專利名稱：一種檢測食管鱗癌標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種蛋白質(zhì)芯片。應(yīng)用該蛋白質(zhì)芯片及其試劑盒篩查食管鱗癌特異蛋白標(biāo)志物。
背景技術(shù)：
食管癌是世界上第8位最常見的惡性腫瘤之一，被認(rèn)為是繼胰腺癌之后第二位難以治愈的消化道惡性腫瘤。中國又是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率較高的國家，占全世界的50%以上，每年約有25萬新診斷的食管癌病例，發(fā)病率僅次于胃癌、肺癌、肝癌之后居第四位，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。食管癌又分為食管鱗癌和腺癌，中國食管鱗癌的比例高達(dá)90%以上。食管癌的研究對降低發(fā)病率和死亡率具有非常重要的意義。目前食管癌篩查和診斷仍以食管內(nèi)鏡檢查及食管粘膜碘染色為主，存在一定的弊端，如成本較高，檢查效率低，侵入式檢查使患者依從性差，還受到醫(yī)生的技術(shù)水平等人為因素的影響，不適合用于早期篩查和臨床檢測。隨著研究向分子生物學(xué)領(lǐng)域推進(jìn)，從基因水平上研究篩查出異?；颍M(jìn)行基因測序，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，再尋找敏感的藥物是一個治療途徑，但這個過程比較繁瑣。隨著對基因組認(rèn)識的深入，人們發(fā)現(xiàn)藥物通常是作用于基因編碼的蛋白質(zhì)而不是基因本身，雖然人類基因組包含了我們身體的全部遺傳信息，但要經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)錄、翻譯過程實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)，人體各種功能的發(fā)揮都是由蛋白質(zhì)來完成的。蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者和體現(xiàn)者，對蛋白質(zhì)組的研究可以更深入、更貼近生命本質(zhì)，這催生了一個新的科學(xué)領(lǐng)域一一蛋白組學(xué):專門研究人體大量未知的蛋白質(zhì)、以及他們多樣性的形態(tài)和功能。表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜(surface-enhanced laser desorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometry, SELD1-TOF-MS)技術(shù)是一種蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，由血清與弱陽離子親和蛋白芯片結(jié)合，用質(zhì)譜儀讀取血清蛋白圖譜，用蛋白質(zhì)指紋分析軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析而獲得蛋白指紋。食管癌血清蛋白指紋由12個不同質(zhì)荷比(M/Z)的蛋白質(zhì)組成。但此種方法檢測出的蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比往往是多種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，不能確定是哪一種蛋白質(zhì)，而且有很多是人類未知的蛋白質(zhì)，對后續(xù)個體化治療和新藥研制帶來困難，逐漸不為人采用。選擇人類已知的蛋白進(jìn)行研究可以最快速度找到特異蛋白標(biāo)志物。蛋白質(zhì)又分為組織蛋白和血清蛋白，血清蛋白具有取樣容易，樣品處理簡單，可反映身體即時的生理病理變化，適合作為腫瘤篩查、診斷以及病情監(jiān)測的標(biāo)志物。食管癌的發(fā)生發(fā)展是正常細(xì)胞經(jīng)過多基因、多步驟的變化，逐漸演變成具有惡性增殖特性的癌細(xì)胞并不斷轉(zhuǎn)移播散的過程。食管癌細(xì)胞與增殖、凋亡、分化和轉(zhuǎn)移相關(guān)的多種基因的表達(dá)都發(fā)生了改變，此種變化最終表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能改變，從而影響細(xì)胞的生命活動。在癌變過程中發(fā)生改變的蛋白質(zhì)和小肽可以經(jīng)腫瘤細(xì)胞代謝、分泌釋放到血液或其他體液中。因此，通過研究食管癌血清蛋白質(zhì)的改變，有可能發(fā)現(xiàn)與食管癌相關(guān)或特異的蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)，即食管癌血清蛋白標(biāo)志物。但血清蛋白的含量都是非常低的，即低豐度蛋白，所以血清蛋白檢測存在一定難度。傳統(tǒng)的蛋白檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放免分析法(RIA)、免放測定法(IR-MA)和熒光免疫測定法(FIA)等，酶聯(lián)免疫吸附法是目前臨床用得最多的檢測方法，但酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法需要在加入受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體時有半小時至一小時的孵育時間，中間還須經(jīng)過數(shù)次洗板過程才能加入反應(yīng)底物進(jìn)行顯色后在酶標(biāo)儀上完成檢測，步驟較為繁瑣費(fèi)時，且存在檢出陽性率低、容易污染等不足，而且一次只能檢測一種指標(biāo)，按照這些方法對每份血清進(jìn)行多項(xiàng)標(biāo)志物的測定在人力、物力和財力上均不現(xiàn)實(shí)。人們希望能有一種快速、簡便的，價格低廉的，可同時檢測多人份的多項(xiàng)指標(biāo)的診斷方法來提高檢測的效率及準(zhǔn)確性。蛋白芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使高通量、大范圍研究血清蛋白質(zhì)組學(xué)成為可能。蛋白芯片法只需在反應(yīng)板上依次加入封閉液、受檢標(biāo)本、洗滌液和膠體金標(biāo)記的二抗即可。液體在自動滲濾的過程中，受檢標(biāo)本內(nèi)的抗體及膠體金標(biāo)記的第二抗體便自動完成吸附，第二抗體因膠體金標(biāo)記而不需底物進(jìn)行顯色而呈色，可直接觀測結(jié)果。蛋白質(zhì)芯片是一種在固體基片表面固定蛋白質(zhì)或多肽微陣列，通過免疫學(xué)原理對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行檢測、識別、分析和診斷，可應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域?，F(xiàn)有的蛋白芯片，價格昂貴，一般只含有一種或幾種用于檢測體液標(biāo)本的標(biāo)志蛋白，目前能夠應(yīng)用于臨床檢測的標(biāo)志物很單一，主要檢測EGFR受體來輔組診斷食管癌，假陽性率偏高，靈敏度、準(zhǔn)確性偏低，重復(fù)性差。目前尚沒有專門的食管癌篩查和診斷蛋白芯片廣泛應(yīng)用。例如，發(fā)明專利申請?zhí)枮?00510116733.2，申請日為2005.10.28，
公開日為2007.05.02，公開號為CN1955737A的“一種用于篩查食管癌癌前病變的蛋白芯片”發(fā)明專利申請，該發(fā)明的蛋白芯片只包含了有16種蛋白標(biāo)志物，而且僅有TP53這一個蛋白重合，兩種蛋白芯片所檢測的目標(biāo)抗體不同，其得出的結(jié)論和意義也不同；實(shí)用新型申請?zhí)枮?00820059666.4，申請日為2008.06.13，授權(quán)公告日為2009.05.27，授權(quán)公告號為CN201247246Y的“一種男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片及其試劑盒”實(shí)用新型專利，其芯片只有含有7種標(biāo)志物，可用于檢測食管癌的標(biāo)志物只有3種:CYFRA21-1、SCC-AG, CEA。這三種標(biāo)志物對于食管癌的診斷準(zhǔn)確性低，重復(fù)性低，假陽性高，且僅限于檢測男性食管癌?，F(xiàn)有技術(shù)中雖有50多種蛋白的研究，如美國 Kilic A 等人的《Use of novel autoantibody and cancer-relatedprotein arrays for the detection of esophageal adenocarcionma in seru)) (ThoracCardiovasc Surg, 2008)研究的蛋白芯片涉及53種腫瘤相關(guān)抗原,但其僅限于對于早期食管腺癌檢測，所選蛋白標(biāo)志物與本發(fā)明所選蛋白差異很大，本發(fā)明是針對食管鱗癌，重合的蛋白僅有:IL-8、EGFR、CA19-9、CA72-4、MMP-7等4種。總之，現(xiàn)有技術(shù)缺乏一種能夠高通量篩查和檢測食管鱗癌、價格能夠?yàn)槿藗兯邮艿?、能夠在人群體檢中普及推廣的蛋白芯片。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種用于食管鱗癌檢測血清蛋白標(biāo)志物的蛋白芯片。本發(fā)明蛋白芯片所選擇的蛋白是已知的食管鱗癌相關(guān)蛋白標(biāo)志物，所檢測的目標(biāo)蛋白明確、應(yīng)用性強(qiáng)，特別針對食管癌尤其是中國高發(fā)的食管鱗癌，所選標(biāo)志物也屬于鱗癌的標(biāo)志物；選用55種食管鱗癌蛋白標(biāo)志物及蛋白對照制成蛋白芯片，對食管鱗癌高發(fā)區(qū)通過胃鏡檢測及組織病理診斷確診的三類人群，即:正常人群、食管鱗癌癌前病變?nèi)巳杭笆彻荀[癌人群各150例的血清或血漿的差異蛋白，從而確立該三類人群的食管鱗癌相關(guān)蛋白圖譜，找出食管鱗癌發(fā)展中的特異蛋白標(biāo)志物為:CA72-4、CTAG1B、Cyfra21_l、GAGE7、SERPINB4共5種蛋白，用于食管鱗癌早期篩查，中、晚期診斷和病情監(jiān)測提供一種檢測方法。同時為尋找敏感性藥物提供了一種手段。本發(fā)明的食管鱗癌標(biāo)志物蛋白質(zhì)芯片，由基片和陣列式分布于基片上的蛋白檢測指標(biāo)以及對照檢測指標(biāo)涂層組成，以物理固定方法，即在涂布有偶氮聚合物的玻璃基片上點(diǎn)樣抗原等蛋白質(zhì)。用光線照射后，偶氮聚合物產(chǎn)生順式異構(gòu)體-反式異構(gòu)體的交替變換，蛋白質(zhì)逐漸陷入偶氮聚合物內(nèi)部。停止光照后，偶氮聚合物重新凝固成固體，蛋白質(zhì)就實(shí)現(xiàn)了物理固定在基片上面，基片是玻璃片基或塑料片基。蛋白檢測指標(biāo)包括:Annexin1、Annexin I1、BIRC5、CA 19-9, CA72-4、CCNBU CCNDU CCNEU CDC25A、CDC25B、CDKU CDK2、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A(A)、CDKN2A(B)、CDKN2A(C)、Clu、CTAGlB、Cyfra 21-1,E2F1、EGFR(A)、EGFR(B)、ERBB2、GAGE7、GJA8、HAVCRl、H00K2、ID-U IGF2BP3、IL-8, MGMT,MMP-7、MSH2、MVD、MYC、NFKBl、pol β、PRDX6、PTK2、PTK2abnova、RAR_b、S100A4、SERPINB4、Smad3、S0D2、SQSTMl、SURF-U TACSTD2 (A)、TACSTD2 (B)、TGF-bl、TP53、TP63 共 55 種腫瘤標(biāo)志物，與樣品對照、陽性對照、陰性對照和試劑對照構(gòu)成陣列式點(diǎn)樣涂層，同時點(diǎn)陣于一張基片上，每個陣列重復(fù)16組。上述基片的一個優(yōu)選例是醛基化玻片。上述的對照檢測涂層包括:樣品對照、陽性對照、陰性對照和試劑對照。樣品對照為人血清抗原；陽性對照為人IgG抗體；陰性對照為抗原點(diǎn)樣所用的稀釋液；試劑對照為生物素標(biāo)記的人IgG抗體。上述芯片涂層上的每個陣列中每個蛋白檢測指標(biāo)有3個重復(fù)點(diǎn)，對照指標(biāo)也有3個重復(fù)點(diǎn)。陣列的多少和大小與蛋白標(biāo)志物的多少、基片大小、以及點(diǎn)樣的大小直接有關(guān)。上述蛋白檢測指標(biāo)與檢測陣列的優(yōu)選例是:當(dāng)?shù)鞍讬z測指標(biāo)點(diǎn)直徑為0.0lmm時，點(diǎn)間距0.0lmm,陣列大小為0. 56mmX0.6mm,可在硝酸纖維素膜蛋白芯片上設(shè)置16個陣列。檢測食管鱗癌的蛋白質(zhì)芯片試劑盒包括:浸潤液(3)，樣本稀釋液(4)，金交聯(lián)試劑稀釋液(5)，濃縮洗滌液￠)，檢測液A(7)，檢測液B(8)，牛血清蛋白溶液(9)，金交聯(lián)試劑
(10)，生物素標(biāo)記的人IgG抗體(11)，抗生物素標(biāo)記的金交聯(lián)試劑(12)。各液體為瓶裝，用紙質(zhì)模版固定于包裝盒內(nèi)。各部分由紙質(zhì)模版固定于一包裝盒內(nèi)，不限放置方式，檢查時配套使用。上述試劑盒的樣本稀釋液4是一種蛋白穩(wěn)定劑(Gentel Dilution Buffer TM,產(chǎn)品號:N0.B255);可以由3% BSA和0.05%洗滌劑(pH=7.3)配置而成。上述濃縮洗滌劑6 (10 XGentel Wash Buffer TM,產(chǎn)品號:Νο.2-1016))是一種中性緩沖液，由洗滌劑配制而成(PH=6.8)。上述的生物素標(biāo)記的人IgG抗體11配制是由20mg/mL牛血清蛋白稀釋液稀釋到100倍，進(jìn)一步由樣本稀釋液稀釋到50，000倍。上述的抗生物素標(biāo)記的金交聯(lián)試劑12是由200mg SilverQuant Reagent C(Gentel,產(chǎn)品號:Νο.10-2135)用 200mL SilverQuant Conjugate Buffers (Gentel,產(chǎn)品號:N0.10-2134)配制成金交聯(lián)試劑，再進(jìn)一步用抗生物素的金交聯(lián)試劑(Gentel，SilverQuant Ant1-biotin Gold Conjugate,產(chǎn)品號:N0.10-1031)配制而成。上述的牛血清蛋白溶液9由20 mg/mL牛血清蛋白配制而成(pH=7.4)
上述的檢測液A、檢測液B指配套使用的兩種試劑，一種含有硝酸銀試劑，另一種含有檸檬酸。一張芯片可同時檢測16個樣本，不僅具有更高的靈敏度，同時大大降低成本并提高檢測效率，克服了以往蛋白芯片價格昂貴、難以推廣普及的弊端。


圖1為安裝和檢測芯片裝置的外觀平面示意圖。有4張芯片，I代表一張芯片；每張芯片包含16個陣列，2代表一個陣列，一個陣列可檢測一個樣本。圖2是點(diǎn)樣陣列示意圖。由14X15點(diǎn)樣組成。圖3為點(diǎn)樣陣列示意圖的標(biāo)志物點(diǎn)樣位置圖。4個角A1-A3、A13-A15、N1_N3、N13-N15為樣本對照，各有3個重復(fù)點(diǎn)樣；B1-D1、K15-M15是陽性對照，各有3個重復(fù)點(diǎn)樣；El-Gl是陰性對照，有3個重復(fù)點(diǎn)樣；K1-M1、B15-D15是試劑對照，各有3個重復(fù)點(diǎn)樣；其余各行分別為蛋白檢測指標(biāo)點(diǎn)樣 Annexin1、Annexin I1、BIRC5、CA 19-9, CA72-4、CCNBUCCNDU CCNEU CDC25A、CDC25B、CDKU CDK2、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A(A)、CDKN2A(B)、CDKN2A(C)、Clu、CTAG1B、Cyfra 21-1、E2F1、EGFR(A)、EGFR(B)、ERBB2、GAGE7、GJA8、HAVCRl、H00K2、ID-U IGF2BP3、IL-8, MGMT, MMP-7、MSH2、MVD, MYC, NFKBl、pol β、PRDX6、PTK2、PTK2abnova、RAR_b、S100A4、SERPINB4、Smad3、S0D2、SQSTMU SURF-UTACSTD2 (A)、TACSTD2 (B)、TGF-bl、TP53、TP63每行最多4個指標(biāo)，各有3個重復(fù)點(diǎn)樣。圖4是試劑盒不意圖。3代表浸潤液；4代表樣本稀釋液；5代表金交聯(lián)試劑稀釋液；6代表濃縮洗滌液；7代表檢測液A ；8代表檢測液B ；9代表牛血清蛋白溶液；10代表金交聯(lián)試劑；11代表生物素標(biāo)記的人IgG抗體；12代表抗生物素標(biāo)記的金交聯(lián)試劑。圖5為檢測血清結(jié)果示意圖，其中樣本對照、陽性對照和試劑對照信號較強(qiáng)，陰性對照信號較弱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信；13為CA72-4信號較強(qiáng)，其余指標(biāo)信號較弱。圖6-圖10為正常人群、食管鱗癌癌前病變?nèi)巳杭笆彻荀[癌病人三類人群的上述55種蛋白指標(biāo)血清蛋白圖譜示意圖；白色柱狀圖代表正常人群蛋白圖譜；網(wǎng)格柱狀圖代表食管鱗癌癌前病變?nèi)巳旱鞍讏D譜；黑色代表食管鱗癌蛋白圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:
一種檢測食管鱗癌的蛋白芯片的制備
其步驟主要是:(I)準(zhǔn)備基質(zhì)硝酸纖維素膜；(2)設(shè)計芯片，確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；(3)點(diǎn)樣針吸出抗原采用噴射點(diǎn)樣，電子電壓噴霧技術(shù)同時噴點(diǎn)到一張玻璃基片上，(4)裝配硝酸纖維素膜，并且進(jìn)行封閉、干燥、包裝、保存。上述用于檢測食管鱗癌多種血清抗體標(biāo)志物的蛋白芯片的制備方法具體包括以下步驟:1.食管鱗癌標(biāo)志物檢測抗原抗體的來源
(I)檢測指標(biāo)抗原的確定:
所有抗原購自北京傲銳東源生物科技有限公司(OriGene)、臺灣亞諾法生技公司(Abnova)和美國 MyBioSource 公司。(2)檢測指標(biāo)抗體的確定:
所采用的檢測抗體對均為小鼠雜交瘤單克隆抗體對，其檢測精度和準(zhǔn)確度明顯優(yōu)于多克隆抗體。2.點(diǎn)樣制備檢測指標(biāo)涂層的I吳芯片
用晶芯微陣列芯片點(diǎn)樣儀噴點(diǎn)，點(diǎn)樣針從384孔板吸出抗原噴點(diǎn)與硝酸纖維素膜上，點(diǎn)陣形式為14X15矩形陣列，如圖2所示。當(dāng)點(diǎn)直徑為0.0lmm時，點(diǎn)間距0.01mm，抗原陣列大小為0.56mmX0.6mm,點(diǎn)樣后貼 旲，封閉；最后將芯片干媒、包裝后于4 C保存。3.蛋白芯片組裝
用具有分隔反應(yīng)區(qū)域的器皿將反應(yīng)區(qū)域固定，組裝方式是先將芯片槽螺絲旋松，取出芯片正面向上放在芯片槽內(nèi)，旋緊螺絲使芯片固定在芯片槽中，將墊圈厚壁卡進(jìn)另一側(cè)設(shè)備中，薄壁接觸芯片，將芯片槽放在墊圈上，螺絲固定設(shè)備，(具體見Gentel的SMplex 64Mult1-Array System說明，產(chǎn)品號4-1025)。組裝完成后示意圖如圖1所示。實(shí)施例2:
試劑盒的制備
一種用于檢測食管鱗癌的血清和/或血漿標(biāo)志物的試劑盒，如圖4所示，由樣本稀釋液4，濃縮洗滌液6，牛血清蛋白溶液9，生物素標(biāo)記的人IgG抗體11，抗生物素標(biāo)記的金交聯(lián)試齊IJ 12，檢測液AB (7、8)。各液體為瓶裝，4°C低溫保存，檢查時配套使用。樣本稀釋液4是一種蛋白穩(wěn)定劑；可以由3% BSA和0.05%洗滌劑(pH=7.3)配置而成。購自 Gentel 公司(Gentel Dilution Buffer TM，產(chǎn)品號:Νο.B255)。提供 I 瓶，500ml。用于稀釋血清樣本(體積比1:500或1000)。濃縮洗漆液6是一種中性緩沖液(IOXGentel Wash Buffer TM,產(chǎn)品號:N0.2-1016);可以由洗滌劑配制而成(pH=6.8)。提供250mL，一瓶。使用時用25mL稀釋到225mL超純水中，混勻。牛血清蛋白溶液9由20mg/mL牛血清蛋白配制而成(ρΗ=7.4 )。生物素標(biāo)記的人IgG抗體11為二抗，由以下方法配制而成:由20mg/mL牛血清蛋白稀釋液稀釋到100倍，進(jìn)一步由樣本稀釋液稀釋到50，000倍。提供50ul，一管。抗生物素標(biāo)記的金交聯(lián)試12包含SilverQuant Reagent C (Gentel,產(chǎn)品號:N0.10-2135) 200mg, SilverQuant Conjugate Buffers (Gentel,產(chǎn)品號:N0.10-2134)200mL, SilverQuant Ant1-biotin Gold Conjugate (Gentel,產(chǎn)品號:Νο.10-1031) 100uL。由以下方法配制而成:200mg SilverQuant Reagent C (Gentel,產(chǎn)品號:Νο.10-2135)加入到 200mL SilverQuant Conjugate Buffers (Gentel,產(chǎn)品號:Νο.10-2134)中配制成金交聯(lián)試劑，取8mL再加入 80uL抗生物素的金交聯(lián)試劑(Gentel，產(chǎn)品號:N0.10-1031),混勻。檢測液A、B 使用 Gentel 公司的 SilverQuant Reagent A (產(chǎn)品號 IO-2I32)和SilverQuant Reagent B (產(chǎn)品號10-2112)作為配套檢測液。A液、B液各I瓶，每瓶10mL。實(shí)施例3:蛋白芯片及試劑盒的應(yīng)用及檢測
本發(fā)明所述的用于檢測食管鱗癌標(biāo)志物抗原的蛋白芯片的應(yīng)用，主要采用抗原-抗體-二抗-納米金結(jié)合-銀沉積方法檢測人血液中的食管鱗癌標(biāo)志物抗原，方法是將人血清加于芯片表面，樣本中的抗體分別于固定在芯片上的相應(yīng)的抗原結(jié)合，甩干后加入二抗反應(yīng)，洗去未結(jié)合的二抗，加入金交聯(lián)試劑，與二抗結(jié)合，洗去未結(jié)合的納米金，加入硝酸銀，納米金促銀沉積在金表面，掃描并收集信號，樣本點(diǎn)的灰度與血清中抗體的濃度成正比。在上述用于檢測食管鱗癌標(biāo)志物抗原的蛋白芯片試劑盒的應(yīng)用中，其抗原抗體反應(yīng)及檢測的具體使用方法如下:
1.對噴點(diǎn)抗原、陽性 對照、陰性對照、試劑對照的芯片用3%BSA溶液封閉，室溫2小時，封閉基片表面非特異性位點(diǎn)；
2.甩干封閉液后，室溫放置4小時，進(jìn)行干燥；
3.在芯片的反應(yīng)區(qū)域，加入經(jīng)1:500稀釋的人血清樣品；每孔加75ul，置于恒溫反應(yīng)中22°C，振蕩反應(yīng)I小時，并且用I倍洗滌液洗滌5次；
4.甩出液體，每孔加入二抗75ul，在室溫下，置于恒溫反應(yīng)儀中22°C，在震蕩器上以160轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速孵育蛋白I小時。并且用I倍稀釋的緩沖液洗滌5次；
5.甩出液體，將200 毫克的 aliquot Silver Quant 試劑 C (Gentel 產(chǎn)品號 10 - 2135)加入到200毫升的Silver Quant親和緩沖液中(Gentel,產(chǎn)品號10 - 2134)。取8mL再力口入80uL抗生物素的金交聯(lián)試劑(Gentel，產(chǎn)品號:N0.10-1031),混勻。每孔加75μ 金親和試劑，室溫下震蕩培養(yǎng)45分鐘(160轉(zhuǎn)/分鐘)；
6.甩出液體，將Gentel公司的SilverQuant試劑A (Gentel，產(chǎn)品號10 - 2132)和Silver Quant試劑B (產(chǎn)品號10 - 2112)混合，加入芯片上各反應(yīng)區(qū)域上，每陣列加ιοομ ,氧化變色；
7.用Gentel 檢測系統(tǒng)(Gentel Proteomics Mult1-System TM 產(chǎn)品號 10-1030)進(jìn)行掃描并收集信號，芯片掃描圖見圖1為一張芯片，圖2為一個陣列，依據(jù)食管鱗癌芯片分析軟件(AthenaQuant Analysis Software vl.6)對掃描結(jié)果進(jìn)行分析。8.使用該方法檢測食管鱗癌高發(fā)區(qū)的正常人群、食管鱗癌癌前病變?nèi)巳杭笆彻荀[癌新發(fā)病例各上百例，圖6-圖10為三類人群的食管鱗癌發(fā)生相關(guān)蛋白圖譜。縱坐標(biāo)代表蛋白分子量，單位為道爾頓，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)，共55種。圖6中顯示了 Annexin1、Annexin I1、BIRC5、CA 19-9, CA72-4、CCNBU CCNDU CCNEU CDC25A、CDC25B、CDK1，圖 7 中顯示了 CDK2、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A(A)、CDKN2A(B)、CDKN2A(C)、Clu、CTAGlB、Cyfra 21-1,圖 8 中顯示了 E2F1、EGFR(A)、EGFR (B)、ERBB2、GAGE7、GJA8、HAVCRl、H00K2、ID-1、IGF2BP3、IL-8，圖 9 中顯示了 MGMT、MMP-7、MSH2、MVD、MYC、NFKBl、pol β、PRDX6、PTK2、PTK2abnova、RAR-b,圖 10 中顯示了 S100A4、SERPINB4、Smad3、S0D2、SQSTMU SURF-K TACSTD2 ⑷、TACSTD2(B)、TGF-bl、TP53、TP63，共55種蛋白質(zhì)。三類人群的蛋白圖譜有統(tǒng)計學(xué)差異，可用來篩查和診斷受檢者。將受檢者得出的圖譜與這三類蛋白圖譜進(jìn)行比對，并進(jìn)行統(tǒng)計分析，從而判斷屬于哪一類人群。本發(fā)明的蛋白芯片正是一種能夠同時檢測多個樣本，從而降低檢測成本，檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性也大大提高，同時根據(jù)食管鱗癌發(fā)生不同時期蛋白圖譜及特異蛋白標(biāo)志物來達(dá)到篩查和診斷的目的。經(jīng)過比對驗(yàn)證，在食管鱗癌高發(fā)區(qū)隨機(jī)抽取經(jīng)內(nèi)窺鏡及組織病理學(xué)診斷確診為食管鱗癌病人、食管鱗癌癌前病變病人和正常人各10例，抽取血樣并由其他人做好標(biāo)記，不讓實(shí)驗(yàn)操作者知道。然后將各組血樣打亂由操作人進(jìn)行蛋白質(zhì)芯片盲法檢測，在檢測、分析數(shù)據(jù)及診斷時不知道該血樣屬于哪類人群。將檢測出的蛋白質(zhì)含量及圖譜與之前得出的食管鱗癌、食管鱗癌癌前病變及正常人各類人群蛋白含量平均值和蛋白圖譜進(jìn)行比對，診斷標(biāo)準(zhǔn)為蛋白含量與某類人群蛋白含量均值比較無統(tǒng)計學(xué)差異則認(rèn)定為該類人群。做出診斷后再與標(biāo)記進(jìn)行核對，確定診斷是否正確。本驗(yàn)證結(jié)果共檢出癌癥9例,癌前11例,正常9例，其中癌癥未檢出I例，正確率為90% ;癌前檢錯I例，正確率為90%，正常人未檢出I例，正確率為90%，故本蛋白芯片診斷正確率為90%。表2為抽檢的人群蛋白均值與食管鱗癌、食管鱗癌前病變及正常人蛋白均值比較無差異(β > 0.05)，說明抽檢的人群分別屬于食管鱗癌、食管鱗癌前病變及正常人群。表1.抽檢人群蛋白均值與食管鱗癌、食管鱗癌前病變及正常人蛋白均值比較(/7)
權(quán)利要求
1.一種檢測食管鱗癌標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片，包括:由基片和陣列式分布于基片上的蛋白檢測指標(biāo)以及對照檢測指標(biāo)涂層組成，其特征在于:蛋白檢測指標(biāo)涂層包括多種食管鱗癌標(biāo)志物,對照檢測指標(biāo)涂層包括樣品對照標(biāo)志物、陽性對照標(biāo)志物、陰性對照標(biāo)志物、試劑對照標(biāo)志物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測食管鱗癌標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于:蛋白檢測指標(biāo)涂層至少包括:Annexin1、Annexin I1、BIRC5、CA 19-9, CA72-4、CCNBl、CCNDl、CCNEl、CDC25A、CDC25B、CDKl、CDK2、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A(A)、CDKN2A(B)、CDKN2A(C)、Clu、CTAGIB, Cyfra 21-1, E2F1、EGFR(A)、EGFR(B)、ERBB2、GAGE7、GJA8、HAVCRU H00K2、ID-U IGF2BP3、IL-8、MGMT, MMP-7、MSH2、MVD, MYC, NFKBl、pol β、PRDX6、PTK2、PTK2abnova、RAR_b、S100A4、SERPINB4、Smad3、S0D2、SQSTMU SURF-U TACSTD2 (A)、TACSTD2 (B)、TGF-bl、TP53、TP63 共 55 種腫瘤標(biāo)志物； 樣品對照標(biāo)志物為人血清抗原，陽性對照標(biāo)志物為人IgG抗體，陰性對照標(biāo)志物為抗原點(diǎn)樣所用的稀釋液，試劑對照標(biāo)志物為生物素標(biāo)記的人IgG抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測食管鱗癌標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于:基片是玻璃片基或塑料片基，每種腫瘤標(biāo)志物重復(fù)多次點(diǎn)樣，每種對照標(biāo)志物重復(fù)多次點(diǎn)樣，每個陣列重復(fù)多次，多個食管鱗癌標(biāo)志物蛋白質(zhì)芯片處在I張基片上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測食管鱗癌標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于:每種腫瘤標(biāo)志物重復(fù)3次點(diǎn)樣，每種對照標(biāo)志物重復(fù)3次點(diǎn)樣，每個芯片陣列重復(fù)16次，16個食管鱗癌標(biāo)志物蛋白質(zhì)芯片處于一張基片上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測食管鱗癌標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于:當(dāng)?shù)鞍讬z測指標(biāo)點(diǎn)直徑為0.0lmm,點(diǎn)間距0.0lmm, 一個陣列大小為0.56mmX0.6mm, 一張基片的大小為 25mmX75mm。
6.一種檢測食管鱗癌標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片試劑盒，其特征包括:浸潤液(3)，樣本稀釋液(4 )，金交聯(lián)試劑稀釋液(5 )，濃縮洗滌液(6 )，檢測液AB( 7、8 )，牛血清蛋白溶液(9 )，金交聯(lián)試劑(10)，生物素標(biāo)記的人IgG抗體(11 )，抗生物素標(biāo)記的金交聯(lián)試劑(12);各液體為瓶裝，用紙質(zhì)模版固定于包裝盒內(nèi)，各部分由紙質(zhì)模版固定于一包裝盒內(nèi)，不限放置方式，檢查時配套使用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種檢測食管鱗癌標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片試劑盒，其特征是:所述的牛血清蛋白溶液(9)由20 mg/mL牛血清蛋白配制而成，ph值為7.4。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種檢測食管鱗癌標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片試劑盒，其特征是:檢測液AB (7、8)指配套使用的兩種試劑，檢測液A (7)是一種含有硝酸銀試劑，檢測液B(8)是一種含有朽1檬酸試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高通量多指標(biāo)篩查食管鱗癌特異蛋白標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片，還公開了一種配套使用的試劑盒。選用血清或血漿中的食管鱗癌差異蛋白共55種作為食管鱗癌蛋白標(biāo)志物及蛋白對照制成蛋白質(zhì)芯片，該蛋白質(zhì)芯片由基片和陣列式分布于基片上的蛋白檢測指標(biāo)以及對照檢測指標(biāo)涂層組成。試劑盒內(nèi)裝有配套實(shí)驗(yàn)試劑的檢測液。應(yīng)用本發(fā)明可以確定正常人群、食管鱗癌前病變?nèi)巳杭笆彻荀[癌三類人群的蛋白圖譜，對食管鱗癌的早期篩查，中、晚期診斷和病情監(jiān)測提供一種手段。
文檔編號G01N33/68GK103149369SQ20131008965
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月20日
發(fā)明者黃桂玲, 趙偉, 孫桂菊, 成于飛, 錢振宇, 劉璇 申請人:江蘇元化生命科技有限公司