專利名稱：柯薩奇病毒b免疫球蛋白抗體g酶免試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)產(chǎn)品，具體涉及一種柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgG ELISA試劑盒及制備方法。
柯薩奇病毒B1-6對(duì)易感人群具有高度的傳染性，兒童是最敏感的人群，病毒流行期兒童的感染率通常為10-20％家庭中所有敏感成員通常都被感染，因此，柯薩奇病毒B感染所致的相關(guān)疾病發(fā)病率較高，尤其柯薩奇病毒性心肌炎對(duì)兒童具有很大威脅和危害。臨床的早期診斷和治療有很重要意義。以往柯薩奇病毒B感染和致病的病原學(xué)確診法是分離病毒，但這種方法的標(biāo)本采集和處理較復(fù)雜，病毒分離程序煩瑣，實(shí)驗(yàn)時(shí)間很長(zhǎng)，因此病毒分離技術(shù)的早期診斷優(yōu)勢(shì)不大。而血清中特異性IgG抗體是繼早期特異性IgM抗體出現(xiàn)后又一次病毒感染的主要標(biāo)志。
本發(fā)明的目的在于克服以往方法的不足之處，研制一種靈敏度和特異性高的診斷試劑盒。本發(fā)明提供了一種柯薩奇病毒BI-6混合型抗體IgG ELISA試劑盒，該試劑盒是用COXB病毒B1-6混合型抗原包被，羊抗人IgG聯(lián)接辣根過氧化物酶為檢測(cè)抗體，檢測(cè)血清中的COXB病毒B1-6混合型抗體IgG，并且由下列試劑組成預(yù)包被反應(yīng)條 48孔酶標(biāo)記液1瓶(3ml)樣品稀釋液1瓶(6ml)陽性對(duì)照1支(200μl)陰性對(duì)照 1支(200μl) 20倍濃洗滌液1瓶(13ml)底物緩沖液甲 1瓶(3ml)底物緩沖液乙1瓶(3ml)終止液1瓶(3ml)本發(fā)明的另一目的是提供了上述柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgG ELISA試劑盒的制備方法，該方法包括下列步驟一、原材料及其規(guī)格COXB病毒B1-6混合抗原1∶1000酶標(biāo)板華東理工大學(xué) ELISA測(cè)定CV(％)＜10％陽性對(duì)照診斷心肌炎患者血清，用本試劑盒測(cè)定A值＞0.8，放置-20℃?zhèn)溆谩?br> 陰性對(duì)照選正常人血清，用本試劑盒測(cè)定A值＜0.09，放置-20℃?zhèn)溆谩?br> 酶標(biāo)抗體羊抗人IgG-HRP辣根過氧化物酶，RZ＞3.0Sigma進(jìn)口酶標(biāo)記羊抗人IgG，雙擴(kuò)散1∶64。
小牛血清 杭州四季清廠生產(chǎn)。
其他試劑
Na2CO3A.RNaHCO3A.R小牛血清 杭州四季清廠生產(chǎn)Na2HPO4.12H2OA.RNaH2PO4.2H2O A.RNaCL A.RTweel-20 化學(xué)純甘油 化學(xué)純H2O2A.R檸檬酸.H2O A.RTMB 熔點(diǎn)168℃EDTAA.RH2SO4A.RTrisA.R蒸餾水必需符合《中國藥典》(1990)之規(guī)定細(xì)胞及動(dòng)物要求(1)Hela細(xì)胞(ATCC CCL-2)(2)山羊 雄性 15公斤左右二、包被抗原(COXB病毒B1-6混合抗原)的制備(1)COX B病毒1-6型毒種來源昆明生物所(2)Hela細(xì)胞來源中科院細(xì)胞所(3)細(xì)胞傳代①培養(yǎng)劑配制PRMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)過濾除菌，200ml基礎(chǔ)培養(yǎng)劑中含牛血清10％青霉素 4萬單位鏈霉素 4萬單位6％NaHCO3 4ml3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制用無Ca、Mg離子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化細(xì)胞。
③細(xì)胞傳代將成片的細(xì)胞傾去培養(yǎng)液，加入DT進(jìn)行細(xì)胞消化，觀察細(xì)胞已呈疏松網(wǎng)狀，既倒去DT，加入營養(yǎng)液后，分瓶培養(yǎng)培養(yǎng)3-5天。
(4)病毒的感染、培養(yǎng)、收毒和鑒定①將形態(tài)完整、成片的單層細(xì)胞傾去培養(yǎng)液后，用不含牛血清的洗液洗一次。
②細(xì)胞感染病毒后，在37℃吸附1小時(shí)。
③補(bǔ)充培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)。
④逐日觀察細(xì)胞至所有細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變后，用無菌方法收獲病毒。
⑤微量平底板進(jìn)行病毒濃度的滴定和病毒鑒定。
病毒滴定用10倍的倍比稀釋的方法進(jìn)行病毒的稀釋，病毒加入微量板中，每孔加50ul病毒，每個(gè)稀釋度加4孔，然后加入細(xì)胞50ul，設(shè)細(xì)胞對(duì)照，按Reed-Muench方法計(jì)算病毒的TCID50。
病毒的鑒定應(yīng)用免疫電鏡法；應(yīng)用中和試驗(yàn)方法(微量滴定法)病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔內(nèi)，25ul/孔，抗血清作1∶4-1∶1024連續(xù)4倍稀釋，25ul/孔，每個(gè)稀釋度4孔，將板加蓋，37℃中培育2小時(shí)。然后每孔內(nèi)加Hela細(xì)胞50ul，同時(shí)設(shè)病毒陰性、陽性對(duì)照，逐日觀察細(xì)胞病變。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出現(xiàn)CPE。
(5)抗原的制備、濃縮和純化①病毒滅活。
②去除病毒碎片用冷凍離心的方法去除細(xì)胞碎片。
③初步濃縮、提純用PEG方法進(jìn)行提純。
④病毒的進(jìn)一步純化用葡聚糖過柱、洗脫的方法，然后在A280的分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定。三、羊抗人IgG(r)制備(1)人IgG(r)鏈的制備(2)30ml人臍帶混合血清，50％及33％飽和硫酸銨各鹽析1次，PH7.2PBS透析去鹽，體積濃縮至30％。
(3)過Sephadex G200柱，PH8.00.2M Nacl-O.1MTris緩沖液洗脫，分管收集，第二峰為IgG。
(4)雙擴(kuò)散法鑒定IgG純度。
(5)10mM疏基乙醇4℃3h解離輕鏈，對(duì)PB透析24h。
(6)再過Sephadex G200柱，洗脫液同上，收集第一峰IgG(r)鏈。
(7)雙擴(kuò)散鑒定r鏈特異性。
(8)光密度法測(cè)定IgG(r)濃度。
(9)抗r鏈特異性抗體的制備。
(10)1mg/ml r鏈加等量福氏完全佐劑研缽中研磨乳化。
(11)每只羊背部多點(diǎn)注射3mg r鏈抗原，2周-1個(gè)月1次，共5-8次，雙擴(kuò)散效價(jià)達(dá)1∶64以上時(shí)采集血清。
(12)辛酸法純化抗血清IgG部分蛋白定量。四、酶標(biāo)記抗體制備羊抗人IgG(r)用過典酸鈉法與辣根過氧化物酶偶聯(lián)對(duì)PBS充分透析，加等體積甘油，-20℃以下保存，效價(jià)＞1∶2000(方陣滴定法測(cè)定)五、酶標(biāo)記羊抗人IgG(r)濃度測(cè)定采用方陣滴定法選擇酶標(biāo)記抗體工作濃度為1∶2000六、預(yù)包被抗原板的制備(1)包被Na2CO30.6gNa2HCO31.58g重蒸水 500ml加入適量COXB病毒1-6混合型抗原，調(diào)整PH至9.5加入板條各孔中，置濕盒中加蓋，4℃過夜后甩干。
(2)洗滌Tris 2.42g重蒸水1000ml加入板條各孔中，靜置5秒后甩干，上述操作重復(fù)3次，以除去剩余抗原。
(3)封閉蔗糖 100g羊血清 25ml0.1MPBS1000ml加入板條各孔中放入濕盒中(加蓋)37℃2h，棄去液體，吸水紙上拍干重復(fù)一次，待干燥后，放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4℃。
(4)陽性對(duì)照制備診斷心肌炎患者的血清，60℃放置1小時(shí)，除菌過濾，用本試劑盒測(cè)定A值＞0.8備用，分裝。
(5)陰性對(duì)照的制備正常人血清用本試劑盒測(cè)定A值0-0.09用萬分之二硫柳汞防腐備用分裝。
(6)酶標(biāo)記抗體配制30％小牛血清羊抗人IgG(r)-HRP 50％0.15MPBS(稀釋度1∶2000)20％甘油——→稀釋20倍分裝(7)酶標(biāo)記抗體稀釋液小牛血清 30ml0.15MPBS 50ml甘油 20ml20％Tween-20 2.5ml調(diào)PH至7.2(8)底物液甲Na2HPO4.12H2O 1.7g
檸檬酸.H2O 0.5g3％H2O2200ul重蒸水 100ul調(diào)PH至5.0(9)底物液乙EDTA 17.5mg檸檬酸.H2O 0.5g重蒸水 100ml加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25ul(10)終止液濃H2SO410ml蒸餾水 80ml(11)20X洗滌液Tris 4.84g重蒸水 100ml七、半成品的檢定(1)已包被板的檢定測(cè)定陽性血清CV(％)＜10％(n-10)(2)穩(wěn)定性檢定①陰性對(duì)照和陽性對(duì)照+4℃-+8℃的穩(wěn)定性檢定試劑盒內(nèi)設(shè)定陰性對(duì)照及陽性對(duì)照均+4℃-+8℃放置9個(gè)月，再用該試劑盒測(cè)定吸光度在正常范圍內(nèi)。
②試劑盒37℃穩(wěn)定性檢定裝配前一星期將羊抗人IgG(r)-HRP(1+100)(同一批羊抗人IgG(r)-HRP檢測(cè)一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各測(cè)定一次，并用羊抗人IgG(r)-HRP置-20℃作對(duì)照，測(cè)得質(zhì)控血清7天基本不變，則可以使用。
(3)特異性檢定用65份內(nèi)控參比血清來檢測(cè)半成品，陰性參比血清允許出現(xiàn)陽性1份，陽性參比血清允許出現(xiàn)陰性1份。
陰性內(nèi)控血清組成T1-3HAV抗體陽性血清，T4-6HCV抗體陽性血清T7-9HEV抗體陽性血清，T10-14HBV表面抗體陽性血清，T15-24CVB-IgM陰性血清，T25-27類風(fēng)濕因子陽性血清，T28-30TB陽性血清，T31-33EBV陽性血清，T34-36CMV陽性血清，T37-39HVS陽性血清，T40-42Hpol陽性血清，T43-45TOXO陽性血清，45份特異性血清應(yīng)允許1份為陽性；陽性內(nèi)控血清組成Y1-20 CVB-IgM陽性血清，20份陽性血清，應(yīng)允許1份為陰性，其余19份應(yīng)檢測(cè)為陽性；(4)靈敏度血清①組成L1#按以下稀釋度稀釋1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀釋度稀釋1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀釋度稀釋1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判斷標(biāo)準(zhǔn)L1#靈敏度應(yīng)檢測(cè)到1∶64L2#靈敏度應(yīng)檢測(cè)到1∶128L3#靈敏度應(yīng)檢測(cè)到1∶32(5)精密性血清將同一樣品平行加樣10孔，其檢測(cè)值的變異系數(shù)小于15％(CV％＜15)；(6)酶標(biāo)抗體稀釋液，底物液，經(jīng)過37℃細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)無細(xì)菌生長(zhǎng)；八、試劑盒組裝(1)上述制備步驟所用試劑用過濾器除菌過濾后超凈分裝；(2)試劑盒必需有外包裝盒，海棉墊，塑料瓶6瓶，eppenkof管2支，包被板，說明書，內(nèi)標(biāo)簽紙9張，外標(biāo)貼紙1張，批號(hào)lot/EXP，48T/96T；九、成品檢定(1)物理檢查①藥盒外包裝，標(biāo)簽，批號(hào)，規(guī)格(48T/96T)有無遺漏；②藥盒內(nèi)試劑瓶完整無滲漏，試劑瓶數(shù)和說明書無欠缺，標(biāo)簽完整，有效期應(yīng)清楚明晰；③藥盒試劑(酶標(biāo)抗體稀釋液，底物液甲，底物液乙，洗滌液)核對(duì)PH值及溶液是否澄清；(2)穩(wěn)定性檢定完全同半成品檢定；(3)特異性檢定完全同半成品檢定；(4)靈敏度完全同半成品檢定；(5)精密性完全同半成品檢定；(6)抽樣合格后，留下5個(gè)試劑盒剩余入庫。
3個(gè)試劑盒4℃ 2個(gè) 隔一個(gè)月測(cè)定1次37℃ 1個(gè) 第一次隔三天測(cè)定1次，以后每星期測(cè)定1次，記錄數(shù)據(jù)，繪制圖表；2個(gè)試劑盒留庫備查十、保存與有效期保存于2-8℃，自檢定后合格之日起有效期為8個(gè)月。
ELISA法檢測(cè)人血清中CVB1-6 IgM和CVB1-6 IgG試劑盒使用報(bào)告(上海中醫(yī)科大學(xué)附屬曙光醫(yī)院提供)一、材料1、“柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM(CVB1-6IgM)檢測(cè)試劑盒”、“柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgG(CVB1-6 IgG)檢測(cè)試劑盒”均由上海新新醫(yī)學(xué)生物工程公司提供。2、檢測(cè)樣品來自小兒、心內(nèi)科及呼吸科等門診及住院病人血樣。二、方法根據(jù)試劑盒規(guī)定用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定病人血清中的CXB1-6 IgM和CVB1-6IgG，試驗(yàn)具體詳見試劑盒操作說明書。三、結(jié)果我們對(duì)1998年11月到2000年6月就診病人隨機(jī)抽樣443例臨床似診心肌炎、上呼吸道感染、心肌病、下呼吸道感、冠心病等類型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析調(diào)查，報(bào)告見表。
四、討論目前柯薩奇病毒B組已發(fā)現(xiàn)6型(CVB1-6)，它可引起各種疾病，該病毒感染人體后，可引起各種癥狀，從輕度的心臟癥狀或上呼吸道感染到重度的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如心肌炎、心包炎、擴(kuò)張性心肌病、肺炎、腦炎、腎炎、肝炎、糖尿病等。臨床上絕大多數(shù)病毒性心肌炎是由柯薩奇病毒和?？刹《?兩者都屬腸道病毒)感染引起。而柯薩奇B組病毒為人體患病毒性心肌炎的首位病原體。機(jī)體為了抵御柯薩奇B組病毒的感染，早期或在急性期會(huì)產(chǎn)生特異性CVB1-6 IGM抗體。從實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的表中可看出臨床似診心肌炎146例中CVB1-6 IgM陽性的有65例(65/146)占總數(shù)44.5％CVB！-6IgG陽性的有82例(82/146)占總數(shù)56.2％，除心肌炎外的其他病種297例中CVB IgM陽性56例(56/297)占總數(shù)18.9％，CVB1-6IgG陽性48例(48/297)占總數(shù)16.3％?？傊?，臨床確診心肌炎的病例出現(xiàn)CVB1-6IGM、IgG陽性率遠(yuǎn)大于其他病種，所以我們通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，體會(huì)到由上海新新醫(yī)學(xué)生物工程公司研制《柯薩奇病毒B1-6混合型IgM檢測(cè)試劑盒》、《柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgG檢測(cè)試劑盒》能為臨床診斷病毒性心肌炎提供比較可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM檢測(cè)試劑盒，柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgG檢測(cè)試劑盒臨床考核總結(jié)報(bào)告(由上海新新醫(yī)學(xué)生物工程公司提供)本公司研究和生產(chǎn)的“柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM及IgG試劑盒”于1998年3月至2000年6月期間委托第二軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院，上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬新華醫(yī)院和上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院三家醫(yī)療單位作臨床應(yīng)用和考核，現(xiàn)每家醫(yī)院均出具了詳細(xì)的臨床分析使用報(bào)告，本公司將此歸納總結(jié)如下；三家醫(yī)院共對(duì)1787份病例血清作了CVB1-6IgM抗體檢測(cè)，其中心肌炎612人，心律失常247人，上感823人，心肌病44人，下感29人，冠心病32人，各病種CVB1-6 IgM和IgG抗體陽性率見下表病名 例數(shù) IgM(+)％IgG(+)％心肌炎612294 44.8339 55.4心律失常 247 28 11.3 41 16.6上感 823134 16.3 97 11.8心肌病 44 9 20.5 15 34.1下感 29 5 17.2 7 24.1冠心病 32 7 21.9 9 28.175份傳染病性心肌炎相對(duì)比IgM陽性率分別為4％和69.1％IgG陽性率分別為4％和76.8％，統(tǒng)計(jì)處理差異非常顯著，P＜0.01提示CVB感染是病毒性心肌炎的主要原因，CVB1-6IgM和IgG抗體的檢測(cè)在病毒性心肌炎的診斷和治療上有重要應(yīng)用價(jià)值。
另一組210例病毒性心肌炎年齡分布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，年齡越小，病毒性心肌炎的發(fā)病率越高，且IgM抗體的陽性率也越高，而IgG抗體的陽性率隨年齡的增長(zhǎng)而增高，這提示，CVB感染后，年齡越小，病毒的潛伏期越短，發(fā)病越早。
上呼吸道感染中，CVB IgM和IgG的總體陽性率分別為16.3％和11.8％但將臨床癥狀和血清指標(biāo)結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)單純呼吸道癥狀的上感中，IgM和IgG抗體的陽性率都只有0.92％，而呼吸道癥狀再伴有皮疹。胸痛或肌痛等癥狀時(shí)，IgM的陽性率升至27.9-46.75，IgG陽性率為16.3-33.3％，都與單純呼吸道癥狀的陽性率有顯著差異。因皮疹、胸痛、肌痛、咽峽炎等是CVB感染后的較特征性癥狀，故癥狀與抗體陽性率的一致說明本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果較正確。
不同病因引起的心律失常患者中，CVB抗體的陽性率有所差異，主要表現(xiàn)在由急性感染引起的心律失常，其CVB IgM和IgG抗體陽性率明顯高于其它病因的心律失?？贵w陽性率，這對(duì)進(jìn)一步研究CVB感染與心律失常的發(fā)病關(guān)系有一定指導(dǎo)作用，也使CVB1-6IgM和IgG成為明確感染性心律失常病因的一項(xiàng)輔助檢測(cè)指標(biāo)。
本應(yīng)用中檢測(cè)了44例心肌病患者中的該項(xiàng)指標(biāo)，IgM和IgG抗體陽性率分別為20.5％和34.1％從一份分類統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中可以看出，原發(fā)性心肌病的IgM和IgG抗體均高于特異性心肌病，這對(duì)進(jìn)一步研究原發(fā)性心肌病的病因和致病機(jī)理提供了信息。
曙光醫(yī)院的應(yīng)用中還檢測(cè)了29例下感(肺炎)和32例冠心病，這二類抗體也都有一定的陽性率，這提示肺炎和冠心病也與CVB感染有關(guān)，值得進(jìn)一步加以關(guān)注。
三家醫(yī)藥經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間和大病例數(shù)的應(yīng)用后，一致認(rèn)為我們研制的CVB1-6IgM和IgG檢測(cè)試劑盒質(zhì)量可靠，操作簡(jiǎn)便，試劑穩(wěn)定性好，測(cè)定結(jié)果正確，該試劑盒對(duì)病毒性心肌炎的診斷和合理治療有特別的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)感染性心律失常和上感，心肌病的病因分析也能起到很大的作用，各病種及分類測(cè)定值與臨床診斷結(jié)果一致，醫(yī)院應(yīng)用結(jié)果滿意。
柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgM及IgG試劑盒使用報(bào)告(由第二軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供)1998年3月至2000年6月期間，本院臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)診斷為心肌炎、心律失常和上感的三種疾病共830例，同時(shí)作COXB1-6IgM和IgG抗體檢測(cè)，旨在對(duì)這三種疾病與柯薩奇病毒感染間的關(guān)系作一探討，檢測(cè)用試劑盒由上海新新醫(yī)學(xué)生物工程公司提供，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，標(biāo)本來源為本院小兒、心內(nèi)和呼吸科門診及住院病人血清。
檢測(cè)總結(jié)果見表一表一三種疾病COXB1-6抗體陽性率病名病例數(shù) IgM(+)％IgG(+)％心肌炎256128 50.0142 55.5心律失常 2472811.3 4116.6上感 3274012.2 27 8.3合計(jì) 830 19623.621025.3表一中顯示，心肌炎中有大約一半的病例可能系由COX病毒1-6型感染所引起，另按病因分類，心肌炎有的是明確疾病的并發(fā)癥，如白核、結(jié)核、肝炎、腮腺炎等各種細(xì)胞或病毒感染后的心肌炎，這類心肌炎一般歸納為傳染病性心肌炎。而有的心肌炎。原發(fā)疾病很不明確，臨床擬診為病毒性心肌炎者多數(shù)屬這一類，我們將上述心肌炎按這二類病因分析統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如下表二 心肌炎病因與COXB1-6抗體的關(guān)系病 因 病例數(shù) IgM(+)％IgG(+)％傳染病性心肌炎75 3 4.0 3 4.0擬診病毒性心肌炎 181 12569.1139 76.8表二說明，疾病明確的并發(fā)癥性心肌炎，COXB1-6抗體陽性率很低，而在無明確疾病引起的病毒性心肌炎中，COXB1-6抗體的陽性率很高，提示COX病毒感染是病毒性心肌炎的主要原因，COXB！-6IiM和IgG抗體的檢測(cè)在病毒性心肌炎的診斷和治療上有重要應(yīng)用價(jià)值。
表一的247例心律失?；颊咧校珻OXB1-6IgM和IgG的陽性率分別只有11.3％和16.6％，但我們將心律失常按其病因分類后，可見器質(zhì)性心臟病，藥物，甲亢等引起的心律失常，其COCB1-6病毒感染與心律失常中，該抗體的陽性率分別高達(dá)25％和38.2％(表3)，說明COXB1-6病毒感染與心律失常也有較大關(guān)系，也已成為感染性心律失常的檢測(cè)指標(biāo)。
表三 心律失常病因COXB1-6抗體的關(guān)系病名 例數(shù)IgM(+) ％IgG(+) ％器質(zhì)性心臟病 74 2 2.7 3 4.1藥物 21 1 4.8 2 9.5甲亢 38 2 5.3 4 10.5急性感染 76 19 25 29 7.9其它 38 4 10.53 38.2合計(jì)2472811.3 4116.6上感一般由流感病毒或合胞病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、?？刹《尽⒐跔畈《镜纫?，故COXB1-6IgM和IgG的抗體陽性率在上感的檢測(cè)中一般不會(huì)太高，正如表一所示，其抗體陽性率分別只有12.2和8.3％，但我們結(jié)合上感的各種癥狀，分別統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)上感中只有一般呼吸道癥狀的，COXB1-6抗體陽性率則十分低，而呼吸道癥狀同時(shí)伴有皮疹、胸痛、肌痛等癥時(shí)，該抗體的陽性率就明顯增高(表四)，因此，對(duì)上感中出現(xiàn)皮疹和肌痛的病例作血清COXB1-6抗體檢測(cè)，對(duì)明確COX病毒性上感的診斷有很大的作用。因皮診、胸痛、肌痛和咽峽炎等是CVB感染后的較特征性癥狀，故癥狀與抗體陽性率的一致說明本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果較正確。
表四 上感癥狀與COXB1-6抗體的關(guān)系癥狀 病例數(shù) IgM(+) ％IgG(+)％呼吸道癥狀 218 2 0.922 0.92呼吸道癥，皮疹 43 12 27.97 16.3呼吸道癥，胸痛，肌痛36 12 33.38 22.2呼吸道癥，皮疹，肌痛30 14 46.710 33.3合計(jì)327 40 12.227 8.3經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間和大病例數(shù)的應(yīng)用，我們認(rèn)為由上海新新醫(yī)學(xué)生物工程公司生產(chǎn)的COXB1-6 IgM和IgG試劑盒對(duì)明確臨床病毒性心肌炎的診斷和采取正確的治療方案具有重要作用，在感染性心律失常和上感的病因分析方面也有很高的應(yīng)用價(jià)值，試劑穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判定可靠。三種疾病的分類測(cè)定值與臨床診斷結(jié)果一致，并且心肌炎中COXB1-6 IgM陽性率低于IgG陽性率，而上感中IgM陽性率高于IgG，這又顯示了疾病的潛伏期長(zhǎng)短與IgM，IgG抗體的消長(zhǎng)規(guī)律一致，因此，我們認(rèn)為該試劑盒的檢測(cè)結(jié)果正確，使用滿意。
柯薩基病毒B1-6混合型抗體IgM及IgG檢測(cè)試劑盒應(yīng)用報(bào)告(由上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬新華醫(yī)院提供)柯薩基病毒于1948年在美國柯薩基地區(qū)分離不得名，屬小RNA病毒，分A、B兩組，B組病毒簡(jiǎn)稱CVB在人類病毒性心肌炎、上呼吸道感染等疾病中占有重要地位。用“柯薩基病毒B1-6混合型抗體IgM檢測(cè)試劑盒”和“柯薩基病毒B1-6混合型抗體IgG檢測(cè)試劑盒”來檢測(cè)和監(jiān)視相關(guān)病人血清中的柯薩基病毒B1-6混合型抗體IgM、IgG對(duì)臨床防治和研究CVB性心肌炎，上感等有實(shí)際意義。
資料和方法一、臨床資料我們對(duì)1998年10月至2000年5月間的本院病毒性心肌炎、上呼吸道感染、心肌病共514例的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
二、檢測(cè)用試劑盒由上海新新醫(yī)學(xué)生物工程公司提供，系間接ELISA方法，具體按試劑盒說明書操作。
結(jié)果一、臨床診斷為病毒性心肌炎者共210例，其中CVB1-6IgM陽性101例，陽性率為48.1％，CVB1-6IgG陽性115例，陽性率54.8％，CVB1-6IgM和IgG共同陽性的81例，占38.6％，至少一項(xiàng)指標(biāo)陽性者共135例，陽性率為64.3％。按年齡分布統(tǒng)計(jì)，陽性率見下表年齡病例IgM(+)％IgG(+) ％＜5 81 44 54.339 48.15-15 65 33 50.835 53.816-2538 15 39.523 60.526以上 26 9 34.618 69.2210 101 48.111554.8測(cè)定統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，年齡越小，IgM抗體陽性率越高，但I(xiàn)gG抗體的陽性率隨年齡增長(zhǎng)而增高，這提示，CVB感染患者后，年齡越小，病毒的潛伏期越短，發(fā)病越早。
二、臨床表現(xiàn)為上呼吸道感染者共278例，CVB1-6IgM陽性55例，陽性率19.8％IgG陽性44％，陽性率15.8％，IgM和IgG均陽性的有40例，占14.4％，至少一項(xiàng)指標(biāo)陽性的共59例，陽性率為21.25。
三、臨床診斷為心肌病者26例，其中原發(fā)性心肌病18例，特異性心肌病8例，明確的原發(fā)病因有糖尿病，甲亢、類風(fēng)濕等，分類統(tǒng)計(jì)IgM和IgG抗體陽性率見下表例數(shù)IgM(+)％IgG(+) ％原發(fā)性心肌病 18 3 16.77 38.9特異性心肌病 8 1 12.52 25合計(jì)26 415.4934.6二種心肌病均是IgG抗體陽性率高于IgM，示心肌病的發(fā)病時(shí)間均較長(zhǎng)。目前對(duì)原發(fā)性心肌病因還未研究清楚，一般認(rèn)為家族性，圍產(chǎn)期、克山病等有關(guān)，但本檢測(cè)中原發(fā)性心肌病的CVB1-6IgG(+)率達(dá)到38.9％，這為該病的病因和致病機(jī)理研究提供了信息，本試劑盒為成為該領(lǐng)域研究和診治的有效工具。
試劑盒的使用評(píng)價(jià)由上海新新醫(yī)學(xué)生物工程公司研制并提供的ELISA檢測(cè)人血清柯薩基病B1-6混合型抗體IgM，IgG的試劑盒，靈敏、特異、穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，二年多來試劑盒未出現(xiàn)明顯質(zhì)量問題，為我們的科研和臨床檢驗(yàn)作出了貢獻(xiàn)，由于柯薩基病毒不是特異性的致病因子，因此，本項(xiàng)研究中未能對(duì)該試劑盒的靈敏度和特異性作具體考核，但二年來應(yīng)用的總體感覺，試劑盒較穩(wěn)定，測(cè)定結(jié)果較符合理論值。目前，病毒性心肌炎發(fā)病率較高，因病毒分離培養(yǎng)技術(shù)復(fù)雜，需時(shí)很長(zhǎng)，顯然不能滿足早期診斷需要，而本試劑盒操作簡(jiǎn)便、快速、測(cè)定結(jié)果正確，在柯薩基病毒性心肌炎的診斷方面具有獨(dú)特的作用。檢測(cè)結(jié)果也表明，上感和心肌病的發(fā)病可能也與柯薩基感染有關(guān)系，況且，上感與病毒性心肌炎間也有某種聯(lián)系，它們間又均可呈現(xiàn)CVB1-6抗體陽性反應(yīng)，因此，該試劑盒對(duì)進(jìn)一步研究心肌炎，上感和心肌病等疾病，闡明它們的發(fā)病機(jī)理，對(duì)這些疾病的早期診斷和治療都具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
本申請(qǐng)的柯薩奇病毒B1-6混合型抗體混合型抗體混合型IgM和IgG ELISA試劑盒。其檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快速，收費(fèi)低廉，靈敏度和特異性均較高，它是柯薩奇病毒B感染疾病早期診斷和鑒別診斷的可靠病因?qū)W指標(biāo)，臨床應(yīng)用價(jià)值較高，有較明顯的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
實(shí)例1、檢測(cè)COXB1-6 IgG抗體試劑盒制備一、主要原材料1.Hela細(xì)胞 中科院細(xì)胞所2.Na2HPO4.12H2O上海新華化工廠3.Nacl 上海試劑一廠4.Kcl 江蘇常熟化工廠5.Cacl2江蘇常熟化工廠6.葡萄糖 成都化學(xué)試劑廠7.EDTA 上海試劑一廠8.水解乳蛋白 上海試劑二廠9.谷氨酸 上海試劑二廠10.谷氨酰胺 上?；瘜W(xué)試劑分裝廠11.L賴氨酸 上海生化所12.L精氨酸L組氨酸L蛋氨酸 上海試劑二廠13.小牛血清 杭州四季青生物材料工程公司14.胰蛋白酶 美國Sigma公司15.氯化銫美國Sigma公司16.辣根過氧化物酶美國Sigma公司17.TMB 上海東風(fēng)試劑廠18.高碘酸鈉 上海化學(xué)試劑分裝廠19.硼氨化鉀 上海試劑一廠20.酶標(biāo)板華東理工大學(xué)新分離技術(shù)研究室二、COXBl-6包被病毒抗原的制備1、COXB病毒1-6型毒種來源昆明生物所2、Hela細(xì)胞來源中科院細(xì)胞所3、細(xì)胞傳代①培養(yǎng)劑配制PRMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)過濾除菌，200ml基礎(chǔ)培養(yǎng)劑中含牛血清 10％青霉素 4萬單位鏈霉素 4萬單位6％NaHCO34ml3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制用無Ca、Mg離子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化細(xì)胞；③細(xì)胞傳代將成片的細(xì)胞傾去培養(yǎng)液，加入DT進(jìn)行細(xì)胞消化，觀察細(xì)胞已呈疏松網(wǎng)狀，既倒去DT，加入營養(yǎng)液后，分瓶培養(yǎng)培養(yǎng)3-5天；4、病毒的感染、培養(yǎng)、收毒和鑒定①將形態(tài)完整、成片的單層細(xì)胞傾去培養(yǎng)液后，用不含牛血清的洗液洗一次；②細(xì)胞感染病毒后，在37℃吸附1小時(shí)；③補(bǔ)充培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)；④逐日觀察細(xì)胞至所有細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變后，用無菌方法收獲病毒；⑤微量平底板進(jìn)行病毒濃度的滴定和病毒鑒定；病毒滴定用10倍的倍比稀釋的方法進(jìn)行病毒的稀釋，病毒加入微量板中，每孔加50ul病毒，每個(gè)稀釋度加4孔，然后加入細(xì)胞50ul，設(shè)細(xì)胞對(duì)照，按Reed-Muench方法計(jì)算病毒的TCID50。病毒的鑒定a.應(yīng)用免疫電鏡法；b.應(yīng)用中和試驗(yàn)方法(微量滴定法)
病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔內(nèi)，25ul/孔，抗血清作1∶4-1∶1024連續(xù)4倍稀釋，25ul/孔，每個(gè)稀釋度4孔，將板加蓋，37℃中培育2小時(shí)。然后每孔內(nèi)加Hela細(xì)胞50ul，同時(shí)設(shè)病毒陰性、陽性對(duì)照，逐日觀察細(xì)胞病變。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出現(xiàn)CPE；三、抗原的制備、濃縮和純化1、病毒滅活；2、去除病毒碎片用冷凍離心的方法去除細(xì)胞碎片；3、初步濃縮、提純用PEG方法進(jìn)行提純；4、病毒的進(jìn)一步純化用葡聚糖過柱、洗脫的方法，然后在A280的分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定；5、包被聚苯乙烯微孔板測(cè)定包被濃度和活性，1mg/ml病毒的包被濃度為1∶1000；四、羊抗人IgG(r)抗體的制備1、人IgG(r)鏈的制備。①30m1人臍帶混合血清，50％及33％硫酸銨飽和度各鹽析1次，PH7.2PBS透析去鹽，體積濃縮至30％；②過sephadex G200柱PH8.0 0.2M NaCl-0.1M Trs緩沖液洗脫，分管收集，第二峰為IgG。③雙擴(kuò)散法鑒定IgG純度。④10mM巰基乙醇4℃3h解離輕鏈，對(duì)PBB透析24h。⑤再過sephadex G200柱，洗脫液同上，收集第一峰IgG(r)鏈。⑥雙擴(kuò)散鑒定r鏈特異性。⑦光密度法測(cè)定IgG(r)濃度。2、抗r鏈特異性抗體的制備。①1mg/ml r鏈加等量福氏完全佐劑研缽中研磨乳化。②每只羊背部多點(diǎn)注射3mg r鏈抗原，2周-1個(gè)月1次，共5-8次，雙擴(kuò)效價(jià)達(dá)1∶64以上時(shí)采集血清。③辛酸法純化抗血清IgG部份，蛋白定量。5、羊抗人IgG(r)酶標(biāo)記物的制備1、稱5mg辣根過氧化物酶加0.5ml蒸餾水，再加0.5ml 60mM過碘酸鈉液氧化15′4℃中。2、加0.16M乙二醇0.5ml中止氧化，4℃30′。3、加10mg/ml羊抗人IgG(r)0.5ml，裝袋對(duì)碳酸鈉緩沖液透析過夜。4、加5mg/ml硼氫化鉀0.2ml，4℃3h再裝透析袋對(duì)PH7.2 0.01M PBS透析24h，換液4-5次。5、取出羊抗人IgG(r)-HRP作活性和效價(jià)測(cè)定，配成1mg/ml濃度時(shí)的工作效價(jià)為1∶2000。六、陰，陽性對(duì)照血清配制。
從病毒攻擊的細(xì)胞保護(hù)試驗(yàn)篩選陰性和陽性對(duì)照血清，并將陽性血清定值。1、Hela細(xì)胞培養(yǎng)2、在試管中將待檢血清，用PBS作1∶50稀釋(10倍PBS1ml+9ml蒸餾水即為工作濃度)3、各孔中滴加100ul滴樣品稀釋液，然后分別加待檢血清5ul，同時(shí)做陽性對(duì)照1孔，陰性對(duì)照1孔(各加50ul)，空白對(duì)照1孔(孔含樣品稀釋液2滴)；4、置37℃溫箱中反應(yīng)60分鐘后，甩去孔內(nèi)液體先在草紙上拍2-3下，然后用洗滌液洗5次，每次條孔加滿洗滌液后停留30秒種，每次甩去洗滌液后都要在草紙上拍干，以便洗滌徹底。(10倍濃洗滌液1ml+9ml蒸餾水即為工作洗滌液)；5、各孔加酶標(biāo)記液1滴(50ul)，置37℃中反應(yīng)60分鐘；6、同上徹底洗滌拍干；7、各孔滴加底物緩沖液甲、乙各1滴，置37℃中反應(yīng)10-15分鐘再每孔滴加終止液1滴，置酶標(biāo)儀中450nm波長(zhǎng)讀數(shù)；8、結(jié)果判定陰性對(duì)照A值×2.5＝臨界值，凡待檢標(biāo)本孔A值大于臨界值即為陽性。陰性對(duì)照小于0.08按0.08計(jì)算；七、靈敏度，特異性和精密度試驗(yàn)1、靈敏度測(cè)定將細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)中滴定為效價(jià)64u/0.1ml( 640u/ml)，32u/0.1ml(320u/ml)及4u/0.1ml(40u/ml)的3份陽性血清用樣品稀釋液作不同濃度的稀釋后，按實(shí)驗(yàn)操作方法作靈敏度測(cè)定，結(jié)果如下方法靈敏度測(cè)定檢測(cè)抗體效價(jià)u/ml血清 640 320 160 8040302015105 2.5陽性血清1 ＞2 ＞2 1.56 1.27 0.83 0.56 0.28 0.19 0.11 0.09 0.07陽性血清2 ＞2 ＞2 1.64 1.13 0.86 0.51 0.37 0.25 0.15 0.10陽性血清30.84 0.60 0.37 0.24 0.17 0.10 0.08*A450值陰性血清測(cè)定值12 3 4 5 60.07 0.12 0.11 0.05 0.07 0.08A陰性平均值為0.0833，陽性臨界值＝0.0833×2.5＝0.208則本檢測(cè)方法對(duì)3份陽性血清的檢測(cè)靈敏度分別為20u/ml，10u/ml和15u/ml，平均為15u/ml2、特異性測(cè)定將細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)中判為陰性的血清20份按實(shí)驗(yàn)操作方法測(cè)定，結(jié)果如下待檢血清測(cè)定值1 2 3 4 5 6 7 8 9 100.08 0.11 0.09 0.11 0.09 0.10 0.13 0.09 0.05 0.10111213141516171819200.05 0.08 0.07 0.11 0.09 0.07 0.09 0.13 0.12 0.10用6份小牛血清液按實(shí)驗(yàn)操作方法測(cè)定的A值分別為0.06 0.07 0.06 0.11 0.12 0.09平均值為0.085 陽性臨界值＝0.085×2.5＝0.215則上面20份細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)陰性血清用本ELISA法測(cè)定也全部陰性，特異性100％；3、精密度測(cè)定取實(shí)驗(yàn)吸光度分別為高中低A值的3份陽性血清做精密度試驗(yàn)，批內(nèi)試驗(yàn)為每份血清同時(shí)做10個(gè)復(fù)孔，批試驗(yàn)為每份血清間隔2-3天，實(shí)驗(yàn)1次，共測(cè)定6次，結(jié)果如下批內(nèi)試驗(yàn)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X SCV(％)1 1.24 1.26 1.30 1.27 1.20 1.18 1.16 1.25 1.26 1.27 1.239 0.045 3.62 0.66 0.74 0.58 0.67 0.65 0.56 0.60 0.61 0.59 0.70 0.636 0.057 9.03 0.31 0.28 0.30 0.25 0.33 0.26 0.29 0.28 0.25 0.32 0.287 0.028 9.9平均批內(nèi)CV＝7.5％批間試驗(yàn)1 2 3 4 5 6 X S CV1 1.24 1.29 1.20 1.19 1.26 1.15 1.22 0.051 4.22 0.66 0.74 0.60 0.59 0.71 0.61 0.65 0.062 9.63 0.31 0.27 0.25 0.32 0.27 0.25 0.278 0.030 10.8平均批間CV＝8.2％八、穩(wěn)定性試驗(yàn)1、三批試劑盒于2-8℃保存的穩(wěn)定性試驗(yàn)檢驗(yàn)報(bào)告一第980521批試劑盒制備日期1998年5月4日有效期 1998年11月21日
檢驗(yàn)報(bào)告二第980607批試劑盒制備日期1998年6月1日有效期 1998年12月7日
檢驗(yàn)報(bào)告三第980617批試劑盒制備日期1998年6月10日有效期 1998年12月17日
2、三批試劑盒置37℃溫箱中保存的穩(wěn)定性試驗(yàn)。
第980521批試劑盒
第980607批試劑盒
第980617批試劑盒
權(quán)利要求
1.一種柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgG試劑盒，其特征在于該試劑盒是用COXB病毒B1-6混合型抗原包被，羊抗人IgG聯(lián)接辣根過氧化物酶為檢測(cè)抗體，檢測(cè)血清中的COXB病毒B1-6混合型抗體IgG，并且由下列試劑組成預(yù)包被反應(yīng)條 48孔 酶標(biāo)記液1瓶(3ml)樣品稀釋液1瓶(6ml) 陽性對(duì)照1支(200μl)陰性對(duì)照 1支(200μl)20倍濃洗滌液1瓶(13ml)底物緩沖液甲 1瓶(3ml) 底物緩沖液乙1瓶(3ml)終止液1瓶(3ml)
2.一種如權(quán)利要求1所述的一種柯薩奇病毒B1-6混合型抗體IgG試劑盒的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟一、原材料及其規(guī)格COXB病毒B1-6混合抗原1∶1000酶標(biāo)板華東理工大學(xué) ELISA測(cè)定CV(％)＜10％陽性對(duì)照診斷心肌炎患者血清，用本試劑盒測(cè)定A值＞0.8，放置-20℃?zhèn)溆?；陰性?duì)照選正常人血清，用本試劑盒測(cè)定A值＜0.09，放置-20℃?zhèn)溆?；酶?biāo)抗體羊抗人IgG-HRP辣根過氧化物酶，RZ＞3.0Sigma進(jìn)口酶標(biāo)記羊抗人IgG，雙擴(kuò)散1∶64。小牛血清杭州四季清廠生產(chǎn)。其他試劑Na2CO3A.RNaHCO3A.R小牛血清杭州四季清廠生產(chǎn)Na2HPO4.12H2O A.RNaH2PO4.2H2O A.RNaCL A.RTweel-20 化學(xué)純甘油 化學(xué)純H2O2A.R檸檬酸.H2O A.RTMB 熔點(diǎn)168℃EDTA A.RH2SO4A.RTris A.R蒸餾水必需符合《中國藥典》(1990)之規(guī)定細(xì)胞及動(dòng)物要求(1)Hela細(xì)胞(ATCC CCL-2)(2)山羊 雄性 15公斤左右二、包被抗原(COXB病毒B1-6混合抗原)的制備(1)COX B病毒1-6型毒種來源昆明生物所(2)Hela細(xì)胞來源中科院細(xì)胞所(3)細(xì)胞傳代①培養(yǎng)劑配制PRMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)過濾除菌，200ml基礎(chǔ)培養(yǎng)劑中含牛血清10％青霉素 4萬單位鏈霉素 4萬單位6％NaHCO3 4ml3％谷氨酰胺6ml②胰酶(DT)配制用無Ca、Mg離子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化細(xì)胞；③細(xì)胞傳代將成片的細(xì)胞傾去培養(yǎng)液，加入DT進(jìn)行細(xì)胞消化，觀察細(xì)胞已呈疏松網(wǎng)狀，既倒去DT，加入營養(yǎng)液后，分瓶培養(yǎng)培養(yǎng)3-5天；(4)病毒的感染、培養(yǎng)、收毒和鑒定①將形態(tài)完整、成片的單層細(xì)胞傾去培養(yǎng)液后，用不含牛血清的洗液洗一次；②細(xì)胞感染病毒后，在37℃吸附1小時(shí)；③補(bǔ)充培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)；④逐日觀察細(xì)胞至所有細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變后，用無菌方法收獲病毒；⑤微量平底板進(jìn)行病毒濃度的滴定和病毒鑒定；病毒滴定用10倍的倍比稀釋的方法進(jìn)行病毒的稀釋，病毒加入微量板中，每孔加50ul病毒，每個(gè)稀釋度加4孔，然后加入細(xì)胞50ul，設(shè)細(xì)胞對(duì)照，按Reed-Muench方法計(jì)算病毒的TCID50；病毒的鑒定應(yīng)用免疫電鏡法；應(yīng)用中和試驗(yàn)方法(微量滴定法)病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔內(nèi)，25ul/孔，抗血清作1∶4-1∶1024連續(xù)4倍稀釋，25ul/孔，每個(gè)稀釋度4孔，將板加蓋，37℃中培育2小時(shí)。然后每孔內(nèi)加Hela細(xì)胞50ul，同時(shí)設(shè)病毒陰性、陽性對(duì)照，逐日觀察細(xì)胞病變。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出現(xiàn)CPE；(5)抗原的制備、濃縮和純化①病毒滅活；②去除病毒碎片用冷凍離心的方法去除細(xì)胞碎片；③初步濃縮、提純用PEG方法進(jìn)行提純；④病毒的進(jìn)一步純化用葡聚糖過柱、洗脫的方法，然后在A280的分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定；三、羊抗人IgG(r)制備(1)人IgG(r)鏈的制備(2)30ml人臍帶混合血清，50％及33％飽和硫酸銨各鹽析1次，PH7.2PBS透析去鹽，體積濃縮至30％；(3)過Sephadex G200柱，PH8.0 0.2M Nacl-O.1MTris緩沖液洗脫，分管收集，第二峰為IgG；(4)雙擴(kuò)散法鑒定IgG純度；(5)10mM疏基乙醇4℃ 3h解離輕鏈，對(duì)PB透析24h；(6)再過Sephadex G200柱，洗脫液同上，收集第一峰IgG(r)鏈；(7)雙擴(kuò)散鑒定r鏈特異性；(8)光密度法測(cè)定IgG(r)濃度；(9)抗r鏈特異性抗體的制備；(10)1mg/ml r鏈加等量福氏完全佐劑研缽中研磨乳化；(11)每只羊背部多點(diǎn)注射3mg r鏈抗原，2周-1個(gè)月1次，共5-8次，雙擴(kuò)散效價(jià)達(dá)1∶64以上時(shí)采集血清；(12)辛酸法純化抗血清IgG部分蛋白定量。四、酶標(biāo)記抗體制備羊抗人IgG(r)用過典酸鈉法與辣根過氧化物酶偶聯(lián)對(duì)PBS充分透析，加等體積甘油，-20℃以下保存，效價(jià)＞1∶2000(方陣滴定法測(cè)定)五、酶標(biāo)記羊抗人IgG(r)濃度測(cè)定采用方陣滴定法選擇酶標(biāo)記抗體工作濃度為1∶2000六、預(yù)包被抗原板的制備(1)包被Na2CO30.6gNa2HCO31.58g重蒸水 500ml加入適量COXB病毒1-6混合型抗原，調(diào)整PH至9.5加入板條各孔中，置濕盒中加蓋，4℃過夜后甩干；(2)洗滌Tris 2.42g重蒸水1000ml加入板條各孔中，靜置5秒后甩干，上述操作重復(fù)3次，以除去剩余抗原；(3) 封閉蔗糖 100g羊血清25ml0.1MPBS 1000ml加入板條各孔中放入濕盒中(加蓋)37℃2h，棄去液體，吸水紙上拍干重復(fù)一次，待干燥后，放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4℃；(4)陽性對(duì)照制備診斷心肌炎患者的血清，60℃放置1小時(shí)，除菌過濾，用本試劑盒測(cè)定A值＞0.8備用，分裝；(5)陰性對(duì)照的制備正常人血清用本試劑盒測(cè)定A值0-0.09用萬分之二硫柳汞防腐備用分裝；(6)酶標(biāo)記抗體配制30％小牛血清羊抗人IgG(r)-HRP50％0.1 5MPBS(稀釋度1∶2000) 20％甘油——————→稀釋20倍分裝(7)酶標(biāo)記抗體稀釋液小牛血清 30ml0.15MPBS 50ml甘油 20ml20％Tween-20 2.5ml調(diào)PH至7.2(8)底物液甲Na2HPO4.12H2O 1.7g檸檬酸.H2O0.5g3％H2O2200ul重蒸水100ul調(diào)PH至5.0(9)底物液乙EDTA 17.5mg檸檬酸.H2O 0.5g重蒸水100ml加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25ul(10)終止液濃H2SO410ml蒸餾水80ml(11)20X洗滌液Tris 4.84g重蒸水100ml七、半成品的檢定(1)已包被板的檢定測(cè)定陽性血清CV(％)＜10％(n-10)(2)穩(wěn)定性檢定①陰性對(duì)照和陽性對(duì)照+4℃-+8℃的穩(wěn)定性檢定試劑盒內(nèi)設(shè)定陰性對(duì)照及陽性對(duì)照均+4℃-+8℃放置9個(gè)月，再用該試劑盒測(cè)定吸光度在正常范圍內(nèi)；②試劑盒37℃穩(wěn)定性檢定裝配前一星期將羊抗人IgG(r)-HRP(1+100)(同一批羊抗人IgG(r)-HRP檢測(cè)一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各測(cè)定一次，并用羊抗人IgG(r)-HRP置-20℃作對(duì)照，測(cè)得質(zhì)控血清7天基本不變，則可以使用；(3)特異性檢定用65份內(nèi)控參比血清來檢測(cè)半成品，陰性參比血清允許出現(xiàn)陽性1份，陽性參比血清允許出現(xiàn)陰性1份；陰性內(nèi)控血清組成T1-3HAV抗體陽性血清，T4-6HCV抗體陽性血清T7-9HEV抗體陽性血清，T10-14HBV表面抗體陽性血清，T15-24CVB-IgM陰性血清，T25-27類風(fēng)濕因子陽性血清，T28-30TB陽性血清，T31-33EBV陽性血清，T34-36CMV陽性血清，T37-39HVS陽性血清，T40-42Hpol陽性血清，T43-45TOXO陽性血清，45份特異性血清應(yīng)允許1份為陽性；陽性內(nèi)控血清組成Y1-20 CVB-IgM陽性血清，20份陽性血清，應(yīng)允許1份為陰性，其余19份應(yīng)檢測(cè)為陽性。(4)靈敏度血清①組成L1#按以下稀釋度稀釋1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀釋度稀釋1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀釋度稀釋1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判斷標(biāo)準(zhǔn)L1#靈敏度應(yīng)檢測(cè)到1∶64L2#靈敏度應(yīng)檢測(cè)到1∶128L3#靈敏度應(yīng)檢測(cè)到1∶32(5)精密性血清將同一樣品平行加樣10孔，其檢測(cè)值的變異系數(shù)小于15％(CV％＜15)；(6)酶標(biāo)抗體稀釋液，底物液，經(jīng)過37℃細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)無細(xì)菌生長(zhǎng)；八、試劑盒組裝(1)上述制備步驟所用試劑用過濾器除菌過濾后超凈分裝。(2)試劑盒必需有外包裝盒，海棉墊，塑料瓶6瓶，eppenkof管2支，包被板，說明書，內(nèi)標(biāo)簽紙9張，外標(biāo)貼紙1張，批號(hào)lot/EXP，48T/96T；九、成品檢定(1)物理檢查①藥盒外包裝，標(biāo)簽，批號(hào)，規(guī)格(48T/96T)有無遺漏；②藥盒內(nèi)試劑瓶完整無滲漏，試劑瓶數(shù)和說明書無欠缺，標(biāo)簽完整，有效期應(yīng)清楚明晰；③藥盒試劑(酶標(biāo)抗體稀釋液，底物液甲，底物液乙，洗滌液)核對(duì)PH值及溶液是否澄清；(2)穩(wěn)定性檢定完全同半成品檢定(3)特異性檢定完全同半成品檢定(4)靈敏度完全同半成品檢定(5)精密性完全同半成品檢定。(6)抽樣合格后，留下5個(gè)試劑盒剩余入庫；3個(gè)試劑盒4℃ 2個(gè) 隔一個(gè)月測(cè)定1次37℃ 1個(gè) 第一次隔三天測(cè)定1次，以后每星期測(cè)定1次，記錄數(shù)據(jù)，繪制圖表；2個(gè)試劑盒留庫備查十、保存與有效期保存于2-8℃，自檢定后合格之日起有效期為8個(gè)月。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種柯薩奇病毒B1—6混合型抗體IgG ELISA試劑盒。該試劑盒可用于因柯薩奇病毒B感染致病的早期診斷,檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快速、成本低廉、靈敏度和特異性高,有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提供了制備方法。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1341857SQ0012509
公開日2002年3月27日 申請(qǐng)日期2000年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月7日
發(fā)明者杜鳳鳴 申請(qǐng)人:杜鳳鳴