一種生物活性酶輔助微波法合成碳量子點(diǎn)的方法、由此制備的碳量子點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物活性酶輔助微波法合成超強(qiáng)熒光碳量子點(diǎn)的方法，具體步驟為：（1）將碳前驅(qū)體和生物活性酶超聲分散于去離子水中，制成透明的水溶液；（2）將步驟（1）中得到的溶液置于家用微波爐中進(jìn)行微波加熱，反應(yīng)后得到棕黃色液體即為生物活性酶修飾的碳量子點(diǎn)；（3）將步驟（2）中反應(yīng)得到的碳量子點(diǎn)溶液用透析袋透析，去除未反應(yīng)的碳前驅(qū)體和生物活性酶。該方法產(chǎn)率高，制備的熒光碳量子點(diǎn)為生物活性酶修飾的，能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，因而具有對(duì)癌癥的診療功能；采用生物活性酶作為反應(yīng)的活性劑和鈍化試劑，以檸檬酸、檸檬酸鹽、葡萄糖、果糖或者直鏈淀粉為碳前軀體，使得熒光碳量子點(diǎn)在制備和使用過程中生物安全性好；采用微波合成法成本低廉。
【專利說明】一種生物活性酶輔助微波法合成碳量子點(diǎn)的方法、由此制備的碳量子點(diǎn)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種生物活性酶輔助微波法合成熒光碳量子點(diǎn)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著納米技術(shù)及光學(xué)影像技術(shù)的快速發(fā)展，利用納米材料獨(dú)特的光學(xué)、磁學(xué)和電學(xué)等獨(dú)特的性質(zhì)，為臨床醫(yī)學(xué)中對(duì)重大疾病的早期診斷和治療帶來了新的契機(jī)。
[0003]分子影像學(xué)是目前臨床醫(yī)學(xué)腫瘤檢測(cè)的重要手段之一。生物納米探針技術(shù)的發(fā)展為分子影像技術(shù)的發(fā)展提供了新的思路，例如Alivisatos P.在《Nature Biotechnology》(自然，生物技術(shù))(2004,22(1):47)期刊上發(fā)表了題為納米晶體在生物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用(Theuse of nanocrystals in biological detection),該文章闡述了納米生物探針技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用前景。熒光量子點(diǎn)由于其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，在納米生物探針技術(shù)的發(fā)展中起到重要作用。眾所周知，鎘系熒光納米粒子就是量子點(diǎn)中的一種，由于含有重金屬元素，在實(shí)際使用時(shí)將會(huì)給環(huán)境和生物體帶來不可忽略的損害。因此尋找適合于生物標(biāo)記、疾病探 測(cè)以及藥物輸送等生物化學(xué)領(lǐng)域中所需的高量子產(chǎn)率的熒光納米材料具有重要意義。
[0004]碳元素是自然界最豐富的元素之一，也是生命體最重要的組成元素之一。自然界中存在的碳原子組成的碳材料也很多，形態(tài)各異，如炭黑、煤炭、石墨、金剛石等；今年來一直研究熱點(diǎn)的新型納米碳材料有碳納米管、富勒烯、石墨烯、納米鉆石、納米碳纖維等。Xu 等人在 J Am.Chem.Soc,《美國(guó)化學(xué)期刊》(2004,126: 12736)發(fā)表了 Electrophoreticanalysis and purification of fluorescent single—walled carbon nanotubefragments (電泳分析純化熒光單壁碳納米管片段)，首次證實(shí)了熒光碳量子點(diǎn)的存在。
[0005]熒光碳量子點(diǎn)，其直徑一般在IOnm以下，具有發(fā)射波長(zhǎng)可“調(diào)諧”，可以實(shí)現(xiàn)一元激發(fā)多元發(fā)射，發(fā)射波長(zhǎng)跨度很大，吸收波長(zhǎng)可以從可見光區(qū)延伸到近紅外光區(qū)，斯托克位移比較寬，無熒光漂白和閃爍的性質(zhì)，具有良好的生物安全性，是傳統(tǒng)半導(dǎo)體量子點(diǎn)的理想替代材料。
[0006]根據(jù)其制備方法的不同，熒光碳量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)和表面結(jié)構(gòu)也有所不同。目前熒光碳量子點(diǎn)的制備方法很多，如激光灼燒法、化學(xué)合成法、電化學(xué)合成法、高溫氧化法、超聲法、水熱合成法和微波合成法，其中微波合成法具有操作簡(jiǎn)單、合成周期短、表面基團(tuán)和顆粒尺寸可控等特點(diǎn)。
[0007]根據(jù)目前報(bào)道的微波合成法，熒光碳量子點(diǎn)的產(chǎn)率在I~10%左右，如果不做進(jìn)一步靶分子修飾，基本進(jìn)入不了細(xì)胞核內(nèi)且不具有對(duì)癌癥的診療功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)碳量子點(diǎn)制備方法產(chǎn)率低并且制備出的碳量子點(diǎn)，如果不做進(jìn)一步靶分子修飾，基本進(jìn)入不了細(xì)胞核內(nèi)，不具有對(duì)癌癥的診療功能等缺陷，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)率高、生物安全性好、合成方法簡(jiǎn)單、成本低廉的制備碳量子點(diǎn)的方法。
[0009]本發(fā)明提供的生物活性酶輔助微波法合成熒光碳量子點(diǎn)的方法，采用生物活性酶作為反應(yīng)的活性劑和鈍化試劑，采用微波合成法制備碳量子點(diǎn)。
[0010]該方法產(chǎn)率高，克服了現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)率低的不足，使得制備的熒光碳量子點(diǎn)能夠應(yīng)用于生物標(biāo)記、疾病探測(cè)；同時(shí)制備的熒光碳量子點(diǎn)為生物活性酶修飾的，能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，因而具有對(duì)癌癥的診療功能；采用生物活性酶作為反應(yīng)的活性劑和鈍化試劑，以低分子量的有機(jī)酸、有機(jī)酸鹽或多糖為碳前軀體，使得熒光碳量子點(diǎn)在制備和使用過程中生物安全性好，不會(huì)環(huán)境和生物體造成的損害；采用微波合成法一步合成熒光碳量子點(diǎn)，合成方法簡(jiǎn)單、設(shè)備簡(jiǎn)單，因此合成成本低廉。
[0011]本發(fā)明提供的生物活性酶輔助微波法合成碳量子點(diǎn)的方法，包括以下步驟:
[0012](I)將碳前驅(qū)體和生物活性酶分散于去離子水中，進(jìn)行超聲處理，制成透明的水溶液；
[0013](2)將步驟(1)中得到的水溶液進(jìn)行微波加熱，反應(yīng)后得到生物活性酶修飾的碳量子點(diǎn)溶液；
[0014](3)將步驟(2)中反應(yīng)得到的碳量子點(diǎn)溶液用透析袋透析，去除未反應(yīng)的碳前驅(qū)體和生物活性酶。
[0015]進(jìn)一步地，生物活性酶作為反應(yīng)的活性劑和鈍化試劑。
[0016]進(jìn)一步地，生物活性酶為核糖核酸酶A。
[0017]核糖核酸酶A (Bovine Pancreatic Ribonuclease A,縮寫為 Rnase A),是一類廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的核酸水解酶，控制著細(xì)胞內(nèi)RNA的種類和數(shù)量，參與核酸調(diào)節(jié)和代謝過程。Rnase A是一個(gè)具有124個(gè)氨基酸序列的蛋白質(zhì)，分子量13.64Dka，其空間結(jié)構(gòu)由3個(gè)α螺旋、9個(gè)β折疊和四對(duì)分子內(nèi)二硫鍵組成，并具有高溫穩(wěn)定性的特點(diǎn)。更重要的是，RNase A是第一個(gè)被用于動(dòng)物腫瘤治療的核糖核酸酶，一系列研究表明，RNase A具有的重要生理功能使其有望成為一類新型的抗腫瘤藥物。本發(fā)明選用RNase A作為反應(yīng)的活性劑和鈍化試劑，使得制備出的生物活性酶修飾的碳量子點(diǎn)性質(zhì)穩(wěn)定，并且兼有對(duì)癌癥影像和治療的功能。
[0018]進(jìn)一步地，碳前驅(qū)體為檸檬酸、檸檬酸鹽、葡萄糖、果糖或者直鏈淀粉，所選的碳前軀體均為普通試劑，來源廣泛，價(jià)格便宜。
[0019]進(jìn)一步地，碳前驅(qū)體和生物活性酶的質(zhì)量比為100:0.5~100:4。
[0020]進(jìn)一步地，超聲處理是指利用工作頻率為40~200kHz，超聲功率100~800W，超聲時(shí)間為I~20min的超聲作用。
[0021]進(jìn)一步地，微波加熱為在功率為200W~1000W的微波爐中，加熱I~20min。
`[0022]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的方法制備的碳量子點(diǎn)。顆粒分散性較好，沒有團(tuán)聚，有利于發(fā)光，因而穩(wěn)定性好并且具有優(yōu)異的單分散性和熒光性質(zhì)。
[0023]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的方法制備的碳量子點(diǎn)能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，因而具有對(duì)癌癥的診療功能。
[0024]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的方法制備的碳量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記在對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的激光共聚焦成像中的用途。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的生物活性酶輔助微波法合成熒光碳量子點(diǎn)的方法，具有以下有益效果:
[0026](I)制備的熒光碳量子點(diǎn)產(chǎn)率高達(dá)20~40%，產(chǎn)率高，克服了現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)率低的不足，使得制備的熒光碳量子點(diǎn)能夠應(yīng)用于生物標(biāo)記、疾病探測(cè)；
[0027](2)制備的熒光碳量子點(diǎn)為生物活性酶修飾的，能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，具有對(duì)癌癥的診療功能；因其對(duì)癌癥具有影像和治療功能，已成功地應(yīng)用于細(xì)胞成像和胃癌靶向治療，具有廣闊的應(yīng)用前景；
[0028](3)采用生物活性酶作為反應(yīng)的活性劑和鈍化試劑，以低分子量的有機(jī)酸、有機(jī)酸鹽或多糖為碳前軀體，使得熒光碳量子點(diǎn)在制備和使用過程中生物安全性好，不會(huì)環(huán)境和生物體造成的損害；
[0029](4)采用微波合成法一步合成熒光碳量子點(diǎn)，合成方法簡(jiǎn)單、設(shè)備簡(jiǎn)單，因此合成成本低廉；
[0030](5)分離提純簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，在一般實(shí)驗(yàn)室均能完成，易于規(guī)?；屯茝V。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1a為核糖核酸酶A碳量子點(diǎn)的低分辨率掃描電鏡圖SEM圖；
[0032]圖1b為核糖核酸酶A碳量子點(diǎn)的高分辨率掃描電鏡圖SEM圖；
[0033]圖2a為核糖核酸酶A碳量子點(diǎn)的紫外吸收光譜；
[0034]圖2b為核糖核酸酶A碳量子點(diǎn)的紅外吸收光譜；
[0035]圖3a為核糖核酸酶A碳量子點(diǎn)的熒光光譜圖；
[0036]圖3b為核糖核酸酶A碳量子點(diǎn)的光學(xué)照片；
[0037]圖4a是核糖核酸酶A碳量子點(diǎn)作為生物標(biāo)記對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞共聚焦成像2D照片；
[0038]圖4b是核糖核酸酶A碳量子點(diǎn)作為生物標(biāo)記對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞共聚焦成像3D照片。
【具體實(shí)施方式】
[0039]實(shí)施例1
[0040]以檸檬酸為碳前驅(qū)體，RNase A為生物合成模板，制備超強(qiáng)熒光碳量子點(diǎn)。
[0041]步驟一:在室溫下，稱取Ig檸檬酸和20mg RNase A，量取5mL H2O,全部移入25mL玻璃反應(yīng)瓶中，把該反應(yīng)瓶放在工作頻率為40kHz，功率200W的超聲中處理lmin，得到均勻的水溶液；
[0042]步驟二:將步驟一中得到的水溶液置于家用微波爐中，在800W功率下進(jìn)行微波加熱4min,反應(yīng)后得到棕黃色液體；
[0043]步驟三:使用截留分子量為5000的透析袋，透析步驟二中得到的棕黃色液體，透析時(shí)間為24h，透析過程中不間斷的更換超純水，以除去未反應(yīng)的檸檬酸和RNase A，即可得到RNase A修飾的超強(qiáng)熒光碳量子點(diǎn)，RNase AiC-dots產(chǎn)率為24.2%。
[0044]圖1a和圖1b為實(shí)施例1的方法制備的碳量子點(diǎn)的掃描電鏡圖SEM圖，從中可以看出，RNase A@C-dots顆粒分散性較好，沒有團(tuán)聚，有利于發(fā)光，因而穩(wěn)定性好并且具有優(yōu)異的單分散性和熒光性質(zhì)。[0045]圖2a是實(shí)施例1的方法制備的碳量子點(diǎn)的紫外吸收光譜，表征紫外吸收性質(zhì)；圖2b是實(shí)施例1的方法制備的碳量子點(diǎn)的紅外光譜，表征表面化學(xué)基團(tuán)。
[0046]圖3a是RNase A@C-dots的熒光光譜圖，為吸收和激發(fā)光譜，表明碳量子點(diǎn)的熒光發(fā)射性質(zhì)；圖3b為RNase AiC-dots光學(xué)照片，左邊為自然光照射，右邊為紫外光照射，反映了溶液的發(fā)光現(xiàn)象。
[0047]圖4a和圖4b是核糖核酸酶A碳量子點(diǎn)作為生物標(biāo)記對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞共聚焦成像2D和3D照片，從中可以看出，RNase AiC-dots能夠進(jìn)入細(xì)胞核，對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞具有影像，加之RNase A本身對(duì)癌癥有治療功能，因而RNase AiC-dots已成功地應(yīng)用于細(xì)胞成像和胃癌靶向治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0048]實(shí)施例2
[0049]以葡萄糖為前驅(qū)體，RNase A為生物合成模板，制備高強(qiáng)熒光碳量子點(diǎn)。
[0050]步驟一:在室溫下,稱取Ig葡萄糖和IOmg RNase A,量取5mL H2O,全部移入25mL玻璃反應(yīng)瓶中，把該反應(yīng)瓶放在工作頻率為40kHz，功率200W的超聲中處理lmin，得到均勻的水溶液。
[0051]步驟二:將步驟一中得到的水溶液置于家用微波爐中，在800W功率下進(jìn)行微波加熱4min,反應(yīng)后得到棕黃色液體。
[0052]步驟三:使用截留分子量為5000的透析袋，透析步驟二中得到的棕黃色液體，透析時(shí)間為36h，透析過程中不間斷的更換超純水，以除去未反應(yīng)的葡萄糖和RNase A，即可得到RNase A修飾的碳量 子點(diǎn)，RNase AiC-dots產(chǎn)率為18.6%。
[0053]碳前驅(qū)體也可以使用果糖或低分子量的直鏈淀粉等多糖小分子，所選的碳前軀體均為普通試劑，來源廣泛，價(jià)格便宜。
[0054]實(shí)施例3
[0055]采用RNase AiC-dots為熒光標(biāo)記對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的激光共聚焦成像。
[0056]步驟一:制備BRCAAl抗體標(biāo)記的多功能突光RNase A@C_dots探針。由于RNaseA@C-dots表面同時(shí)富含羧基和氨基，因此用交聯(lián)劑碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)對(duì)RNase AiC-dots顆粒表面的-C00H進(jìn)行活化，通過BRCAAl抗體表面的-NH2與量子點(diǎn)表面-C00H的縮合反應(yīng)2h，實(shí)現(xiàn)BRCAAl抗體與量子點(diǎn)的偶聯(lián)。經(jīng)過三次PBS緩沖液清洗后，得到的BRCAAl抗體標(biāo)記的量子點(diǎn)并保存在4°C下備用。
[0057]步驟二:腫瘤細(xì)胞的靶向富集。運(yùn)用常規(guī)的體外培養(yǎng)方法培養(yǎng)胃癌MGC-803細(xì)胞，具體方法如下:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌MGC-803細(xì)胞。每個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中加入2mL胰蛋白酶，放置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化5min，加入RP1640培養(yǎng)液5mL后用槍頭進(jìn)行吹打，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm條件下離心5min，去除上清液后得到聚集的細(xì)胞，將聚集的細(xì)胞中再次加入5mL RP1640培養(yǎng)液，并用ImL槍頭進(jìn)行吹打，從而使聚集的細(xì)胞均勻分散于整個(gè)懸液中。利用白細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行胃癌MGC-803細(xì)胞計(jì)數(shù)。最后將細(xì)胞均勻稀釋至107個(gè)/mL。取上述濃度的細(xì)胞懸液各lmL，加入前面準(zhǔn)備好的120 μ M的步驟一中的偶聯(lián)有BRCAAl抗體的熒光碳量子點(diǎn)。在37°C條件下反應(yīng)12h，采用多聚甲醛對(duì)細(xì)胞固定，并用4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對(duì)細(xì)胞核染色，初步在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光照片。
[0058]步驟三:激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行二維和三維成像。本實(shí)驗(yàn)選擇型號(hào)為TCS SP5激光共聚焦顯微鏡(萊卡，顯微系統(tǒng)，德國(guó)曼海姆；LeicaMicrosystems, Mannheim, Germany)。米用405激發(fā)光作為光源，對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞進(jìn)行2D和3D成像，如圖4a和圖4b所示，可以看到碳量子點(diǎn)通過細(xì)胞的包吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并且可以觀察到少量碳量子點(diǎn)已經(jīng)進(jìn)入了細(xì)胞核，這也是本發(fā)明優(yōu)越特性之一。
[0059]綜上所述，本發(fā)明的生物活性酶輔助微波法合成超強(qiáng)熒光碳量子點(diǎn)的方法，完全在水相中進(jìn)行，操作安全、快捷方便、生物安全性好并且產(chǎn)率高。
[0060]本發(fā)明提供的生物活性酶輔助微波法合成熒光碳量子點(diǎn)的方法，制備的熒光碳量子點(diǎn)產(chǎn)率高達(dá)20~40%，產(chǎn)率高，克服了現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)率低的不足，使得制備的熒光碳量子點(diǎn)能夠應(yīng)用于生物標(biāo)記、疾病探測(cè)；制備的熒光碳量子點(diǎn)為生物活性酶修飾的，能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，具有對(duì)癌癥的診療功能；因其對(duì)癌癥具有影像和治療功能，已成功地應(yīng)用于細(xì)胞成像和胃癌靶向治療，具有廣闊的應(yīng)用前景；采用生物活性酶作為反應(yīng)的活性劑和鈍化試劑，以低分子量的有機(jī)酸、有機(jī)酸鹽或多糖為碳前軀體，使得熒光碳量子點(diǎn)在制備和使用過程中生物安全性好，不會(huì)環(huán)境和生物體造成的損害；采用微波合成法一步合成熒光碳量子點(diǎn)，合成方法簡(jiǎn)單、設(shè)備簡(jiǎn)單，因此合成成本低廉；分離提純簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，在一般實(shí)驗(yàn)室均能完成，易于規(guī)?；屯茝V。
[0061]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù) 本發(fā)明的構(gòu)思做出諸多修改和變化。因此，凡本【技術(shù)領(lǐng)域】中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種生物活性酶輔助微波法合成碳量子點(diǎn)的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將碳前驅(qū)體和生物活性酶分散于去離子水中，進(jìn)行超聲處理，制成乳白色的水溶液； (2)將步驟(1)中得到的所述水溶液進(jìn)行微波加熱，反應(yīng)后得到生物活性酶修飾的碳量子點(diǎn)溶液； (3)將步驟(2)中得到的所述碳量子點(diǎn)溶液用透析袋透析，去除未反應(yīng)的所述碳前驅(qū)體和所述生物活性酶。
2.如權(quán)利要求1所述的生物活性酶輔助微波法合成碳量子點(diǎn)的方法，其特征在于，所述生物活性酶作為反應(yīng)的活性劑和鈍化試劑。
3.如權(quán)利要求2所述的生物活性酶輔助微波法合成碳量子點(diǎn)的方法，其特征在于，所述生物活性酶為核糖核酸酶A。
4.如權(quán)利要求1所述的生物活性酶輔助微波法合成碳量子點(diǎn)的方法，其特征在于，所述碳前驅(qū)體為檸檬酸、檸檬酸鹽、葡萄糖、果糖或者直鏈淀粉。
5.如權(quán)利要求1所述的生物活性酶輔助微波法合成熒光碳量子點(diǎn)的方法，其特征在于，所述碳前驅(qū)體和所述生物活性酶的質(zhì)量比為100:0.5~100:4。
6.如權(quán)利要求1所述的生物活性酶輔助微波法合成碳量子點(diǎn)的方法，其特征在于，所述的超聲處理是指利用工作頻率為40~200kHz，超聲功率100~800W，超聲時(shí)間為I~20min的超聲作用。
7.如權(quán)利要求1所述的生物活性酶輔助微波法合成碳量子點(diǎn)的方法，其特征在于，所述微波加熱為在功率為200W~1000W的微波爐中，加熱I~20min。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法制備的碳量子點(diǎn)。
9.如權(quán)利要求8所述的碳量子點(diǎn)，其特征在于，所述碳量子點(diǎn)能夠進(jìn)入細(xì)胞核。
10.如權(quán)利要求8所述的碳量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記在對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的激光共聚焦成像中的用途。
【文檔編號(hào)】B82Y20/00GK103771390SQ201410005216
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】沈廣霞, 劉慧旸, 王青, 崔大祥 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)