專利名稱：一種加壓裝置及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及加壓裝置，尤其涉及用于藥物篩選的加壓裝置，以及利用該加壓裝置進(jìn)行藥物篩選的方法和用途。
背景技術(shù)：
常壓環(huán)境下視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法已經(jīng)比較成熟、穩(wěn)定，能夠較好的反映細(xì)胞的生長狀態(tài)及藥物對(duì)細(xì)胞體外存活的影響，但是不能針對(duì)性的考察藥物對(duì)高壓下培養(yǎng)細(xì)胞的影響。整體動(dòng)物的高眼壓模型盡管研究較多，但不能全程觀察高眼壓導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷的病理過程。由此，需要建立一種體外高壓培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的方法，便于進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞水平的藥物篩選。
目前國內(nèi)外常用的加壓培養(yǎng)裝置多為注液式加壓，即在密封的容器內(nèi)注滿培養(yǎng)液，然后連接另一裝有培養(yǎng)液的容器，通過調(diào)節(jié)兩容器內(nèi)液體高度差來改變壓力大小。該裝置的缺陷表現(xiàn)在首先培養(yǎng)瓶中缺乏氣體，特別是氧氣，不能排除缺氧導(dǎo)致細(xì)胞損傷的可能；密封裝置雖能保證無液體滲漏，但不能確保外部管道中的液體是否回吸入培養(yǎng)瓶，因而回吸會(huì)造成污染等。而現(xiàn)有的注氣式加壓裝置，即加壓時(shí)將培養(yǎng)瓶口密封，然后用注射器注入無菌氣體，單人即可操作；利用和培養(yǎng)瓶相連的壓力表，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)瓶內(nèi)壓力。但該裝置仍存在一些不足之處加壓操作繁瑣，需要同時(shí)監(jiān)控多個(gè)培養(yǎng)瓶，且不同培養(yǎng)瓶之間壓力不容易保持穩(wěn)定；實(shí)驗(yàn)需要樣本量多，細(xì)胞數(shù)量大，相應(yīng)的試劑用量也增多，不能滿足大量的細(xì)胞篩選需要。整體動(dòng)物的高眼壓模型盡管研究較多，但不能全程觀察高眼壓導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷的病理過程。
目前，已有采用培養(yǎng)瓶注氣式加壓裝置考察不同壓力或加壓時(shí)間對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、牛眼小梁細(xì)胞等的影響的報(bào)道。也有關(guān)于考察了持續(xù)壓力不同時(shí)程對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的影響等的報(bào)道。但尚未有模擬體內(nèi)高壓，根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行不同藥物篩選的加壓裝置的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種加壓裝置，利用該加壓裝置能滿足藥物篩選過程中大量篩選細(xì)胞需要。為解決該技術(shù)問題本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明的加壓裝置，包括由下殼、殼蓋構(gòu)成的耐壓殼體，和設(shè)置在下殼、殼蓋結(jié)合端面之間的密封件，以及加壓后使殼蓋與下殼緊固連接的鎖止結(jié)構(gòu)，所述耐壓殼體上開設(shè)有壓力檢測(cè)端口、進(jìn)氣端口，壓力檢測(cè)端口外固定連接有壓力表，進(jìn)氣端口外則連接有控制閥和進(jìn)氣管。
本發(fā)明還提供了一種藥物篩選方法，它是利用本發(fā)明加壓裝置進(jìn)行細(xì)胞水平藥物篩選的方法。
該藥物篩選方法包括如下步驟a、分離培養(yǎng)目的細(xì)胞；b、將目的細(xì)胞放入加壓裝置中，加入供篩選的藥物，在40～140mmHg的壓力下培養(yǎng)12～72h，觀察，記錄、分析數(shù)據(jù)。
其中，所述的目的細(xì)胞是視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，加壓裝置壓力是80mmHg；所述的培養(yǎng)時(shí)間是48h。
其中，所述的培養(yǎng)容器是染缸、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶；所述的培養(yǎng)液是800ml·L-1DMEM高糖培養(yǎng)基、200ml·L-1胎牛血清、L-谷氨酰胺0.45g·L-1、NaHCO33g·L-1、HEPES 4.5g·L-1、青霉素1×106U·L-1和鏈霉素1×106U·L-1。
其中，所述的目的細(xì)胞還可以是大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、牛眼小梁細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或大鼠成骨細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了該加壓裝置用于篩選治療青光眼或高血壓的藥物中的用途。
在本發(fā)明加壓裝置中，可以根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)選擇不同的培養(yǎng)方式，如貼壁細(xì)胞可以先在蓋玻片(24×24mm)上培養(yǎng)，貼壁完全后，將覆有細(xì)胞的蓋玻片嵌入染缸內(nèi)，然后將染缸統(tǒng)一放入加壓裝置中進(jìn)行高壓培養(yǎng)；如懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞可以直接用培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入加壓裝置中進(jìn)行高壓培養(yǎng)。本發(fā)明加壓裝置適用于模擬體內(nèi)與青光眼相關(guān)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、小梁細(xì)胞及與高血壓相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞等相關(guān)細(xì)胞的體外高壓培養(yǎng)試驗(yàn)研究。本發(fā)明篩選方法模擬了體內(nèi)青光眼高眼壓環(huán)境，建立了體外高壓視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)模型，確定了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的加壓條件，并考察了藥物對(duì)高壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響。
本發(fā)明加壓裝置內(nèi)可同時(shí)放入多個(gè)染缸、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶，不用對(duì)每個(gè)培養(yǎng)瓶分別加壓，大大減少了工作量；可以根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)選擇不同的培養(yǎng)方式，而且各受試藥組和模型組可以同時(shí)在一個(gè)完全相同的條件下進(jìn)行高壓培養(yǎng)，盡可能的避免操作帶來的差異；解決了用培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿等培養(yǎng)時(shí)無法加壓等問題；還可以根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)及檢測(cè)手段要求的不同，選擇不同的培養(yǎng)容器，節(jié)約大量的培養(yǎng)及檢測(cè)試劑，減少細(xì)胞用量，從而大大降低實(shí)驗(yàn)成本。本發(fā)明加壓裝置的操作方法簡(jiǎn)便可行，為模擬體內(nèi)高壓進(jìn)行細(xì)胞水平的藥物篩選提供一種新的選擇。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。


本說明書包括如下兩幅附圖圖1是本發(fā)明加壓裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明加壓裝置的局部放大示意圖。
圖中零部件、部位及編號(hào)下殼10、殼蓋11、壓力檢測(cè)端口12、進(jìn)氣端口13、鉸鏈14、壓力表15、控制閥16、進(jìn)氣管17、密封圈18、卸壓閥19、鎖止結(jié)構(gòu)20、曲臂21、銷軸22、螺桿23。
以下通過附圖結(jié)合實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式
如圖1所示，本發(fā)明的加壓裝置，包括由下殼10、殼蓋11構(gòu)成的耐壓殼體，設(shè)置在下殼10、殼蓋11接觸端面之間的密封件，以及加壓后使殼蓋11與下殼10緊固連接的鎖止結(jié)構(gòu)20。耐壓殼體上設(shè)置有壓力檢測(cè)端口12、進(jìn)氣端口13，壓力檢測(cè)端口12外固定連接有壓力表15，進(jìn)氣端口13外則連接有控制閥16和進(jìn)氣管17。下殼10底部平坦，可以放入染缸、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶數(shù)個(gè)，將下殼10、殼蓋11鎖止后，通過進(jìn)氣管17向耐壓殼體注入消毒空氣進(jìn)行加壓并達(dá)到所需壓力。
本發(fā)明的加壓裝置適應(yīng)于模擬體內(nèi)與青光眼相關(guān)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、小梁細(xì)胞及與高血壓相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞等相關(guān)細(xì)胞的體外高壓培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究。
殼蓋11與下殼10可以采用多種連接方式，圖1示出了其中一種，如該圖所示，殼蓋11通過鉸鏈14與下殼10連接，壓力檢測(cè)端口12、進(jìn)氣端口13均開設(shè)在殼蓋11上，下殼10的端口上開設(shè)有環(huán)形凹槽，所述密封件為設(shè)置于該環(huán)形凹槽內(nèi)的密封圈24。。同樣，鎖止結(jié)構(gòu)20也可以采用多種結(jié)構(gòu)，圖2示出了其中一種，如該圖所示，鎖止結(jié)構(gòu)20設(shè)置在下殼10與鉸鏈14相對(duì)一側(cè)，它包括設(shè)置在下殼10、殼蓋11結(jié)合部處的曲臂21，該曲臂21的下端通過銷軸22與下殼10形成鉸鏈連接，曲臂21的上端則設(shè)置有可抵壓在殼蓋11上的螺桿23。
高壓培養(yǎng)結(jié)束后，在打開殼蓋11之前應(yīng)先對(duì)耐壓殼體進(jìn)行卸壓，卸壓可以采用如下的兩種方式，其一，取下進(jìn)氣管17，打開控制閥16卸壓；其二，在殼蓋11上開設(shè)有卸壓端口18，在該卸壓端口18外設(shè)置卸壓閥19。
本發(fā)明加壓裝置進(jìn)行藥物篩選試驗(yàn)如下試驗(yàn)例1本發(fā)明加壓裝置篩選藥物的加壓條件1、主要試劑多聚鳥氨酸(Sigma公司)，層粘連蛋白(Roche公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，小牛血清(成都哈里生物有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Sigma公司)，5-溴-2′-脫氧脲苷(Roche公司)。
2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD乳鼠(出生2～3d內(nèi))，雌雄兼用。由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)川實(shí)動(dòng)管第11號(hào)。
3、主要儀器LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；LDZX-40BI型自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；Multiskan MK3酶標(biāo)儀，SANYO MCO-15ACCO2孵箱，DMIL萊卡倒置相差顯微鏡，萊卡體式顯微鏡，Sartorius超純水器。
4、方法與結(jié)果根據(jù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)將培養(yǎng)瓶培養(yǎng)改成蓋玻片(24×24mm)培養(yǎng)，加壓時(shí)將覆有細(xì)胞的蓋玻片固定于染缸內(nèi)，每缸可放置蓋玻片6～12張，將染缸放入本發(fā)明加壓裝置中，分別使壓力達(dá)到80、120mmHg，保持24h、48h，采用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL-POD)法，檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)，結(jié)果見表1。
表1不同時(shí)間及壓力對(duì)細(xì)胞凋亡指數(shù)(％)的影響


注與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01上述結(jié)果表明，模型組(80mmHg和120mmHg)凋亡率都明顯高于對(duì)照組(0mmHg)，細(xì)胞凋亡程度隨壓力和加壓時(shí)間的變化而變化。通過對(duì)細(xì)胞凋亡指數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析，選擇壓力80mmHg，時(shí)間48h為高眼壓造模條件。
試驗(yàn)例2本發(fā)明加壓裝置用于篩選藥物對(duì)壓力誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)及凋亡的影響在本發(fā)明加壓裝置中進(jìn)行下述藥物篩選試驗(yàn)。
1、培養(yǎng)板的處理取6孔板，每孔預(yù)先置入一蓋玻片(24×24mm)，加入0.2mg/ml多聚鳥氨酸1ml，振蕩均勻，室溫靜置2h后，吸棄上清液，用適量PBS液洗滌三次，加入5μg/ml層粘連蛋白2ml，放置37℃，5％的CO2孵箱中過夜，備用。
2、細(xì)胞懸液制備將乳鼠斷頸處死，無菌條件下摘取眼球，置入含青霉素的PBS液中。在體式顯微鏡下沿角膜剪開，去除晶狀體和玻璃體，鈍性分離出視網(wǎng)膜。用0.125％的胰蛋白酶37℃下消化，30min后加入純小牛血清終止消化，用200目無菌鋼篩網(wǎng)濾過。將濾液1000r·min-1離心6min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)液(800ml·L-1DMEM高糖培養(yǎng)基、200ml·L-1胎牛血清、L-谷氨酰胺0.45g·L-1、NaHCO33g·L-1、HEPES 4.5g·L-1、青霉素1×106U·L-1、鏈霉素1×106U·L-1)，吸管吹打使之分散均勻制成單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為毫升含5×106個(gè)細(xì)胞。
3、接種培養(yǎng)將細(xì)胞懸液按每孔1ml接種于經(jīng)包被的6孔板中，培養(yǎng)24h后加入5-溴-2′-脫氧脲苷以抑制非神經(jīng)細(xì)胞生長。
4、模型制作及藥物的加入培養(yǎng)72h后每孔吸棄上清液，將蓋玻片轉(zhuǎn)移本發(fā)明加壓裝置中，并加入各不同藥液后，按選定的加壓條件同前進(jìn)行加壓操作。加壓培養(yǎng)48h后，分批進(jìn)行Fas蛋白免疫組化染色檢測(cè)，原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL-POD)法，結(jié)果見表2、3。
表2 各給藥組對(duì)RGCs中Fas蛋白表達(dá)的影響


注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01
表3各給藥組對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響


注與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01結(jié)果表明，與模型組比較，燈盞細(xì)辛黃酮類提取物、燈盞花素及陽性藥尼莫地平、維拉帕米均能明顯抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞Fas蛋白的表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)，也能明顯對(duì)抗體外高壓誘導(dǎo)的RGCs凋亡(P＜0.05)。而燈盞細(xì)辛咖啡酰類提取物及咖啡酸無明顯影響。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果中還可看出各組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差比較小，各批實(shí)驗(yàn)的結(jié)果重復(fù)性良好。
上述藥物篩選試驗(yàn)說明，本發(fā)明加壓裝置用于藥物的篩選，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性高，可操作性強(qiáng)，能為臨床藥物篩選試驗(yàn)提供較準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，為正確判斷藥物使用提供了依據(jù)。本發(fā)明加壓裝置還可以節(jié)約大量的培養(yǎng)及檢測(cè)試劑，減少細(xì)胞用量，從而大大降低實(shí)驗(yàn)成本，為模擬體內(nèi)高壓進(jìn)行細(xì)胞水平的藥物篩選提供一種新的選擇。
權(quán)利要求
1.加壓裝置，包括由下殼(10)、殼蓋(11)構(gòu)成的耐壓殼體，設(shè)置在下殼(10)、殼蓋(11)接觸端面之間的密封件，以及加壓后使殼蓋(11)與下殼(10)緊固連接的鎖止結(jié)構(gòu)(20)，其特征在于所述耐壓殼體上設(shè)置有壓力檢測(cè)端口(12)、進(jìn)氣端口(13)，壓力檢測(cè)端口(12)外固定連接有壓力表(15)，進(jìn)氣端口(13)外則連接有控制閥(16)和進(jìn)氣管(17)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的加壓裝置，其特征在于所述殼蓋(11)通過鉸鏈(14)與下殼(10)連接，所述壓力檢測(cè)端口(12)、進(jìn)氣端口(13)均開設(shè)在殼蓋(11)上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的加壓裝置，其特征在于所述鎖止結(jié)構(gòu)(20)設(shè)置在下殼(10)與鉸鏈(14)相對(duì)一側(cè)，它包括設(shè)置在下殼(10)、殼蓋(11)結(jié)合部處的曲臂(21)，該曲臂(21)的下端通過銷軸(22)與下殼(10)形成鉸鏈連接，曲臂(21)的上端則設(shè)置有可抵壓在殼蓋(11)上的螺桿(23)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的加壓裝置，其特征在于所述殼蓋(11)上開設(shè)有卸壓端口(18)，該卸壓端口(18)外設(shè)置有卸壓閥(19)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的加壓裝置，其特征在于所述下殼(10)的端口上開設(shè)有環(huán)形凹槽，所述密封件為設(shè)置于該環(huán)形凹槽內(nèi)的密封圈(24)。
6.一種藥物篩選方法，它是利用權(quán)利要求1所述的加壓裝置進(jìn)行細(xì)胞水平藥物篩選的方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物篩選方法，它包括如下步驟a、分離培養(yǎng)目的細(xì)胞；b、將目的細(xì)胞放入加壓裝置中，加入供篩選的藥物，在40～140mmHg的壓力下培養(yǎng)12～72h，觀察，記錄、分析數(shù)據(jù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物篩選方法，其特征在于所述的目的細(xì)胞是視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，加壓裝置壓力是80mmHg；所述的培養(yǎng)時(shí)間是48h。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物篩選方法，其特征在于所述的培養(yǎng)容器是染缸、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶；所述的培養(yǎng)液是800ml·L-1DMEM高糖培養(yǎng)基、200ml·L-1胎牛血清、L-谷氨酰胺0.45g·L-1、NaHCO33g·L-1、HEPES 4.5g·L-1、青霉素1×106U·L-1和鏈霉素1×106U·L-1。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物篩選方法，其特征在于所述的目的細(xì)胞是大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、牛眼小梁細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或大鼠成骨細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1所述的加壓裝置用于篩選治療青光眼或高血壓的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于藥物篩選的加壓裝置，包括由下殼(10)、殼蓋(11)構(gòu)成的耐壓殼體，設(shè)置在下殼(10)、殼蓋(11)接觸端面之間的密封件，以及加壓后使殼蓋(11)與下殼(10)緊固連接的鎖止結(jié)構(gòu)(20)。本發(fā)明還提供了該加壓裝置的用途，用于藥物的篩選。本發(fā)明裝置可節(jié)約大量的培養(yǎng)及檢測(cè)試劑，減少細(xì)胞用量，從而大大降低實(shí)驗(yàn)成本。本發(fā)明加壓裝置用于藥物的篩選，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性高，可操作性強(qiáng)，能為臨床藥物篩選試驗(yàn)提供較準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，為正確判斷藥物使用提供了依據(jù)，為模擬體內(nèi)高壓進(jìn)行細(xì)胞水平的藥物篩選提供一種新的選擇。
文檔編號(hào)F17C1/00GK1995800SQ20051002244
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2005年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者孟憲麗, 張藝, 段俊國, 盛艷梅, 張靜, 龍怡, 曾潔萍 申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)