有假定對(duì)這種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有響應(yīng)。盡管在高度富集外周神經(jīng)元的培養(yǎng)物中進(jìn)行的研究有力地使人想到BDNF直接對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生作用(Lindsay等人，1985，Dev.Biol.112∶319-328;Lindsay，1988.J.Neruosei.T∶2394-2405)，但仍可以認(rèn)為在本項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)的BDNF對(duì)神經(jīng)元的作用有可能是通過(guò)BDNF對(duì)星形神經(jīng)膠質(zhì)或其他非神經(jīng)元細(xì)胞的基本作用而間接引起的，但是發(fā)現(xiàn)在有以星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為主的連生單層存在下，或者在通過(guò)用分裂抑制子胞嘧啶阿拉伯糖苷處理而使神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量被消耗的培養(yǎng)基中，BDNF同樣有效地誘導(dǎo)CAT活性。這些實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)有趣發(fā)現(xiàn)是對(duì)BDNF的劑量響應(yīng)曲線的形狀在這兩種情況下明顯不同，在有神經(jīng)膠質(zhì)單層存在下，對(duì)BDNF的響應(yīng)隨BDNF濃度的遞增呈線性變化。在神經(jīng)元富集培養(yǎng)物中，對(duì)BDNF的劑量響應(yīng)特性左移。這些結(jié)果的一種可能的解釋是該神經(jīng)膠質(zhì)本身可以表達(dá)BDNF受體，從而降低了位于神經(jīng)元上的受體可獲得的配體的有效濃度。作為另一種解釋是星形細(xì)胞的抑制作用可能是間接的、即與配體濃度或受體表達(dá)的作用無(wú)關(guān)，并例如是通過(guò)大量增加BDNF的降解量而間接起作，Hartikka和Hefti(Hartikka，J.和Hefti，F(xiàn).，1988，J.Neurosci.8∶2967-2985)以及Honegger和Lenoir，(Honegger.P.和LenoirD.1982，Dev.BrainRes.3∶229-238)也報(bào)導(dǎo)了類似的觀察結(jié)果。現(xiàn)已證實(shí)，不同腦區(qū)域的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞強(qiáng)烈影響著與這些區(qū)域有關(guān)的神經(jīng)元的形態(tài)(Prochiantz等人，1979，Proc.Natl.AcadSci.U.S.A.76∶5387-5391;Prochiantzetal.1981，Nature293∶570-572)。因此，膈神經(jīng)膠質(zhì)可能具有膈的或分泌的固有特性，該特性起抑制膽堿能表現(xiàn)型表達(dá)的作用。現(xiàn)在，人們正在對(duì)由海馬分離的星形細(xì)胞在類似的試驗(yàn)條件下的調(diào)節(jié)特性進(jìn)行研究。根據(jù)所給出的數(shù)據(jù)，很顯然，BDNF和NGF二者均能提高膈膽堿能神經(jīng)元的功能，推測(cè)一下這兩種顯然作用在單獨(dú)一個(gè)神經(jīng)元群體上的高度同源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之間可能的生理學(xué)上的關(guān)系是十分有趣的，已有的一些建議告訴我們，在外周神經(jīng)元的早期發(fā)育期間，尤其是在背側(cè)根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的亞群體上或其母前體上BDNF-和NGF的作用一開(kāi)始可能是彼此重疊的，然后，后者分離出來(lái)，獨(dú)立地對(duì)不同的細(xì)胞群體起作用(Lindsayetal.，1985，Dev.Biol.112∶319-328;Ersberger，U.andRohrer，H.，1988Dev.Biol.126∶420-432)，Barde，Y.A.1989，Neuron21525-1534)，但是，至今尚未用合適確定感覺(jué)神經(jīng)元亞群的標(biāo)志物以確切地確認(rèn)這一點(diǎn)。由于這項(xiàng)研究集中于在發(fā)育的單獨(dú)一個(gè)時(shí)間點(diǎn)E17上培養(yǎng)物中產(chǎn)生的胚胎膈神經(jīng)元上，因此，在該膈細(xì)胞以后的各個(gè)發(fā)育階段中，有可能發(fā)生類似的分離現(xiàn)象。因此，在膈膽堿能神經(jīng)元對(duì)BDNF或NGF的響應(yīng)中可以證明存在時(shí)間上和空間上的差別?，F(xiàn)在，我們感興趣的是對(duì)于BDNF在體內(nèi)對(duì)前腦底部膽堿能神經(jīng)元的作用進(jìn)行研究，有證據(jù)表明，由海馬獲得的NGF可能與體內(nèi)前腦底部膽堿能神經(jīng)元的正常發(fā)展及維持有關(guān)，弄清BDNF在體內(nèi)是否具有類似的作用是十分有意義的，最近的關(guān)于BDNFmRNA在海馬中特別豐富的發(fā)現(xiàn)支持了這樣一種作用。17例將前期前BDNF酶催轉(zhuǎn)化成有活性的成熟BDNF17.1.原料及方法將從市場(chǎng)上買來(lái)的內(nèi)蛋白酶Arg-C(由小鼠)下頜下腺提取)用于將hBDNF較大的前體形式(前期前BDNF)酶催轉(zhuǎn)化成生物活性的成熟蛋白質(zhì)，該酶催分裂過(guò)程在體外完成，酶催反應(yīng)中的基質(zhì)是在CHO-DG44細(xì)胞中合成的前期前hBDNF，該前期前hBDNF被分泌到細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中并被收集起來(lái)，該培養(yǎng)介質(zhì)由Ham氏F12介質(zhì)(無(wú)核苷)組成，該Ham氏F12介質(zhì)中具有1%胎牛血清(FBS)和各1%的青霉素和鏈霉素。在37℃下，用5個(gè)單位的酶和50μl含有前期前hBDNF的CHO-DG44細(xì)胞上清液將反應(yīng)進(jìn)行5分鐘，在這些條件下，前期前hBDNF分裂成成熟的hBDNF。17.2結(jié)果及討論用內(nèi)蛋白酶Arg-C在體外將前期前體形式的重組hBDNF(大約31，000道爾頓)完全加工成成熟的生物活性hBDNF(大約12，000道爾頓)。重組體人腦獲得的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子已經(jīng)能成功地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(CHO-DG44細(xì)胞)中產(chǎn)生。該hBDNF基因能被穩(wěn)定地整合到CHO細(xì)胞基因組中，而用氨甲嘌呤擴(kuò)增法可以將該hBDNF基因擴(kuò)增，該重組hBDNF被分泌到介質(zhì)中，并被發(fā)現(xiàn)它是有生物活性的。在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(15%凝膠)之前進(jìn)行的代謝標(biāo)記證明，合成的用[35S]標(biāo)記的大多數(shù)hBDNF產(chǎn)物(被分泌到培養(yǎng)介質(zhì)中)均能象具有表現(xiàn)分子量為31，000的前期前體形式那樣遷移(圖30，通道2)。由野生型CHO-DG44細(xì)胞分泌的，用[35S]-標(biāo)記的蛋白質(zhì)被示于圖30中的通道。為了主要產(chǎn)生成熟的hBDNF(表現(xiàn)分子量為12，000)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種酶促化分裂hBDNF的體外方法。圖30中通道3-6表示胰蛋白酶消化產(chǎn)物，將牛胰腺蛋白酶(由Worthington購(gòu)買，無(wú)胰凝乳蛋白酶)溶解在磷酸鹽緩沖液中，并將它加入到50μl，用[35S]標(biāo)記的CHO細(xì)胞hBDNF的等分試驗(yàn)中，所用的胰蛋白酶濃度分別是25、50、75和100μg/ml，用[35S]標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物分別示于泳道3-6，該酶催化分裂反應(yīng)在37℃下進(jìn)行5分鐘，可以看到分子量為31，000的前期前體hBDNF的標(biāo)記強(qiáng)度在逐漸減小。而分子量為18，500的產(chǎn)物則相應(yīng)地增加，在這些條件下，不能產(chǎn)生成熟形式的hBDNF(分子量為12，000)。圖30中通道7表示在用內(nèi)蛋白酶Arg-C對(duì)CHO細(xì)胞hBDNF進(jìn)行酶催化消化后的[35S]標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物，所述的內(nèi)蛋白酶Arg-C是由來(lái)自BoehringerMannheimBiochemicalsInc.得到的小鼠頜下腺中分離出的。用100μlMilli-Q水，由凍干制劑重構(gòu)100單位的這種酶，并將它貯存在-20℃下，為了對(duì)CHO細(xì)胞hBDNF進(jìn)行酶催化消化，我們采用了5單位(5μl)的酶和50μl從含有原始hBDNF(圖30通道2)的CHO細(xì)胞上清液得到的[35S]標(biāo)記蛋白質(zhì)。如圖30中通道7所示，5個(gè)單位的內(nèi)蛋白酶Arg-C(能在37℃下，5分鐘內(nèi)將前期前體形式的hBDNF(31，000分子量)，轉(zhuǎn)化成成熟的hBDNF(12，000分子量)。相對(duì)未加工的上清液而言，用內(nèi)蛋白酶Arg-C酶催處理表達(dá)hBDNF的CHO細(xì)胞上清液，可以增加BDNF的生物活性水平，在37℃下，用內(nèi)蛋白酶Arg-C將從表達(dá)hBDNF的CHO-DG44細(xì)胞得到的上清液處理5分鐘，用20單位的酶處理200μl的上清液，用E8小雞背側(cè)根神經(jīng)節(jié)的外殖體對(duì)經(jīng)過(guò)處理的和未經(jīng)處理的hBDNF進(jìn)行生物活性測(cè)定，在加入hBDNF后24小時(shí)，對(duì)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)情況定量計(jì)分，我們始終發(fā)現(xiàn)經(jīng)內(nèi)蛋白酶處理過(guò)的BDNF試樣，其生物活性明顯高于對(duì)照的(未處理的)hBDNF試樣的生物活性。圖31表示由這些數(shù)據(jù)組成的濃度曲線?？傊?，提純的內(nèi)蛋白酶Arg-C可用于體外酶催化反應(yīng)中來(lái)從未完全處理的前體分子(即前期BDNF)產(chǎn)生成熟的，具有生物活性的重組體人腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。這種新方法可以使我們由哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)大規(guī)模地有效制備有生物活性的人BDNF，舉例來(lái)說(shuō)，我們可以將內(nèi)蛋白酶Arg-C固定到一種固體基質(zhì)中，并建立一種有效的柱色譜分析方法。18.例腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)大鼠前側(cè)的多巴胺能神經(jīng)元的存活和成熟18.1原料和方法18.1.1.細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)將由E14-E15大鼠胚胎剖割獲得的前側(cè)中腦組織用酶催化法和機(jī)械法分離建立解離的培養(yǎng)物。典型地，收集由2升或3升大鼠胚胎(取自定時(shí)交配的Sprague-Dawley大鼠)得到的組織，并在F12介質(zhì)(Gibco)中于37℃下用胰蛋白酶(0.125%，Wor-thington)處理20分鐘，將它在生長(zhǎng)介質(zhì)(含有下列補(bǔ)充物的MEM，谷氨酰胺，2mM，葡萄糖，6mg/ml，青霉素G，0.5U/ml，鏈霉素5μg/ml，胎牛血清7.5%)中沖洗，然后將該組織低速下短時(shí)間離心5分鐘，并將沉淀通過(guò)研磨解離，等1-2分鐘，使其中未分散開(kāi)的細(xì)胞團(tuán)沉淀，而后，將該單細(xì)胞懸浮液接種到35mm含有生長(zhǎng)介質(zhì)的皿板上(該皿板上事先涂以聚鳥氨酸和昆布氨酸;Lindsay，etal.，1985，Dev.Biol.112∶319)，使其密度達(dá)到每平方厘米5×104細(xì)胞，在生長(zhǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)一整夜，使其細(xì)胞附著，而后，將細(xì)胞在有或沒(méi)BDNF存在的條件下在無(wú)血清的如Bottenstein和Sato所述的(Bottenstein和Sato，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76∶514)規(guī)定介質(zhì)中培養(yǎng)，不同的是所述規(guī)定介質(zhì)中以20ng/ml包括胰島素。為了用肉眼觀察多巴胺能細(xì)胞，將培養(yǎng)基用4%多聚甲醛固定，仔細(xì)沖洗用含有1.5%馬血清的Sorensen氏緩沖溶液中的0.02%Saponin進(jìn)行滲透化，并用抗大鼠TH(Boehringer-Mannheim)的小鼠單克隆抗體將它染色，用VectastainABC藥盒(VectorLabs)使初始的抗體結(jié)合情況能用肉恨觀察到。18.1.2.測(cè)定多巴胺攝取量按上18.1.1所述制備培養(yǎng)物，并在有或沒(méi)有50ng/ml豬BDNF條件下將它生長(zhǎng)所指出的天數(shù)，在所指明的時(shí)間點(diǎn)上在同樣的三個(gè)培養(yǎng)物中測(cè)定多巴胺的攝入量，將細(xì)胞在其有下列成份的攝取一緩沖溶液中預(yù)洗;136.8mMNaCl，2.7mMKCl，8mMNa2HPO4·7H2O，1.5mMKH2PO4，5mM葡萄糖，1mMCaCl2，1mMMgSO4，0.1mM抗壞血酸鹽和0.1mM巴吉林，pH7.4。這些等測(cè)定非神經(jīng)元3H-多巴胺攝取量的試樣，含有苯托品(BZT)，它包括在該吸收緩沖溶液中，其濃度為5μM，洗滌后，將這些細(xì)胞在新鮮的攝取緩沖液中預(yù)熱到37℃5分鐘，在第5分鐘時(shí)，加入3H-多巴胺(NEN，40ci/mmol)，使其最終濃度達(dá)到50nM，將該培養(yǎng)物在37℃下保溫15分鐘，除去該攝取溶液，并將該細(xì)胞放在冰上，并用冰冷的攝取緩沖液洗滌四次，向培養(yǎng)皿中加入0.5NNaOH，收集細(xì)胞在貝克曼閃爍計(jì)數(shù)器中，用15mlUltimaGold閃爍液(Packard.Instruments)測(cè)量該NaOH提取物。特定的神經(jīng)元的多巴胺吸收量被定義為在沒(méi)有BZT存在時(shí)觀察到的攝取量(cpm)，低于有BZT存在時(shí)的攝取量。一般，全部攝取量中的70-90%可被BZT抑制，在每一個(gè)同樣的培養(yǎng)物中，在每個(gè)時(shí)刻利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)測(cè)定TH+神經(jīng)元的數(shù)目，所顯示的結(jié)果代表了對(duì)每一種TH+的基值標(biāo)準(zhǔn)化的攝取量。18.1.3.BDNF的短暫表述用含有編碼人BDNF的順序的載體cDMS將CosM5細(xì)胞轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后第72小時(shí)，收集50ml培養(yǎng)物上清液，并對(duì)6M尿素滲析，將滲析后的上清液與兩性電解質(zhì)(pH3.5-10，BioRad)結(jié)合4個(gè)半小時(shí)。收集其組分，并用滲析管將它對(duì)pH為7.6的25mMNaPO4緩沖液進(jìn)行滲析，所述的滲析管事先用BSA(0.5mg/ml)預(yù)洗滌，以防止非特異性吸收生。在E8小雞背側(cè)根神經(jīng)節(jié)外殖體培養(yǎng)物，檢測(cè)組分的神經(jīng)軸突生長(zhǎng)促進(jìn)活性。將活性組分合并在一起，在8-18%凝膠上，用SDSPAGE對(duì)該活性集中物進(jìn)行分析，隨后在8-18%凝膠上進(jìn)行銀染色(Wrayetal.，1981，Anal，Biochem.118∶197)揭示了在對(duì)應(yīng)于BSA的68KD處有一條微弱的帶，而在12KD附近有一條單吸收帶，該吸收帶與以前看到的豬BDNF的相對(duì)應(yīng)(Barde.etal.，1982，EMBO.J.1∶549)(數(shù)據(jù)未給出)。將在雞背側(cè)根神經(jīng)節(jié)的，結(jié)狀的和交感神經(jīng)節(jié)的外殖體上進(jìn)行的生物測(cè)試結(jié)果作比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提純的重組體BDNF的特異活性及神經(jīng)元特異性與提純的豬BDNF的相似。18.1.4.由轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞產(chǎn)生hBDNFCHO-DG44細(xì)胞是L.Chasin博士(ColumbiaUniversity，NY)的一項(xiàng)成果，這些細(xì)胞缺乏二氫葉酸還原酶(dhfr-)(Urlaub和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77∶4216-4220)將CHO-DG44細(xì)胞保持在含有10%胎牛血清1%青霉素和鏈霉素及2mM“谷氨酰胺的Ham氏F12介質(zhì)中，將這些細(xì)胞一周通過(guò)兩次，并對(duì)其枝原體摻雜情況進(jìn)行例行檢查，在轉(zhuǎn)染之前，通過(guò)雙層氯化銫色帶法純化所有的質(zhì)粒DNA，如前所述，將由人腦獲得的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因亞克隆到該哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCDM8中，以生成pC8hB(Maisonpierreetal.，1990，science.247∶1446-1451)。由L.chasin博士提供弱化的二氫葉酸還原酶基因，p410。用電穿孔技術(shù)將這兩種基因結(jié)構(gòu)一同轉(zhuǎn)染到CHO-DG44細(xì)胞中(參見(jiàn)Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques6∶742-751)，用20μgpC8hB和0.2μgp410可以轉(zhuǎn)染大約1×106細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，將CHO-DG44細(xì)胞分到一些由下列物質(zhì)組成的選擇介質(zhì)中;無(wú)核苷酸的Ham氏F12(無(wú)胸苷和次黃嘌呤;-HT)加上10%經(jīng)過(guò)滲析的牛胎血清以及1%青霉素和鏈霉素。在將這些細(xì)胞放在無(wú)核苷選擇介質(zhì)中后大約10天，分出各單個(gè)克隆體。用0.02，0.05，或0.1μM氨甲喋呤(MTX)處理經(jīng)單個(gè)選擇出來(lái)的，對(duì)在無(wú)核苷Ham氏F12(-HT)介質(zhì)中生長(zhǎng)有抗性的克隆體，從而誘發(fā)基因擴(kuò)增，(Altetal.，1978，J.Biol.Chem.2531357-1370)。將這些抗MTX克隆體培養(yǎng)成資源庫(kù)，并用1.5、2.0或2.5μMMTX使之進(jìn)一步擴(kuò)增，從中分離并選出單獨(dú)一個(gè)抗2.5μMMTX的克隆體，以用于擴(kuò)大培養(yǎng)以及制備hBDNF。對(duì)該克隆(DGZ1000-B-3-2.5)進(jìn)行Southern印跡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型CHO-DG44細(xì)胞相比，BDNF基因擴(kuò)增了大約50倍，用胚胎(E8)雞背側(cè)根神經(jīng)節(jié)(DRG)外殖體進(jìn)行生物測(cè)試，用該測(cè)試結(jié)果推測(cè)出這種克隆體產(chǎn)生約9.5μghBDNF/ml(未示出)。通過(guò)在480cm2柱形瓶中培養(yǎng)DGZ1000-B-3-2.5細(xì)胞來(lái)大規(guī)模地制備重組hBDNF，在這些細(xì)胞達(dá)到連生狀態(tài)后大約4天時(shí)，收集介質(zhì)，象前面對(duì)COS上清液所述的那樣，從培養(yǎng)上清液中提純hBDNF。18.2.結(jié)果及討論表征控制神經(jīng)元存活及靶細(xì)胞支配特異性的分子信號(hào)具有重要的意義，這不僅僅是因?yàn)樗兄诮忉屔窠?jīng)系統(tǒng)是如何形成的，而且有可能使我們更好地理解有關(guān)維持和以適當(dāng)?shù)耐挥|構(gòu)形修復(fù)成熟神經(jīng)元的機(jī)現(xiàn)。顯然人們普遍認(rèn)為神經(jīng)元的存活及維持取決于特定的、由靶細(xì)胞獲得的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Levi-Montalcini和Angeletti，1968，Physiol.Rev.，48∶534;Thoenen和Barde，1980，Physiol.Rev.60∶1284;Purves，D.，1988，inBodyandBrainHarvardUniversityPress，Cambridge，MA;Barde，Y.A.1989.Neuron.2∶1525;Lind-say，R.M.1988，TheMakingoftheNervoussystem，OxfordUni-versityPress，Oxford，p148)但只有極少數(shù)這樣一些分子的特征被完整地描述過(guò)，至今只有兩種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，即神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和由腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)已被表明能選擇性地維持體內(nèi)不同神經(jīng)元群體的存活(Levi-MontalciniandAngeletti，1968，Physiol，Rev.48∶534;Barde，Y.A.，1989，Neuron，2∶1525，Leibrocketal.1989，Nature341149)。神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物已被廣泛地用來(lái)進(jìn)行識(shí)別細(xì)胞和組織提取物中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的生物測(cè)定(Levi-MontalciniandAngeletti，1968，Physiol，Rev.48∶534;thoenenandBarde，1980，Physiol，Rev.60∶1284;Lindsay，R.M.1988，TheMakingoftheNervousSystem，OxfordUniversityPress，Oxford.P.148;VaronandAdler，1981，Adv.Cell.Neurobiol.2∶118)，它們還被用來(lái)測(cè)定被純化神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的神經(jīng)元特異性(Ebendal，T.，1989，inNerveGrouwthFactors，JohnWileyLondon.p81，Barbinetal.，1984.JNeurochem.43.1468;Bardeetal，1982，EMBOJ.1∶549;Daviesetal.，1986，J.Neurosci.6∶1897;Lindsayetal.，1985，Dev.Biol.112∶319)，至今，已有許多人對(duì)不同種類的外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)神經(jīng)元的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)需求問(wèn)題進(jìn)行了研究，NGF的可獲得性使之已經(jīng)成為被詳細(xì)表征過(guò)其特性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NGF被表明在體外及體內(nèi)對(duì)PNS和CNS的神經(jīng)元亞群體的存活和維持是必不可少的(Levi-Montal-cini和Angeletti，1968，Physiol.Rev.48∶534;Thoenen和Barde，1980，Physiol，Rev.，60∶1284;Whittemore和Seiger，1987，BrainRes.Rev.，12439;Snider和Johnson，1989，Ann.Neurol.26∶489;Heftietal.1989.NeurobiologyofAging10515;Martinezetal.，1987，BrainRes.412295;Takeietal.，1988，J.Neuro-chem.511118;Hartikka和Hefti，1988，J.Neurosci，8∶2967)。阻礙識(shí)別CNS神經(jīng)元的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子一直是不同于NGF的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的提取制劑有限的可獲得性，以及制備特定神經(jīng)元群體的同源制劑的困難性。最近的兩項(xiàng)觀察成果促使我們?nèi)パ芯緽DNF對(duì)CNS(黑質(zhì))多巴胺能神經(jīng)元的作用，首先，現(xiàn)在已經(jīng)清楚，BDNF基因是在CNS可表達(dá)的，且其表達(dá)水平相當(dāng)于或比NGF基因更高(Leibrocketal.，1989，Nature341∶149)。其次，已經(jīng)有報(bào)導(dǎo)說(shuō)，一種由牛的紋狀體(一種黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的靶)部分純化的，其特征似乎與BDNF相似的蛋白質(zhì)能提高由中腦制得的多巴胺能神經(jīng)元的體外存活力(DalTosoetal.，1988，J.Neurosci8∶733)圖32A表示在培養(yǎng)9天以后，被分離的前側(cè)中腦細(xì)胞的典型外部形狀。事實(shí)上，所有的細(xì)胞均具有明亮相的核周體，且過(guò)程較長(zhǎng)，很明顯，只有極少量具有成纖維細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞出現(xiàn)，而且當(dāng)對(duì)培養(yǎng)物用星形標(biāo)記物，即神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸蛋白(GFAP;Bignamietal.，1972，BrainRes.43∶429)的抗體進(jìn)行染色時(shí)，檢測(cè)不到有星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞存在。為了肉眼觀察這些培養(yǎng)物中的多巴胺能神經(jīng)元，用TH的單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，正如所期望的那樣，TH+神經(jīng)元的數(shù)量較小(箭頭，圖32B，32C)并且隨培養(yǎng)時(shí)間而變化，變化范圍為被放置細(xì)胞的0.1-0.5%。如圖33所示，在TH細(xì)胞中可以看到各種神經(jīng)元形態(tài)。在所有的培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)在體外最初的3-4天后，TH+細(xì)胞的數(shù)量總要逐漸下降(圖34A、35)例如，在培養(yǎng)到第8天時(shí)，對(duì)照培養(yǎng)物中的TH+細(xì)胞數(shù)只是第二天在相似培養(yǎng)物中所測(cè)得數(shù)量的25%(圖35)但是，與對(duì)照物相比，在用BDNF處理過(guò)的培養(yǎng)物中，TH+細(xì)胞的損失量大大地減小，在體外培養(yǎng)8天后，在任一時(shí)間(在用BDNF處理過(guò)的培養(yǎng)物中)測(cè)得的TH+細(xì)胞量總是高于未處理的對(duì)照物中的量，例如，當(dāng)單獨(dú)一次加入BDNF時(shí)數(shù)量增加1.8倍(圖34A)，而當(dāng)多次加入時(shí)則增加5倍(圖35)。即使是向維持了8天的培養(yǎng)物中只加一次BDNF，也能發(fā)現(xiàn)BDNF的作用隨劑量變化的(圖34B)，與以前的報(bào)導(dǎo)(Dal.Tosoetal.，1988，J.Neurosci.8733;Knuseletal.，1990，J.Neurosci.10∶558)相一致的是，NGF(50ng/ml)對(duì)TH+細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有影響(圖34C)。作為研究BDNF在這些培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)多巴胺能神經(jīng)元影響的另一個(gè)方法，我們對(duì)TH+細(xì)胞攝取3H-多巴胺的能力進(jìn)行了研究。如表X所示，多巴胺的攝取能力(每一個(gè)TH+神經(jīng)元標(biāo)準(zhǔn)化的值)在培養(yǎng)過(guò)程前8天中顯著增加，而此后便下降，但我們發(fā)現(xiàn)，BDNF不改變TH+細(xì)胞攝取多巴胺的能力。因?yàn)樵谟蠦DNF存在或沒(méi)有存在時(shí)，其時(shí)間過(guò)程相同，攝取量相似(表X)。由此結(jié)果，我們假定，與在存活不一定非需要BDNF不可的神經(jīng)元中誘導(dǎo)多巴胺能表現(xiàn)型的表達(dá)相反，在中腦培養(yǎng)物中，BDNF可能在起作用來(lái)促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元的存活。為了進(jìn)一步研究這點(diǎn)，我們進(jìn)行了一些實(shí)驗(yàn)，在這些實(shí)驗(yàn)中，我們一開(kāi)始推遲幾天向培養(yǎng)物中加入BDNF，然后測(cè)定這些培養(yǎng)過(guò)程中的TH+神經(jīng)元的數(shù)量。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)推遲到第5天方加入BDNF，并隨后在第6、8或10天時(shí)測(cè)定TH+細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與在第二天加入BDNF的平行培養(yǎng)過(guò)程相比，在這些延緩培養(yǎng)過(guò)程中只有極少量的多巴胺能細(xì)胞(圖36)。雖然延緩加入BDNF與參照物相比能明顯提高TH+神經(jīng)元的數(shù)量，但即使是在同等的時(shí)刻進(jìn)行測(cè)定，延緩加入的作用永遠(yuǎn)不能發(fā)現(xiàn)救活象在第二天加入BDNF是救活那樣多的TH+神經(jīng)元。綜合起來(lái)看，這些結(jié)果與BDNF只可能在一定數(shù)量的細(xì)胞中起增加TH基因表達(dá)作用的說(shuō)法是矛盾的，并且說(shuō)明BDNF通過(guò)提高多巴胺能神經(jīng)元的存活力而施加其影響。而多巴胺能神經(jīng)元不在早期就向培養(yǎng)物中加入這種BDNF神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子時(shí)，就會(huì)被損失。有好幾份報(bào)告均提供資料證明，用從靶獲得的提取物或各種生長(zhǎng)因子均能促進(jìn)中腦多巴胺能神經(jīng)元的成熟，并提高其體外存活力(Dal.Tosoetal.，1988，JNeurosci.8∶733;Knuseletal.，1990，JNeurosci.10∶558;Prochiantzetal.，1979，ProcNatl.Acad.Sci.USA76∶5387;Diporzioetal.，1980，Nature288∶370，Pro-chiantzetal.，1981，Nature293∶570;DenisDoninietal.，1983.J.Neurosci3∶2292)但至今，還沒(méi)有一份報(bào)告說(shuō)一種完全純化的分子能在完全沒(méi)有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞存在下直接地和有選擇性地維持TH+神經(jīng)元的存活或促使細(xì)胞分裂(例如用IGF-1或FGF進(jìn)行觀察，DalTosoetal.，1988，J.Neurosci.8∶733)。與以前的采用早期小鼠胚胎組織的報(bào)導(dǎo)(DalTosoetal.，1988，J.Neu-rosci.8∶733)相一致的是在無(wú)血清規(guī)定介中培養(yǎng)的E14大鼠前側(cè)中腦細(xì)胞中基本上沒(méi)有星形細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。該研究過(guò)程采用比較低的細(xì)胞放置密度50，000細(xì)胞/cm2，因此，使得任何一種可能的內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的作用減至最少，并且可以更準(zhǔn)確地進(jìn)行計(jì)數(shù)，從這里給出的結(jié)果來(lái)看，由DalToso等人從牛紋狀體中被部分純化的該神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(DalTosoetal.，1988，JNeurosci.8∶733)看來(lái)很可能與BDNF相似，這表明BDNF是在該紋狀體中產(chǎn)生的并被從該黑質(zhì)伸出的多巴胺能神經(jīng)元的末端所吸收。但至今為止，用Northern印跡分析法一直不曾發(fā)現(xiàn)，在紋狀體組織中有大量的BDNF的mRNA(或該神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子族中其它成員的mRNA)。很顯然，在培養(yǎng)期間加入BDNF，即使是采用多次加入方式也不會(huì)使黑質(zhì)多巴胺的神經(jīng)元完全存活。在與我們的實(shí)驗(yàn)條件極其相似的條件下，DalToso等人也觀察到了這種現(xiàn)象(DalTosoetal.，1988，J.Neurosci8∶733)，DalToso等人認(rèn)為這種損失可能與所用的細(xì)胞密度有關(guān);在較高的細(xì)胞密度時(shí)(是我們所用密度的4倍)，可以看到大量?jī)翰璺影?螢光細(xì)胞，而且這些細(xì)胞的自發(fā)消失現(xiàn)象降低了。有可能是細(xì)胞間的接觸是這些細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間存活所需要的。為了確定這里所述的BDNF作用的生理關(guān)系，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的研究，特別應(yīng)對(duì)BDNF對(duì)體內(nèi)前側(cè)中腦多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育及維持的影響進(jìn)行研究?？紤]到在帕金森癥中黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的特定消失，因此，特別需要找到一種選擇性地影響這些細(xì)胞的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。因此，我們發(fā)現(xiàn)BDNF能維持這些用NGF難控制的神經(jīng)元細(xì)胞的存活。就為一些確定BDNF是否能保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元使之免受6-羥基多巴胺或MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)的神經(jīng)元毒性影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。這些研究將找到一種新的治療帕金森綜合癥的方法。表Ⅹ在前側(cè)中腦細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，BDNF不直接使多巴胺攝取量增加，培養(yǎng)天數(shù)3H-多巴胺攝取量(cpm/TH/(+)神經(jīng)元/15分鐘)對(duì)照物用BDNF處理的30.51±0.10.95±0.264.5±0.33.1±0.6818.5±5.327.3±1.2103.37±0.242.21±0.1819.例BDNF對(duì)γ-氨基丁酸攝取量產(chǎn)生一個(gè)與劑量有關(guān)的抑制作用。19.1原料及方法19.1.1.海馬細(xì)胞培養(yǎng)物從Sprague-Dawley大鼠的E18-19大鼠胚胎中解剖分離出海馬，并將它收集在F10介質(zhì)中，將該組織弄碎，用F10介質(zhì)(Gibco)沖洗兩次，并在37℃下，用0.25%胰蛋白酶Gibco將它胰蛋白酶化20分鐘，通過(guò)向其中加入由補(bǔ)充有牛胎血清(FCS10%)、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(25U/ml)和鏈霉素(25μg/ml)的最低基本介質(zhì)(MEM)組成的含血清介質(zhì)使胰蛋白酶失活。輕輕研磨使細(xì)胞離解，然后將離解的細(xì)胞收集起來(lái)，并以低速(500轉(zhuǎn)/分)將它離心30秒鐘，該離心過(guò)程是重復(fù)兩次進(jìn)行的，然后將細(xì)胞沉淀再次懸浮于含血清介質(zhì)中，將這些細(xì)胞鋪放到6mm小孔或35mm皿板上，這些小孔或皿板事先涂覆了聚鳥氨酸(10μg/ml)和昆布氨酸(10μg/ml)，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞以大約71，000細(xì)胞/cm2的低密度鋪放，在細(xì)胞鋪放后5-6小時(shí)，將介質(zhì)換成一種含有1%N3和青霉素-鏈霉素(分別為25單位/ml，25μg/ml)的無(wú)血清介質(zhì)，并在此時(shí)加入BDNF介質(zhì)每3天至4天換1次，同時(shí)重新加入該因子。19.1.2.測(cè)定γ-氨基丁酸GABA的高親和性攝取量利用改進(jìn)的Tomozawa和Appel的方法(1986，BrainRes.399∶111-124)來(lái)測(cè)定高親和性GABA的攝取量。在含有140mMNaCl，2.6mMKcl，1mMKH2PO4，1mMNa2HPO4，6mg/ml葡萄糖，1mMMgCl2，1mMCaCl2，0.1%BSA的GABA攝取緩沖溶液洗滌細(xì)胞，該GABA吸收緩沖液沖洗后在37℃下，將細(xì)胞與該GABA攝取緩沖液一起培養(yǎng)5分鐘，然后加入3H-GABA(NEN，NET-191X，111.4Ci/mmol)，使其最終濃度達(dá)到12nM，在37℃下進(jìn)行10分鐘保溫，然后將細(xì)胞放在冰上，并用該攝取緩沖液洗滌三次，在室溫下與0.14NNaOH一起將細(xì)胞保溫2小時(shí)，并對(duì)提取物中的3H-GABA進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3H-GABA攝取量一直高達(dá)至少30分鐘是線性增加的，加入2mMβ-氨基丙酸后，攝入到非神經(jīng)元細(xì)胞的GABA的攝取量受到抑制，而通過(guò)1mM3-哌啶甲酸的抑制作用，改變對(duì)神經(jīng)元特異的攝取量。19.2.結(jié)果及討論最近我們已在神經(jīng)元富集的海馬培養(yǎng)物中，檢測(cè)到大量的BDNF信使，而在海馬星形細(xì)胞中則未發(fā)現(xiàn)，這些數(shù)據(jù)有力地表明BDNF位于海馬神經(jīng)元中。為了觀察BDNF對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的海馬神經(jīng)元的影響，我們用各種濃度的BDNF(由COS上清液rotorphor純化的)處理這些細(xì)胞。在8天處理周期結(jié)束時(shí)，測(cè)定進(jìn)入神經(jīng)元中的高親和性GABA攝取量。如圖37中所示，BDNF產(chǎn)生了一種與劑量相關(guān)的GABA攝取抑制作用，因此，BDNF可能影響GABA能神經(jīng)元的存活和/或表現(xiàn)型的表達(dá)，BDNF對(duì)含有谷氨酸的神經(jīng)元沒(méi)有任何作用(由谷氨酸攝取量測(cè)定結(jié)果得出)，對(duì)神經(jīng)纖維蛋白質(zhì)也沒(méi)有作用，因此，BDNF對(duì)海馬培養(yǎng)物的作用似乎是對(duì)GABA能神經(jīng)元特異的。20.例BDNF對(duì)MPP+的毒性作用產(chǎn)生一種保護(hù)作用20.1原料及方法20.1.1測(cè)定神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)MPP+處理過(guò)的SH-sy5y細(xì)胞的作用將SH-SY5Y細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔的密度種入24孔板中，種入后24小時(shí)，用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子處理該細(xì)胞，用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子處理后24小時(shí)用MPP+(10μM)處理該細(xì)胞，在加入MPP+48小時(shí)后，用臺(tái)盼藍(lán)排斥測(cè)定法定量確定存活的細(xì)胞量。所用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是mNGF-COS(1∶5稀釋度)，hBDNF-COS(1∶5稀釋度)，由大腸桿菌提純的rCNTF(25ng/ml)，提純的牛腦bFGF(25ng/ml)，rNT3-COS(1∶5稀釋度)和純化的hEGF(25ng/ml)。20.1.2.測(cè)定神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)經(jīng)MPP+處理的前側(cè)中腦細(xì)胞培養(yǎng)物的作用根據(jù)前面所述的方法(參見(jiàn)前面18部分)，用E14大鼠胚胎建立被離解的前側(cè)中腦神經(jīng)元培養(yǎng)物，在這些培養(yǎng)物建立后48小時(shí)，用適當(dāng)?shù)乃赋龅纳窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)劑對(duì)這些培養(yǎng)物進(jìn)行處理，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子包括hBDNF(由CHO細(xì)胞rotophor提純的，≤50ng/ml)，提純的mNGF(50ng/ml)，rNT-3(COS上清液，1∶50稀釋度)，提純的牛腦bFGF(10ng/ml)和由大腸桿菌提純的rCNTF(25ng/ml)。加入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子后24小時(shí)，用MPP+(1μM)處理這些培養(yǎng)物，在用MPP+處理后48小時(shí)，用免疫組織化學(xué)染色法識(shí)別其中的TH陽(yáng)性神經(jīng)元并進(jìn)行計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)代表了每個(gè)實(shí)驗(yàn)用三份同樣試樣做的三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，用有斜陰影的條塊表示經(jīng)MPP+處理后的TH陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目?？瞻讞l塊代表未用MPP+處理的TH-陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量。20.2結(jié)果及討論臺(tái)盼藍(lán)排斥測(cè)定法分別測(cè)試BDNF、NGF，CNTF，NT-3，bFGF和EGF保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞免受1-甲基-4苯基吡啶姆(MPP+)毒性影響的能力時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，似乎只有BDNF和NGF對(duì)MPP+毒性表現(xiàn)出明顯的保護(hù)性活性(表Ⅺ和表Ⅻ)表ⅪBDNF和NGF使SH-sy5Y細(xì)胞免受MPP+毒性的保護(hù)作用結(jié)果處理存活的細(xì)胞數(shù)(%存活)COS-Mock轉(zhuǎn)染的(1∶5)0.4×104(5%)BDNF-COS(1∶5)1.2×105(67%)NGF-COS(1∶5)1.7×105(84%)CNTF0.6×104(14%)NT-30.7×104(20%)bFGF0.4×104(11%)EGF0.1×104(3%)表ⅫBDNF和NGF在MPP+毒性實(shí)驗(yàn)中的濃度曲線處理%存活細(xì)胞COS-MOCK(1∶2)13(1∶5)5(1∶10)3(1∶20)6(1∶50)7(1∶100)2COS-BDNF(1∶2)73(1∶5)67(1∶10)65(1∶20)42(1∶50)30(1∶100)25COS-NGF(1∶2)88(1∶5)84(1∶10)63(1∶20)50(1∶50)47(1∶100)34在前側(cè)中腦細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，這些數(shù)據(jù)表明BDNF對(duì)MPP+毒性具有明顯的保護(hù)性作用，而bNGF起比較小的作用(圖38)，用MPP+處理能使酪氨酸羥基酶陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量比對(duì)照培養(yǎng)物降低85%，但在與MPP+接觸前預(yù)先用BDNF處理的培養(yǎng)物中只減少40%。MPP+是毒素MPTP的可能的活性代謝物，它已被認(rèn)為能在體內(nèi)誘發(fā)象帕金森病那樣的綜合癥(它是一個(gè)人們接受的、帕金森氏綜合病的典型方式)，因此，BDNF和NT-3的保護(hù)作用表明，這兩種物質(zhì)可能在治療帕金森氏病或在中毒后防止神經(jīng)組織受到傷害被證明是有用的。21.微生物寄存下列重組噬菌體得重組質(zhì)粒DNA已在1989年8月30日寄存在美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心，(TheAmericanTypeCultureCollectien.12301ParklawnDriveRockvilleMaryland20852).登記號(hào)ATCCphBDNF-C-140648λhBDNF-G-140649本發(fā)明并不限于本文中描述的具體實(shí)施例的范圍，事實(shí)上，除了這些描述內(nèi)容以外，根據(jù)前面所作的描述及附圖本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員顯然可對(duì)本發(fā)明作出各種的改變。這些改變也落在本申請(qǐng)所附的權(quán)利要求書的范圍中。本文中引用了許多篇出版物，它們作為參考文獻(xiàn)被全部結(jié)合到本申請(qǐng)中。權(quán)利要求1.一種重組DNA分子，它包括有一種編碼了腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的核酸序列或其它的含有至少的10個(gè)核苷酸的亞序列。2.如權(quán)利要求1所述的重組DNA分子，其中腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子編碼核酸序列或其亞序列基本上如圖1中從大約核苷酸167至大約核苷酸927所示。3.如權(quán)利要求1或2所述的重組DNA分子，它包括有一種cDNA序列。4.如權(quán)利要求1或2所述的重組DNA分子，它包括一種基因組DNA序列。5.如權(quán)利要求1所述的重組DNA分子，它包括一種基本上如圖5所示的人DNA序列或其亞序列。6.如權(quán)利要求5所述的重組DNA分子，它包括至少基本上如圖5中在大約核苷酸974到核苷酸1440之間所示的序列的一部分。7.如權(quán)利要求1或2所述的重組DNA分子，它包括一種豬DNA序列。8.如權(quán)利要求5所述的重組DNA分子，它包含在寄存在美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)其登記號(hào)為40648的phBDNFC-1中。9.如權(quán)利要求5所述的重組DNA分子，它包含在寄存在美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)，其登記號(hào)為40649的λhBDNF-G-1中。10.一種與權(quán)利要求1或2所述的重組DNA分子互補(bǔ)的重組核糖核酸分子。11.一種核酸順序，它包含有一個(gè)編碼了一種基本上與圖1所示的氨基酸序列或其一部分同源的蛋白質(zhì)的序列。12.一種核酸序列，它含有編碼了一種基本上與圖5所示的氨基酸序列或其一部分同源的蛋白質(zhì)序列。13.一種核酸序列，它含有一種基本上和圖1所示的核酸序列或其一種可雜交部分同源的序列。14.如權(quán)利要求1或2所述的重組DNA分子，其中編碼BDNF蛋白或肽片段的核酸序列的表達(dá)由第二種核酸序列調(diào)節(jié)，從而使腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子蛋白或肽在一種用該重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主中被表達(dá)。15.如權(quán)利要求14所述的重組DNA分子，它包含在pCMV-pBDNF-1中。16.一種核酸載體，它包含有權(quán)利要求1所述的DNA分子。17.一種重組微生物，包含有權(quán)利要求1，2或13所述的DNA分子。18.如權(quán)利要求17所述的重組微生物，它是一種細(xì)菌。19.如權(quán)利要求18所述的重組微生物，它是一種酵母。20.一種細(xì)胞，它含有權(quán)利要求13所述的重組DNA分子。21.一種細(xì)胞，它由權(quán)利要求14所述的重組DNA分子組成。22.一種核酸序列，包含有一種編碼了基本如圖1所示的氨基的序列或它的包含了一個(gè)抗原決定子的亞序列的序列。23.一種純化蛋白質(zhì)，它具有一種基本上如圖1所示的氨基酸序列或它的包含有一個(gè)抗原決定子的亞序列的氨基酸序列。24.一種純化蛋白質(zhì)，它具有一種基本上如圖1所示的氨基酸序列或它的包含一個(gè)功能活性肽的亞序列的氨基酸序列。25.一種純化蛋白質(zhì)，它具有一種基本上如圖5所示的人BDNF的氨基酸序列或它的包含有一個(gè)功能活性肽的亞序列的氨基酸序列。26.一種純化蛋白質(zhì)，它具有一種基本上如圖5所示的氨基酸序列或它的包含有一個(gè)功能活性肽的亞序列的氨基酸序列。27.一種純化蛋白質(zhì)，它具有基本上如圖1中從約氨基酸134到氨基酸252所示的氨基酸序列或它的包含有一個(gè)抗原決定子的亞序列的氨基酸序列。28.一種純化蛋白質(zhì)，它具有一種由基本上如圖5所示的雞BDNF的核酸序列或它的包含有一個(gè)抗原決定因子的亞序列編碼的氨基酸序列。29.一種純化蛋白質(zhì)，它具有一種由基本上如圖5所示的雞BDNF的核酸序列或它的包含有一個(gè)功能活性肽的亞序列編碼的氨基酸序列。30.一種純化蛋白質(zhì)，它具有一種由基本上如圖5所示的大鼠BDNF的核酸序列或它的包含有一個(gè)抗原決定子的亞序列編碼的氨基酸序列。31.一種純化蛋白質(zhì)，它具有一種由基本上如圖5所示的大鼠BDNF的核酸序列或它的包含有一個(gè)功能活性肽的亞序列編碼的氨基酸序列。32.一種產(chǎn)生BDNF蛋白或其片段的方法，包括培養(yǎng)一種含有權(quán)利要求1所述的DNA分子的重組微生物，使得該微生物表達(dá)該DNA分子并分離被表達(dá)的BDNF蛋白或片段。33.一種產(chǎn)生BDNF蛋白或其片段的方法，它包括培養(yǎng)一種含有權(quán)利要求2所述的DNA分子的重組微生物，使得該微生物表達(dá)該DNA分子，并分離被表達(dá)的BDNF蛋白或片段。34.一種產(chǎn)生BDNF蛋白或其片段的方法，它包括(a)在一定條件下培養(yǎng)含有權(quán)利要求14所述的DNA分子的重組微生物，使得該微生物表達(dá)該DNA分子;以及(b)分離被表達(dá)的BDNF蛋白或片段。35.一種產(chǎn)生BDNF蛋白或其片段的方法，它包括(a)在一定條件下培養(yǎng)含有權(quán)利要求15所述的DNA分子的重組微生物，使得該微生物表達(dá)該DNA分子;以及(b)分離被表達(dá)的BDNF蛋白或片段。36.一種產(chǎn)生BDNF蛋白或其片段的方法，它包括(a)在一定條件下培養(yǎng)含有權(quán)利要求2所述的DNA分子的重組宿主，使得該宿主表達(dá)該DNA分子;以及(b)分離被表達(dá)的BDNF蛋白或片段。37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的宿主是一種真核類細(xì)胞。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的宿主是非人的轉(zhuǎn)移基因動(dòng)物。39.用權(quán)利要求32所述方法制得的產(chǎn)品。40.用權(quán)利要求33所述方法制得的產(chǎn)品。41.用權(quán)利要求34所述方法制得的產(chǎn)品。42.用權(quán)利要求35所述方法制得的產(chǎn)品。43.權(quán)利要求39所述的產(chǎn)品，其中沒(méi)有去污劑。44.權(quán)利要求40所述的產(chǎn)品，其中沒(méi)有去污劑。45.權(quán)利要求41所述的產(chǎn)品，其中沒(méi)有去污劑。46.權(quán)利要求42所述的產(chǎn)品，其中沒(méi)有去污劑。47.權(quán)利要求36、39或40所述的產(chǎn)品，它是糖基化的。48.權(quán)利要求36、39或40所述的產(chǎn)品，它是未糖基化的。49.一種抗體、抗體片段或其衍生物，它能識(shí)別BDNF蛋白、肽片段或其衍生物。50.如權(quán)利要求49所述的抗體、抗體片段或其衍生物，它是通過(guò)下列方法制備的，該方法包括用一種BDNF蛋白、肽片段或其衍生物使一種宿主動(dòng)物免疫，該BDNF蛋白、肽片段或衍生物是通過(guò)培養(yǎng)一種重組生物而產(chǎn)生的，該重組生物表達(dá)一種編碼了該BDNF蛋白、肽片段或其衍生物的重組核酸載體。51.如權(quán)利要求49所述的抗體、抗體片段或衍生物，其中，該核酸載體包含有一種基本上如圖1中從大約核苷酸167到大約核苷酸927所示的核酸序列或其亞序列。52.如權(quán)利要求49所述的抗體，抗體片段或衍生物，它是由下列方法制得的，該方法包括用權(quán)利要求23所述的純化BDNF蛋白或肽片段或其衍生物使一種宿主動(dòng)物免疫。53.如權(quán)利要求49所述的抗體，抗體片段或衍生物，它能識(shí)別B5肽片段，該B5肽片段包含有基本上如圖1中殘基153到185所示的氨基酸序列。54.一種重組DNA分子，它編碼一種蛋白或肽，該蛋白或肽包含有(a)一個(gè)與BDNF/NGF基因族中兩個(gè)不同的已知成分同源的第一種氨基酸序列以及(b)一個(gè)既不與BDNF也不與NGF同源的第二種氨基酸順序。55.如權(quán)利要求54所述的重組DNA分子，其中一個(gè)已知的成員是BDNF。56.如權(quán)利要求54所述的重組DNA分子，其中，一個(gè)已知的成員是NGF。57.如權(quán)利要求54所述的重組DNA分子，它是通過(guò)下列方法被分離的，該方法包括(a)從多種核酸序列中選出那些與BDNF和NGF二者同源的序列。(b)從(a)中所選出的那些核酸序列中，識(shí)別出那些含有大約至少由6個(gè)鄰接的不與NGF和BDNF同源的核苷酸組成序列。58.如權(quán)利要求57所述的重組DNA分子，其中步驟(a)的方法包括使用采用了一對(duì)寡聚核苷酸引物的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，該引物能雜交到BDNF和NGFDNA的同源區(qū)上，使得有義鏈引物能夠雜交到BDNF和NGF的一個(gè)第一同源DNA序列上，而反有義鏈寡聚核苷酸引物則能雜交到BDNF和NGF的一個(gè)第二同源DNA序列上。59.如權(quán)利要求58所述的重組DNA分子，其中，該有義鏈寡核苷酸引物包含有一種基本上如圖1所示的核苷酸序列;該核酸序列是從下列順序中選出的殘基587到616，殘基713至739，殘基764至781，殘基863至898，以及其亞序列，而反有義鏈寡聚核苷酸引物由基本上如圖1所示的核酸順序組成，該核酸順序(a)由下列順序中選出殘基587至616，殘基713至739;殘基764至781，殘基863至898，以及其亞序列，(b)與有義鏈引物不同。60.如權(quán)利要求54所述的重組DNA分子，它與基本上如圖1中從約殘基587約616所示的BDNF核苷酸序列同源，或與來(lái)自另一個(gè)物種的BDNF基因中相應(yīng)的核苷酸序列同源。61.如權(quán)利要求54所述的重組DNA分子，它與基本上如圖1中從約殘基713至約739所示的BDNF核酸序列同源，或與來(lái)自另一個(gè)物種的BDNF基因中的相應(yīng)的核苷酸序列同源。62.如權(quán)利要求54所述的重組DNA分子，它與基本上如圖1中從約殘基764至約781所示的BDNF核酸序列同源，或與來(lái)自另一個(gè)物種的BDNF基因中相應(yīng)的核苷酸序列同源。63.如權(quán)利要求54所述的重組DNA分子，它與基本上如圖1中從約殘基863至約898所示的BDNF核酸序列同源，或與來(lái)自另一物種的BDNF基因中相應(yīng)的核苷酸序列同源。64.一種藥物組合物，它包括了在一種藥物學(xué)允許的載體中的有效量的基本純凈的BDNF蛋白。65.一種藥物組合物，它包括了在一種藥物學(xué)允許的載體中的有效量的基本純凈的功能活性BDNF肽片段或衍生物。66.一種藥物組合物，它包括了在一種藥物學(xué)允許的載體中的有效量的基本純凈的帶有抗原決定體的BDNF肽片段或衍生物。67.如權(quán)利要求65或66所述的藥物組合物，其中，該BDNF肽片段或衍生物物包含有至少一部分基本上如圖1所示的氨基酸序列。68.如權(quán)利要求64所述的藥物組合物，其中，該BDNF蛋白質(zhì)包含有基本上如圖1所示的氨基酸序列。69.如權(quán)利要求64所述的藥物組合物，其中，該BDNF蛋白質(zhì)包含有基本上如圖1中從約氨基酸134至約氨基酸252所示的氨基酸序列。70.一種藥物組合物，它包括了在一種藥物學(xué)允許的載體中的有效量的如權(quán)利要求36、39或40所述的產(chǎn)物。71.一種藥物組合物，它包括了在一種藥物學(xué)允許的載體中的有效量的如權(quán)利要求43或44所述的產(chǎn)物。72.一種藥物組合物，它包括了在一種藥物學(xué)允許的載體中的有效量的如權(quán)利要求45所述的產(chǎn)物。73.一種藥物組合物，它包括了在一種藥物學(xué)允許的載體中的有效量的如權(quán)利要求46所述的產(chǎn)物。74.一種藥物組合物，它包括了在一種藥物學(xué)允許的載體中的有效量的如權(quán)利要求47所述的產(chǎn)物。75.一種藥物組合物，它包括了在一種藥物學(xué)允許的載體中的有效量的如權(quán)利要求48所述的產(chǎn)物。76.如權(quán)利要求68或69所述的藥物組合物，它能提高神經(jīng)元的存活力。77.如權(quán)利要求68或69所述的藥物組合物，它能促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)。78.如權(quán)利要求68或69所述的藥物組合物，它能維持有區(qū)別的細(xì)胞功能。79.權(quán)利要求68或69所述的藥物組合物，其中，所述的蛋白質(zhì)，肽或衍生物是糖基化的。80.權(quán)利要求68或69所述的藥物組合物，其中，所述的蛋白質(zhì)，肽.或衍生物是未糖基化的。81.一種藥物組合物，它包含了有效量的一種抗體組成，該抗體能識(shí)別BDNF蛋白質(zhì)或其肽片段或其衍生物。82.一種藥物組合物，它包含了有效量的基本純凈的BDNF蛋白質(zhì)或肽片段或其衍生物與一個(gè)第二種試劑的組合物。83.如權(quán)利要求82所述的藥物組合物，使所述的組合物對(duì)BDNF的一種功能活性具有協(xié)同作用。84.如權(quán)利要求82所述的藥物組合物，其中所述的第二種試劑是神經(jīng)生長(zhǎng)因子。85.權(quán)利要求82所述的藥物組合物，其中所述的第二種試劑是該DBNF/NGF族中的另一個(gè)成員。86.一種藥物組合物，它包含了有效量的一種由權(quán)利要求54、55、56、58或59所述的重組DNA分子編碼的蛋白質(zhì)或肽或其衍生物。87.一種診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)癥的方法它包括(a)在允許發(fā)生雜交的條件下，將一種組織與一處其上標(biāo)記可以檢測(cè)的核酸分子接觸，該核酸分子合有至少10個(gè)基本上如圖5所示的核苷酸;以及(b)檢測(cè)已發(fā)生的任何雜交作用。88.一種診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)癥的方法，它包括(a)在允許發(fā)生雜交的條件下，將從一種組織收集的RNA與一種其上標(biāo)記可以檢測(cè)的核酸分子接觸，該核酸分子含有至少10個(gè)基本上如圖1所示的核苷酸，以及(b)檢測(cè)已發(fā)生的任何雜交作用。89.一種診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)癥的方法，它包括(a)在允許發(fā)生雜交的條件下，將從一種組織收集的RNA產(chǎn)生的CDNA與一種其上標(biāo)記可以檢測(cè)的核酸分子接觸，該核酸分子含有至少10個(gè)基本上如圖1所示的核苷酸;以及(b)檢測(cè)已發(fā)生的任何雜交作用。90.如權(quán)利要求87、88或89所述的方法，其中所述的神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)癥是由下列病癥中選出的腫瘤、變性疾病、視網(wǎng)膜疾病和感覺(jué)神經(jīng)元疾病。91.如權(quán)利要求90所述的方法，其中所述的腫瘤是成神經(jīng)細(xì)胞瘤。92.一種診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)癥的方法，它包括(a)在允許發(fā)生結(jié)合條件下，將一種組織與一種其上標(biāo)記可以檢測(cè)的抗體分子接觸，該抗體分子能結(jié)合到BDNF蛋白或肽片段或其衍生物上;以及(b)檢測(cè)已發(fā)生的任何結(jié)合。93.如權(quán)利要求92所述的方法，它是在體內(nèi)進(jìn)行的。94.如權(quán)利要求92所述的方法，它是在體外進(jìn)行的。95.如權(quán)利要求92所述的方法，其中所述的神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)癥由下列病癥中選出的;腫瘤，變性疾病，視網(wǎng)膜疾病和感覺(jué)神經(jīng)元疾病。96.如權(quán)利要求95所述的方法，其中所述的腫瘤是成神經(jīng)細(xì)胞瘤。97.一種治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)癥的方法，它包括向病人施用有效量的BDNF蛋白質(zhì)，或其功能活性肽片段或衍生物。98.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述的神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)癥是一種變性疾病。99.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述的變性疾病是視網(wǎng)膜疾病。100.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述的神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)癥包括有該神經(jīng)系統(tǒng)損傷。101.如權(quán)利要求100所述的方法，其中所述的損傷是由下列事件引起的外傷、外科手術(shù)、梗塞、感染和惡性生長(zhǎng)。102.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述的疾病或失調(diào)癥是由于接觸毒劑而引起的。103.如權(quán)利要求97所述的方法，其中所述的疾病或失調(diào)癥是由于營(yíng)養(yǎng)缺乏而引起的。104.如權(quán)利要求94所述的方法，其中所述的失調(diào)癥包括先天性視網(wǎng)膜失調(diào)癥。105.一種治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)癥的方法，它包括施用有效量的、BDNF蛋白質(zhì)或其功能活性肽片段或衍生物與一個(gè)第二種試劑的組合物。106.權(quán)利要求105所述的方法，其中所述的組合物對(duì)病人在BDNF的功能活性上呈現(xiàn)協(xié)同作用。107.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述的第二種試劑是神經(jīng)生長(zhǎng)因子。108.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述的第二種試劑是BDNF/NGF族的另一個(gè)成員。109.如權(quán)利要求107所述的方法，其中所述的疾病或失調(diào)癥是變性疾病。110.如權(quán)利要求109所述的方法，其中所述的變性疾病是由下列病癥中選出的早老性癡呆癥(Alzheimer氏疾病)、亨廷頓(Huntington)氏舞蹈癥、視網(wǎng)膜病和帕金森癥。111.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述的疾病或失調(diào)癥包括有神經(jīng)系統(tǒng)損傷。112.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述的失調(diào)癥是由由于下列事件而引起的外傷、外科手術(shù)、梗塞、感染和惡性生長(zhǎng)和毒劑。113.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述的疾病或失調(diào)癥包括感覺(jué)神經(jīng)元疾病或失調(diào)癥。114.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述的疾病或失調(diào)癥包括先天性視網(wǎng)膜失調(diào)癥。115.用于分離一種基因的方法，該基因是腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因族中的一員，但它既不編碼神經(jīng)生長(zhǎng)因子也不編碼腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，該方法包括(a)從多種核酸序列中選出那些與BDNF和NGF二者同源的序列，(b)從(a)中所選出的那些核酸序列中，識(shí)別出那些含有由大約至少6個(gè)鄰接的與NGF和BDNF不同源的核苷酸序列的序列。(c)分離出由(b)識(shí)別出的序列。116.如權(quán)利要求115所述的方法，其中，步驟(a)的方法包括使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，在該技術(shù)中采用一種能雜交到BDNF和NGFDNA的同源區(qū)上的寡聚核苷酸引物使得該有義鏈引物，能雜交到BDNF和NGF的一個(gè)第一同源DNA序列上，而該反有義鏈寡聚核苷酸引物則雜交到BDNF和NGF的一個(gè)第二同源DNA序列上。117.如權(quán)利要求116所述的方法，其中，該有義鏈寡聚核苷酸引物包含有一種基本上如圖1所示的核酸序列，該核酸序列是從下列序列中選出的從約殘基587至約殘基616，從約殘基713至約殘基739，從約殘基764至約殘基781，從約殘基863至約殘基898，以及它們的亞序列，而該反有義鏈寡聚核苷酸引物由基本上如圖1所示的核酸序列組成，該核酸序列(a)由下列順序中選出從約殘基587至約殘基616，從約殘基713至約殘基739，從約殘基764至約殘基781，從約殘基863至約殘基898，以及它們的亞序列(b)與有義鏈引物不同。118.分離一種基因的方法，該基因是腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因族中的一員，但它既不編碼神經(jīng)生長(zhǎng)因子也不編碼腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，該方法包括(a)從多種核酸序列中選出那些與BDNF或NGF以及編碼于基本上如圖14所示的氨基酸序列(記號(hào)為M3/4)的基因同源的序列。(b)從(a)中所選出的那些核酸序列中，識(shí)別出那些含有由大約至少6個(gè)鄰接的與NGF和BDNF不同源的核苷酸序列的序列。(c)分離在(b)中識(shí)別出的序列。119.權(quán)利要求118所述的方法，其中步驟(a)的方法包括使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，在該技術(shù)中采用一對(duì)能雜交到BDNF或NGF以及編碼了基本上如圖14所示的氨基酸序列(記號(hào)為M3/4)的基因的同源寡聚核苷酸引物，使得其有義鏈到物能雜交到BDNF或NGF或編碼了被標(biāo)記為M3/4的所述氨基酸序列的基因或者Neurotrophin-3(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3)或NT-3的一個(gè)第一同源DNA序列上，而其反有義鏈寡聚核苷酸引物則雜交到BDNF和NGF或編碼了M3/4的基因的一個(gè)第二同源DNA序列上。120.一種提高BDNF在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)水平的方法，它包括將該神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞與紅藻氨酸或類似的化合物接觸。121.一種提高BDNF在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)水平的方法，它包括將該神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞與非NMDA受體興奮劑接觸。122.一種提高NGF在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)水平的方法，它包括將該神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞與紅藻氨酸或類似的化合物接觸。123.一種提高NGF在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)水平的方法，它包括將該神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞與非-NMDA受體興奮劑接觸。124.一種促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元存活的方法，它包括將該神經(jīng)元與有效量的BDNF接觸。125.一種促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元存活的方法，它包括將該神經(jīng)元與有效量的BDNF接觸。126.如權(quán)利要求125所述的方法，其中所述的膽堿能神經(jīng)元是前腦底部膽堿能神經(jīng)元。127.如權(quán)利要求125所述的方法，其中所述的膽堿能神經(jīng)元是膈膽堿能神經(jīng)元。128.一種抑制星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖的方法，它包括將該星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與有效量的BDNF接觸。129.一種抑制神經(jīng)元中γ-氨基丁酸攝取量的方法，它包括將該神經(jīng)元與有效量的BDNF接觸。130.一種向上調(diào)節(jié)NGF受體在細(xì)胞表面上表達(dá)的方法，它包括將該細(xì)胞與有效量的BDNF接觸。131.一種從活性較低的前體分子制備活性BDNF的方法，它包括將該前體分子與有效量的內(nèi)蛋白酶Arg-C接觸。132.如權(quán)利要求131所述的方法，其中所述有效量的內(nèi)蛋白酶Arg-C是濃度為0.1單位/μl的內(nèi)蛋白酶Arg-C133.用權(quán)利要求131所述的方法產(chǎn)生的活性形式的BDNF。134.用權(quán)利要求132所述的方法產(chǎn)生的活性形式的BDNF。135.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述的變性疾病是帕金森癥。136.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述的變性疾病是早老性癡呆癥(Alzheimer氏癥)。137.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述的失調(diào)癥是因毒劑引起的損害。138.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述的變性疾病是“帕金森附加”(Parkinson-Plus)綜合癥。139.如權(quán)利要求138所述的方法，其中所述的“帕金森附加“綜合癥是由下列病癥中選出的進(jìn)行性核上麻庳(Steele-Richard-son-Olszewski綜合癥)，橄欖體腦橋(Olivopontocerebellar)萎縮癥，Shy-Drager綜合癥(多體系萎縮癥，MultipleSystemsAtrophy)和GuamanianParkinsonism-Dementia復(fù)合癥。140.如權(quán)利要求135所述的方法，其中所述的帕金森綜合癥是因毒劑而引起的。141.如權(quán)利要求99所述的方法，其中所述的視網(wǎng)膜疾病是“因眼神經(jīng)損傷而引起的。142.一種增加BDNF在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)水平的方法，它包括將該神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞與氯化氨基甲酰膽堿接觸。143.一種增加BDNF在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)的水平，它包括將該神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞與組胺接觸。144.一種增加BDNF在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)水平的方法，它包括將該神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞與舒緩激肽接觸。145.一種增加NGF在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)水平的方法，它包括將該神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞與氯化氨基甲酰膽堿接觸。146.一種增加NGF在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)水平的方法，它包括將該神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞與組胺接觸。147.一種增加NGF在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)水平的方法，它包括將該神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞與舒緩激肽接觸。148.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述的變性疾病是亨廷頓(Huntington)氏舞蹈病。全文摘要本發(fā)明涉及編碼了腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的核酸序列以及用這些核酸順序大量制得的BDNF蛋白及其片段和衍生物。此外，本發(fā)明還涉及BDNF的藥物組合物及治療用途。第一次為臨床使用提供了產(chǎn)生足夠數(shù)量的，基本純凈的BDNF。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，可以用BDNF來(lái)促進(jìn)黑多巴胺能神經(jīng)元和前腦底部膽堿能神經(jīng)元的存活，從而分別為帕金森癥和早老性癡呆癥提供了一種治療方法。本發(fā)明還涉及針對(duì)BDNF或其片段的抗體，從而提供了一種產(chǎn)生足量免疫原的方法。此外，通過(guò)對(duì)BDNF和NGF的核酸序列進(jìn)行比較，本發(fā)明還為BDNF和NGF之間核酸序列的同源區(qū)域提供了識(shí)別方法，從而定義了BDNF/NGF基因族；本發(fā)明還提供了用于識(shí)別和分離該基因族中其它成員的方法。文檔編號(hào)F02B75/02GK1052142SQ90108380公開(kāi)日1991年6月12日申請(qǐng)日期1990年8月30日優(yōu)先權(quán)日1989年8月30日發(fā)明者卡羅琳·海曼,拉爾夫·奧爾德森,喬治·揚(yáng)科普洛斯,伊夫斯-阿倫·巴爾德,漢斯·弗里德里希·厄爾溫·特倫,安德烈斯·霍恩,弗里德里?！ぢ逅古上?羅納德·M·林賽,馬格達(dá)萊娜·霍弗,約阿希姆·萊布洛克,戴維·埃德加申請(qǐng)人:馬克斯普朗克科學(xué)促進(jìn)協(xié)會(huì),里珍納龍藥品有限公司