專(zhuān)利名稱(chēng)：：應(yīng)用?；夹g(shù)生產(chǎn)檢測(cè)血糖用電化學(xué)傳感器的酶電極試條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物化學(xué)、酶工程和醫(yī)學(xué)臨床診斷技術(shù)，特別涉及一種將室溫?；夹g(shù)應(yīng)用于定量檢測(cè)血糖的電化學(xué)傳感器用一次性玻態(tài)葡萄糖氧化酶電極試條的生產(chǎn)。自從1967年尤普代克(Updike)把固定化葡萄糖氧化酶覆蓋于鉑電極，使之能定量測(cè)定血糖，并首次提出“酶電極”這一概念以來(lái)，各種生物傳感器(biosensor；簡(jiǎn)稱(chēng)BS)如雨后春筍般地蓬勃發(fā)展起來(lái)。盡管學(xué)術(shù)界一直對(duì)BS技術(shù)的前景看好，發(fā)表的論文數(shù)已不下百萬(wàn)篇，然而真正進(jìn)入市場(chǎng)的屬“酶電極”類(lèi)的品種至今仍只有數(shù)種，且其質(zhì)量常遭非議。究其原因，主要在于組成識(shí)別器件的關(guān)鍵組分(如固定化酶)的不穩(wěn)定性。例如最近報(bào)道說(shuō)，用常規(guī)BS技術(shù)制造的測(cè)定血糖的雙酶膜(由固定化葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化物酶組成)，在使用一次后保存于4℃冰箱內(nèi)，過(guò)一個(gè)月后取出安裝于電極表面后檢測(cè)，酶活力降為95.5％，過(guò)二個(gè)月后取出檢測(cè)則降為89.5％(詳見(jiàn)李海虹、嚴(yán)少華、漆德瑤等，環(huán)糊精交聯(lián)固定酶的生物傳感器及臨床應(yīng)用生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1998，25(2)162-166)。顯然，這在正規(guī)的臨床檢驗(yàn)中是不容許的，而在常規(guī)BS技術(shù)中，上述結(jié)果還被認(rèn)為是高穩(wěn)定性的，經(jīng)常發(fā)生的則是固定化酶活力隨著使用次數(shù)的增加而無(wú)規(guī)律地下降，因而難以實(shí)現(xiàn)商品化。此外，常規(guī)BS技術(shù)的操作也較麻煩。如上述文獻(xiàn)中的操作程序是先把存放于冰箱的固定化酶膜取出，小心地安裝于電極表面；調(diào)整信號(hào)轉(zhuǎn)換器件；加血樣于反應(yīng)液中，測(cè)定并讀數(shù)后關(guān)機(jī)；再小心地取下酶膜，經(jīng)干燥后放入冰箱；清洗使用過(guò)的電極，以清除電極表面因電化學(xué)反應(yīng)所形成的氧化層。顯然，這樣復(fù)雜的操作必須由專(zhuān)業(yè)人員執(zhí)行，難以家庭自測(cè)。而且，酶膜的忽干忽濕，更易使固定化酶活力下降。如何改正常規(guī)BS技術(shù)中這些關(guān)鍵性弱點(diǎn)，使之成為操作簡(jiǎn)便、酶活力不變的家庭自測(cè)工具？1990年，日本南海等人(NankaiS.KawaguriM.IijimaT.，BiosensorandmethodformakingthesameUSpatent，G01N，4897173，1990-01-30)提出了把當(dāng)時(shí)盛行的各類(lèi)診斷試條技術(shù)融入生物傳感器技術(shù)的設(shè)計(jì)，使酶電極成為一次性試條。這一構(gòu)思因能克服傳統(tǒng)BS技術(shù)中固定化酶活力隨使用次數(shù)增加而發(fā)生無(wú)規(guī)律下降等關(guān)鍵性弱點(diǎn)，立即受到世界各國(guó)包括德、美、英等國(guó)同行們的重視，并競(jìng)相研制與改進(jìn)。迄今，已有兩類(lèi)適于家庭自測(cè)的一次性試條式生物傳感器商品問(wèn)世。一類(lèi)系根據(jù)電化學(xué)原理設(shè)計(jì)的傳感器(HoenesJ.SchaofflerJ.，MethodandsensorelectrodesystemfortheelectrochemicaldeterminationofananalystoranoxidoreductaseaswellastheuseofsuitablecompoundsthereforUSpatent，G01N，5286362，1994-02-15)，其所附一次性酶試條上有電極；另一類(lèi)系根據(jù)反射光譜原理設(shè)計(jì)的比色計(jì)(MilpitasS.A.K.McGarraughG.YeungS.，controlsolutionforabloodglucosemonitorUSpatent，G01N，5605837，1997-02-25)，其所附一次性酶試條上無(wú)電極，試條加血樣后即顯肉眼可見(jiàn)色。嚴(yán)格說(shuō)來(lái)，這類(lèi)比色試條及比色計(jì)不能算作傳感技術(shù)。加之，血樣中所含紅色的血紅蛋白會(huì)使吸收光譜波長(zhǎng)發(fā)生改變，從而產(chǎn)生一定誤差。這兩類(lèi)商品皆于1998年進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，功能較多的機(jī)型銷(xiāo)售價(jià)分別高達(dá)1900元和1100元，要比它們?cè)谄渖a(chǎn)國(guó)的售價(jià)50美元和40美元高近4～5倍。值得注意的是，目前這兩類(lèi)商品皆只限于測(cè)定血糖，且皆是利用以葡萄糖氧化酶為主的酶反應(yīng)系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這是因?yàn)樵撁篙^穩(wěn)定，容易制造的緣故。其它氧化酶類(lèi)則因其不穩(wěn)定性而尚無(wú)這類(lèi)一次性酶電極試條式產(chǎn)品入市。為此，只有研制新的一次性酶電極試條才能改變傳統(tǒng)BS技術(shù)，這就應(yīng)將免疫層析試條技術(shù)與可把酶、抗體等蛋白質(zhì)長(zhǎng)期室溫保存的玻璃化技術(shù)這兩項(xiàng)技術(shù)融入到傳統(tǒng)BS技術(shù)中，才能獲得具有高度穩(wěn)定性的、用于檢測(cè)血糖的、屬于電化學(xué)類(lèi)傳感器的一次性酶電極試條。本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用?；夹g(shù)生產(chǎn)檢測(cè)血糖用電化學(xué)傳感器的酶電極試條，它通過(guò)室溫?；夹g(shù)使酶電極試條能在室溫下長(zhǎng)期存放而活力不變，解決了該試條原在室溫存儲(chǔ)下穩(wěn)定性差的問(wèn)題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種應(yīng)用?；夹g(shù)生產(chǎn)檢測(cè)血糖用電化學(xué)傳感器的酶電極試條，其生產(chǎn)工藝包括下列步驟第一步，玻態(tài)葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)取葡萄糖氧化酶溶液，加入固態(tài)?；d體，使其終濃度達(dá)到10％，分裝入瓶；將瓶全部放入?；瘷C(jī)中玻化12小時(shí)；?；吀髌烤跈C(jī)內(nèi)用橡皮塞密封，再取出封上鋁蓋，此即玻態(tài)葡萄糖氧化酶成品，于室溫下貯存即可；第二步，玻態(tài)葡萄糖氧化酶的活力檢測(cè)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取已在室溫下貯存3個(gè)月的上述玻態(tài)葡萄糖氧化酶成品5瓶(每瓶1000單位)，放入45℃恒溫箱中保溫21天，與此同時(shí)，放入對(duì)照品葡萄糖氧化酶凍干品；保溫到21天時(shí)取出各樣品，按經(jīng)典比色法測(cè)酶活力；其結(jié)果是玻態(tài)葡萄糖氧化酶成品活力絲毫未變，而對(duì)照品葡萄糖氧化酶凍干品的酶活力喪失了32％，由此，玻態(tài)葡萄糖氧化酶具有最高穩(wěn)定性；第三步，葡萄糖氧化酶酶電極試條的?；瘜⒈景l(fā)明的一次性酶電極試條在傳統(tǒng)的酶反應(yīng)系統(tǒng)中添加?；d體，使酶電極試條呈玻態(tài)而高度穩(wěn)定；本發(fā)明的試條電極采用兩極材料相同而面積不等的形式，電極材料為噴金電極，以抗空氣氧化，使導(dǎo)電性能優(yōu)良；酶反應(yīng)系統(tǒng)的?；僮鬟^(guò)程如下1、酶反應(yīng)系統(tǒng)組分的配制固定化載體為羥乙基纖維素和微晶纖維素的混合物，最適濃度為4.5％；粘結(jié)劑為羧甲基纖維素，最適濃度為0.5％；電子傳遞中間體為鐵氰化鉀，最適濃度為16％；濕潤(rùn)劑為T(mén)ritonX-100，最適濃度為0.08％；玻態(tài)葡萄糖氧化酶的最適加量為1750μ/ml；最適緩沖系統(tǒng)為pH6.2、0.34mol/L磷酸鉀緩沖液；配制時(shí)，上述各試劑分別用pH6.2、0.3mol/L磷酸鉀緩沖液配制成高濃度貯備液，使用時(shí)再按所需量組合，并過(guò)濾取清液，量體積后計(jì)算此液中已含玻化載體量，再補(bǔ)加固態(tài)?；d體使其終濃度達(dá)到10％，制成酶反應(yīng)?；海?、酶電極試條的制備取新生產(chǎn)的兩極面積不等式噴金電極試條，在其加酶池和兩電極接點(diǎn)處，先用洗潔精清洗、蒸餾水漂清，再用消毒棉簽沾無(wú)水乙醇擦洗，待乙醇揮發(fā)干凈后，把各電極試條整齊劃一地裝入加樣盒，放到設(shè)在10萬(wàn)級(jí)凈化室中的全自動(dòng)加液機(jī)操作平臺(tái)上，噴加酶反應(yīng)玻化液于試條加酶池中；在自動(dòng)加液機(jī)的貯液瓶中預(yù)先灌入上述第1項(xiàng)操作過(guò)程中所配制好的酶反應(yīng)?；?；加樣所需各參數(shù)也預(yù)先在其電腦控制器上設(shè)置完成；3、酶電極試條的?；瘜⒓雍妹阜磻?yīng)?；旱脑嚄l，連盒放入?；瘷C(jī)中?；?，?；瘻囟葹?5℃，?；瘯r(shí)間為40分鐘；?；瓿珊?，在氣室中把各盒加蓋密閉，移入設(shè)置在10萬(wàn)級(jí)凈化室的局部去濕柜中，在控濕為相對(duì)濕度25％的條件下，把各酶電極加樣池粘貼薄膜蓋后，將試條分裝入鋁箔袋中并封口，此即檢測(cè)血糖用電化學(xué)傳感器的酶電極試條成品。本發(fā)明將傳統(tǒng)的、號(hào)稱(chēng)可反復(fù)使用的柱式酶電極(實(shí)際為用一次，酶活力就下降一些)改為一次性酶電極試條，此試條用后即棄，酶活力由廠方保證。其次，本發(fā)明在傳統(tǒng)的酶反應(yīng)系統(tǒng)中添加了玻化載體，使酶電極試條呈玻態(tài)而高度穩(wěn)定。本發(fā)明解決了酶電極試條在室溫存儲(chǔ)下穩(wěn)定性差的問(wèn)題，通過(guò)室溫?；夹g(shù)使酶電極試條能在室溫下長(zhǎng)期存放而活力不變。本發(fā)明的生產(chǎn)傳感器用室溫穩(wěn)定的酶電極試條具有如下三個(gè)特點(diǎn)一是將購(gòu)買(mǎi)到的國(guó)產(chǎn)液態(tài)葡萄糖氧化酶(簡(jiǎn)稱(chēng)GOD)玻璃化，使之無(wú)須放置冰箱，能在室溫下長(zhǎng)期存放而活力不變。二是酶電極試條的生產(chǎn)采用了自創(chuàng)?；に?，并在自制室溫?；瘷C(jī)中實(shí)施。三是成品包裝是在設(shè)置于10萬(wàn)級(jí)凈化室內(nèi)的局部去濕柜中完成，柜內(nèi)相對(duì)濕度自動(dòng)恒定在25％。本發(fā)明所得玻態(tài)葡萄糖氧化酶經(jīng)45℃破壞實(shí)驗(yàn)達(dá)21天活力不變，而作為對(duì)照的來(lái)自美國(guó)西格馬公司(Sigma)的兩種葡萄糖氧化酶凍干品，在同條件下進(jìn)行破壞，活力分別下降了26％(SigmaG-2133)和60％(SigmaG-7016)。同樣，本發(fā)明所得檢測(cè)血糖的電化學(xué)傳感器用一次性玻態(tài)葡萄糖氧化酶電極試條，經(jīng)45℃破壞實(shí)驗(yàn)達(dá)21天，酶活力仍無(wú)變化，50片試條的平均條間差仍能保持在破壞實(shí)驗(yàn)前的±0.5mmol/L內(nèi)，用此試條分別測(cè)試6.25、12.5和25mmol/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)呈線(xiàn)性。下面結(jié)合附圖、附表和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。圖1是一種應(yīng)用玻化技術(shù)生產(chǎn)檢測(cè)血糖用電化學(xué)傳感器的酶電極試條的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明的玻態(tài)葡萄糖氧化酶產(chǎn)品經(jīng)日本著名的旭化成化學(xué)試劑工業(yè)有限公司在日本總部檢測(cè)其穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3是本發(fā)明生產(chǎn)的玻態(tài)一次性酶電極試條，插入微型數(shù)字式電化學(xué)測(cè)定儀中測(cè)定葡萄糖一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)所得線(xiàn)性曲線(xiàn)圖。圖4是本發(fā)明的玻態(tài)葡萄糖氧化酶電極的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表1是用本發(fā)明生產(chǎn)的玻態(tài)GOD酶電極試條測(cè)各濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表2是用德國(guó)寶靈曼電化學(xué)傳感器及其所附酶電極試條測(cè)各濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。參看圖1，本發(fā)明的酶電極試條上設(shè)有加酶及?；旱募訕映?，在試條的下端有電極引出端2。本發(fā)明應(yīng)用?；夹g(shù)生產(chǎn)檢測(cè)血糖用電化學(xué)傳感器的酶電極試條，其生產(chǎn)工藝包括下列步驟第一步，玻態(tài)葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)取購(gòu)自保定長(zhǎng)城臨床試劑公司的葡萄糖氧化酶溶液，共33萬(wàn)單位，加入購(gòu)自上海保康生物高科技公司的IV型固態(tài)?；d體，使其終濃度達(dá)到10％。以每瓶1000單位分裝，共330瓶，全部放入自產(chǎn)?；瘷C(jī)(參見(jiàn)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利發(fā)明者范培昌申請(qǐng)人:上海正源生命技術(shù)有限公司