一種在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進(jìn)行納米金生長的方法
【專利摘要】一種在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進(jìn)行納米金生長的方法，也即基于基因修飾的TMVCP模板的一維金納米復(fù)合材料的制備方法，其特征在于：是以基因修飾的TMVCP為模板，通過其與含金元素基團(tuán)的靜電作用，在其表面吸附含金元素基團(tuán)，最后加入還原劑，從而實(shí)現(xiàn)了納米金在基因修飾的TMVCP模板表面的生長，得到了新型的TMVCP-納米金一維復(fù)合材料。結(jié)果表明，與在未經(jīng)基因修飾的TMVCP模板上進(jìn)行納米金的生長相比，在基因修飾的TMVCP模板上進(jìn)行納米金的生長，納米金在模板表面的生長密度得到較大提升，可望對TMVCP-納米金一維復(fù)合材料的應(yīng)用產(chǎn)生積極影響。
【專利說明】一種在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進(jìn)行納米金生長的方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料研究領(lǐng)域，具體說是一種在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進(jìn)行納米金生長的方法，也即一種基于基因修飾的TMVCP模板的一維金納米復(fù)合材料的制備方法，利用本發(fā)明提供的方法，可提升TMVCP-納米金復(fù)合材料的一維化程度和納米金在TMVCP模板表面的生長密度，可望對TMVCP-納米金一維復(fù)合材料的應(yīng)用廣生積極影響。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]煙草花葉病毒(TMV)，是煙草花葉病得病原體，對煙葉生長危害極大，目前有關(guān)煙草花葉病毒的研究多以防治煙草花葉病相關(guān)(例如專利:銀杏內(nèi)酯B在制備抗煙草花葉病毒藥物中的應(yīng)用(申請?zhí)?01010291033.8);專利:柴胡皂苷A在制備抗煙草花葉病毒藥物中的應(yīng)用(申請?zhí)?01010291073.2)，專利:6_0_咖啡酰基飛蓬苷在制備抗煙草花葉病毒藥物中的應(yīng)用(申請?zhí)?01010291012.6))。
[0005]近年來，有研究者開始將TMV在材料研究領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。TMV外殼蛋白(CP)以其納米管狀的幾何外形、高活性的內(nèi)外表面被認(rèn)為是一種理想的構(gòu)筑低維材料的模板(R.Tsukamotoj M.Muraokaj M.Sekij H.Tabataj 1.Yamashita.Chem.Mater.，2007，19: 2389 ；E.Dujardinj C.Peetj G.Stubbs, J.Ν.Culver, S.Mann.Nano Lett.,2003，3: 413 ；M.Knezj `M.Sumserj A.M.Bittner, C.Wegej H.Jeskej T.P.Martin,K.Kern.Adv.Funct.Mater., 2004，14: 116.)，目前以 TMVCP 為模板，已經(jīng)進(jìn)行了多種納米材料的生長，最終得到的復(fù)合材料被認(rèn)為可在信息存儲、光捕集以及傳感器等領(lǐng)域有應(yīng)用的潛力(R.J.Tseng, C.Tsai, L Maj J.0uyangj C.S.0zkanj Y.Yang.Nature Nanotechnology, 2006，1: 72 ；R.A.Miller, A.D.Presley, Μ.B.Francis.J.Am.Chem.Soc.，2007，129: 3104 ；T.L Schlickj Z.Ding, E.W.Kovacsj M.B.Francis.J.Am.Chem.Soc.，2005，127: 3718)。
[0006]一般來說，TMVCP的組裝體在分散介質(zhì)中存在多種可能的狀態(tài)(A.Klug.PhilosTrans R.Soc.London B, 1999, 354: 531),調(diào)控體系pH值、離子強(qiáng)度以及溫度等條件，可以使得TMVCP處于某幾種狀態(tài)的動態(tài)平衡中，這就使得TMVCP在具體應(yīng)用中呈現(xiàn)出結(jié)構(gòu)的不連續(xù)性，不利于發(fā)揮其作為模板材料的功能。本專利申請案的發(fā)明人在前期研究中，已經(jīng)通過分子生物學(xué)的方法，對TMVCP進(jìn)行了基因修飾，改善了 TMVCP模板的結(jié)構(gòu)均一性，并已申請了中國專利:一種煙草花葉病毒殼蛋白模板結(jié)構(gòu)修飾方法，申請?zhí)?01210336227.4。而在本專利申請中，發(fā)明人則進(jìn)一步以基因修飾的TMVCP為模板，進(jìn)行了納米金的生長。也即前一專利申請的續(xù)篇，對前一專利申請得到的結(jié)果進(jìn)行了更深一步的改善，結(jié)果表明，與在未經(jīng)基因修飾的TMVCP模板上進(jìn)行納米金的生長相比，在基因修飾的TMVCP模板上進(jìn)行納米金的生長，納米金在模板表面的生長密度得到較大提升，可望對TMVCP-納米金一維復(fù)合材料的應(yīng)用產(chǎn)生積極影響。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
一種在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進(jìn)行納米金生長的方法，也即基于基因修飾的TMVCP模板的一維金納米復(fù)合材料的制備方法，是以基因修飾的TMVCP為模板，通過其與含金元素基團(tuán)的靜電作用，在其表面吸附含金元素基團(tuán)，最后加入還原劑，從而實(shí)現(xiàn)了納米金在基因修飾的TMVCP模板表面的生長，得到了新型的TMVCP-納米金一維復(fù)合材料。具體步驟如下:
(I)以六聚組氨酸(His-tag)對煙草花葉病毒殼蛋白TMVCP進(jìn)行基因修飾，得到基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板His-TMVCPJf His-TMVCP分散于去離子水中，得到濃度約為
0.3~0.5 mg/mL的懸浮液。
[0009](2)將1(T15 mL此懸浮液、5~7 mL乙酸溶液、0.3^0.5 mL氯金酸溶液一同置于反應(yīng)容器中，在避光條件下攪拌2~3 h。其中乙酸溶液的質(zhì)量濃度為5%，氯金酸溶液濃度為0.01 M。
[0010](3)將fl.5 mL的水合肼溶液加入反應(yīng)物中，室溫下將反應(yīng)物靜置2~3 h。其中水合肼溶液濃度為10_3 M0
[0011](4)用去離子水、以離心的方法對產(chǎn)物進(jìn)行多次洗滌、提純，得到深棕色絮狀產(chǎn)物即本發(fā)明的目標(biāo)產(chǎn)物，將該產(chǎn)物再次分散于去離子水中，得到含有目標(biāo)產(chǎn)物的懸浮液，以便進(jìn)行透射電鏡(TEM)表征(見附圖)，該目標(biāo)產(chǎn)物即為基于基因修飾的TMVCP模板的一維金納米復(fù)合材料。
[0012]本發(fā)明步驟(1)中所述的基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板His-TMVCP是通過以下方法制備的:①兩條引物被用來擴(kuò)增TMV外殼蛋白(WT-TMV-CP)，上游引物TMVCP F1,GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC,和下游引物 His-TMV-CP Rl, TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTCo ② PCR 產(chǎn)物使用 T4DNA 連接酶連接進(jìn)入 pET28a載體。③在羧基端含有6*His標(biāo)簽的含有確定DNA序列的His-TMV-CP質(zhì)粒被亞克隆進(jìn)原核表達(dá)菌株Rosetta中進(jìn)行蛋白表達(dá)。④上柱純化蛋白時，首先以50 mL預(yù)冷緩沖液沖洗柱子(50 mM磷酸鉀，300 mM氯化鉀，I mM PMSF, 10 mM β -巰基乙醇，10 mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0)隨后，再以沖洗緩沖液-40沖洗柱子(50 mM磷酸鉀，300 mM氯化鉀，I mM PMSF,10 mM β-巰基乙醇，40 mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0)，最后，使用洗脫緩沖液來洗脫目標(biāo)蛋白(50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，I mM PMSF, 10 mM β-巰基乙醇，500 mM咪唑，10%乙醇，PH 值 8.0)。
[0013]本發(fā)明通過基因修飾的TMVCP模板與含金元素基團(tuán)的靜電作用，以化學(xué)沉積的方法，在基因修飾的TMVCP模板表面進(jìn)行了納米金的生長，實(shí)現(xiàn)了基因修飾的TMVCP與納米金的復(fù)合，與在未經(jīng)基因修飾的TMVCP模板上進(jìn)行納米金的生長相比，納米金在模板表面的生長密度得到較大提升。【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為基于His-TMVCP模板生長的納米金透射電鏡(TEM)照片。
[0015]圖2為基于未經(jīng)基因修飾的TMVCP模板生長的納米金透射電鏡(TEM)照片。
[0016]從圖(I)和圖(2)的對比可以看出，與在未經(jīng)基因修飾的TMVCP模板上進(jìn)行納米金的生長相比，在基因修飾的TMVCP模板上進(jìn)行納米金的生長，納米金在模板表面的生長密度的到較大提升。
【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明以下結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步描述:
實(shí)施例1
(I)以六聚組氨酸(His-tag)對TMVCP進(jìn)行基因修飾，得到的產(chǎn)物以His-TMVCP表示，制備過程如前面
【發(fā)明內(nèi)容】
中所述(也可具體參照已公開的中國專利201210336227.4中的方法)，將His-TMVCP分散于去離子水中，得到濃度約為0.3 mg/mL的懸浮液。
[0018](2)將10 mL的His-TMVCP懸浮液、5 mL乙酸溶液、0.3 mL氯金酸溶液一同置于反應(yīng)容器中，在避光條件下攪拌2 h。其中乙酸溶液的質(zhì)量濃度為5%，氯金酸溶液濃度為0.01M0
[0019](3)將I mL的水合肼溶液加入反應(yīng)物中，室溫下將反應(yīng)物靜置2 h。其中水合肼溶液濃度為10_3 M0
[0020](4)用去離子水、以離心的方法對產(chǎn)物進(jìn)行多次洗滌、提純，得到深棕色絮狀產(chǎn)物，將該產(chǎn)物再次分散于去離子水中，得到含有目標(biāo)產(chǎn)物的懸浮液，而后進(jìn)行電鏡表征。
[0021]實(shí)施例2
Cl)以六聚組氨酸(His-tag)對TMVCP進(jìn)行基因修飾，得到的產(chǎn)物以His-TMVCP表示，將His-TMVCP分散于去離子水中，得到濃度約為0.4 mg/mL的懸浮液。
[0022](2)將15 mL此懸浮液、6 mL乙酸溶液、0.4 mL氯金酸溶液一同置于反應(yīng)容器中，在避光條件下攪拌2 h。其中乙酸溶液的質(zhì)量濃度為5%，氯金酸溶液濃度為0.01 M0
[0023](3)將1.5 mL的水合肼溶液加入反應(yīng)物中，室溫下將反應(yīng)物靜置2?3 h。其中水合肼溶液濃度為10_3 M0
[0024](4)用去離子水、以離心的方法對產(chǎn)物進(jìn)行多次洗滌、提純，得到深棕色絮狀產(chǎn)物，將該產(chǎn)物再次分散于去離子水中，得到含有目標(biāo)產(chǎn)物的懸浮液，而后進(jìn)行電鏡表征。
[0025]實(shí)施例3
Cl)以六聚組氨酸(His-tag)對TMVCP進(jìn)行基因修飾，得到的產(chǎn)物以His-TMVCP表示，將His-TMVCP分散于去離子水中，得到濃度約為0.5 mg/mL的懸浮液。
[0026](2)將15 mL此懸浮液、7 mL乙酸溶液、0.5 mL氯金酸溶液一同置于反應(yīng)容器中，在避光條件下攪拌3 h。其中乙酸溶液的質(zhì)量濃度為5%，氯金酸溶液濃度為0.01 M0
[0027](3)將1.5 mL的水合肼溶液加入反應(yīng)物中，室溫下將反應(yīng)物靜置3 h。其中水合肼溶液濃度為10_3 M0
[0028](4)用去離子水、以離心的方法對產(chǎn)物進(jìn)行多次洗滌、提純，得到深棕色絮狀產(chǎn)物，將該產(chǎn)物再次分散于去離子水中，得到含有目標(biāo)產(chǎn)物的懸浮液，而后進(jìn)行電鏡表征。[0029]實(shí)施例4
Cl)以六聚組氨酸(His-tag)對TMVCP進(jìn)行基因修飾，得到的產(chǎn)物以His-TMVCP表示，將His-TMVCP分散于去離子水中，得到濃度約為0.3 mg/mL的懸浮液。
[0030](2)將10 mL此懸浮液、6 mL乙酸溶液、0.4 mL氯金酸溶液一同置于反應(yīng)容器中，在避光條件下攪拌3 h。其中乙酸溶液的質(zhì)量濃度為5%，氯金酸溶液濃度為0.01 M0
[0031](3)將1.2 mL的水合肼溶液加入反應(yīng)物中，室溫下將反應(yīng)物靜置2 h。其中水合肼溶液濃度為10_3 M0
[0032](4)用去離子水、以離心的方法對產(chǎn)物進(jìn)行多次洗滌、提純，得到深棕色絮狀產(chǎn)物，將該產(chǎn)物再次分散于去離子水中，得到含有目標(biāo)產(chǎn)物的懸浮液，而后進(jìn)行電鏡表征。
【權(quán)利要求】
1.一種在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進(jìn)行納米金生長的方法，也即基于基因修飾的TMVCP模板的一維金納米復(fù)合材料的制備方法，其特征在于:是以基因修飾的TMVCP為模板，通過其與含金元素基團(tuán)的靜電作用，在其表面吸附含金元素基團(tuán)，最后加入還原劑，從而實(shí)現(xiàn)了納米金在基因修飾的TMVCP模板表面的生長，得到了新型的TMVCP-納米金一維復(fù)合材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進(jìn)行納米金生長的方法，其特征在于:包括以下具體步驟: (1)以六聚組氨酸(His-tag)對煙草花葉病毒殼蛋白TMVCP進(jìn)行基因修飾，得到基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板His-TMVCPJf His-TMVCP分散于去離子水中，得到濃度約為0.3~0.5 mg/mL的懸浮液； (2)將1(T15mL此懸浮液、5~7 mL乙酸溶液、0.3^0.5 mL氯金酸溶液一同置于反應(yīng)容器中，在避光條件下攪拌2~3 h ； (3)將f1.5 mL的水合肼溶液加入反應(yīng)物中，室溫下將反應(yīng)物靜置2~3 h ； (4)用去離子水、以離心的方法對產(chǎn)物進(jìn)行多次洗滌、提純，得到深棕色絮狀產(chǎn)物即本發(fā)明的的目標(biāo)產(chǎn)物，將該產(chǎn)物再次分散于去離子水中，得到含有目標(biāo)產(chǎn)物的懸浮液，該目標(biāo)產(chǎn)物即為基于基因修飾的TMVCP模板的一維金納米復(fù)合材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進(jìn)行納米金生長的方法，其特征在于:步驟(2)中的乙酸溶液的質(zhì)量濃度為5%，氯金酸溶液濃度為0.01 M0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進(jìn)行納米金生長的方法，其特征在于:步驟(2)中的水合肼溶液濃度為10-3Μ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板上進(jìn)行納米金生長的方法，其特征在于:步驟(1)中所述的基因修飾的煙草花葉病毒殼蛋白模板His-TMVCP是通過以下方法制備的:①兩條引物被用來擴(kuò)增TMV外殼蛋白(WT-TMV-CP)，上游引物TMVCPFl, GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物 His-TMV-CP Rl, TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC !② PCR 產(chǎn)物使用 T4DNA 連接酶連接進(jìn)入pET28a載體；③在羧基端含有6*His標(biāo)簽的含有確定DNA序列的His-TMV-CP質(zhì)粒被亞克隆進(jìn)原核表達(dá)菌株Rosetta中進(jìn)行蛋白表達(dá)；④上柱純化蛋白時，首先以50 mL預(yù)冷緩沖液沖洗柱子，隨后，再以沖洗緩沖液-40沖洗柱子，最后，使用洗脫緩沖液來洗脫目標(biāo)蛋白。
【文檔編號】B82Y30/00GK103706800SQ201410018780
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】劉楠, 張威, 羅安娜, 王英元, 馮曉民, 何聲寶, 閆新甫 申請人:國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心