專利名稱：一種高效親和色譜填料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效親和色譜填料及其制備方法，具體涉及以肝素為配基的高效親和色譜填料及其制備方法。
按親和填料的基質(zhì)又可分為軟膠和硬膠兩種類型。軟膠包括天然多糖和聚丙烯酰胺等，它們具有良好的親水性，對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性吸附低，在低壓操作下，具有優(yōu)良的色譜分離性能，但它們的機(jī)械強(qiáng)度差，凝膠顆粒極易變形而破壞，使操作壓力和流速均受到很大限制，且使用壽命也短。大孔硅膠是被廣泛使用的硬膠，它們具有很好的機(jī)械性能，可在高壓、高流速條件下使用，但它們的化學(xué)穩(wěn)定性差，僅在pH2～8條件下使用。另外，硅膠表面的帶負(fù)電荷的硅羥基，對(duì)蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的非特異性吸附，使得回收率大大降低，因而也很難用于實(shí)用的高效親和色譜。理想的高效親和色譜填料應(yīng)具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，較好的化學(xué)穩(wěn)定性，良好的親水性和生物相容性以及較長(zhǎng)的使用壽命。
以肝素為配基的親和填料是一種用途廣泛的特種生化分離材料。以肝素為配基的親和填料有肝素-Sepharose，肝素-聚丙烯酰胺和肝素-硅膠等。
在與本發(fā)明相關(guān)的工作中，F(xiàn).L.Zhuo等曾報(bào)道了一種以肝素為配基的高效親和色譜填料[Journal ofChromatography，476(1989)，195-203]，他們是將DEAE-agrose包覆在大孔硅膠的表面，再將肝素鍵合在包覆層上，制備了以肝素為配基的高效親和色譜填料。經(jīng)色譜表征，該材料對(duì)抗凝血酶III有較強(qiáng)的親和作用，但在硅膠表面包覆天然多糖后，并不能完全屏蔽硅膠表面的硅羥基，對(duì)蛋白質(zhì)仍存在較強(qiáng)的非特異性吸附，質(zhì)量回收率僅為78％。
本發(fā)明的目的在于提供了一種以肝素為配基的高效親和色譜填料，克服了已有技術(shù)中以肝素為配基的高效親和色譜填料蛋白質(zhì)回收率低的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該填料的制備方法。
本發(fā)明的高效親和色譜填料，以聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球作為基質(zhì)，在該填料中含有下式的聚合單元 其中P的結(jié)構(gòu)為 Hep為肝素，其結(jié)構(gòu)為 上述的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球是甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯和甲基丙烯酸乙二醇雙酯的共聚物。
本發(fā)明的高效親和色譜填料的制備，采用如下三種方法1)先用鹽酸對(duì)肝素進(jìn)行處理，然后再利用肝素分子中的氨基與聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球上的環(huán)氧基偶聯(lián)，得到本發(fā)明的填料，其中肝素處理步驟包括將肝素溶于0.1M鹽酸中，加熱，然后加入到乙醇中。
2)先將聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球進(jìn)行氨基化，得到氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，然后再將所述氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與肝素在1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亞胺存在下，利用肝素分子中的羧基與聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球上的氨基反應(yīng)，得到本發(fā)明的填料。
3)先將聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球進(jìn)行氨基化，得到氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，然后再將所述氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與肝素在氰基硼氫化鈉存在下進(jìn)行還原氨化反應(yīng)，利用肝素分子還原端的醛基與聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球上的氨基反應(yīng)得到本發(fā)明的填料。方法一 方法二 方法三
本發(fā)明的高效親和色譜填料的3種制備方法具體步驟如下方法一1.將肝素鈉溶于0.1M HCl中，濃度為1％-20％(w/V)，置于沸水浴中加熱10-60min。
2.將上述溶液加入到乙醇中，有大量白色沉淀生成，乙醇的體積是上述溶液的1-10倍。
3.過濾，將濾渣于30-80℃溫度下干燥至干。
4.將上述干燥后產(chǎn)物溶于0.3-1.0mol/L的Na2CO3溶液中，溶液濃度為0.5％-10％(w/V)，再加入聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，肝素與聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的重量比為30∶1-3∶1，較佳的為20∶1-5∶1，攪拌，在40-80℃反應(yīng)24-96h。
5.過濾，將濾渣于30-80℃溫度下干燥至干。方法二1.制備氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⒕奂谆┧岘h(huán)氧丙酯微球加入氨水中，二者的重量體積比為1∶6-1∶2，攪拌，在30-60℃保溫5-10h后，得到氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。
2.0.05-0.20mol/L HCl溶液中加入肝素，濃度為1％-40％(w/V)，再加入氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亞胺，氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亞胺的重量比為10∶1-1∶1，較佳的為8∶1-3∶1，攪拌，調(diào)節(jié)pH＝2-8，在室溫下反應(yīng)24-96h。
3.過濾，將濾渣用大量水洗滌至中性后抽干。
4.加入0.1-0.5mol/Na2CO3溶液，攪拌成均勻的懸濁液后，加入乙酸酐，乙酸酐的體積是懸濁液的0.5-5倍，在室溫下反應(yīng)10-60min。
5.過濾，濾渣用水充分洗滌至pH值為中性后抽干。方法三1、同方法二(1)2.將肝素溶于0.05-0.50mol/LK2HPO4中，肝素的濃度為1％-10％(w/V)，再加入氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球和氰基硼氫化鈉，二者的重量比為100∶1-10∶1，攪拌成均勻的懸濁液后，于30-100℃加熱5-15h，反應(yīng)溫度優(yōu)選為50-95℃。
3.過濾，濾渣用水充分洗滌至中性后真空抽至干。
4.加入0.1-0.5mol/Na2CO3溶液，攪拌成均勻的懸濁液后，加入乙酸酐，乙酸酐的體積是懸濁液的0.5-5倍，在室溫下反應(yīng)10-60min。
5.過濾，用水充分洗滌至中性后真空吸濾至干。
本發(fā)明的以肝素為配基的高效親和色譜填料，首先通過分散聚合的方法，制備微米級(jí)粒度均勻的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，再將其活化，將活性官能團(tuán)引入聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球后，通過多種方法將肝素鍵合在聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面，制備出高效親和色譜填料。
聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的制備，是通過將甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、偶氮二異丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、乙醇和甲苯混合，甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、偶氮二異丁腈、聚乙烯吡咯烷酮分別為上述總體原料量的1wt％-10wt％、0.1wt％-1.0wt％、0.5wt％-5.0wt％，乙醇與甲苯的比例為2/8-9/1(V/V)，攪拌，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于20-70℃下反應(yīng)5-48h，反應(yīng)結(jié)束后，用沉降法除去溶劑，并用乙醇充分洗滌，得到粒徑單分散的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。
由掃描電鏡可知，本發(fā)明的高效親和色譜填料顆粒尺寸為7μm，且顆粒粒徑分布極其均勻，呈單分散狀。當(dāng)將該填料以20Mpa壓強(qiáng)裝填于φ4.0×7.0cm的不銹鋼柱中，并連接于高效液相色譜系統(tǒng)時(shí)，其柱后壓力為1.5-4.0MPa(流速為1mL/min)，以抗凝血酶III為樣品時(shí)，其親和容量為1.2-4.0mg/g親和填料。當(dāng)以人血清白蛋白為樣品測(cè)定其對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性吸附時(shí)，蛋白質(zhì)回收率大于90％。實(shí)驗(yàn)例1將下面實(shí)施例1-4制備的肝素-聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球樹脂為填料，在20MPa壓力下以勻漿法裝柱，柱管為φ4.0×7.0cm不銹鋼柱或任選。在下列條件下進(jìn)行高效液相色譜表征及高效親和分離平衡液0.004M Tris-HCl，0.10M NaCl，pH＝4.0洗脫液0.02M Tris-HCl，2.0M NaCl，pH＝7.35流速0.1mL/min～10.0mL/min檢測(cè)波長(zhǎng)280nm本發(fā)明的以肝素為配基的高效親和色譜填料具有很好的機(jī)械強(qiáng)度，能于30MPa以下穩(wěn)定工作，從而可用于高流速淋洗；化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能耐受pH1.0-12.0的環(huán)境；對(duì)抗凝血酶III具有高的親和容量和低的非特異性吸附，質(zhì)量回收率達(dá)94％，如表1所示。
表1
權(quán)利要求
1.一種高效親和色譜填料，以聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球作為基質(zhì)，其特征在于在所述的填料中含有下式的聚合單元 其中Hep為肝素，P的結(jié)構(gòu)為
2.權(quán)利要求1的填料的制備方法，其特征在于先用鹽酸對(duì)肝素進(jìn)行處理，然后再將肝素直接鍵合到聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球上，得到權(quán)利要求1的填料，其中肝素處理步驟包括將肝素溶于0.1M鹽酸中，加熱，然后加入到乙醇中。
3.權(quán)利要求1的填料的制備方法，其特征在于先將聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球進(jìn)行氨基化，得到氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，然后再將所述氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與肝素在1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亞胺存在下進(jìn)行反應(yīng)，得到權(quán)利要求1的填料。
4.權(quán)利要求1的填料的制備方法，其特征在于先將聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球進(jìn)行氨基化，得到氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，然后再將所述氨基化的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與肝素在氰基硼氫化鈉存在下進(jìn)行還原氨化反應(yīng)，得到權(quán)利要求1的填料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球作為基質(zhì)高效親和色譜填料,該填料中含有右上式的聚合單元，其中Hep為肝素,P的結(jié)構(gòu)為右下式，其制備方法是通過將肝素鍵合到聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球上,得到本發(fā)明的親和色譜填料。本發(fā)明的親和色譜填料對(duì)抗凝血酶III具有高的親和容量和低的非特異性吸附,質(zhì)量回收率達(dá)94%。
文檔編號(hào)G01N30/56GK1354365SQ0013264
公開日2002年6月19日 申請(qǐng)日期2000年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月20日
發(fā)明者趙睿, 趙瑩歆, 劉國詮 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所