與相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考

本申請(qǐng)?jiān)?5U.S.C.§119(e)下要求2011年6月8日提交的標(biāo)題為"Design and Development of Novel Detergents for Use in PCR Systems"的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.61/494,812(將其公開內(nèi)容通過(guò)引用以其全部并入本文)的權(quán)益。

領(lǐng)域

本公開涉及用于多種方法包括例如核酸擴(kuò)增反應(yīng)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的改性去污劑。還描述了用于制備改性去污劑的方法。

背景

許多廣為人知的重組DNA技術(shù)涉及復(fù)制或聚合和/或擴(kuò)增DNA。一個(gè)此種實(shí)例是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在PCR過(guò)程中，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶存在時(shí)在兩個(gè)溫度低溫與高溫(例如，55℃與95℃)之間重復(fù)地循環(huán)反應(yīng)。在反應(yīng)過(guò)程中在高溫下花費(fèi)的總時(shí)間取決于循環(huán)的總數(shù)、每一個(gè)循環(huán)的高溫步驟的持續(xù)時(shí)間和斜坡速度(ramp speed)(即，熱循環(huán)儀從一個(gè)溫度變成另一個(gè)溫度的速度)。雖然用于PCR的DNA聚合酶是高度熱穩(wěn)定的，但它們傾向于在高溫下隨時(shí)間變得失活。此外，這些聚合酶還可因被引入具有次優(yōu)濃度的輔因子，或具有次優(yōu)的pH水平，或包括化學(xué)或生物抑制劑的存在的反應(yīng)混合物環(huán)境而變得失活。

在這種條件下穩(wěn)定酶的一種方式是添加穩(wěn)定劑例如表面活性劑。表面活性劑例如去污劑是表面活性化合物，其穩(wěn)定酶的活性形式與其液體環(huán)境之間的界面。例如，通過(guò)添加非離子型去污劑例如NP-40或20穩(wěn)定了Taq DNA聚合酶的活性(Bachmann,等人Nuc.Acids Res.18(5)：1309(1990))。然而，在一些應(yīng)用中，20-穩(wěn)定化的DNA聚合酶具有低的擴(kuò)增效率或?qū)е路翘禺愋援a(chǎn)物的擴(kuò)增。此外，一些去污劑需要高的濃度。此外，還已知一些去污劑(例如，NP-40)具有毒性。因此存在對(duì)改善熱穩(wěn)定DNA聚合酶在溶液中的穩(wěn)定性的去污劑、特別是改善酶穩(wěn)定性而不賦予目前使用的去污劑的任何弊端的去污劑的需要。

附圖概述

本申請(qǐng)中顯示的所有擴(kuò)增曲線圖解地將核酸擴(kuò)增表示為作為循環(huán)次數(shù)(x-軸)的函數(shù)的ΔRn(y-軸)。

圖1.使用根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案擴(kuò)增的1Kb和3Kb PCR產(chǎn)物進(jìn)行的不同濃度的新型去污劑Dt1和Dt2的滴定。

圖2.根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案，在新型去污劑Dt1和Dt2存在時(shí)進(jìn)行的視紫紅質(zhì)基因的擴(kuò)增。

圖3.對(duì)于根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案擴(kuò)增的0.1-1Kb PCR產(chǎn)物，對(duì)0.004％和0.0002％的新型去污劑Dt2相較于20進(jìn)行的比較。

圖4.對(duì)于根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案擴(kuò)增的1-2Kb PCR產(chǎn)物，對(duì)0.004％和0.002％的新型去污劑Dt2相較于20進(jìn)行的比較。

圖5.PCR活性：對(duì)于根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案擴(kuò)增的視紫紅質(zhì)基因產(chǎn)物進(jìn)行的新型去污劑Dt2與單獨(dú)的Brij-58的比較。

圖6.使用根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案擴(kuò)增的Rhod-1043靶序列進(jìn)行的新型去污劑Dt2和Dt4的滴定。

圖7.Dt4與20的比較：根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案進(jìn)行的β-2微球蛋白(B2M)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、大核糖體蛋白(RPLPO)和葡糖醛酸酶β(GUSB)的擴(kuò)增。

圖8.Dt4與20(對(duì)數(shù)標(biāo)度)的比較：根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案進(jìn)行的B2M、GAPDH、RPLPO和GUSB的擴(kuò)增。

圖9.Dt4與20的比較：根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案，通過(guò)Cq表示的不同PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增效率。

圖10.Dt1、Dt3、Dt5、Dt6和Dt7與20的比較：根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案進(jìn)行的擴(kuò)增。

圖11.根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案進(jìn)行的比較Dt4與Brij-58和20(每一種的0.001％和0.0008％)的活性的次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT1)的擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。

圖12.根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案進(jìn)行的比較Dt4與Brij-58和20(每一種的0.0006％和0.0004％)的活性的HPRT1的擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。

圖13.根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案進(jìn)行的比較Dt4與Brij-58和20(每一種的0.001％和0.0008％)的活性的肽基脯氨酰異構(gòu)酶A(PPIA)的擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。

圖14.根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案進(jìn)行的比較Dt4與Brij-58和20(每一種的0.0006％和0.0004％)的活性的PPIA的擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。

圖15.根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案進(jìn)行的比較Dt4與Brij-58和20(每一種的0.0002％和0.0001％)的活性的PPIA的擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。

圖16.根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案進(jìn)行的比較0.002％Dt4與0.01％和20的活性的B2M的擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。

圖17.根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案進(jìn)行的比較0.002％Dt4與0.01％和20的活性的GAPDH的擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。

圖18.根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案進(jìn)行的比較0.002％Dt4與0.01％和20的活性的RPLPO的擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。

圖19.根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案，在兩個(gè)月中以約1周的間隔進(jìn)行的顯示聚合酶在5X緩沖液中的穩(wěn)定性的擴(kuò)增反應(yīng)(Cq)(ACTB(肌動(dòng)蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴(kuò)增反應(yīng))的圖示。

圖20.根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案，在兩個(gè)月中以約1周的間隔進(jìn)行的顯示聚合酶在5X緩沖液中的穩(wěn)定性的擴(kuò)增反應(yīng)(δRn)(ACTB(肌動(dòng)蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴(kuò)增反應(yīng))的圖示。

圖21.兩個(gè)不同的Dt4批次與20(Cq，RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、PGK1(磷酸甘油酸酯激酶1)、B2M、GUSB和HPRT1的擴(kuò)增反應(yīng))的比較。根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案，在兩個(gè)月中以約1周的間隔進(jìn)行的顯示聚合酶在5X緩沖液中的穩(wěn)定性的擴(kuò)增反應(yīng)(Cq)(ACTB(肌動(dòng)蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴(kuò)增反應(yīng))的圖示。

圖22.兩個(gè)不同的Dt4批次與20(δRn，RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、PGK1(磷酸甘油酸酯激酶1)、B2M、GUSB和HPRT1的擴(kuò)增反應(yīng))的比較。根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案，在兩個(gè)月中以約1周的間隔進(jìn)行的顯示聚合酶在5X緩沖液中的穩(wěn)定性的擴(kuò)增反應(yīng)(Cq)(ACTB(肌動(dòng)蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴(kuò)增反應(yīng))的圖示。

圖23.根據(jù)本文中公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施方案進(jìn)行的多種測(cè)定間的Dt4擴(kuò)增的比較。

概述

本文中提供了用于多種用途(包括但不限于核酸擴(kuò)增反應(yīng))的改性去污劑。在一些實(shí)施方案中，提供了通過(guò)化學(xué)修飾簡(jiǎn)單起始材料而合成的離子型和兩性離子型去污劑。觀察了所有中間產(chǎn)物并且使用LC-MS分析對(duì)其進(jìn)行了分析，隨后沒有純化而使用。在一些實(shí)施方案中，提供了新型去污劑例如Dt4(下文中描述的)。這類新型去污劑可用于多種方法，包括例如核酸擴(kuò)增反應(yīng)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。

在某些實(shí)施方案中，所述改性去污劑具有下列結(jié)構(gòu)式：

其中：

R¹是H、(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、或(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代；

R²和R³各自獨(dú)立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂(C₆H₅)或C(CH₃)₃；

R⁴和R⁵各自獨(dú)立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、C₆H₅、CH₂(C₆H₅)、C(CH₃)₃、CH₂CH(CH₃)₂、CHCH₂CH(CH₃)₂、CH₂C₆H₅OH、CH₂C＝CH NH(C₆H₅)、CH₂C＝CHN＝CHNH、CH₂COOH、CH₂CONH₂、(CH₂)₂CONH₂、(CH₂)₂COOH、CH₂SH、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN、CH₂OH、CH(OH)CH₃、(CH₂)₂SCH₃、(CH₂)₃NHC(NH₂)＝NH，或者R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；

和，

每一個(gè)n獨(dú)立地為任何正整數(shù)，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些實(shí)施方案中，R¹是C₈烷基。在某些實(shí)施方案中，R¹是C₁₆烷基。在某些實(shí)施方案中，R²和R³各自獨(dú)立地選自H和CH₃。在某些實(shí)施方案中，R⁴和R⁵各自獨(dú)立地選自H、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN，或者，R⁴與R⁵一起形成5-或6-元環(huán)。

還提供的是用于聚合和/或擴(kuò)增核酸的方法，所述方法包括將靶核酸與至少一種聚合物、引物、dNTP和至少一種式I的新型去污劑混合，和聚合和/或擴(kuò)增靶核酸。在此種方法的一些實(shí)施方案中，使用至少一種引物。在某些實(shí)施方案中，提供了包含至少一種聚合酶、dNTP、至少一種引物和至少一種式I的新型去污劑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物還可包含可檢測(cè)標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括一個(gè)或多個(gè)用于檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記以定量擴(kuò)增的核酸的步驟。在某些實(shí)施方案中，提供了用于通過(guò)在其中包含式I的新型去污劑來(lái)在熱循環(huán)過(guò)程中抑制聚合酶失活的方法。在某些實(shí)施方案中，提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一種式I的新型去污劑以及將其組合以在使所述酶的聚合酶活性穩(wěn)定的條件下形成混合物的方法。在某些實(shí)施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。在某些實(shí)施方案中，本文中描述的方法提供了具有與當(dāng)在常規(guī)(例如，已知的)去污劑例如NP-40和/或20存在時(shí)的擴(kuò)增效率相比較相似(例如，大致相同)或增加的擴(kuò)增效率的擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，本文中描述的新型去污劑可在擴(kuò)增反應(yīng)中替代NP-40和/或20。

在某些實(shí)施方案中，本文中描述的所述至少一種新型去污劑在反應(yīng)混合物中的有效濃度低于常規(guī)去污劑例如NP-40和/或20所需的濃度。在一些這樣的實(shí)施方案中，所述至少一種新型去污劑在反應(yīng)混合物中的有效濃度可直至常規(guī)去污劑例如NP-40和/或20所需的濃度，約為所述濃度，或至少一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍更少于所述濃度。還提供了用于產(chǎn)生新型去污劑的方法。

在某些實(shí)施方案中，本文中提供了包含至少一種式I的新型去污劑的組合物。在某些實(shí)施方案中，提供了包含至少一種聚合酶和至少一種式I的新型去污劑的組合物。在一些實(shí)施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。還提供了包括實(shí)施此種方法或制備此種混合物所必需的試劑等的試劑盒。

發(fā)明詳述

本文中提供了用于多種用途(包括但不限于核酸聚合和/或擴(kuò)增反應(yīng))的新型去污劑。在一些實(shí)施方案中，提供了使用更簡(jiǎn)單的起始材料化學(xué)合成的離子型和兩性離子型去污劑。在一些實(shí)施方案中，提供了新型去污劑例如Dt1、Dt2、Dt3、Dt4、Dt5、Dt6、Dt7、Dt8、Dt9和Dt10(下文中描述的)。這類新型去污劑可被用于多種方法(包括例如核酸聚合和/或擴(kuò)增反應(yīng)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR))中。在一些實(shí)施方案中，式I的新型去污劑的一種或多種的存在可穩(wěn)定反應(yīng)混合物中的聚合酶，減小對(duì)反應(yīng)混合物內(nèi)的聚合酶的抑制，和/或增加聚合酶的聚合和/或擴(kuò)增效率。如此，提供了包含至少一種聚合酶和至少一種式I的新型去污劑的反應(yīng)混合物。此種反應(yīng)混合物還可包含一種或多種dNTP以及至少一種核酸擴(kuò)增引物(例如，PCR引物)。

在某些實(shí)施方案中，本文中提供了包含至少一種式I的新型去污劑的組合物。在某些實(shí)施方案中，提供了包含至少一種聚合酶和至少一種式I的新型去污劑的組合物。在一些實(shí)施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。還提供了試劑盒，所述試劑盒包括此種反應(yīng)混合物的組分以及任選地還有實(shí)施此種方法或用于制備此種混合物所必需的其它試劑。

本文中描述了新型去污劑及制備和使用所述去污劑的方法。術(shù)語(yǔ)“新型去污劑”通常是指式I的去污劑。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“去污劑”可以指一種或多種新型去污劑，任選地包括一種或多種“常規(guī)去污劑”。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“常規(guī)去污劑”是指除本文中描述的式I下的去污劑外的去污劑。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“去污劑”可僅指新型去污劑，或一種或多種新型去污劑與一種或多種常規(guī)去污劑的組合。類似地，術(shù)語(yǔ)“至少一種新型去污劑”的使用可以指一種或多種單獨(dú)的、與另一種新型去污劑一起的和/或與一種或多種常規(guī)去污劑一起的新型去污劑。因此，在一些實(shí)施方案中，本文中描述的組合物和/或反應(yīng)混合物還可包含一種或多種常規(guī)去污劑例如但不限于非離子型去污劑、Brij-58、CHAPS、正-十二烷基-b-D-麥芽糖苷、NP-40、十二烷基硫酸鈉(SDS)、X-15、X-35、X-45、X-100、X-102、X-114、X-165、X-305、X-405、X-705、20和/或其它去污劑也可以是適合的，如可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的(關(guān)于示例性去污劑，參見，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2008/0145910；美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2008/0064071；美國(guó)專利No.6,242,235；美國(guó)專利No.5,871,975和美國(guó)專利No.6,127,155；將其全部通過(guò)引用整體并入本文)。其它去污劑也可以是適合的，如將由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的。

在某些實(shí)施方案中，所述新型去污劑具有下列結(jié)構(gòu)式：

其中：

R¹是H、(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基或(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代；

R²和R³各自獨(dú)立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂(C₆H₅)或C(CH₃)₃；

R⁴和R⁵各自獨(dú)立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、C₆H₅、CH₂(C₆H₅)、C(CH₃)₃、CH₂CH(CH₃)₂、CHCH₂CH(CH₃)₂、CH₂C₆H₅OH、CH₂C＝CHNH(C₆H₅)、CH₂C＝CHN＝CHNH、CH₂COOH、CH₂CONH₂、(CH₂)₂CONH₂、(CH₂)₂COOH、CH₂SH、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN、CH₂OH、CH(OH)CH₃、(CH₂)₂SCH₃、(CH₂)₃NHC(NH₂)＝NH，或者R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；

和，

每一個(gè)n獨(dú)立地為任何正整數(shù)，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些實(shí)施方案中，R¹是C₈烷基。在某些實(shí)施方案中，R¹是C₁₆烷基。在某些實(shí)施方案中，R²和R³各自獨(dú)立地選自H和CH₃。在某些實(shí)施方案中，R⁴和R⁵各自獨(dú)立地選自H,(CH₂)_nNH,(CH₂)_nN，或者，R⁴與R⁵一起形成5-或6-元環(huán)。

可通過(guò)使用更簡(jiǎn)單的起始化合物材料制備式I的去污劑以提供新型和/或改性去污劑及其性質(zhì)。使用LC-MS分析分析了中間產(chǎn)物并且不純化而進(jìn)行下一個(gè)步驟。

用于制備本文中描述的新型去污劑的方法包括順此地將化合物A(如方法1中顯示的)(例如，1個(gè)當(dāng)量)、甲基三苯氧基碘化鏻(例如，4個(gè)當(dāng)量)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(例如，6mL)組合至鋁箔覆蓋的圓底燒瓶(例如，50mL)中。然后，在適當(dāng)?shù)臏囟?例如，室溫)，適當(dāng)?shù)臍夥?例如，氬氣)下攪拌反應(yīng)物充足的時(shí)間(例如，3天)。在充足的時(shí)間(例如，3天)后，可監(jiān)控(例如，使用分析液相色譜/質(zhì)譜(LC-MS))反應(yīng)的進(jìn)展。中間產(chǎn)物模式的出現(xiàn)可確認(rèn)改性去污劑的形成?？梢苑蛛x或(通常)可以不分離該預(yù)期的中間產(chǎn)物(中間產(chǎn)物B)?？上蛟撝虚g產(chǎn)物添加氨基酸酯鹽酸鹽(例如，2當(dāng)量)和Et₃N(例如，2當(dāng)量)?？稍谶m當(dāng)?shù)臏囟?例如，65℃)加熱所述反應(yīng)混合物適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如，3-4天)?？墒褂梅治鯨C-MS監(jiān)控反應(yīng)的進(jìn)展。隨后通常使反應(yīng)混合物冷卻至適當(dāng)?shù)臏囟?例如，室溫)和濃縮(例如，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上)至適當(dāng)?shù)捏w積(例如，約2mL)。隨后可通過(guò)制備HPLC純化濃縮的粗制混合物。隨后可將所需的級(jí)分合并和濃縮(例如，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上)以提供所需的產(chǎn)物(例如，如在方法1中，以產(chǎn)生離子型去污劑Dt1、Dt3、Dt5、Dt7、Dt9、Dt11和Dt12)。隨后可使該產(chǎn)物經(jīng)歷水解反應(yīng)(例如，使用2NNaOH)。隨后可攪拌(例如，在室溫)反應(yīng)混合物直至全部起始材料被消耗，如通過(guò)分析LC-MS確定的。隨后可進(jìn)行中和(例如，利用安伯來(lái)特(Amberlite))以產(chǎn)生兩性離子型終產(chǎn)物(例如，Dt2、Dt4、Dt6、Dt10)或陰離子型終產(chǎn)物(Dt8)。

因此，用于開發(fā)式I的新型去污劑的示例性方法示于下面：

其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和n是如上文中描述的，X選自H,CH₃,CH₂CH₃,CH₂(C₆H₅)和C(CH₃)₃。式I的新型去污劑可以是例如離子型的(例如，陽(yáng)離子型、陰離子型、兩性離子型)。使用方法I制造的示例性新型去污劑示于下面：

其中n是如上文中所描述的。在某些實(shí)施方案中每一個(gè)n獨(dú)立地是5、6、7、8、9、10、15、20、25或30。

在某些實(shí)施方案中，提供了用于聚合和/或擴(kuò)增核酸的方法，所述方法包括將靶核酸與至少一種聚合物、引物、dNTP和至少一種式I的新型去污劑混合，以及聚合和/或擴(kuò)增靶核酸。在某些實(shí)施方案中，所述方法可包括至少一種引物。在某些實(shí)施方案中，提供了包含至少一種聚合酶、dNTP、至少一種引物和至少一種式I的新型去污劑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物。在某些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物還可包含可檢測(cè)的標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括一個(gè)或多個(gè)用于檢測(cè)和/或定量可檢測(cè)標(biāo)記以檢測(cè)和/或定量擴(kuò)增的核酸的步驟。

在某些實(shí)施方案中，提供了用于通過(guò)在其中包含式I的新型去污劑而在熱循環(huán)過(guò)程中抑制聚合酶的失活的方法。在某些實(shí)施方案中，提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一種式I的新型去污劑，以及將其組合以在使所述酶的聚合酶活性穩(wěn)定化的條件下形成混合物的方法。在某些實(shí)施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。在某些實(shí)施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。在某些實(shí)施方案中，本文中描述的方法提供了具有與當(dāng)常規(guī)(例如，已知的)去污劑例如NP-40和/或20存在時(shí)的擴(kuò)增效率相比相似(例如，大致相同)或增加的擴(kuò)增效率的擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，本文中描述的新型去污劑可在擴(kuò)增反應(yīng)中替代NP-40和/或20。

在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物中所述至少一種式I的新型去污劑(例如，Dt1、Dt2、Dt3、Dt4、Dt5、Dt6、Dt7、Dt8、Dt9、Dt10、Dt1l和/或Dt 12)的“有效濃度”(例如，將支持?jǐn)U增反應(yīng)例如PCR的量)可以比常規(guī)去污劑(例如，NP-40和/或20)所需的有效濃度更高、與其相同或比其更低。在某些此種實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物中的所述至少一種新型去污劑(例如，Dt4)的有效濃度可直至常規(guī)去污劑(例如NP-40和/或20)所需的有效濃度，約為此濃度，或至少一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍更少于此濃度。例如通常將NP-40或20以約0.01％或更低的濃度(例如，如通過(guò)從儲(chǔ)液至反應(yīng)混合物中的稀釋確定的)包含在反應(yīng)中。在某些實(shí)施方案中，可以以比常規(guī)去污劑(例如，相較于0.01％20，對(duì)于Dt4為0.002％；圖11-18)更低的濃度(例如，作為百分比(即，w/v或v/v))使用本文中描述的新型去污劑。

在某些實(shí)施方案中，提供了用于聚合和/或擴(kuò)增核酸的方法，所述方法包括將目標(biāo)核酸(例如，靶核酸)與至少一種聚合酶、引物、dNTP和至少一種式I的新型去污劑混合，以及聚合和/或擴(kuò)增所述靶核酸。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括至少一種引物。在某些實(shí)施方案中，提供了核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，所述混合物包含至少一種聚合酶、dNTP、至少一種引物和至少一種式I的改性去污劑。在其它實(shí)施方案中，提供了使用此類混合物的方法?？墒褂枚喾N反應(yīng)和系統(tǒng)中的任一種來(lái)擴(kuò)增靶核酸。

如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增(amplification)”、“核酸擴(kuò)增”或“擴(kuò)增(amplifying)”是指產(chǎn)生多個(gè)拷貝的核酸模板，或產(chǎn)生多個(gè)與核酸模板互補(bǔ)的核酸序列拷貝。所述術(shù)語(yǔ)(包括術(shù)語(yǔ)“聚合”)也可指延伸核酸模板(例如，通過(guò)聚合)。擴(kuò)增反應(yīng)可以是聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。然而，任何已知的擴(kuò)增反應(yīng)可適合于本文中描述的用途?？稍诒疚闹惺褂猛ǔＲ庵赴泻怂岬摹爸笖?shù)”增加的術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”來(lái)描述所選核酸靶序列的數(shù)目的線性和指數(shù)增加。

術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增反應(yīng)混合物”和/或“預(yù)混合物”可指包含用于擴(kuò)增靶核酸的各種(一些或全部)試劑的水性溶液。還可使用固體支持物(例如，陣列)來(lái)進(jìn)行這樣的反應(yīng)。還可按用戶的意愿，以單重或多重形式進(jìn)行所述反應(yīng)。這些反應(yīng)通常包括酶、水性緩沖劑、鹽、擴(kuò)增引物、靶核酸和核苷三磷酸。取決于上下文，所述混合物可以是完全或不完全擴(kuò)增反應(yīng)混合物。用于擴(kuò)增靶核酸的方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員可得的任何方法?？墒褂糜糜谠黾雍怂岚行蛄械目截惖娜魏误w外手段。這類手段包括線性、對(duì)數(shù)和/或任何其它擴(kuò)增法。雖然本公開通?？蓪CR討論為核酸擴(kuò)增反應(yīng)，預(yù)期本文中描述的改性去污劑在其它類型的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中應(yīng)當(dāng)是有效的，所述其它類型的核酸擴(kuò)增反應(yīng)包括聚合酶介導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng)(例如解螺旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)、重組酶-聚合酶擴(kuò)增(RPA)和滾鏈擴(kuò)增(rolling chain amplification)(RCA))和連接酶介導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng)(例如連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)和每種的缺口版本(gap-version))以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)(例如LDR與PCR)的組合(參見，例如，美國(guó)專利6,797,470)。例如，所述改性去污劑可用于例如各種連接介導(dǎo)的反應(yīng)，其中例如與PCR引物相反，使用連接探針。其它示例性方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR；參見，例如，美國(guó)專利No.4,683,202；4,683,195；4,965,188；和/或5,035,996)、等溫法(使用一種或多種RNA聚合酶(參見，例如，PCT公布No.WO 2006/081222)、鏈置換(參見，例如，美國(guó)專利No.RE39007E)、引物分子的部分破壞(參見，例如，PCT公布No.WO 2006/087574))、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(參見，例如，Wu,等人,Genomics 4：560-569(1990))和/或Barany,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193(1991))、QβRNA復(fù)制酶系統(tǒng)(參見，例如，PCT公布No.WO 1994/016108)、基于RNA轉(zhuǎn)錄的系統(tǒng)(例如，TAS,3SR)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)(參見，例如，美國(guó)專利No.5,854,033；美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2004/265897；Lizardi等人Nat.Genet.19：225-232(1998)；和/或Baner等人Nucleic Acid Res.,26：5073-5078(1998))以及鏈置換擴(kuò)增(SDA)(Little,等人Clin.Chem.45:777-784(1999))等等。這些系統(tǒng)，與許多本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的其它系統(tǒng)一起，可適合用于聚合和/或擴(kuò)增靶核酸以用于本文中描述的用途。

“擴(kuò)增效率”可指可被定量以測(cè)定拷貝數(shù)的任何產(chǎn)物(例如，術(shù)語(yǔ)可指PCR擴(kuò)增子、LCR連接產(chǎn)物和/或類似的產(chǎn)物)。特定的去污劑在特定擴(kuò)增反應(yīng)中是否按所需起作用可通過(guò)進(jìn)行至少兩個(gè)分開的擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)確定，每一個(gè)反應(yīng)分別在去污劑存在和不存在時(shí)進(jìn)行，定量在每一個(gè)反應(yīng)中發(fā)生的擴(kuò)增。還可在分開的反應(yīng)混合物中測(cè)試去污劑的不同濃度或組合，以確定對(duì)擴(kuò)增效率的影響。擴(kuò)增和/或聚合效率可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)測(cè)定，包括但不限于校準(zhǔn)稀釋曲線和斜率計(jì)算的確定、使用如Hellemans等人,Genome Biology 8:R19(2007)中描述的qBase軟件來(lái)確定、使用如由Livak和Schmittgen,Methods 25:402(2001)描述的δδCq(ΔΔCq)計(jì)算的確定或通過(guò)如由Pfaffl,Nucl.Acids Res.29:e45(2001)描述的方法進(jìn)行的確定，將全部所述文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文。

用于聚合和/或擴(kuò)增核酸的示例性方法包括例如聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)。例如，聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)可以是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在其它實(shí)施方案中，核酸擴(kuò)增反應(yīng)是多重反應(yīng)。例如，用于聚合和/或擴(kuò)增以及檢測(cè)適合本文中描述的用途的核酸的示例性方法是商購(gòu)可得的，如(參見，例如，美國(guó)專利No.4,889,818；5,079,352；5,210,015；5,436,134；5,487,972；5,658,751；5,210,015；5,487,972；5,538,848；5,618,711；5,677,152；5,723,591；5,773,258；5,789,224；5,801,155；5,804,375；5,876,930；5,994,056；6,030,787；6,084,102；6,127,155；6,171,785；6,214,979；6,258,569；6,814,934；6,821,727；7,141,377；和/或7,445,900,將其全部通過(guò)引用整體并入本文)。通常如下進(jìn)行測(cè)定：使用具有5'-至-3'核酸酶活性的核酸聚合酶、能夠與靶多核苷酸雜交的引物和能夠在相對(duì)于所述引物的3’處與所述靶多核苷酸雜交的寡核苷酸探在所述靶多核苷酸上進(jìn)行核酸擴(kuò)增。寡核苷酸探針通常包括可檢測(cè)標(biāo)記(例如，熒光報(bào)告分子)和能夠淬滅所述報(bào)告分子的熒光的淬滅分子。通常，可檢測(cè)標(biāo)記和淬滅分子是單個(gè)探針的一部分。隨著擴(kuò)增進(jìn)行，聚合酶消化探針以將可檢測(cè)標(biāo)記與淬滅分子分開。在反應(yīng)過(guò)程中監(jiān)控可檢測(cè)標(biāo)記(例如，熒光)，其中標(biāo)記的檢測(cè)對(duì)應(yīng)于核酸擴(kuò)增的發(fā)生(例如，信號(hào)越強(qiáng)，則擴(kuò)增的量越大)。測(cè)定的變化(例如，LNA^TM摻入的測(cè)定)在本領(lǐng)域是已知的并且適合用于本文中描述的方法。

適合于本文中描述的用途的另一個(gè)示例性系統(tǒng)在置換雜交法中利用雙鏈探針(參見，例如，Morrison等人Anal.Biochem.,18:231-244(1989)；和/或Li,等人Nucleic Acids Res.,30(2,e5)(2002))。在此種方法中，探針通常包括具有不同長(zhǎng)度的兩個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸，其中一個(gè)包括可檢測(cè)標(biāo)記而另一個(gè)包括淬滅分子。當(dāng)未結(jié)合至靶核酸時(shí)，淬滅劑抑制來(lái)自可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)。探針在與靶核酸置換雜交后變得可檢測(cè)?？墒褂枚鄠€(gè)探針，每一個(gè)探針包含不同的可檢測(cè)標(biāo)記，從而可在單一反應(yīng)中質(zhì)詢多種靶核酸。

用于聚合和/或擴(kuò)增以及檢測(cè)適用于本文中描述的用途的靶核酸的另外的示例性方法包括“分子信標(biāo)”，其是單鏈發(fā)夾形狀寡核苷酸探針。在靶序列存在時(shí)，探針展開，結(jié)合并且發(fā)射信號(hào)(例如，熒光)。分子信標(biāo)通常包括至少4個(gè)組件：1)“環(huán)”，其是與靶序列互補(bǔ)的18-30個(gè)核苷酸的區(qū)域；2)在環(huán)的任一端發(fā)現(xiàn)的并且彼此互補(bǔ)的兩個(gè)5-7個(gè)核苷酸的“莖”；3)在5'末端，可檢測(cè)標(biāo)記；和4)在3'末端，當(dāng)探針以閉合環(huán)形狀存在時(shí)(例如，未結(jié)合至靶核酸)阻止可檢測(cè)標(biāo)記發(fā)射信號(hào)的淬滅部分。因此，在互補(bǔ)靶存在時(shí)，信標(biāo)的“莖”部分分開，從而導(dǎo)致探針與靶雜交。其它類型的分子信標(biāo)也是已知的并且可適合用于本文中描述的方法。分子信標(biāo)可用于多種測(cè)定系統(tǒng)中。一個(gè)此種系統(tǒng)是基于核酸序列的擴(kuò)增其為用于聚合RNA和/或?qū)⑵鋽U(kuò)增成雙鏈DNA而無(wú)需溫度循環(huán)的單步驟等溫過(guò)程(single step isothermal process)。NASBA反應(yīng)通常需要禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)、逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、T7RNA聚合酶、RNA酶H和兩個(gè)寡核苷酸引物。擴(kuò)增后，可使用分子信標(biāo)來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增的靶核酸。分子信標(biāo)的其它用途在本領(lǐng)域是已知的，并將適合用于本文中描述的方法。

Scorpions^TM系統(tǒng)是另一種可用于本文中描述的方法的示例性測(cè)定形式。Scorpions^TM引物是雙功能分子，其中引物共價(jià)地連接至探針，連同可檢測(cè)標(biāo)記(例如，熒光團(tuán))和淬滅可檢測(cè)標(biāo)記的熒光的非可檢測(cè)的淬滅劑部分。在靶核酸存在時(shí)，可檢測(cè)標(biāo)記與淬滅劑分開，這導(dǎo)致從可檢測(cè)標(biāo)記發(fā)射的信號(hào)增加。通常，用于擴(kuò)增反應(yīng)中的引物包括5'末端的探針元件以及發(fā)夾環(huán)的起始處的“PCR阻斷子”元件(例如，六乙二醇(HEG)單體(Whitcombe,等人Nat.Biotech.17：804-807(1999))。探針通常包括在一端具有可檢測(cè)標(biāo)記并且在另一端具有淬滅劑的自我互補(bǔ)的莖序列。在初始擴(kuò)增循環(huán)(例如，PCR)中，引物與靶雜交并且因聚合酶的作用而發(fā)生延伸。Scorpions^TM系統(tǒng)可用于使用多個(gè)探針來(lái)檢查和鑒定點(diǎn)突變，所述多個(gè)探針可被差異標(biāo)記以在探針間進(jìn)行區(qū)分。使用PCR作為示例，在完成一個(gè)延伸循環(huán)后，新合成的靶區(qū)域?qū)⒈贿B接至與探針相同的鏈。在第二循環(huán)的變性和退火后，探針與靶雜交。發(fā)夾序列然后與一部分新產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物雜交。這引起檢測(cè)標(biāo)記與淬滅劑的分離，從而引起信號(hào)的發(fā)射。這樣的標(biāo)記探針的其它用途在本領(lǐng)域是已知的并將適用于本文中描述的方法。

可用于所公開的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的核酸聚合酶可以是起作用來(lái)進(jìn)行所需的反應(yīng)的任何核酸聚合酶，包括例如原核生物、真菌、病毒、噬菌體、植物和/或真核生物核酸聚合酶。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“DNA聚合酶”是指使用核酸鏈作為模板從頭合成DNA鏈的酶。DNA聚合酶使用現(xiàn)存的DNA或RNA作為DNA合成的模板，沿著其所讀取的模板鏈催化脫氧核糖核苷酸聚合。新合成的DNA鏈與模板鏈互補(bǔ)。DNA聚合酶僅可將游離核苷酸添加至新形成的鏈的3'-羥基末端。其通過(guò)將一磷酸核苷從脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)轉(zhuǎn)移至正在生長(zhǎng)的寡核苷酸鏈的3'-羥基來(lái)合成寡核苷酸。這導(dǎo)致新鏈以5'-至-3'方向延長(zhǎng)。由于DNA聚合酶僅可添加核苷酸至預(yù)先存在的3'-OH基團(tuán)，以開始DNA合成反應(yīng)，因此DNA聚合酶需要可向之添加第一核苷酸的引物。適當(dāng)?shù)囊锟砂琑NA或DNA的寡核苷酸或其嵌合體(例如，RNA/DNA嵌合引物)。DNA聚合酶可以是天然存在的DNA聚合酶或具有上述活性的天然酶的變體。例如，其可包括具有鏈置換活性的DNA聚合酶、缺乏5'-至-3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶、具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶或具有內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶。

適合的核酸聚合酶還可包括全酶、全酶的功能性部分、嵌合聚合酶或可實(shí)現(xiàn)核酸分子的合成的任何經(jīng)修飾的聚合酶。在本公開中，DNA聚合酶還可包括聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶和/或多核苷酸磷酸化酶。聚合酶的非限制性實(shí)例可包括例如，T7DNA聚合酶,真核生物線粒體DNA聚合酶γ,原核生物DNA聚合酶I、II、III、IV,和/或V；真核生物聚合酶α、β、γ、δ、ε、ε、δ、ι和/或κ；大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I；大腸桿菌DNA聚合酶IIIα和/或ε亞基；大腸桿菌聚合酶IV、大腸桿菌聚合酶V；水生棲熱菌(T.aquaticus)DNA聚合酶I；嗜熱脂肪芽胞桿菌(B.stearothermophilus)DNA聚合酶I；廣古菌門聚合酶；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)；釀酒酵母聚合酶4；跨損傷合成聚合酶；逆轉(zhuǎn)錄酶；和/或端粒酶。可使用的適當(dāng)?shù)臒岱€(wěn)定DNA聚合酶的非限制性實(shí)例包括Taq、Tfl、Tfi、Pfu和Vent^TM DNA聚合酶、具有減小的或不顯著的3'-至-5'外切核酸酶活性的任何經(jīng)遺傳工程化的DNA聚合酶(例如，SuperScript^TMDNA聚合酶)和/或經(jīng)遺傳工程化的DNA聚合酶(例如，具有活性位點(diǎn)突變F667Y或F667Y的等同物(例如，在Tth中)的那些DNA聚合酶、ThermoSequenase^TM)、Gold、Therminator I、Therminator II、Therminator III、Therminatorγ(全部可獲得自New England Biolabs、Beverly、MA)，和/或它們的任意衍生物和片段。其它核酸聚合酶也可以是適合的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的。

在另一個(gè)方面，本公開提供了用于聚合和/或擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列(例如，靶序列)的反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物還可包含可檢測(cè)標(biāo)記。所述方法還可包括一個(gè)或多個(gè)用于檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記以定量所擴(kuò)增的核酸的步驟。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)標(biāo)記”是指多種指示擴(kuò)增的信號(hào)分子的任一種。例如，綠和其它DNA結(jié)合染料是可檢測(cè)標(biāo)記。此種可檢測(cè)標(biāo)記可包括或可以是例如核酸嵌入劑或非嵌入劑。如本文中所用，嵌入劑是能夠非共價(jià)插入雙鏈核酸分子的堆積堿基對(duì)之間的試劑或部分。非嵌入劑是不插入雙鏈核酸分子的試劑或部分。核酸結(jié)合劑可直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)?？墒褂美鐭晒夂?或吸光度來(lái)直接檢測(cè)信號(hào)，或可使用例如下述來(lái)間接檢測(cè)信號(hào)，其中可檢測(cè)地受到與雙鏈核酸的接近影響的任何部分或配體是適合的，例如連接至核酸結(jié)合劑的經(jīng)取代的標(biāo)記部分或結(jié)合配體。核酸結(jié)合劑通常必需在結(jié)合至雙鏈核酸時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，所述可檢測(cè)的信號(hào)與當(dāng)所述試劑在溶液中或結(jié)合至單鏈核酸時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)是可區(qū)分的。例如，當(dāng)嵌入雙鏈DNA時(shí)，嵌入劑例如溴化乙錠熒光比當(dāng)結(jié)合至單鏈DNA、RNA時(shí)或在溶液中時(shí)更強(qiáng)(參見，例如，美國(guó)專利No.5,994,056；6,171,785；和/或6,814,934)。類似地，當(dāng)結(jié)合至單鏈核酸時(shí)放線菌素D在UV/VIS光譜的紅色部分中發(fā)熒光，當(dāng)結(jié)合至雙鏈核酸時(shí)其在UV/VIS光譜的綠色部分中發(fā)熒光。在另一個(gè)實(shí)例中，已報(bào)導(dǎo)光反應(yīng)補(bǔ)骨脂素4-氨甲基-4-5',8-三甲基補(bǔ)骨脂素(AMT)在長(zhǎng)波長(zhǎng)顯示減少的吸收，在嵌入雙鏈DNA中后發(fā)熒光(Johnson等人Photochem.&Photobiol,33:785-791(1981)。例如，美國(guó)專利No.4,257,774描述了熒光嵌合劑與DNA的直接結(jié)合(例如，乙錠(ethidium)鹽、道諾霉素,米帕林和吖啶橙,4',6-二脒基-α-苯基吲哚)。非嵌入劑(例如，本文中描述的小溝結(jié)合劑例如Hoechst 33258,偏端霉素,紡綞菌素)也可能是適用的。例如，Hoechst 33258(Searle,等人Nucl.Acids Res.18(13):3753-3762(1990))隨著靶的量的遞增顯示出改變的熒光。小溝結(jié)合劑在本文中其它地方被更詳細(xì)地描述。

其它DNA結(jié)合染料是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的，并且可單獨(dú)使用或與測(cè)定系統(tǒng)的其它試劑和/或組分組合使用。示例性DNA結(jié)合染料可包括例如吖啶類(例如，吖啶橙、吖啶黃)、放線菌素D(Jain、等人J.Mol.Biol.68:21(1972))、氨茴霉素、BOBO^TM-1、BOBO^TM-3、BO-PRO^TM-1、cbromomycin、DAPI(Kapuseinski等人Nucl.Acids Res.6(112)：3519(1979))、道諾霉素、偏端霉素(例如，偏端霉素D)、美國(guó)專利No.7,387,887中描述的染料、玫瑰樹堿、乙錠鹽(例如，溴化乙錠)、熒光香豆素(fluorcoumanin)、熒光嵌合劑(如美國(guó)專利No.4,257,774中描述的)、(Cambrex Bio Science Rockland Inc.,Rockland,Me.)、Hoechst 33258(Searle和Embrey,Nucl.Acids Res.18:3753-3762(1990))、Hoechst 33342、胡銨、JO-PRO^TM-1、LIZ染料、LO-PRO^TM-1、米帕林、光輝霉素、NED染料、紡綞菌素、4',6-二脒基-α-苯基吲哚、原黃素、POPO^TM-1、POPO^TM-3、PO-PRO^TM-1、碘化丙啶、多吡啶釕、S5、Gold、綠I(美國(guó)專利No.5,436,134和5,658,751)、綠II、藍(lán)、綠、43、44、45、藍(lán)、11、13、15、16、20、23、噻唑橙(Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wis.)、TOTO^TM-3、和(Molecular Probes、Inc.、Eugene、OR)等等。綠I(參見，例如，美國(guó)專利No.5,436,134；5,658,751；和/或6,569,927)例如已被用于監(jiān)控PCR反應(yīng)。其它DNA結(jié)合染料也可以是適合的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的。

對(duì)于本文中描述的用途，可將一種或多種可檢測(cè)標(biāo)記和/或淬滅劑連接至一個(gè)或多個(gè)引物和/或探針(例如，可檢測(cè)標(biāo)記)。當(dāng)游離或當(dāng)結(jié)合至靶核酸之一時(shí)，可檢測(cè)標(biāo)記可發(fā)射信號(hào)。當(dāng)接近另一個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記時(shí)，所述可檢測(cè)標(biāo)記也可發(fā)射信號(hào)。也可將所述檢測(cè)標(biāo)記與淬滅劑分子一起使用，從而只有當(dāng)與淬滅劑分子不足夠靠近時(shí)信號(hào)才是可檢測(cè)的。例如，在一些實(shí)施方案中，測(cè)定系統(tǒng)可使可檢測(cè)標(biāo)記從淬滅分子釋放。數(shù)種可檢測(cè)標(biāo)記中的任意均可被用于標(biāo)記用于本文中描述的方法的引物和探針。如上所述，在一些實(shí)施方案中，可將可檢測(cè)標(biāo)記連接至探針，其可被摻入引物中，或其可另外地結(jié)合至擴(kuò)增的靶核酸(例如，可檢測(cè)的核酸結(jié)合劑例如嵌入或非嵌入染料)。當(dāng)使用超過(guò)一種可檢測(cè)標(biāo)記時(shí)，每一種可檢測(cè)標(biāo)記應(yīng)當(dāng)在它們的光譜性質(zhì)上不同，從而所述標(biāo)記可彼此相區(qū)分，或從而所述可檢測(cè)標(biāo)記一起發(fā)射不被任一單獨(dú)的可檢測(cè)標(biāo)記發(fā)射的信號(hào)。示例性可檢測(cè)標(biāo)記包括例如，熒光染料或熒光團(tuán)(例如，可被光激發(fā)以發(fā)射熒光或磷光的化學(xué)基團(tuán))、能夠淬滅來(lái)自熒光供體染料的熒光信號(hào)的“接受者染料”等。合適的可檢測(cè)標(biāo)記可包括例如熒光素(例如，5-羧基-2,7-二氯熒光素；5-羧基熒光素(5-FAM)；5-羥色胺(5-HAT)；6-JOE；6-羧基熒光素(6-FAM)；FITC；6-羧基-1,4-二氯-2',7'-二氯熒光素(TET)；6-羧基-1,4-二氯-2',4',5',7'-四氯熒光素(HEX)；6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基熒光素(JOE)；Alexa熒光團(tuán)(例如，350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750)；熒光團(tuán)(例如，492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-X、650/665-X、665/676、FL、FL ATP、F1-神經(jīng)酰胺、R6G SE、TMR、TMR-X綴合物、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE)、香豆素類(例如，7-氨基-4-甲基香豆素、AMC、AMCA、AMCA-S、AMCA-X、ABQ、CPM甲基香豆素、香豆素鬼筆環(huán)肽、羥基香豆素、CMFDA、甲氧基香豆素)、鈣黃綠素、鈣黃綠素AM、鈣黃綠素藍(lán)、鈣染料(例如，鈣深紅、鈣綠、鈣橙、熒光增白劑)、級(jí)聯(lián)(Cascade)藍(lán)、級(jí)聯(lián)黃；Cy^TM染料(例如，3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7)、藍(lán)綠色GFP、環(huán)AMP Fluorosensor(FiCRhR)、熒光蛋白(例如，綠色熒光蛋白(例如，GFP.EGFP)、藍(lán)色熒光蛋白(例如，BFP、EBFP、EBFP2、藍(lán)銅礦、mKalama1)、藍(lán)綠色熒光蛋白(例如，ECFP、Cerulean、CyPet)、黃色熒光蛋白(例如，YFP、Citrine、Venus、YPet)、FRET供體/接受者對(duì)(例如，熒光素/四甲基羅丹明、IAEDANS/熒光素、EDANS/dabcyl、熒光素/熒光素、FL、熒光素/QSY7和QSY9)、和LysoSensor^TM(例如，藍(lán)DND-22、藍(lán)-白DPX、黃HCK-123、綠DND-26、紅DND-99、LysoSensor^TM藍(lán)DND-167、LysoSensor^TM綠DND-189、LysoSensor^TM綠DND-153、LysoSensor^TM黃/藍(lán)DND-160、LysoSensor^TM黃/藍(lán)10,000MW葡聚糖)、Oregon綠(例如，488、488-X、500、514)；羅丹明(例如，110、123、B、B 200、BB、BG、B extra、5-羧基四甲基羅丹明(5-TAMRA)、5GLD、6-羧基羅丹明6G、麗絲胺、麗絲胺羅丹明B、Phallicidine、鬼筆環(huán)肽、紅、Rhod-2、ROX(6-羧基-X-羅丹明)、5-ROX(羧基-X-羅丹明),磺基羅丹明B can C,磺基羅丹明G Extra,TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明)、四甲基羅丹明(TRITC),WT)、德克薩斯紅、德克薩斯紅-X、VIC和例如美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2009/0197254(通過(guò)引用整體并入本文)中描述的其它標(biāo)記等等，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。還可使用其它的可檢測(cè)標(biāo)記(參見，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2009/0197254(通過(guò)引用整體并入本文))，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。任意這些系統(tǒng)和可檢測(cè)標(biāo)記，以及許多其它系統(tǒng)和可檢測(cè)標(biāo)記可被用于檢測(cè)經(jīng)擴(kuò)增的靶核酸。

一些可檢測(cè)的標(biāo)記可以是基于序列的(在本文中也稱為“基因座特異性可檢測(cè)標(biāo)記”)，例如5'核酸酶探針。此種探針可包含一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記。各種可檢測(cè)標(biāo)記在本領(lǐng)域中是已知的，例如本文中描述的探針(也參見美國(guó)專利No.5,538,848(通過(guò)引用整體并入本文))各種莖-環(huán)分子信標(biāo)(參見，例如，美國(guó)專利No.6,103,476和5,925,517以及Tyagi和Kramer,Nature Biotechnology 14:303-308(1996))、無(wú)莖或線性信標(biāo)(參見，例如，PCT公布No.WO 99/21881；美國(guó)專利No.6,485,901)、PNA Molecular Beacons^TM(參見，例如，美國(guó)專利No.6,355,421和6,593,091)、線性PNA信標(biāo)(參見，例如，Kubista等人,SPIE 4264:53-58(2001))、非FRET探針(參見，例如，美國(guó)專利No.6,150,097)、探針(美國(guó)專利No.6,548,250)、莖-環(huán)和雙體(duplex)Scorpions^TM探針(Solinas等人，Nucleic Acids Research 29:E96(2001)和美國(guó)專利No.6,589,743)、凸環(huán)探針(美國(guó)專利No.6,590,091)、假結(jié)探針(美國(guó)專利No.6,589,250)、cyclicons(美國(guó)專利No.6,383,752)、MGB Eclipse^TM探針(Epoch Biosciences)、發(fā)夾探針(美國(guó)專利No.6,596,490)、肽核酸(PNA)點(diǎn)亮(light-up)探針(Svanvik,等人Anal Biochem 281:26-35(2001))、自我裝配納米顆粒探針、二茂鐵修飾的探針，例如在美國(guó)專利No.6,485,901；Mhlanga等人,Methods 25:463-471(2001)；Whitcombe等人，Nature Biotechnology.17:804-807(1999)；Isacsson等人，Molecular Cell Probes.14:321-328(2000)；Svanvik等人,Anal Biochem.281:26-35(2000)；Wolffs等人，Biotechniques 766:769-771(2001)；Tsourkas等人,Nucleic Acids Research.30:4208-4215(2002)；Riccelli等人，Nucleic Acids Research 30:4088-4093(2002)；Zhang等人，Acta Biochimica et Biophysica Sinica(Shanghai).34:329-332(2002)；Maxwell等人，J.Am.Chem.Soc.124:9606-9612(2002)；Broude等人，Trends Biotechnol.20:249-56(2002)；Huang等人，Chem Res.Toxicol.15：118-126(2002)；和Yu等人，J.Am.Chem.Soc.14：11155-11161(2001)中所描述的；(www.qiagen.com)、(French,等人Mol.Cell.Probes 15:363-374(2001))、置換探針(Li,等人Nucl.Acids Res.30:e5(2002))、HybProbes(Cardullo,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8790-8794(1988))、MGB Alert(www.nanogen.com)、Q-PNA(Fiandaca,等人Genome Res.11:609-611(2001))、(www.Promega.com)、LUX^TM引物(Nazarenko,等人Nucleic Acids Res.30:e37(2002))、DzyNA引物(Todd,等人Clin.Chem.46:625-630(2000))?？蓹z測(cè)標(biāo)記還可包含淬滅可檢測(cè)標(biāo)記的熒光的非可檢測(cè)淬滅劑部分，包括例如黑洞淬滅劑(Biosearch)、Iowa淬滅劑(IDT)、QSY淬滅劑(Molecular Probes)以及Dabsyl和磺酸Dabsyl/羧酸淬滅劑(Epoch)?？蓹z測(cè)標(biāo)記還可包含兩個(gè)探針，其中例如熒光團(tuán)在一個(gè)探針上，淬滅劑在另一個(gè)探針上，其中兩個(gè)探針一起在靶上的雜交淬滅信號(hào)，或其中在靶上的雜交通過(guò)熒光的變化改變信號(hào)特征。示例性的系統(tǒng)還可包括FRET、水楊酸/DTPA配體系統(tǒng)(參見，例如，Oser等人Angew.Chem.Int.Engl.29(10)：1167(1990))、置換雜交、同源探針和/或歐洲專利No.EP 070685和/或美國(guó)專利No.6,238,927中描述的測(cè)定?？蓹z測(cè)標(biāo)記還可包含具有SO₃而非羧酸基團(tuán)的熒光素染料的磺化衍生物、熒光素的亞磷酰胺形式、Cy5的亞磷酰胺形式(例如可獲自Amersham)。上述所有參考資料均通過(guò)引用整體并入本文。

其它實(shí)施方案提供了用于通過(guò)在其中包含式I的新型去污劑來(lái)在熱循環(huán)過(guò)程中抑制聚合酶的失活的方法。還提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一種式I的新型去污劑，以及將它們組合以在使所述酶的聚合酶活性穩(wěn)定化的條件下形成混合物的方法。聚合酶可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何聚合酶，包括但不限于本文中描述的那些。在某些實(shí)施方案中，所述聚合酶是熱穩(wěn)定的。

本文中描述的去污劑和方法可用于檢測(cè)和/或定量多種來(lái)自測(cè)試樣品的靶核酸。靶核酸是測(cè)定系統(tǒng)被設(shè)計(jì)來(lái)鑒定或檢測(cè)其在測(cè)試樣品中的存在(或不存在)和/或?qū)ζ溥M(jìn)行定量的任何核酸。此類核酸可包括例如感染性試劑的那些(例如，病毒、細(xì)菌、寄生物等)、疾病過(guò)程例如癌癥、糖尿病等的那些，或用于測(cè)免疫免疫應(yīng)答。示例性的“測(cè)試樣品”包括各種類型的樣品，例如生物學(xué)樣品。示例性的生物學(xué)樣品包括例如，體液(例如，血液、唾液和脊髓液)、組織樣品、食物(例如，肉)或飲料(例如，乳)產(chǎn)品等。經(jīng)表達(dá)的核酸可包括例如其表達(dá)(或其缺少)與醫(yī)學(xué)病況例如感染性疾病(例如，細(xì)菌、病毒、真菌、原生動(dòng)物感染)或癌癥相關(guān)的基因。本文中描述的方法還可用于檢測(cè)藥物、食物或飲料產(chǎn)品中的污染物(例如，細(xì)菌、病毒、真菌和/或原生動(dòng)物)。本文中描述的方法還可用于在野生型等位基因的存在下檢測(cè)稀有的等位基因(例如，在10⁶-10⁹個(gè)野生型等位基因的存在下的1個(gè)突變等位基因)。所述方法可用于例如檢測(cè)最小殘留疾病(例如，緩解過(guò)程中稀少的殘余癌細(xì)胞，特別是p53基因或先前在腫瘤內(nèi)鑒定的其它腫瘤抑制基因中的突變)和/或測(cè)量突變負(fù)荷(例如，存在于正常組織例如血液或尿中的特定體細(xì)胞突變的頻率)。

還提供了用于進(jìn)行本文中描述的方法的試劑盒。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“試劑盒”是指相關(guān)組分(通常是一種或多種化合物或組合物)的包裝套件。所述試劑盒可包括一對(duì)用于聚合和/或擴(kuò)增至少一種來(lái)自樣品的靶核酸的寡核苷酸、一種或多種新型去污劑(例如，和/或常規(guī)去污劑，或包含所述去污劑的任一種的混合物)、生物催化劑(例如，DNA聚合酶)和/或用可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記的相應(yīng)的一種或多種探針。試劑盒還可包括含有待用于對(duì)照反應(yīng)的預(yù)確定的靶核酸的樣品。試劑盒還可任選地包括儲(chǔ)液、緩沖劑、酶、可檢測(cè)標(biāo)記或檢測(cè)所需的試劑、可用于完成擴(kuò)增反應(yīng)的試管、膜等。在一些實(shí)施方案中，包括了多個(gè)引物組。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可包括如下的一種或多種：例如緩沖劑(例如，Tris)、一種或多種鹽(例如，KCl)、甘油、dNTP(dA,dT,dG,dC,dU)、重組BSA(牛血清白蛋白)、染料(例如，ROX被動(dòng)參照染料)、一種或多種去污劑(例如，Dt4)、一種或多種熱起始PCR機(jī)制、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和/或明膠(例如，魚或牛來(lái)源)。還包括本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的特定系統(tǒng)和試劑盒的其它實(shí)施方案。

為了更清楚和簡(jiǎn)明地描述和指出本公開的主題，為特定術(shù)語(yǔ)提供了下列定義，所述術(shù)語(yǔ)用于下列描述和所附權(quán)利要求中。貫穿本說(shuō)明書，特定術(shù)語(yǔ)的舉例說(shuō)明應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是非限制性的實(shí)例。

除非上下文明確地另有所指，否則單數(shù)形式“一個(gè)/一種(a)”、“一個(gè)/一種(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指代物。如本文中所用，近似語(yǔ)言在整個(gè)說(shuō)明書和權(quán)利要求中可被用于修飾可允許變化而不導(dǎo)致與其相關(guān)的基本功能的變化的任何定量表示。因此，由術(shù)語(yǔ)例如“約”修飾的值將不限于所指定的精確值。必要時(shí)，提供了范圍，且那些范圍包含其間的所有亞范圍。

在本公開中，除非明確地另有所指，否則單數(shù)的使用可包括復(fù)數(shù)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開將理解的，單數(shù)是唯一的功能性實(shí)施方案。因此，例如，“一個(gè)/一種(a)”可意指超過(guò)一個(gè)/一種，“一個(gè)實(shí)施方案”可意指該描述用于多個(gè)實(shí)施方案。用語(yǔ)“和/或”表示簡(jiǎn)寫方式，其顯示特定的組合以組合、及交替分開地被設(shè)想。

將理解，在本教導(dǎo)中討論的溫度、濃度、時(shí)間等之前存在隱含的“約”，從而微小和非實(shí)質(zhì)性的偏差在本文中的本教導(dǎo)的范圍內(nèi)。此外，“包含”、“含有”、“包括”、“包含有”、“包括”、“包括的”、“包括”、“包括有”和“含有”的使用無(wú)意是限制性的。要理解，前述一般描述和詳細(xì)描述僅僅是示例性和解釋性的而不限制本發(fā)明。

除非上面的說(shuō)明書中明確指出，否則上面說(shuō)明書中引述“包含”各種組分的實(shí)施方案也被理解為“由所引述的組分組成”或“基本上由所引述的組分組成”；說(shuō)明書中引述“由各種組分組成”的實(shí)施方案也理解為“包含”或“基本上由所引述的組分組成”；說(shuō)明書中引述“基本上由各種組分組成”的實(shí)施方案也理解為“由所引述的組分組成”或“包含”所引述的組分(該可互換性不應(yīng)用于這些術(shù)語(yǔ)在權(quán)利要求中的使用)。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”或“核苷酸堿基”是指核苷磷酸。其包括但不限于天然核苷酸、合成核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或替代置換部分或通用核苷酸(例如，肌苷)。核苷磷酸可以是一磷酸核苷、二磷酸核苷或三磷酸核苷。核苷磷酸中的糖部分可以是戊糖例如核糖，磷酸酯化位點(diǎn)可對(duì)應(yīng)于連接至核苷的戊糖的C-5位置的羥基。核苷酸可以是但不限于脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)或核糖核苷三磷酸(NTP)。核苷酸可使用按字母順序的字母(字母名稱)表示。例如，A表示腺苷(即，包含核堿基腺嘌呤的核苷酸)，C表示胞苷，G表示鳥苷，T表示胸苷，U表示尿苷以及I表示肌苷。N代表任意核苷酸(例如，N可以是A,C,G,T/U或I中的任意)。還可使用天然存在和合成的類似物，包括例如次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5,N4-ethencytosine、4-氨基吡唑[3,4-d]嘧啶和6-氨基-4-羥基[3,4-d]嘧啶等等。寡核苷酸的核苷酸單元還可具有交聯(lián)功能(例如烷化劑)。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指核苷酸的寡聚物或其衍生物。所述寡聚物可以是DNA、RNA或其類似物(例如，硫代磷酸類似物)。寡聚物還可包括經(jīng)修飾的堿和/或主鏈(例如，經(jīng)修飾的磷酸連接或經(jīng)修飾的糖部分)。賦予寡聚物穩(wěn)定性和/或其它優(yōu)勢(shì)的合成主鏈的非限制性實(shí)例可包括硫代磷酸連接、肽核酸、鎖定核酸(Singh,等人Chem.Commun.4:455-456(1998))、木糖核酸和/或其類似物。寡核苷酸可以是任意長(zhǎng)度“n”。例如，n可以是1、2、4、6、8、12、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40等核苷酸數(shù)目中的任意。多核苷酸結(jié)構(gòu)(N)_n代表由n數(shù)目的核苷酸N組成的寡核苷酸(例如，(I)₈代表具有序列IIIIIIII的寡核苷酸；或(A)₁₂代表具有序列AAAAAAAAAAAA的寡核苷酸)。其它類型的寡核苷酸或多核苷酸也是適合使用的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員由本公開將理解的。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“核酸”是指核苷酸或其衍生物的聚合物。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“靶核酸”是指希望在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中被擴(kuò)增的核酸。例如，靶核酸包括核酸模板。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“序列”是指寡核苷酸或核酸的核苷酸序列。貫穿本說(shuō)明書，每當(dāng)寡核苷酸/核酸由字母的序列表示時(shí)，核苷酸從左至右以5'至3'的順序。例如，由序列(I)n(A)n(其中n＝1、2、3、4等)表示的寡核苷酸代表其中5'末端核苷酸是肌苷并且3'末端核苷酸是腺苷的寡核苷酸。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)混合物”是指試劑或試劑溶液的組合，其被用于進(jìn)行化學(xué)分析或生物測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物包含用于進(jìn)行核酸(DNA)合成/擴(kuò)增反應(yīng)的所有必需組分。如上所述，這樣的反應(yīng)混合物可包括至少一個(gè)適于聚合和/或擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的擴(kuò)增引物對(duì)和至少一種去污劑。如上所述，適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)混合物還可包括含有進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)所需的組分(例如，通常不包括引物對(duì))的“預(yù)混合物”?？蓪⑺鲱A(yù)混合物與一種或多種去污劑組合以形成反應(yīng)混合物。本文中還涉及反應(yīng)混合物的其它實(shí)施方案，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“試劑溶液”或“適于進(jìn)行DNA合成反應(yīng)的溶液”是指通常用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)或DNA合成的任何或所有溶液。它們包括但不限于在DNA擴(kuò)增方法中使用的溶液、在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中使用的溶液等。適于DNA合成反應(yīng)的溶液可包含緩沖劑、鹽和/或核苷酸。其還可包含待擴(kuò)增的引物和/或DNA模板。一種或多種試劑溶液通常被包含在本文中描述的反應(yīng)混合物或預(yù)混合物中。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“引物”或“引物序列”是指與靶核酸序列(例如，待擴(kuò)增的DNA模板)雜交以引發(fā)核酸合成反應(yīng)的短的線性寡核苷酸。引物可以是RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列(例如，包含RNA和DNA)。引物可包含天然、合成或經(jīng)修飾的核苷酸。引物長(zhǎng)度的上限和下限被經(jīng)驗(yàn)性地確定。引物長(zhǎng)度的下限是在核酸擴(kuò)增反應(yīng)條件下與靶核酸雜交后形成穩(wěn)定的雙鏈體所需的最小長(zhǎng)度。非常短的引物(通常少于3個(gè)核苷酸長(zhǎng))在這樣的雜交條件下不與靶核酸形成熱動(dòng)力學(xué)上穩(wěn)定的雙體。上限通常由在靶核酸中除預(yù)先確定的核酸序列外的區(qū)域中具有雙體形成的概率來(lái)確定。一般地，適合的引物長(zhǎng)度在例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40(等)核苷酸長(zhǎng)度的約任意的范圍內(nèi)。

如本文中所用，“烷基”是指任選地線性或分支的碳?xì)浠衔铮淇梢允峭耆柡偷?、單或多不飽和的。此外，如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“烷基”還包括在碳?xì)浠衔镦溒蔚囊粋€(gè)或多個(gè)碳原子處的一個(gè)或多個(gè)置換。

如本文中所用，“芳基”是指具有單環(huán)或多個(gè)稠環(huán)的芳香族部分，其中的每一個(gè)任選地和獨(dú)立地被H、鹵素、氰基、疊氮基、磺酸、磺酸的堿鹽或銨鹽、羧酸的生物相容性鹽、硝基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基或烷基酰氨基取代。

如本文中所用，“取代的”是指其中一個(gè)或多個(gè)氫原子被一個(gè)或多個(gè)非氫原子、官能團(tuán)或部分替代的分子。例如，未取代的氮是-NH₂，而經(jīng)取代的氮是-NHCH₃。示例性的取代基包括但不限于鹵素，例如氟和氯、烷基、烯烴、炔烴、硫酸鹽、磺基、磺酸鹽、氨基、銨、酰胺基、腈基、烷氧基、苯氧基、芳基、苯基、多環(huán)芳基和雜環(huán)。

某些實(shí)施方案在下面的實(shí)施例中被進(jìn)一步描述。這些實(shí)施方案僅作為示例被提供，并且無(wú)意以任何方式限制權(quán)利要求的范圍。

實(shí)施例

新型去污劑的開發(fā)

使用下面描述的方法1開發(fā)了新型去污劑Dt1、Dt2、Dt3、Dt4、Dt5、Dt6、Dt7、Dt8、Dt9、D10、Dt11和Dt12：

其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和n是如上文中所描述的，X選自H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂(C₆H₅)和C(CH₃)₃。式I的新型去污劑可以是例如離子性的(例如，陽(yáng)離子性、陰離子性、兩性離子性)。

如方法1中所示，將化合物A(1個(gè)當(dāng)量)、甲基三苯氧基碘化鏻(4個(gè)當(dāng)量)和N,N-二甲基甲酰胺(6mL)順次添加至50mL鋁箔覆蓋的圓底燒瓶中。然后使反應(yīng)在室溫下于氬氣氛下攪拌3天。3天后，使用分析LC-MS監(jiān)控反應(yīng)的進(jìn)展。中間產(chǎn)物模式的出現(xiàn)將確認(rèn)其形成。不分離該預(yù)期的中間產(chǎn)物(中間產(chǎn)物B)。向從先前步驟獲得的該中間產(chǎn)物添加氨基酸酯鹽酸鹽(2個(gè)當(dāng)量)和Et₃N(2個(gè)當(dāng)量)。將反應(yīng)混合物在65℃下加熱3-4天。使用分析LC-MS監(jiān)控反應(yīng)的進(jìn)展。使反應(yīng)混合物冷卻至室溫，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上使其濃縮至約2mL。通過(guò)制備型HPLC純化濃縮的粗制混合物。合并所有所需的級(jí)分，并將其在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮以提供所需的產(chǎn)物(離子性去污劑Dt1、Dt3、Dt5、Dt7、Dt9、Dt11、Dt12)。然后使該產(chǎn)物經(jīng)歷使用2N NaOH的水解反應(yīng)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物直至全部起始材料被消耗，如在分析LC-MS上觀察到的，隨后用中和以提供如下所示的最終兩性離子性產(chǎn)物Dt2、Dt4、Dt6、Dt10和陰離子性產(chǎn)物：

其中n是如上文中描述的。在某些實(shí)施方案中，每一個(gè)n獨(dú)立地是5、6、7、8、9、10、15、20、25或30。

測(cè)試Dt1和Dt2支持通過(guò)聚合酶的核酸擴(kuò)增的能力。在0.1％NP-40和0.1％20(對(duì)照反應(yīng))，Dt1或Dt2存在下使用Taq聚合酶通過(guò)PCR擴(kuò)增1kb和3kb的兩個(gè)不同的核酸靶標(biāo)(分別為Rhod-1043和Rhod-3637)。如圖1中顯示的，Dt1和Dt2以與20相當(dāng)?shù)姆绞街С謹(jǐn)U增反應(yīng)。當(dāng)以0.008％至0.0006％的濃度被包括在50μl反應(yīng)中時(shí)，Dt1支持1kb擴(kuò)增子(Rhod-1043)和3Kb擴(kuò)增子(Rhod-3637)的擴(kuò)增。當(dāng)以0.04％至0.0001％(在0.0008％時(shí)觀察到一些擴(kuò)增)的濃度被包含在50μl反應(yīng)中時(shí)，Dt2支持1kb擴(kuò)增子(Rhod-1043)和3Kb擴(kuò)增子(Rhod-3637)的擴(kuò)增。

還使用視紫紅質(zhì)基因引物擴(kuò)增約4Kb擴(kuò)增子(Rhod-3920、Rhod-4181和Rhod-4089)(圖2；“儲(chǔ)液B”：20mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA、50％甘油、1mM DTT、蒸餾水)來(lái)測(cè)試Dt1。PCR條件是94℃進(jìn)行2分鐘；35個(gè)循環(huán)(在94℃進(jìn)行15秒，在60℃進(jìn)行30秒，在72℃進(jìn)行4分鐘30秒)；在72℃下延伸10分鐘。當(dāng)以0.008％至0.001％的濃度被包含在50μl反應(yīng)中時(shí)，Dt1支持Rhod-3920和Rhod-4181的擴(kuò)增。當(dāng)以0.008％至0.001％的濃度被包含在50μl反應(yīng)中時(shí)，Dt1支持Rhod-4089的擴(kuò)增。

圖3顯示出0.004％和0.002％Dt1在擴(kuò)增0.1至1Kb的擴(kuò)增子方面與0.004％20相當(dāng)。圖4顯示出0.004％和0.002％Dt1在擴(kuò)增1-2kb的擴(kuò)增子方面與0.004％20相當(dāng)。

圖5提供了Brij-58與Dt1的比較。如其中所示，Dt1(0.04％至0.006％)以與Brij-58(0.04％至0.0004％)或20(0.002％)相當(dāng)?shù)姆绞街С謹(jǐn)U增。數(shù)據(jù)顯示這不是由于用于修飾的Brij-58起始材料的污染。

圖6比較Dt1與Dt2的活性。如其中顯示的，這兩種改性去污劑都支持?jǐn)U增。當(dāng)以0.04％至0.001％的濃度包含在反應(yīng)混合物中時(shí)，Dt1被顯示支持?jǐn)U增。當(dāng)以0.04％至0.006％的濃度包含在反應(yīng)混合物中時(shí)，Dt2被顯示支持?jǐn)U增。

圖7和8提供Dt4與20之間在擴(kuò)增4個(gè)不同靶標(biāo)(B2M、GAPDH、RPLPO和GUSB)方面的比較。如其中顯示的，在0.01％Dt4或0.01％20存在時(shí)的擴(kuò)增提供了相似的結(jié)果。

圖9提供了Dt4與20之間在擴(kuò)增各種不同靶標(biāo)方面的比較。如其中顯示的，在Dt4或20存在時(shí)的擴(kuò)增提供了相似的結(jié)果。

圖10闡釋了在Dt1、Dt3、Dt5、Dt6和Dt7的存在下擴(kuò)增的結(jié)果。如其中所顯示的，擴(kuò)增得到了每一種去污劑的支持，雖然在這些實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件下，Dt4是最高水平，其次是Dt1。Dt5和Dt7顯示相似的活性，隨后是Dt6。

圖11-15顯示在擴(kuò)增HPRT1或PPIA方面比較不同濃度時(shí)Dt4與Brij-58和20的活性的擴(kuò)增曲線。如其中所示，在所有所測(cè)試的濃度(0.001％至0.0001％)中，Dt4以與Brij-58和20相當(dāng)?shù)姆绞街С謹(jǐn)U增反應(yīng)。

圖16-18闡釋了Dt4在不同的反應(yīng)中可以以比20更低的濃度被使用(例如，0.002％Dt4相較于0.01％20)。

圖19和20顯示Dt4在“5X”緩沖液(Tris(pH 8.0)、KC1和BSA)中，在至少2個(gè)月中是穩(wěn)定的(例如，其保持其支持?jǐn)U增的能力)。

圖21和22提供了兩個(gè)Dt4不同批次相對(duì)于20支持不同靶標(biāo)擴(kuò)增的能力的比較。

圖23闡釋了Dt4在多種測(cè)定中支持?jǐn)U增。

將本公開中引述的所有參考資料通過(guò)引用整體并入本文。雖然已在優(yōu)選實(shí)施方案方面描述了某些實(shí)施方案，應(yīng)理解對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員可產(chǎn)生變化和修飾。因此，所附權(quán)利要求意欲覆蓋在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)的所有此類等同變化。

本說(shuō)明書還包括下列內(nèi)容：

1.式I的化合物：

其中：

R¹是H、(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中所述取代的芳基或取代的苯基被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、或(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代；

R²和R³各自獨(dú)立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂(C₆H₅)或C(CH₃)₃；

R⁴和R⁵各自獨(dú)立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、C₆H₅、CH₂(C₆H₅)、C(CH₃)₃、CH₂CH(CH₃)₂、CHCH₂CH(CH₃)₂、CH₂C₆H₅OH、CH₂C＝CHNH(C₆H₅)、CH₂C＝CHN＝CHNH、CH₂COOH、CH₂CONH₂、(CH₂)₂CONH₂、(CH₂)₂COOH、CH₂SH、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN、CH₂OH、CH(OH)CH₃、(CH₂)₂SCH₃、(CH₂)₃NHC(NH₂)＝NH，或者R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個(gè)n獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

2.實(shí)施方式1的化合物，其中：

R¹是(C₈-C₁₆)烷基或(C₈-C₁₆)取代的烷基；

R²和R ³各自獨(dú)立地為H或CH₃；

R⁴和R⁵各自獨(dú)立地為H、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN，或者，R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個(gè)n獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

3.實(shí)施方式1的化合物，其中所述化合物選自：

4.一種包含聚合酶和至少一種式I的化合物的組合物：

其中：

R¹是H、(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、或(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代；

R²和R³各自獨(dú)立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂(C₆H₅)或C(CH₃)₃；

R⁴和R⁵各自獨(dú)立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、C₆H₅、CH₂(C₆H₅)、C(CH₃)₃、CH₂CH(CH₃)₂、CHCH₂CH(CH₃)₂、CH₂C₆H₅OH、CH₂C＝CHNH(C₆H₅)、CH₂C＝CHN＝CHNH、CH₂COOH、CH₂CONH₂、(CH₂)₂CONH₂、(CH₂)₂COOH、CH₂SH、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN、CH₂OH、CH(OH)CH₃、(CH₂)₂SCH₃、(CH₂)₃NHC(NH₂)＝NH，或者R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個(gè)n獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

5.實(shí)施方式4的組合物，其中：

R¹是(C₈-C₁₆)烷基或(C₈-C₁₆)取代的烷基；

R²和R³各自獨(dú)立地為H或CH₃；

R⁴和R⁵各自獨(dú)立地為H、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN，或者，R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個(gè)n獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

6.實(shí)施方式4的組合物，其中所述化合物選自：

7.實(shí)施方式4的組合物，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定的。

8.包括儲(chǔ)備或反應(yīng)組合物的試劑盒，所述組合物包含聚合酶和至少一種式I的化合物：

其中：

R¹是H、(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、或(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代；

R²和R³各自獨(dú)立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂(C₆H₅)或C(CH₃)₃；

R⁴和R⁵各自獨(dú)立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、C₆H₅、CH₂(C₆H₅)、C(CH₃)₃、CH₂CH(CH₃)₂、CHCH₂CH(CH₃)₂、CH₂C₆H₅OH、CH₂C＝CHNH(C₆H₅)、CH₂C＝CHN＝CHNH、CH₂COOH、CH₂CONH₂、(CH₂)₂CONH₂、(CH₂)₂COOH、CH₂SH、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN、CH₂OH、CH(OH)CH₃、(CH₂)₂SCH₃、(CH₂)₃NHC(NH₂)＝NH，或者R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個(gè)n獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

9.實(shí)施方式8的試劑盒，其中：

R¹是(C₈-C₁₆)烷基或(C₈-C₁₆)取代的烷基；

R²和R³各自獨(dú)立地為H或CH₃；

R⁴和R⁵各自獨(dú)立地為H、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN，或者，R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個(gè)n獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

10.實(shí)施方式8的試劑盒，其中所述化合物選自：

11.實(shí)施方式8的試劑盒，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定的。

12.試劑盒，其包含含有聚合酶和至少一種實(shí)施方式1的化合物的組合物。

13.試劑盒，其包含含有聚合酶和至少一種實(shí)施方式3的化合物的組合物。

14.用于增加聚合酶的效率的方法，所述方法包括下列步驟：

a)將靶核酸與至少一種聚合酶、至少一種引物、dNTP和至少一種實(shí)施方式1的化合物混合；

b)擴(kuò)增所述靶核酸。

15.實(shí)施方式14的方法，其中所述增加的效率與當(dāng)聚合酶在NP-40或20而非所述化合物存在時(shí)的效率相同。

16.實(shí)施方式14的方法，其中所述增加的效率比當(dāng)聚合酶在NP-40或20而非所述化合物存在時(shí)的效率更大。

17.實(shí)施方式14的方法，其中所述去污劑的有效濃度為至少一倍至十倍更少于常規(guī)去污劑所需的濃度。

18.實(shí)施方式17的方法，其中所述常規(guī)去污劑是NP-40或20。

19.實(shí)施方式17或18的方法，其中所述去污劑在5X緩沖液中至少2個(gè)月是穩(wěn)定的。

20.用于檢測(cè)樣品中的靶核酸的方法，所述方法包括下述步驟：

a)形成反應(yīng)混合物，其包含至少一種聚合酶、至少一種引物、dNTP、至少一種實(shí)施方式1的化合物和可檢測(cè)標(biāo)記；

b)擴(kuò)增所述靶核酸；和

c)檢測(cè)從所述可檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)生的指示所述靶核酸在所述樣品中的存在和/或量的信號(hào)。

21.用于在熱循環(huán)過(guò)程中抑制聚合酶的失活的方法，所述方法包括在熱循環(huán)過(guò)程中使所述聚合酶與實(shí)施方式1的化合物接觸。

22.實(shí)施方式21的方法，其中所述聚合酶失活的抑制與當(dāng)聚合酶在NP-40或20而非所述化合物存在時(shí)的聚合酶失活的抑制相同。

23.實(shí)施方式21的方法，其中所述聚合酶失活的抑制比當(dāng)聚合酶在NP-40或20而非所述化合物存在時(shí)聚合酶失活的抑制更大。

24.一種方法，其包括組合具有聚合酶活性的酶和實(shí)施方式1的化合物以在使所述酶的所述聚合酶活性穩(wěn)定化的條件下形成混合物。

25.實(shí)施方式24的方法，其中所述穩(wěn)定化與當(dāng)聚合酶在NP-40或20而非所述化合物存在時(shí)聚合酶活性的穩(wěn)定化相同。

26.實(shí)施方式24的方法，其中所述穩(wěn)定化大于當(dāng)聚合酶在NP-40或20而非所述化合物存在時(shí)的聚合酶活性的穩(wěn)定化。

27.實(shí)施方式14-26的任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定的。

28.一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，其包含：

a)至少一種聚合酶；

b)dNTP；和

c)至少一種實(shí)施方式1的化合物。

29.實(shí)施方式28的反應(yīng)混合物，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定的。

30.一種用于聚合靶核酸的方法，其包括下述步驟：

a)使所述靶核酸與反應(yīng)混合物中的至少一種聚合酶和至少一種實(shí)施方式1的化合物組合；和

b)聚合所述靶核酸。

31.一種用于聚合靶核酸的方法，其包括下述步驟：

a)使所述靶核酸與反應(yīng)混合物中的至少一種聚合酶和至少一種實(shí)施方式3的化合物組合；和

b)聚合所述靶核酸。

32.一種用于擴(kuò)增靶核酸的方法，其包括下述步驟：

a)使所述靶核酸與作為反應(yīng)混合物的一部分的至少一種聚合酶和至少一種實(shí)施方式1的化合物組合；和

b)聚合所述靶核酸。

33.一種用于擴(kuò)增靶核酸的方法，其包括下述步驟：

a)使所述靶核酸與作為反應(yīng)混合物的一部分的至少一種聚合酶和至少一種實(shí)施方式3的化合物組合；和

b)聚合所述靶核酸。

34.實(shí)施方式30-33的任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包含至少一種核酸引物和dNTP。

35.實(shí)施方式30-33的任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)所述靶核酸的聚合或擴(kuò)增。

36.實(shí)施方式35的方法，其中使用可檢測(cè)標(biāo)記來(lái)檢測(cè)所述靶核酸的聚合或擴(kuò)增。

37.實(shí)施方式36的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是引物或探針的一部分。

38.實(shí)施方式35的方法，其中定量所述靶核酸的聚合或擴(kuò)增。

39.實(shí)施方式30-33的任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合酶選自T7DNA聚合酶、真核生物線粒體DNA聚合酶γ、原核生物DNA聚合酶I、原核生物DNA聚合酶II、原核生物DNA聚合酶III、原核生物DNA聚合酶IV、原核生物DNA聚合酶V、真核生物聚合酶α、真核生物聚合酶β、真核生物聚合酶γ、真核生物聚合酶δ、真核生物聚合酶ε、真核生物聚合酶ε、真核生物聚合酶δ、真核生物聚合酶ι、真核生物聚合酶κ；大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶IIIα亞基、大腸桿菌DNA聚合酶IIIε亞基、大腸桿菌聚合酶IV、大腸桿菌聚合酶V、水生棲熱菌DNA聚合酶I、嗜熱脂肪芽胞桿菌DNA聚合酶I、廣古菌門聚合酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)、釀酒酵母聚合酶4、跨損傷合成聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定聚合酶和端粒酶。

40.實(shí)施方式39的方法，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶選自Taq DNA聚合酶、Tfi DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Vent^TMDNA聚合酶、具有減小的3’-至-5’外切核酸酶活性的聚合酶、SuperScript^TMDNA聚合酶、遺傳工程的DNA聚合酶、具有活性位點(diǎn)突變F667Y的聚合酶、具有活性位點(diǎn)F667Y的等同物的聚合酶、Tth聚合酶、ThermoSequenase^TM、Therminator I、Therminator II、Therminator III、Therminatorγ、它們的衍生物和片段。

41.實(shí)施方式40的方法，其中所述熱穩(wěn)定的聚合酶是Taq DNA聚合酶。

42.實(shí)施方式40的方法，其中所述熱穩(wěn)定的聚合酶是Tfl DNA聚合酶。

43.一種用于檢測(cè)樣品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)形成反應(yīng)混合物，其包含至少一種聚合酶、至少一種引物、dNTP和至少一種實(shí)施方式1的化合物以及可檢測(cè)標(biāo)記；

b)擴(kuò)增所述靶核酸；和

c)檢測(cè)從所述可檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)生的指示所述靶核酸在所述樣品中存在的信號(hào)。

44.實(shí)施方式43的方法，其使用實(shí)施方式3的化合物。

45.一種方法，其用于通過(guò)在熱循環(huán)過(guò)程中使聚合酶與實(shí)施方式1的化合物接觸來(lái)在熱循環(huán)過(guò)程中抑制聚合酶的失活。

46.實(shí)施方式45的方法，其使用實(shí)施方式3的化合物。

47.一種方法，其包括在使酶的聚合酶活性穩(wěn)定化的條件下，使具有聚合酶活性的所述酶與實(shí)施方式1的所述化合物組合以形成混合物。

48.實(shí)施方式47的方法，其使用實(shí)施方式3的化合物。

49.一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，其包含至少一種聚合酶、dNTP、至少一種引物和至少一種實(shí)施方式1的化合物。

50.實(shí)施方式49的反應(yīng)混合物，其使用實(shí)施方式3的化合物。

51.用于產(chǎn)生改性去污劑的方法，其包括：

a)順次地組合化合物A、甲基三苯氧基碘化鏻和N,N-二甲基甲酰胺以產(chǎn)生混合物；

b)在適當(dāng)?shù)臏囟?，適當(dāng)?shù)臍夥障聰嚢杷龌旌衔锍渥愕臅r(shí)間以產(chǎn)生中間產(chǎn)物混合物；

c)向所述中間產(chǎn)物混合物添加氨基酸酯鹽酸鹽和Et₃N；

d)將c)的混合物冷卻至適當(dāng)?shù)臏囟炔⑶覍⑵錆饪s以產(chǎn)生粗制濃縮混合物；

e)通過(guò)制備型HPLC分級(jí)分離所述粗制濃縮混合物；和

f)混合并且濃縮所需的級(jí)分以分離所述改性去污劑。

52.實(shí)施方式51的方法，其還包括使步驟(f)的級(jí)分經(jīng)歷水解。

53.實(shí)施方式51或52的方法，其還包括中和所述產(chǎn)物。

54.實(shí)施方式53的方法，其中使用中和所述產(chǎn)物。

55.實(shí)施方式51-54的任一項(xiàng)的方法，其中所述改性去污劑是式I的去污劑：

其中：

R¹是H、(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、或(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代；

R²和R³各自獨(dú)立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂(C₆H₅)或C(CH₃)₃；

R⁴和R⁵各自獨(dú)立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、C₆H₅、CH₂(C₆H₅)、C(CH₃)₃、CH₂CH(CH₃)₂、CHCH₂CH(CH₃)₂、CH₂C₆H₅OH、CH₂C＝CHNH(C₆H₅)、CH₂C＝CHN＝CHNH、CH₂COOH、CH₂CONH₂、(CH₂)₂CONH₂、(CH₂)₂COOH、CH₂SH、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN、CH₂OH、CH(OH)CH₃、(CH₂)₂SCH₃、(CH₂)₃NHC(NH₂)＝NH，或者R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個(gè)n獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

56.實(shí)施方式55的方法，其中：

R¹是(C₈-C₁₆)烷基或(C₈-C₁₆)取代的烷基；

R²和R³各自獨(dú)立地是H或CH₃；

R⁴和R⁵各自獨(dú)立地是H、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN，或者，R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(gè)(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個(gè)n獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

57.實(shí)施方式55的方法，其中所述改性去污劑選自：