專利名稱：一種檢測等位基因點突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)基因診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其是關(guān)于一種檢測等位基因點突變的方法。
目前，檢測基因點突變的主要技術(shù)有DNA測序、熔解曲線分析配合熒光探針雜交、等位基因特異擴(kuò)增等多種技術(shù)。在眾多技術(shù)中，以DNA測序和熔解曲線分析配合熒光探針雜交技術(shù)代表了當(dāng)前基因突變檢測的最高水平(參見文獻(xiàn)Allen et al.，Hepatolog.1998；Vol.27 No.61670～1677；NorioOgata et al.，Journal of Medical virology 1999；59270～276；Patricia A.Cane etal.，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1999；Vol.43，No.71600-1608)。DNA測序的最大優(yōu)點在于能全面反映被檢基因的堿基排列順序及多處發(fā)生點突變的情況，適合對復(fù)雜的基因突變進(jìn)行檢測。但被檢樣品中若含有幾種等位基因時，DNA測序只能反映處于優(yōu)勢的等位基因突變情況。另外，DNA測序所用的測序儀價格極其昂貴，除少數(shù)專門研究機(jī)構(gòu)外，很少有用DNA測序技術(shù)進(jìn)行基因點突變常規(guī)檢測的。DNA測序所用試劑價格昂貴，操作復(fù)雜，化費時間長等，均是DNA測序技術(shù)難以克服的缺點。而熔解曲線分析配合熒光探針雜交的優(yōu)勢是能在一次檢測中，同時檢測等位基因的幾種點突變，但僅所用的專用儀器“Light Cycler”售價就需七萬美元，除此所用試劑價格也不菲，是普通實驗室難以承受的，該技術(shù)所用的熒光探針的設(shè)計，合成技術(shù)要求較高，一般實驗室難以辦到。熔解曲線分析配合熒光探針雜交技術(shù)是近二年Roche(羅氏)公司發(fā)明的，國內(nèi)尚未有成功使用該技術(shù)檢測基因突變的報道。因此，該技術(shù)檢測基因突變的穩(wěn)定性、重復(fù)性還有待進(jìn)一步研究觀察。等位基因特異抗突變擴(kuò)增系統(tǒng)(Amplification RefractoryMutation system簡稱ARMS)技術(shù)(Schuster H.et al..Biochemistry，1992；204(1)22-25)，雖不需特殊設(shè)備，但此技術(shù)檢測基因點突變的特異性欠佳，目前用該技術(shù)檢測基因點突變已較為少見。因此，建立一種操作簡便，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，無需特殊設(shè)備且所用試劑價格低廉的檢測基因點突變的新方法，是從事基因突變研究工作者，臨床基因診斷實驗室迫切需要的。
為此，本發(fā)明的目的是提供一種檢測等位基因點突變的方法，該方法是在采用基因擴(kuò)增技術(shù)檢測時，其中用的一條引物在3’端第二位堿基與目的基因?qū)?yīng)的堿基是不互補(bǔ)的。該檢測方法特異性強(qiáng)，敏感性高，簡便且實用。
本發(fā)明提供一種檢測等位基因點突變的方法，是采用基因擴(kuò)增技術(shù)，在基因擴(kuò)增反應(yīng)體系中，加入被檢DNA樣品，再加入一條按常規(guī)方法設(shè)計合成的引物和一條在3’端第二位堿基與目的基因?qū)?yīng)的堿基按不互補(bǔ)原則設(shè)計的引物。所述3’端第二位堿基與目的基因?qū)?yīng)的堿基按不互補(bǔ)原則設(shè)計的引物包括以下11種形式A-A，A-G，A-C，G-G，G-T，G-U，C-C，C-T，C-U，T-T，T-U。經(jīng)基因擴(kuò)增反應(yīng)后，只需對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，就可得知被檢樣品是否發(fā)生了基因點突變。
本發(fā)明的詳細(xì)技術(shù)方案敘述如下1、引物的設(shè)計合成從有關(guān)文獻(xiàn)或DNA基因庫中查到需檢測的基因序列，根據(jù)該基因的堿基排列順序，按常規(guī)的堿基互補(bǔ)(A-T、A-U、G-C)的原則設(shè)計一條引物，寫出該引物的堿基排列順序，再標(biāo)明引物的5’端和3’端。然后，按引物的3’→5’方向依次將堿基的代號輸入“DNA合成儀”合成。另一條引物是按3’端第二位堿基與對應(yīng)的目的基因的堿基不互補(bǔ)原則設(shè)計的，除了3’端第二位堿基與目的基因不互補(bǔ)外，引物的其余堿基均與目的基因互補(bǔ)。與第一條引物一樣，通過“DNA合成儀”合成。
2、基因擴(kuò)增按常規(guī)的方法，在擴(kuò)增反應(yīng)試管中加入基因擴(kuò)增反應(yīng)液，需檢測的DNA樣品，合成的二條引物及DNA聚合酶。然后將試管放入擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳檢測，電泳板放在紫外燈下照射，若出現(xiàn)特異的熒光條帶，則說明被檢測樣品DNA存在基因點突變；反之則說明被檢樣品DNA不存在基因點突變。
3、本發(fā)明檢測方法以檢測乙肝病毒DNA-P基因區(qū)點突變?yōu)槔恼f明乙型肝炎患者在接受藥物賀普丁(Lamivudine，拉米夫丁)治療過程中，部分患者體內(nèi)原有的乙肝病毒野生株(即YMDD株)在DNA-P基因區(qū)的第741堿基發(fā)生A→G的點突變成為YVDD變異株，同時野生株(YMDD株)也可在DNA-P基因區(qū)的第743位堿基發(fā)生G→T的點突變，成為另一種變異株，即YIDD株。YMDD株、YVDD株、YIDD株的DNA-P基因區(qū)的各等位基因部分堿基序列如下741位 743位(1)YMMD株5’—— T GATGATGTGGTATTGGGG-3’741位(2)YVDD株5’—— T G GATGATGTGGTATTGGGG-3’743位(3)YIDD株5’——A T GATGATGTGGTATTGGGG-3’為了檢測741位發(fā)生的A→G的點突變的YVDD變異株，設(shè)計一條通用引物，又設(shè)計一條在3’端第二位堿基與目的基因?qū)?yīng)的堿基不互補(bǔ)的特異引物(檢測步驟詳見實施例)。檢測結(jié)果電泳顯示YVDD株是陽性反應(yīng)，而YMDD株和YIDD株都是呈陰性反應(yīng)。檢測結(jié)果證明本發(fā)明檢測方法具有高度特異性，即YVDD株設(shè)計的特異引物僅能檢測得YVDD株上的突變點。
本發(fā)明的高度特異性是由特異引物3’端第二位堿基與目的基因不互補(bǔ)決定的，從YVDD特異引物與YVDD株，YMDD株，YIDD株的互補(bǔ)情況也可充分證明檢測結(jié)果的高度特異性。
YVDD特異引物與YVDD株，YMDD株，YIDD株的堿基互補(bǔ)情況如下(1)YVDD特異引物與YVDD株堿基互補(bǔ)情況
(上下兩個堿基之間以“｜”連接表示兩者互補(bǔ)，以“×”連接表示兩者不互補(bǔ))由于引物僅3’端第二位堿基與目的基因不互補(bǔ)，其余堿基均互補(bǔ)，尤其是3’端第一位堿基與目的基因互補(bǔ)，因此檢測一定呈陽性。
(2)YVDD特異引物與YMDD株堿基互補(bǔ)情況 引物3’端連續(xù)二個堿基與目的基因不互補(bǔ)，尤其是3’端第一位堿基與目的基因不互補(bǔ)，因此用YVDD特異引物檢測YMDD株只能得到陰性結(jié)果。(3)YVDD特異引物與YIDD株堿基互補(bǔ)情況 YVDD特異引物3’端連續(xù)有三個堿基與目的基因不互補(bǔ)，檢測結(jié)果也一定是陰性。
同理，若用YIDD特異引物檢測YVDD和YMDD株，得到的也是陰性結(jié)構(gòu)。YIDD特異引物只能檢測出YIDD株。
本發(fā)明優(yōu)點1、檢測等位基因點突變的特異性高及敏感性強(qiáng)由于在基因擴(kuò)增中使用了一條3’端第二位堿基與目的基因?qū)?yīng)堿基不互補(bǔ)的特異引物，因此擴(kuò)增不受其它可能共存的等位基因影響，這種影響在DNA測序技術(shù)及“ARMS”技術(shù)中表現(xiàn)得尤為明顯。當(dāng)被檢標(biāo)本存在幾種突變的等位基因時，DNA測序技術(shù)只能檢出處于優(yōu)勢(含量較高)的等位基因，即使對同一份標(biāo)本進(jìn)行多次測序，往往也不能檢出處于弱勢的等位基因。而本發(fā)明的方法只需根據(jù)等位基因發(fā)生的幾種不同點突變，在相應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入與之對應(yīng)的點突變特異引物，就可方便地檢測出各種點突變的等位基因，即具有高度的特異性。另外，當(dāng)某一種發(fā)生突變的等位基因處于弱勢時，其它技術(shù)較難檢出，而本發(fā)明的方法具有很強(qiáng)的特異性，因此，對弱勢的等位基因也能檢出，即本發(fā)明的方法具有很強(qiáng)的敏感性。
2、本發(fā)明具有簡便性和實用性用本發(fā)明的方法檢測基因點突變操作上簡便易行，對儀器設(shè)備無特殊要求，凡能開展基因擴(kuò)增研究和基因診斷的實驗室，均可利用現(xiàn)有設(shè)備進(jìn)行基因點突變的研究和檢測。另外發(fā)明方法所用的試劑都已國產(chǎn)化，價格低廉，有很強(qiáng)的實用性。本發(fā)明方法尤其適用于對大量標(biāo)本的檢測，省時簡便，便于普及推廣。


圖1是乙肝病毒DNA YVDD變異株的電泳檢測圖。
圖中1-藥物治療前HBV DNA呈陽性反應(yīng)；2-藥物治療前YVDD株呈陰性反應(yīng)；3-藥物治療52周后HBV DNA仍呈陽性反應(yīng)；4-藥物治療52周后YVDD株呈陽性反應(yīng)。
以下通過檢測乙肝病毒DNA YMDD區(qū)點突變?yōu)閷嵤├M(jìn)一步闡述本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實施例1檢測乙肝病毒DNA YMDD株在741位發(fā)生A→G點突變后的YVDD變異株乙型肝炎患者在接受藥物賀普丁(Lamivudine拉米夫丁)治療過程中，部分患者體內(nèi)原有的乙肝病毒野生株(即YMDD株)在DNA-P基因區(qū)的第741堿基發(fā)生A→G的點突變成為YVDD變異株，同時野生株(YMDD株)也可在DNA-P基因區(qū)的第743位堿基發(fā)生G→T的點突變，成為另一種變異株，即YIDD株。YMDD株、YVDD株、YIDD株的DNA-P基因區(qū)的各等位基因部分堿基序列如下741位 743位(1)YMMD株5’—— T GATGATGTGGTATTGGGG-3’741位(2)YVDD株5’—— T G GATGATGTGGTATTGGGG-3’743位(3)YIDD株5’——A T GATGATGTGGTATTGGGG-3’(一)引物的設(shè)計與合成1、上游通用引物的設(shè)計與合成按常規(guī)的堿基互補(bǔ)(A-T，A-U，G-C)方法，在基因的上游(5’端)，設(shè)計上游通用引物5’TCTTCATCCTGCTGCTATGC 3’然后，按引物的3’→5’方向依次將堿基的序列輸入”DNA合成儀”自動合成。
2、下游通用引物的設(shè)計與合成按常規(guī)的堿基互補(bǔ)方法，在基因的下游(3’端)，設(shè)計下游通用引物5’TCAAATGTATACCCAAAGAC 3’下游通用引物同上法合成。
3、YVDD株的特異引物的設(shè)計與合成以發(fā)生A→G點突變的YVDD株基因的第741位堿基G為特異引物的3’端第一個堿基，設(shè)計3’端第二個堿基與目的基因不互補(bǔ)，而引物其余堿基均是互補(bǔ)的特異引物為3’CGCCTACTACACCATAACCCC 5’，該特異引物與YVDD株的互補(bǔ)情況如下741位 可以看出特異引物的3’端第二位堿基G與目的的基因?qū)?yīng)的堿基T不互補(bǔ)。然后如同上法合成引物。
(二)基因擴(kuò)增取4支0.2(或0.5)m1的專用試管，按1、2、3、4依次編號。在各管中均加入市售(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)基因擴(kuò)增反應(yīng)液20μl，耐高溫DNA聚合酶1μl(含一個國際單位)，1、3號管內(nèi)加上下游通用引物(HBVDNA定性用)各0.5μl，并在1號管內(nèi)加入患者在用賀普丁藥物治療前的HBVDNA 3μl，3號管內(nèi)加入同一患者經(jīng)賀普丁藥物治療52周后的HBV DNA 3μl；在2、4號管內(nèi)加入上游通用引物和YVDD特異引物(檢測YVDD株)各0.5μl，并在2號管內(nèi)加入上述患者用賀普丁治療前的HBV DNA 3μl，4號管內(nèi)加入同一患者經(jīng)賀普丁治療52周后的HBV DNA 3μl，然后將上述4支試管放入基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下先經(jīng)94℃預(yù)變性2分鐘，然后按94℃25秒，56℃20秒，72℃50秒為一個擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增35個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。
(三)電泳分析用2％的瓊脂糖(100ml 2％的瓊脂糖中需加溴化乙錠5-10mg)凝膠電泳板，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，取上述4管的擴(kuò)增產(chǎn)物各10μl，加到電泳板對應(yīng)的1、2、3、4號孔內(nèi)，在5v/cm電場強(qiáng)度下進(jìn)行電泳，電泳30分鐘后，取出電泳板，在紫外燈照射下，電泳板上出現(xiàn)的熒光條帶(見圖1)表明患者經(jīng)賀普丁藥物治療前與治療后HBV DNA均呈陽性(圖1中1和3)，陽性條帶為430bp；在賀普丁藥物治療前未檢出YVDD株(圖1中2)，而經(jīng)賀普丁藥物治療52周后YVDD株呈陽性反應(yīng)，在352bp處出現(xiàn)了特異熒光條帶(圖1中4)。
權(quán)利要求
1.一種檢測等位基因點突變的方法，采用基因擴(kuò)增技術(shù)，其特征在于在擴(kuò)增反應(yīng)體系中用的引物，一條是按常規(guī)設(shè)計的引物，另一條是在3’端第二位堿基與目的基因?qū)?yīng)的堿基按不互補(bǔ)原則設(shè)計的引物。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述3’端第二位堿基與目的基因?qū)?yīng)的堿基按不互補(bǔ)原則設(shè)計的引物包括以下11種形式A-A，A-G，A-C，G-G，G-T，G-U，C-C，C-T，C-U，T-T，T-U。
全文摘要
一種檢測等位基因點突變的方法是采用基因擴(kuò)增技術(shù),在擴(kuò)增反應(yīng)體系中的引物,一條是按常規(guī)設(shè)計的引物,另一條是在3’端第二位堿基與目的基因?qū)?yīng)的堿基按不互補(bǔ)原則設(shè)計的特異引物。該方法可檢測等位基因的不同點突變,特異性強(qiáng),敏感性高,操作簡便,使用的試劑價格低廉,實用性強(qiáng),便于推廣。
文檔編號G01N27/447GK1340705SQ00119758
公開日2002年3月20日 申請日期2000年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月25日
發(fā)明者程新建 申請人:程新建