專利名稱：在環(huán)境掃描電鏡中直接觀察含水生物樣品的裝置及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種環(huán)境掃描電子顯微鏡用的生物樣品臺裝置，特別是涉及一種用于直接觀察含水生物樣品的環(huán)境掃描電子顯微鏡的生物樣品臺的裝置及方法。
掃描電子顯微鏡(以下簡稱掃描電鏡或電鏡)是現(xiàn)代化的大型精密儀器，作為研究微觀世界的有力工具，它在物理、化學(xué)、材料科學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。環(huán)境掃描電子顯微鏡(Enviromental Scanning Electron Microscope-ESEM，以下簡稱環(huán)境掃描電鏡)是一種新型的掃描電鏡，它優(yōu)于常規(guī)掃描電鏡(Scanning Electron Microscope-SEM)之處在于可在通氣環(huán)境下直接觀察不經(jīng)表面處理(噴金或冷凍制樣等)的非導(dǎo)體及含水樣品。
如果用常規(guī)的掃描電鏡(樣品室真空度10-2～10-3托，1托＝1mmHg＝1/760大氣壓)對非導(dǎo)體樣品進(jìn)行觀察，由于入射電子的作用，電子會在非導(dǎo)體樣品表面上不斷聚集，引起充放電現(xiàn)象，不能清楚地觀察表面圖像。所以，觀察前必須對非導(dǎo)體的表面進(jìn)行金屬化處理(噴金等)。目前，在常規(guī)的掃描電鏡中觀察含水的生物樣品有兩種方法(1)樣品經(jīng)干燥并噴金后放入掃描電鏡觀察，例如文獻(xiàn)[1](“掃描電子顯微鏡分析技術(shù)”杜子禮、徐子昂，化學(xué)工業(yè)出版社，1984)中所描述的為了使含水的生物樣品能在高真空下噴金，并在高真空樣品室內(nèi)觀察，必須先用戊二醛和鋨酸固定細(xì)胞的骨架，再用乙醇梯度脫水和二氧化碳臨界點(diǎn)干燥后才能噴金。這樣的制備方法不但費(fèi)時(一般制備一個樣品需要2-3天)、費(fèi)錢，而且會使樣品失去原來的自然面貌(我們將在本說明書的最后部分用對比照片給出其區(qū)別)。(2)樣品深度冷凍后使用冷凍樣品臺放入掃描電鏡觀察。為常規(guī)掃描電鏡配置的商品冷凍樣品臺裝置使用液氮作冷源，使樣品溫度下降至-150℃左右。由于樣品必須深度冷凍制備，生物樣品中的液體部分冷凍成固體，樣品將會失去原來的狀態(tài)。而且此樣品臺裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜，為了使深冷的樣品在進(jìn)樣時不至于結(jié)霜，在電鏡樣品室另開了一個進(jìn)樣窗口，又增加了一套冷凍進(jìn)樣裝置，因此價格昂貴，操作復(fù)雜。
采用環(huán)境掃描電鏡進(jìn)行觀察時，情況發(fā)生根本的變化。樣品室真空度為0.1～20托，通入的環(huán)境氣體在入射電子和信號電子的碰撞下產(chǎn)生大量的電子和正離子，這些正離子會與樣品表面積累的電子迅速作用，消除了充放電現(xiàn)象，使不導(dǎo)電的樣品(包括生物樣品)不經(jīng)表面金屬化處理而直接觀察成為可能。
在環(huán)境掃描電鏡中，樣品室的真空度雖然是可以調(diào)節(jié)的。然而，樣品室的真空度較大地影響著電鏡的分辨率，真空度越低，分辨率越低，圖象越模糊。在環(huán)境掃描電鏡使用中，樣品室的真空度一般都不能太低(不超過5托)。從水的物性數(shù)據(jù)中我們可以知道0℃時水的飽和蒸汽壓為4.6托；室溫20℃時水的飽和蒸汽壓為17.5托。因此，在室溫和不低于水的飽和蒸汽壓(17.5托)下觀察含水的生物樣品時，水仍然處于氣態(tài)，含水的生物樣品仍然存在著失水問題。
當(dāng)在環(huán)境掃描電鏡中使用普通樣品臺進(jìn)樣時，必須打開樣品室大門，放好樣品，關(guān)閉樣品室，再打開電鏡的真空系統(tǒng)，當(dāng)樣品室達(dá)到一定的高真空度后，才能通入氣體，使樣品室達(dá)到預(yù)定的低真空，最后打開電子槍，觀察樣品，這個過程大約需要十多分鐘，含水的生物樣品在這樣的過程中必然會很快地失水。
我們所采取的解決失水問題的方法是適當(dāng)降低溫度，降低真空度并縮短樣品在低真空的樣品室里的觀察時間，以減少含水的生物樣品的失水量。
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有的環(huán)境掃描電鏡在樣品室的一般低真空度中進(jìn)樣速度慢和室溫觀察所導(dǎo)致的含水樣品失水的問題；提供一種價格便宜、結(jié)構(gòu)簡單，機(jī)械部件配合緊湊，操作方便、靈活且精確的專用于直接觀察含水生物樣品的環(huán)境掃描電鏡的生物樣品臺裝置；以及使用該裝置在短時間內(nèi)拍攝出未被失水的生物樣品的自然狀態(tài)圖象的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的在掃描電鏡樣品室的大門上，不但帶有能在XYZ三個方向迅速地移動樣品的部件(就如常規(guī)的電鏡樣品臺上的部件一樣)；而且還裝有帶有進(jìn)樣部件的預(yù)抽室；同時還有冷卻功能。從而可以在不打開電鏡樣品室大門的情況下，通過預(yù)抽室使樣品迅速地進(jìn)入電鏡室內(nèi)(可以同時被冷卻或進(jìn)入電鏡室后被冷卻)，也就是使生物樣品不經(jīng)過高真空階段，直接進(jìn)入低真空的環(huán)境狀態(tài)，從而避免了樣品在高真空中的快速失水，達(dá)到縮短時間并降低溫度的要求，最后實(shí)現(xiàn)在短時間內(nèi)拍攝出未被失水的生物樣品的自然狀態(tài)圖象的目的。
本發(fā)明提供的一種用于直接觀察含水生物樣品的環(huán)境掃描電鏡的生物樣品臺裝置，包括(1)預(yù)抽室預(yù)抽室位于樣品室的門蓋上方，預(yù)抽室外口上有一密封蓋；預(yù)抽室內(nèi)側(cè)與樣品室通過一個小窗口連通，窗口上(樣品室門蓋外側(cè))裝有一個閘閥，閘閥是隔開樣品室與預(yù)抽室的閘板閥門；預(yù)抽室頂部有一真空通道，與樣品室相通，通道上裝有一個電動閥，控制真空通道的開通與關(guān)閉，當(dāng)電動閥打開時，預(yù)抽室內(nèi)的氣壓就能與樣品室的相同，以保證在短時間(幾秒鐘)內(nèi)預(yù)抽完畢；預(yù)抽室側(cè)面裝有一個放氣閥，當(dāng)預(yù)抽室氣壓為真空時，打開放氣閥，可使電鏡外部的空氣流入預(yù)抽室，當(dāng)預(yù)抽室內(nèi)氣壓與周圍的大氣壓相同時，密封的預(yù)抽室門蓋就能打開。(2)進(jìn)樣部件進(jìn)樣部件主要包括一根送樣桿，它位于預(yù)抽室密封蓋中心的密封圈內(nèi)，它可以自由地抽送而不漏氣；送樣桿頭部帶有螺紋；被觀察的樣品可以用多種方法固定在不同形狀的樣品杯的頂蓋上，樣品杯底部有一根小桿，小桿被插入樣品杯座頂部的小孔中，并用小螺釘固定；樣品杯座側(cè)面開有螺紋孔，它可以把送樣桿頭部帶有的螺紋擰入。當(dāng)預(yù)抽室預(yù)抽完畢，閘閥打開時，帶有樣品和樣品杯的樣品杯底座可以穿過預(yù)抽室的小窗口，被送樣桿送入位于樣品臺上的樣品杯座定位槽中。這樣，在不打開電鏡樣品室大門的情況下，通過進(jìn)樣部件，樣品被迅速地送入了電鏡的樣品室內(nèi)。(3)冷卻部件它可以有多種形式，例如帶冰塊的冷卻樣品杯、半導(dǎo)體冷卻部件等，它能使樣品冷卻至0-4℃。(4)樣品移動部件在樣品室門蓋上有三個旋把，每個旋把分別通過一組齒輪和螺桿驅(qū)動著一個朝單一方向(X方向、或Y方向、或Z方向)移動的滑塊，滑塊又帶動樣品臺主體移動，樣品坐落在樣品臺主體中央的樣品杯座定位槽中，從而三個旋把能在X、Y、Z三個方向迅速地移動樣品，以使樣品能迅速地進(jìn)入可觀察的位置。
本發(fā)明提供的在環(huán)境掃描電鏡中使用的樣品臺裝置進(jìn)行含水生物樣品的直接觀察方法，包括樣品送入與觀察等以下步驟1.先將樣品室門蓋關(guān)閉，再打開電鏡真空系統(tǒng)，當(dāng)樣品室達(dá)到一定的高真空度后，通入氣體，使樣品室達(dá)到預(yù)定的低真空度；2.把預(yù)抽室門蓋蓋在預(yù)抽室上，打開預(yù)抽室真空通道上的電動閥，預(yù)抽室就與低真空的樣品室連通，幾秒鐘后預(yù)抽室達(dá)到樣品室的低真空度；3.打開閘閥和樣品室內(nèi)的小燈，把帶有樣品、樣品杯和樣品杯座的送樣桿穿過樣品室門蓋的窗口，將樣品杯座送入樣品臺的樣品杯座定位槽中，擰開送樣桿；4.抽出送樣桿，關(guān)閉閘閥，同時小燈熄滅；5.打開電鏡的所有觀察樣品的電子槍、掃描線圈、消象散器等部件，準(zhǔn)備觀察樣品；6.調(diào)節(jié)X、Y、Z三個方向的旋把，使樣品能迅速地進(jìn)入可觀察位置，拍攝下未被失水的生物樣品的自然狀態(tài)圖象；7.當(dāng)要取出樣品時，可進(jìn)行以上程序的逆操作打開閘閥，伸入送樣桿，把送樣桿頂部的螺紋擰入樣品杯座，抽出帶樣品杯座和樣品杯的送樣桿，關(guān)閉閘閥，打開預(yù)抽室放氣閥，當(dāng)預(yù)抽室的氣壓與周圍的大氣壓相同時，就可以打開預(yù)抽室密封蓋，取出樣品。
本發(fā)明的生物樣品臺利用預(yù)抽室連接環(huán)境掃描電鏡的低真空樣品室，再加上簡單的冷卻樣品杯及精密的機(jī)械結(jié)構(gòu)，同時滿足了真空度、溫度和觀察時間的要求，達(dá)到了直接觀察含水樣品的目的。對于含水的樣品來說，在足夠的氣壓下，水的蒸發(fā)速度降低，潮濕樣品不會很快地失去水分和變形，能夠不經(jīng)冷凍制樣而直接觀察其原來的自然形貌。本生物樣品臺由于結(jié)構(gòu)簡單，價格只是一般冷凍樣品臺的一半。
本生物樣品臺裝置送樣時間小于20秒，定位時間小于1分鐘；冷卻樣品杯可放入冰塊，樣品最低溫度為4～10℃。本生物樣品臺可用于環(huán)境掃描電鏡中固定和冷卻樣品，以供在通氣狀態(tài)下直接觀察含水樣品(動植物細(xì)胞、植物莖根切片、濕的NaCl晶體等)的形貌和結(jié)構(gòu)，也可供觀察和研究含水樣品的脫水(動物、植物等)或干燥(濕水泥等)過程。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于掃描電鏡的生物樣品臺裝置結(jié)構(gòu)簡單，機(jī)械部件配合緊湊，操作方便、靈活且精確；特別是添加了與環(huán)境樣品室相通的預(yù)抽室后，能在短時間(1分鐘左右)內(nèi)拍攝出未被失水的生物樣品的自然狀態(tài)圖象。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。


圖1為本發(fā)明的掃描電鏡的生物樣品臺裝置結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是在常規(guī)的掃描電鏡中所觀察到的經(jīng)過樣品制備(干燥與噴金)的非洲綠猴的腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)形貌。
圖3是使用本發(fā)明的生物樣品臺裝置在環(huán)境掃描電鏡中所觀察到的Vero細(xì)胞的形貌。
圖1的圖面說明如下預(yù)抽室-[1] 樣品臺主體-[2] 樣品杯-[3]樣品杯座-[4] 預(yù)抽室門蓋-[5] 送樣桿-[6]閘閥-[7] 真空通道-[8] 預(yù)抽室電動閥-[9](圖中未示出)預(yù)抽室放氣閥-[10]樣品臺座-[11] 樣品室門蓋-[12]XYZ方向旋把-[13]、[14]、[15]X、Y、Z方向滑塊-[16]、[17]、[18]樣品杯座定位槽-[19] 窗口-[20]實(shí)施例1按圖1的結(jié)構(gòu)制作一掃描電鏡用的生物樣品臺裝置，以下詳細(xì)敘述以使用冷卻樣品杯為例的掃描電鏡的生物樣品臺裝置的結(jié)構(gòu)預(yù)抽室1位于通常的掃描電鏡的樣品室門蓋12的外側(cè)上方，預(yù)抽室密封蓋5帶有送樣桿6，送樣桿可以在密封蓋中心前后抽送并且密封(即在預(yù)抽室處于真空狀態(tài)時，當(dāng)送樣桿前后抽送時都不漏氣)；送樣桿頂部有螺紋，可以把樣品杯座4擰在上面。閘閥7是隔開樣品室與預(yù)抽室的閘板閥門，關(guān)閉時位于樣品室門蓋12的窗口20上。預(yù)抽室的真空通道8與樣品室相連，通道上裝有控制開通和關(guān)閉的電動閥9。冷卻樣品杯3用銅或鋁制成，圓筒型帶有杯蓋，內(nèi)可放冰塊；杯底有一根小桿，將其插入樣品杯座4的小孔，用螺釘固定。被測樣品可用雙面膠帶固定在冷卻樣品杯杯蓋上，同時得到冷卻。樣品臺主體2裝在樣品室門蓋12上，樣品臺主體帶有樣品臺座11，當(dāng)把樣品臺座11的底部插入樣品室內(nèi)的道軌后，就能把整個樣品臺推入樣品室，并關(guān)上樣品室門蓋12。在樣品室門蓋上除有預(yù)抽室1外，還有三個旋把X方向旋把13、Y方向旋把14、Z方向旋把15，它們通過齒輪和螺桿移動三個滑塊-X方向滑塊16、Y方向滑塊17、Z方向滑塊18。滑塊又帶動樣品臺主體2移動，樣品坐落在樣品臺主體2中央的樣品杯座定位槽19中，從而樣品能被用以上三組部件在X、Y、Z三個方向進(jìn)行調(diào)節(jié)，迅速地進(jìn)入電鏡的可觀察位置。
實(shí)施例2在實(shí)施例1所制做的裝冷卻樣品杯的生物樣品臺裝置中，進(jìn)行含水的Vero細(xì)胞觀察和拍攝的具體方法和步驟如下1.先將樣品室門蓋12關(guān)閉，再打開電鏡真空系統(tǒng)，當(dāng)樣品室達(dá)到一定的高真空度后，通入氣體，使樣品室達(dá)到預(yù)定的低真空度；
2.把預(yù)抽室密封蓋5蓋在預(yù)抽室1上，打開預(yù)抽室真空通道8上的電動閥9，預(yù)抽室就與低真空的樣品室連通，幾秒鐘后預(yù)抽室達(dá)到樣品室的低真空度；3.打開閘閥7，此時，樣品室內(nèi)的小燈被打開，通過預(yù)抽室門蓋12的玻璃窗口，我們可以清楚地看到樣品室內(nèi)部情況。把帶有樣品、樣品杯3和樣品杯座4的送樣桿6穿過樣品室門蓋12的窗口20，并可立即將樣品杯座4送入電鏡樣品室內(nèi)的樣品臺主體2上的樣品杯座定位槽19中，擰開送樣桿6，這樣，把帶有樣品的樣品杯3和樣品杯座4留在了樣品室內(nèi)的樣品杯座定位槽19中；4.抽出送樣桿6，關(guān)閉閘閥7，同時小燈熄滅。這樣，在不打開樣品室門蓋12情況下，樣品經(jīng)由預(yù)抽室1，迅速地放入了樣品臺的樣品杯座定位槽19中；5.打開電鏡的所有觀察樣品的各個部件(電子槍、掃描線圈、消象散器等)，準(zhǔn)備觀察樣品；6.調(diào)節(jié)X、Y、Z三個方向的旋把13、14、15，使樣品能迅速地進(jìn)入可考察位置，拍攝下未被失水的生物樣品的自然狀態(tài)圖象；7.當(dāng)要取出樣品時，可進(jìn)行以上程序的逆操作打開閘閥7，伸入送樣桿6，把送樣桿頂部的螺紋擰入樣品杯座4，抽出帶樣品杯座4和樣品杯3的送樣桿6，關(guān)閉閘閥7，打開預(yù)抽室放氣閥10，當(dāng)預(yù)抽室的氣壓與周圍的大氣壓相同時，就可以打開預(yù)抽室門蓋5，取出樣品。
圖2是經(jīng)過常規(guī)的生物樣品制備(兩次固定、脫水、干燥和噴金)后的Vero細(xì)胞的形貌圖象。圖3是未經(jīng)樣品制備的Vero細(xì)胞的圖象，它是使用本發(fā)明的生物樣品臺裝置和方法，在環(huán)境掃描電鏡中所觀察到的Vero細(xì)胞的形貌。此時，樣品不需要制備帶細(xì)胞的微載體可以從培養(yǎng)液中取出后，用濾紙吸干，就直接固定在本生物樣品臺的樣品杯上，并可立即送入電鏡觀察。比較圖3與圖2，我們可以從圖3中清楚地看到未失水細(xì)胞的自然形貌，它們的細(xì)胞皮互相連接，在微載體上貼附生長。經(jīng)過預(yù)處理的Vero細(xì)胞(圖2)失去了生物水，每個細(xì)胞如小球，它們堆積在微載體上，形成一個個小球的集合體，它們的形貌與未失水細(xì)胞的自然形貌(圖3)有很大的不同。所以，在生命科學(xué)的研究中環(huán)境掃描電鏡及其生物樣品臺裝置是研究含水生物樣品微觀世界的必要工具。
權(quán)利要求
1.一種在環(huán)境掃描電鏡中直接觀察含水生物樣品的裝置，包括樣品杯、樣品移動部件，它在樣品室門蓋上有三個旋把[13][14][15]，每個旋把分別通過一組齒輪和螺桿驅(qū)動一個向X、Y、Z三方向中的單一方向移動的滑塊[16][17][18]，且滑塊與樣品臺主體[2]組合在一起；其特征在于還包括一預(yù)抽室[1]、進(jìn)樣部件和冷卻部件，其中所述的預(yù)抽室[1]位于樣品室的門蓋[12]上，預(yù)抽室[1]外口上有一密封蓋[5]；預(yù)抽室[1]內(nèi)側(cè)與樣品室通過一個小窗口[20]連通，窗口[20]內(nèi)壁裝有一個用來隔開樣品室與預(yù)抽室[1]的閘閥[7]；預(yù)抽室[1]頂部有一真空通道[8]，與樣品室相通，真空通道[8]上裝有一個控制真空通道[8]的開通與關(guān)閉的電動閥[9]，預(yù)抽室[1]側(cè)面裝有一個放氣閥[10]；所述的進(jìn)樣部件包括一根送樣桿[6]，送樣桿[6]頭部帶有用于固定樣品杯座[11]的螺紋，送樣桿[6]被插在預(yù)抽室[1]的密封蓋[5]中心的密封圈內(nèi)；樣品杯[3]的底部有一根小桿，小桿被插入樣品杯座[11]頂部的小孔中，并用小螺釘固定；所述的冷卻部件包括冷卻樣品杯或固定在樣品臺主體[2]中心上的半導(dǎo)體冷卻部件。
2.按權(quán)利要求1所述的一種在環(huán)境掃描電鏡中直接觀察含水生物樣品的裝置，其特征在于所述的樣品臺主體[2]還包括樣品杯座定位槽[19]，它位于樣品臺主體[2]的中心。
3.按權(quán)利要求1所述的一種在環(huán)境掃描電鏡中直接觀察含水生物樣品的裝置，其特征在于所述的送樣桿[6]可以穿過樣品室門蓋[12]上的小窗口[20]，當(dāng)閘閥[7]打開時，在預(yù)抽室[1]和樣品室之間自由地抽送，能在不打開樣品室門蓋[12]情況下，將樣品經(jīng)由預(yù)抽室迅速地放入樣品臺中心的樣品杯定位槽[19]內(nèi)。
4.按權(quán)利要求1所述的一種在環(huán)境掃描電鏡中直接觀察含水生物樣品的裝置，其特征在于所述的冷卻樣品杯[3]，其內(nèi)放置冰塊，樣品杯[3]口上蓋有杯蓋。
5.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的在環(huán)境掃描電鏡中直接觀察含水生物樣品的裝置的直接觀察方法，其特征在于包括以下步驟(1)先使樣品室達(dá)到預(yù)定的低真空度；(2)把預(yù)抽室密封蓋[5]蓋在預(yù)抽室[1]上，打開預(yù)抽室真空通道[8]上的電動閥[9]，預(yù)抽室與低真空的樣品室連通，幾秒鐘后預(yù)抽室達(dá)到樣品室的低真空度；(3)打開閘閥[7]和樣品室內(nèi)的小燈，把帶有樣品、樣品杯[3]和樣品杯座[4]的送樣桿[6]穿過樣品室門蓋[12]的窗口，將樣品杯座[4]送入樣品臺的樣品杯座定位槽[19]中，擰開送樣桿；抽出送樣桿，關(guān)閉閘閥，同時小燈熄滅；(4)打開電鏡的所有觀察樣品的電子槍、掃描線圈、消象散器等部件，準(zhǔn)備觀察樣品；(5)調(diào)節(jié)X、Y、Z三個方向的旋把，使樣品能迅速地進(jìn)入可觀察位置，拍攝下未被失水的生物樣品的自然狀態(tài)圖象。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在環(huán)境掃描電鏡中直接觀察含水生物樣品裝置及其方法,該裝置包括在電鏡的樣品室門蓋內(nèi)安裝的三維樣品移動部件、門蓋外安裝的預(yù)抽室和進(jìn)樣部件、及樣品冷卻部件。使用該裝置觀察含水生物樣品能在不打開樣品室門蓋情況下,將樣品經(jīng)由預(yù)抽室,迅速地放入樣品臺;并能在X、Y、Z三方向進(jìn)行調(diào)節(jié),使樣品迅速地進(jìn)入電鏡的可觀察位置,并在1分鐘左右內(nèi)獲得未失水的生物樣品的自然狀態(tài)圖象。
文檔編號G01N23/22GK1353306SQ0013270
公開日2002年6月12日 申請日期2000年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月13日
發(fā)明者邵曼君, 李國征, 李竹川 申請人:中國科學(xué)院化工冶金研究所