專利名稱：膽固醇傳感器和膽固醇的定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)血液、血清、血漿等檢樣中的低密度脂蛋白所含的膽固醇進(jìn)行定量的傳感器和方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，在診斷高膽固醇血癥時(shí)，非常重視低密度脂蛋白中的膽固醇濃度。
以往，這種低密度脂蛋白中的膽固醇的定量方法通過(guò)使用超離心法的分離操作進(jìn)行。但該方法存在的問(wèn)題是，需要使用特殊裝置，而且，測(cè)定所需的時(shí)間長(zhǎng)。
而不進(jìn)行超離心的定量方法通常是，分別求出檢樣中的所有膽固醇、高密度脂蛋白中的膽固醇和甘油三酯的濃度，由Friedewald之式算出低密度脂蛋白中的膽固醇濃度。然而，該方法在用于甘油三酯值高的檢樣時(shí)在再現(xiàn)性和準(zhǔn)確性方面存在著可靠性差的問(wèn)題。
最近幾年，人們提出了新的對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇進(jìn)行定量方法，這些方法不要求有甘油三酯值。
第一種方法是，在硫酸α-環(huán)糊精、硫酸葡聚糖、鎂離子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚的存在下，用酶僅將低密度脂蛋白中的膽固醇氧化，根據(jù)色素的發(fā)色程度，對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇濃度進(jìn)行定量(參見(jiàn)Clinical Chemistry第44卷(1998年)第522頁(yè))。該方法通過(guò)硫酸α-環(huán)糊精、硫酸葡聚糖和鎂離子來(lái)減少酶對(duì)檢樣中的乳糜微粒所含的膽固醇和超低密度脂蛋白中的膽固醇的反應(yīng)性，并通過(guò)聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚來(lái)減少酶對(duì)檢樣中的高密度脂蛋白所含膽固醇的反應(yīng)性。
第二種方法是，在兩性表面活性劑和具有羧基或磺酸基的脂肪族胺的存在下，用酶僅將低密度脂蛋白中的膽固醇氧化，根據(jù)色素的發(fā)色程度，對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇濃度進(jìn)行定量(參見(jiàn)日本特許公開(kāi)公報(bào)1998年84997號(hào))。該方法系在兩性表面活性劑的存在下，減少酶對(duì)低密度脂蛋白以外的脂蛋白中所含的膽固醇的反應(yīng)性。
第三種方法是，用聚陽(yáng)離子處理檢樣并用酶僅將低密度脂蛋白中的膽固醇氧化，根據(jù)色素的發(fā)色程度，對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇濃度進(jìn)行定量(參見(jiàn)美國(guó)專利No.4,185,963)。
第四種方法是，用多孔二氧化硅吸附高密度脂蛋白，并用聚陰離子/二價(jià)陽(yáng)離子形成與乳糜微粒和超低密度脂蛋白的不溶性復(fù)合體，將該復(fù)合體作為沉淀從溶液中除去后，用酶僅將低密度脂蛋白中的膽固醇氧化，根據(jù)色素的發(fā)色程度，對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇濃度進(jìn)行定量(參見(jiàn)美國(guó)專利No.5,401,466)。
根據(jù)上述第一至第四種方法，即使在使用甘油三酯值高的檢樣的情況下，也能以良好的再現(xiàn)性和準(zhǔn)確性進(jìn)行測(cè)定。
但是，上述第一至第四種方法均根據(jù)色素的發(fā)色程度進(jìn)行膽固醇值的定量，因此，當(dāng)檢樣為最初就著色的血液時(shí)無(wú)法定量。此外，為了以良好的再現(xiàn)性和準(zhǔn)確性進(jìn)行測(cè)定，需要分別準(zhǔn)備不含酶的第一試劑和含有酶的第二試劑，先將第一試劑加入到檢樣中，充分反應(yīng)之后再加入第二試劑，操作很繁雜。
發(fā)明的公開(kāi)鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供這樣一種傳感器該傳感器在檢樣為血液時(shí)也能進(jìn)行測(cè)定，無(wú)需在各不同的時(shí)間添加二種以上的試劑，只需提供一次檢樣，就能以良好的再現(xiàn)性準(zhǔn)確地測(cè)定低密度脂蛋白中的膽固醇。
本發(fā)明的目的還在于提供對(duì)上述低密度脂蛋白中的膽固醇進(jìn)行定量的方法。
本發(fā)明涉及這樣一種用于定量低密度脂蛋白中的膽固醇的膽固醇傳感器該傳感器具有絕緣性基板、在上述基板上形成的包含作用電極和對(duì)應(yīng)電極的電極系、在包含上述電極系的上述基板上形成的酶層和形成于向上述電極系供給試液的通路中的上述酶層的上游側(cè)的試劑層，上述酶層至少含有氧化還原酶和電子介體且上述試劑層含有與除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白結(jié)合、形成水溶性復(fù)合體的試劑。
本發(fā)明還涉及這樣一種膽固醇傳感器該傳感器具有絕緣性基板、在上述基板上形成的包含作用電極和對(duì)應(yīng)電極的電極系、在包含上述電極系的上述基板上形成的酶層、形成于向上述電極系供給試液的通路中的上述酶層的上游側(cè)的濾器以及加載在上述濾器上或形成于上述試液供給通路中的濾器的上游側(cè)的試劑層，上述酶層至少含有氧化還原酶和電子介體且上述試劑層含有具有能將除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白吸附和/或凝集的功能的試劑。
本發(fā)明提供下述對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇進(jìn)行定量的方法，該方法包括以下步驟(a)將檢樣與選自下述(i)、(ii)和(iii)中的任一個(gè)試劑或試劑組反應(yīng)的步驟，(i)硫酸α-環(huán)糊精、硫酸葡聚糖、鎂離子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚、(ii)兩性表面活性劑和具有羧基或磺酸基的脂肪族胺、(iii)聚陽(yáng)離子；(b)然后，將上述檢樣和可與膽固醇特異性反應(yīng)的氧化還原酶和電子介體反應(yīng)的步驟；(c)將通過(guò)上述步驟(b)而還原的上述電子介體進(jìn)行電化學(xué)氧化、得到氧化電流值的步驟。
本發(fā)明還提供下述對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇進(jìn)行定量的方法，該方法包括以下步驟(a)將檢樣與聚陰離子、二價(jià)陽(yáng)離子和抗高密度脂蛋白的抗體或二氧化硅反應(yīng)的步驟，(b)然后，將上述檢樣和可與膽固醇特異性反應(yīng)的氧化還原酶和電子介體反應(yīng)的步驟，(c)將通過(guò)上述步驟(b)而還原的上述電子介體進(jìn)行電化學(xué)氧化、得到氧化電流值的步驟。
圖面的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是說(shuō)明用本發(fā)明對(duì)膽固醇濃度進(jìn)行定量時(shí)的反應(yīng)原理的框圖。
圖2是本發(fā)明的實(shí)施方式1中的膽固醇傳感器的垂直剖面示意圖。
圖3是同一傳感器的分解立體圖。
圖4是實(shí)施方式2中的膽固醇傳感器的分解立體圖。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明的對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇進(jìn)行定量的方法包括以下步驟(a)將檢樣與特定試劑反應(yīng)的步驟，(b)然后，將上述檢樣和可與膽固醇特異性反應(yīng)的氧化還原酶和電子介體反應(yīng)的步驟，(c)將通過(guò)上述步驟(b)而還原的上述電子介體進(jìn)行電化學(xué)氧化、得到氧化電流值的步驟，由上述電流值對(duì)膽固醇進(jìn)行定量。
首先對(duì)步驟(a)進(jìn)行說(shuō)明。在步驟(a)中，將檢樣中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白與特定試劑反應(yīng)，抑制除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的膽固醇參與與酶的反應(yīng)。這里所說(shuō)的檢樣，其范圍很廣，可包括高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、超低密度脂蛋白和乳糜微粒，例如是血液、血清、血漿等。
由于本發(fā)明不是根據(jù)吸光度，而是用電化學(xué)的方法測(cè)定膽固醇， 因此，即使檢樣為血液、有混濁的血清或血漿，也能定量低密度脂蛋白中的膽固醇。
上述步驟(a)是將檢樣中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白與特定試劑結(jié)合、形成水溶性復(fù)合體、由此減少除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的膽固醇與酶的反應(yīng)性的步驟(a-1)或?qū)z樣中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白吸附于特定試劑和/或使上述除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白凝集、由此將它們除去的步驟(a-2)。
首先對(duì)步驟(a-1)進(jìn)行說(shuō)明。
在該步驟中，使用選自下述(i)、(ii)和(iii)中的任一個(gè)試劑或試劑組。
(i)硫酸α-環(huán)糊精、硫酸葡聚糖、鎂離子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚、(ii)兩性表面活性劑和具有羧基或磺酸基的脂肪族胺、(iii)聚陽(yáng)離子。
使用聚陽(yáng)離子作為試劑時(shí)，最好在弱離子交換體的存在下使檢樣與聚陽(yáng)離子反應(yīng)。當(dāng)存在弱離子交換體時(shí)，弱離子交換體會(huì)吸附樣品中的中性脂質(zhì)，由此，可抑制因中性脂質(zhì)吸附在電極表面而對(duì)電極反應(yīng)的阻礙。
這里，兩性表面活性劑可以是月桂基甜菜堿、椰油脂族酰胺基丙基甜菜堿、月桂酰胺基丙基甜菜堿、2-烷基-N-羧甲基-N-羥乙基咪唑啉甜菜堿、2-烷基-N-羧基乙基-N-羥乙基咪唑啉甜菜堿等。
具有羧基或磺酸基的脂族胺可以是丙氨酸、谷酰胺、谷氨酸、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸、N，N-二(2-羥基乙基)-2-氨基乙磺酸、N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸、2-{4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基}乙磺酸、2-嗎啉基乙磺酸、哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)、N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸、N-環(huán)己基-2-羥基-3-氨基丙磺酸、3-{N，N-二(2-羥基乙基)氨基}-2-羥基丙磺酸、3-{4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基}丙磺酸、2-羥基-3-{4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基}丙磺酸、3-嗎啉基丙磺酸、2-羥基-3-嗎啉基丙磺酸、哌嗪-1，4-二(2-羥基-3-丙磺酸)、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸、2-羥基-N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸、N-(2-乙酰胺)亞氨基乙酰醋酸、N，N-二(2-羥基乙基)甘氨酸、N-{三(羥甲基)甲基}甘氨酸等。
從反應(yīng)性容易調(diào)節(jié)的角度考慮，上述聚陽(yáng)離子最好是?；坳?yáng)離子或烷基化聚陽(yáng)離子。
在步驟(a-1)中，檢樣中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白與試劑結(jié)合，形成水溶性復(fù)合體，由此，除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的膽固醇與氧化還原酶的反應(yīng)性下降。因此，在下面的步驟(b)中，可將參與與氧化還原酶的反應(yīng)的膽固醇僅限于低密度脂蛋白中的膽固醇。
下面對(duì)步驟(a-2)進(jìn)行說(shuō)明。
在步驟(a-2)中，將檢樣中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白吸附于試劑中和/或使上述除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白凝集，由此將它們除去。
在該步驟中，使用抗高密度脂蛋白的抗體或二氧化硅與聚陰離子和二價(jià)陽(yáng)離子作為試劑。由于高密度脂蛋白特有地含有脫輔基蛋白Apo A-I和Apo A-II，因此，抗高密度脂蛋白的抗體可以是抗Apo A-I和Apo A-II的抗體。此時(shí)，檢樣中的高密度脂蛋白由于抗高密度脂蛋白的抗體而凝集。另一方面，檢樣中的超低密度脂蛋白和乳糜微粒由于聚陰離子和二價(jià)陽(yáng)離子的作用而凝集。這樣，可將高密度脂蛋白、超低密度脂蛋白和乳糜微粒從檢樣中分離、除去。
使用二氧化硅作為除去高密度脂蛋白的試劑時(shí)，檢樣中的高密度脂蛋白吸附于二氧化硅并由此被分離、除去。
在步驟(a-2)中，為了將凝集的高密度脂蛋白、超低密度脂蛋白和乳糜微粒從檢樣中分離、除去，可使用濾器等過(guò)濾手段。
從不會(huì)阻礙酶反應(yīng)的角度考慮，這里使用的聚陰離子最好是硫酸葡聚糖、肝素、磷鎢酸、聚乙烯硫酸中的任一個(gè)。
此外，從不會(huì)阻礙酶反應(yīng)的角度考慮，上述二價(jià)陽(yáng)離子最好是鈣離子、錳離子、鎂離子中的任一個(gè)。
在步驟(a-2)中，為了使檢樣中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白通過(guò)吸附于試劑和/或凝集而除去，在下面的步驟(b)中，可將參與與酶的反應(yīng)的膽固醇僅限于低密度脂蛋白中的膽固醇。
下面對(duì)步驟(b)進(jìn)行說(shuō)明。
在步驟(b)中，僅檢樣中的低密度脂蛋白所含的膽固醇被與膽固醇特異性反應(yīng)的氧化還原酶氧化，與此同時(shí)，電子介體被還原。
這里使用的氧化還原酶和電子介體可以是能在膽固醇的電化學(xué)定量法中使用的迄今公知的氧化還原酶和電子介體。
下面對(duì)步驟(c)進(jìn)行說(shuō)明。
在步驟(c)中，將在步驟(b)中還原的上述電子介體進(jìn)行電化學(xué)氧化，得到氧化電流值。并通過(guò)該氧化電流值求出低密度脂蛋白中的膽固醇濃度。
由于在本發(fā)明中是用電化學(xué)方法對(duì)膽固醇值進(jìn)行定量的，因此，即使檢樣為最初就著色的血液，也可以測(cè)定。
這里，用圖1對(duì)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行膽固醇濃度定量時(shí)的反應(yīng)原理進(jìn)行說(shuō)明。
檢樣中所含脂蛋白中的膽固醇的大部分是以與脂肪酸作酯結(jié)合的膽固醇酯的形式存在。這里，首先，用膽固醇酯酶4將膽固醇酯1的酯基脫去，形成膽固醇2(過(guò)程I)。
然后，用氧化還原酶5將膽固醇2氧化，生成氧化的膽固醇3(過(guò)程II)。該氧化反應(yīng)同時(shí)伴隨著電子介體(氧化型)6的還原(過(guò)程III)。
接著，在作用電極8與對(duì)應(yīng)電極9之間施加使作用電極成為正的電壓，使電子介體(還原型)7在作用電極8上氧化(過(guò)程IV)。此時(shí)通過(guò)的電流值取決于電子介體(還原型)7的濃度，而且，電子介體(還原型)7的濃度還取決于膽固醇2的濃度。因此，若要知道膽固醇2的濃度，測(cè)定在作用電極8與對(duì)應(yīng)電極9之間通過(guò)的電流量即可。
下面結(jié)合附圖對(duì)測(cè)定低密度脂蛋白中的膽固醇的傳感器及定量方法進(jìn)行說(shuō)明。
絲網(wǎng)印刷含有羧甲基纖維素鈉(一種水溶性高分子)的涂料，將包含作用電極和對(duì)應(yīng)電極的電極系覆蓋，在50℃干燥15分鐘，形成水溶性高分子層21。然后，滴流膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶和鐵氰化鉀的混合水溶液，將水溶性高分子層21覆蓋，在50℃干燥15分鐘，形成酶層22。
電子介體可以是對(duì)苯醌及其衍生物、N-甲基吩嗪鎓硫酸單甲酯鹽、亞甲基藍(lán)、二茂鐵及其衍生物中的任一個(gè)。
另一方面，將具有空氣孔20的蓋板19和具有隙縫18的隔板17貼合，在形成于隔板的隙縫18的凹部滴加硫酸α-環(huán)糊精、硫酸葡聚糖、鎂離子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚的混合水溶液之后干燥，形成試劑層23。該試劑層23形成于向電極系供給試液的通路中的酶層的上游側(cè)。
將形成有上述水溶性高分子層21和酶層22的基板11與由形成有試劑層23的蓋板19和隔板17組成的蓋件接合，組裝成生物傳感器。在該生物傳感器中，在隔板17的隙縫18部分形成的中空部分形成試液供給通路。并且，成為該試液供給通路的開(kāi)口處的隙縫18的開(kāi)放端18a部分成為試樣供給口。
當(dāng)血液等試樣與該試樣供給口接觸時(shí)，試樣會(huì)由于試液供給通路的毛細(xì)管現(xiàn)象而吸入空氣孔20側(cè)。
也可通過(guò)將玻璃濾器等載體固定在形成試劑層23的位置上，在該載體上或載體表面滴加上述試劑并干燥來(lái)加載試劑。載體可以是濾紙、玻璃濾器、薄層色譜用載體、纖維素纖維、由高分子化合物制成的纖維片、紙、軟木等。其中，優(yōu)選玻璃濾器或纖維素纖維，因?yàn)樗鼈冚^少吸附氧化還原酶。
若電子介體和氧化還原酶中的至少一個(gè)與表面活性劑一起加載，則溶解性提高，由此，可縮短反應(yīng)時(shí)間。
若通過(guò)冷凍干燥而形成水溶性高分子層、酶層和試劑層中的至少一個(gè)，則溶解性提高，由此，可縮短反應(yīng)時(shí)間。尤其是如圖所示，當(dāng)形成將試液供給通路內(nèi)部堵塞的試劑層時(shí)，最好通過(guò)冷凍干燥，作為多孔性層而形成。因?yàn)檫@樣可在使試液與試劑層接觸時(shí)將試液溶解并吸收。
下面說(shuō)明使用該生物傳感器時(shí)測(cè)定血液中低密度脂蛋白所含膽固醇濃度的例子。首先，將作為檢樣的血液送入試樣供給孔。與血液接觸的試劑層首先溶解，然后，酶層和水溶性高分子層溶解。這樣，通過(guò)試劑層中的硫酸α-環(huán)糊精、硫酸葡聚糖和鎂離子的協(xié)同作用，血液中的超低密度脂蛋白和乳糜微粒形成水溶性復(fù)合體，通過(guò)聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚的作用，血液中的高密度脂蛋白形成水溶性復(fù)合體。由此，除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的膽固醇與酶的反應(yīng)性下降。
這里，若作用的酶是膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，則僅低密度脂蛋白中的膽固醇發(fā)生酶催化反應(yīng)，由此可測(cè)定低密度脂蛋白中的膽固醇濃度。具體地說(shuō)，根據(jù)圖3的反應(yīng)原理，低密度脂蛋白中的酯型膽固醇通過(guò)酶層中的膽固醇酯酶而轉(zhuǎn)化成游離型膽固醇。并且，由于膽固醇酯酶而產(chǎn)生的游離型膽固醇和原先存在于低密度脂蛋白中的游離型膽固醇由于膽固醇氧化酶的作用而氧化。與此同時(shí)，酶層中的鐵氰化鉀被還原，生成亞鐵氰化鉀。從送入血液起的一定時(shí)間之后，在作用電極和對(duì)應(yīng)電極之間使作用電極為正，例如，施加500mV電壓5秒鐘，測(cè)定5秒鐘后的電流值。將該電流值作為應(yīng)答值。
本實(shí)施方式1的優(yōu)點(diǎn)是，由于不是根據(jù)色素的發(fā)色程度進(jìn)行測(cè)定的，因此，即使是血液之類的最初就著色的檢樣，也能進(jìn)行膽固醇定量。此外，由于試劑層23與酶層22在空間上是隔開(kāi)的，因此，將檢樣送到試劑層23后，檢樣與試劑層23中的試劑反應(yīng)，然后，到達(dá)酶層22，與酶層22中的氧化還原酶和電子介體等反應(yīng)。由此，只要將檢樣送入一次，就能以良好的再現(xiàn)性和準(zhǔn)確性對(duì)檢樣中的低密度脂蛋白所含的膽固醇濃度進(jìn)行定量，而無(wú)需將多個(gè)試劑在各不相同的時(shí)間加入到檢樣中之類繁雜的操作。
在本實(shí)施方式1中，試劑層23中所含的試劑是硫酸α-環(huán)糊精、硫酸葡聚糖、鎂離子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚的組合，但也可使用兩性表面活性劑和具有羧基和磺酸基的脂肪族胺加以代替。此外，作為另一個(gè)例子，試劑也可以是聚陽(yáng)離子。除了聚陽(yáng)離子之外，最好還加入弱離子交換體。這里，上述聚陽(yáng)離子最好是?；蛲榛坳?yáng)離子。上述聚陽(yáng)離子最好是聚乙烯亞胺。
可在試劑層23中添加pH緩沖劑。pH緩沖劑可以是3-嗎啉基丙磺酸、2-{4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基}乙磺酸、2-嗎啉基乙磺酸、哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)等良好緩沖液、磷酸緩沖液等。
與實(shí)施方式1同樣，在由作用電極14和對(duì)應(yīng)電極15組成的電極系上使用形成有水溶性高分子層21和酶層22的基板11。在該基板11上安裝具有方形透孔38的隔板37、設(shè)有空氣孔40和試樣供給口41的蓋板39和濾器43，組裝成傳感器。
濾器43在形成于隔板37的透孔38處的試液供給通路中位于酶層22的上游側(cè)，吸收從試樣供給口41送入的試液，并通過(guò)毛細(xì)管現(xiàn)象將試液送至電極系側(cè)。在濾器43中浸滲有抗高密度脂蛋白的抗體、硫酸葡聚糖(聚陰離子)和鈣離子。
可使用濾紙、纖維素纖維、由高分子化合物制成的纖維片、薄膜濾器、網(wǎng)篩、棉等作為濾器。濾器的孔徑最好為0.05-0.5μm。
下面就使用該傳感器測(cè)定血液中低密度脂蛋白所含膽固醇濃度的方法進(jìn)行說(shuō)明。
首先，將作為檢樣的血液從試樣供給口41送至濾器43上。血液中的血球被濾器43濾去，血漿成分到達(dá)空氣孔40側(cè)。同時(shí)，血液中的高密度脂蛋白由于濾器內(nèi)的抗高密度脂蛋白的抗體而凝集。凝集的脂蛋白被濾器的篩孔扣住，不能到達(dá)酶層22。此外，血液中的乳糜微粒和超低密度脂蛋白由于濾器內(nèi)的硫酸葡聚糖和鈣離子而凝集。凝集的脂蛋白被濾器的篩孔扣住，不能到達(dá)酶層。由此，在到達(dá)酶層的血漿成分里，脂蛋白中只剩下低密度脂蛋白了。
在酶層22中，膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于低密度脂蛋白，低密度脂蛋白中的膽固醇發(fā)生酶催化反應(yīng)。如此，與實(shí)施方式1同樣，可測(cè)定低密度脂蛋白中的膽固醇濃度。
在上述方法中，可用吸附高密度脂蛋白的二氧化硅代替用作使高密度脂蛋白凝集的試劑的抗高密度脂蛋白的抗體。由于二氧化硅將檢樣中的高密度脂蛋白吸附，因此，高密度脂蛋白不能到達(dá)酶層。在到達(dá)酶層的成分里，脂蛋白中只剩下低密度脂蛋白了。另外，可在濾器43中添加pH緩沖劑。
在本實(shí)施方式2中，與實(shí)施方式1同樣，由于不是根據(jù)色素的發(fā)色程度進(jìn)行測(cè)定的，因此，即使是血液之類的最初就著色的檢樣，也能進(jìn)行膽固醇定量。此外，由于試劑加載在濾器43上，與酶層22在空間上是隔開(kāi)的，因此，將檢樣送到濾器上后，檢樣與濾器中的試劑反應(yīng)，通過(guò)濾器后，到達(dá)酶層22，與酶層中的氧化還原酶和電子介體等反應(yīng)。由此，只要將檢樣送入一次，就能以良好的再現(xiàn)性和準(zhǔn)確性對(duì)檢樣中的低密度脂蛋白所含的膽固醇濃度進(jìn)行定量，而無(wú)需將多個(gè)試劑在各不相同的時(shí)間加入到檢樣中之類繁雜的操作。
在圖示的例中，試劑加載在濾器43上，但也可將濾器和試劑分別設(shè)置。例如，在酶層22上形成膜狀濾器，在濾器43的位置形成試劑層或設(shè)置加載了試劑的載體。將濾器與試劑分離時(shí)，在向電極系供給試液的通路中，將試劑設(shè)置在濾器的上游側(cè)。
在上述例中，使用硫酸葡聚糖作為濾器43中所含試劑的聚陽(yáng)離子，但也可用肝素、磷鎢酸或聚乙烯硫酸等代替。此外，在上述例中使用鈣離子作為二價(jià)離子，但也可用錳離子或鎂離子等代替。
作為濾器43中所含的試劑，使用了抗高密度脂蛋白的抗體、聚陰離子和二價(jià)陽(yáng)離子的組合，但也可用二氧化硅、聚陰離子和二價(jià)陽(yáng)離子的組合代替。此時(shí)，當(dāng)檢樣與濾器43接觸后，檢樣中的高密度脂蛋白被二氧化硅吸附，不能到達(dá)酶層22。此外，檢樣中的超低密度脂蛋白和乳糜微粒與前述同樣地凝集，被濾器43濾去，從而不能到達(dá)酶層22。
在實(shí)施方式1和2中，使用聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯作為基板11，但對(duì)基板11的材質(zhì)無(wú)特別限制，只要具有電絕緣性和一定程度的剛性即可。例如，可使用聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、飽和聚酯等熱塑性樹(shù)脂、尿素樹(shù)脂、密胺樹(shù)脂、酚醛樹(shù)脂、環(huán)氧樹(shù)脂、不飽和聚酯樹(shù)脂等熱固性樹(shù)脂等。
電極通過(guò)在基板11上絲網(wǎng)印刷碳糊而形成，但也可用在基板11上蒸鍍或?yàn)R射鈀等金屬而形成。
在上述例中，使用膽固醇氧化酶和膽固醇酯酶作為氧化還原酶，使用鐵氰化鉀作為電子介體，但對(duì)氧化還原酶和電子介體無(wú)特別限制，可以是迄今公知的其他氧化還原酶和電子介體。例如，可用膽固醇脫氫酶等代替膽固醇氧化酶作為氧化還原酶，或用對(duì)苯醌等作為電子介體。
酶層22最好含有膽固醇酯酶。此外，為了使脂蛋白中的膽固醇容易溶解，也可在酶層22中加入表面活性劑。
在電極系的上部設(shè)置了用于保護(hù)電極的水溶性高分子層，但這不是必不可少的。
在實(shí)施方式1中的試劑層23的情況下和在實(shí)施方式2中將試劑與濾器43分開(kāi)的情況下，最好使用加載了試劑的載體。由此，檢樣通過(guò)試劑層的時(shí)間增加，這樣，可使檢樣中所含的除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白與試劑層中的試劑在檢樣在到達(dá)酶層22之前能充分反應(yīng)。對(duì)上述載體無(wú)特別限制，只要其能加載試劑成分即可，例如，可以是玻璃濾器、濾紙、薄膜濾器、網(wǎng)篩、棉等。此時(shí)，加載的試劑可以是干燥的固體狀態(tài)，也可以是溶液狀態(tài)或凝膠狀態(tài)。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性在本發(fā)明中，由于不是根據(jù)色素的發(fā)色程度進(jìn)行測(cè)定的，因此，即使是血液之類的最初就著色的檢樣，也能對(duì)低密度脂蛋白中所含的膽固醇進(jìn)行定量。此外，只要將檢樣送入一次，就能以良好的再現(xiàn)性和準(zhǔn)確性對(duì)低密度脂蛋白中所含的膽固醇進(jìn)行定量。由于本發(fā)明不需要繁雜的操作，因此，適合在家庭中使用的用于測(cè)定低密度脂蛋白中的膽固醇的試劑盒。
權(quán)利要求
1.用于對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇進(jìn)行定量的膽固醇傳感器，其特征在于，它具有絕緣性基板、在上述基板上形成的至少包含作用電極和對(duì)應(yīng)電極的電極系、在包含上述電極系的上述基板上形成的酶層和形成于向上述電極系供給試液的通路中的上述酶層的上游側(cè)的試劑層，上述酶層至少含有氧化還原酶和電子介體且上述試劑層含有與除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白結(jié)合、形成水溶性復(fù)合體的試劑。
2.如權(quán)利要求1所述的膽固醇傳感器，其特征在于，所述試劑層含有硫酸α-環(huán)糊精、硫酸葡聚糖、鎂離子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚。
3.如權(quán)利要求1所述的膽固醇傳感器，其特征在于，所述試劑層含有兩性表面活性劑和具有羧基或磺酸基的脂肪族胺。
4.如權(quán)利要求1所述的膽固醇傳感器，其特征在于，所述試劑層含有聚陽(yáng)離子。
5.用于對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇進(jìn)行定量的膽固醇傳感器，其特征在于，它具有絕緣性基板、在上述基板上形成的至少包含作用電極和對(duì)應(yīng)電極的電極系、在包含上述電極系的上述基板上形成的酶層、形成于向上述電極系供給試液的通路中的上述酶層的上游側(cè)的濾器以及加載在上述濾器上或形成于上述試液供給通路中的濾器的上游側(cè)的試劑層，上述酶層至少含有氧化還原酶和電子介體且上述試劑層含有具有能將除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白吸附和/或凝集的功能的試劑。
6.如權(quán)利要求5所述的膽固醇傳感器，其特征在于，所述試劑層含有聚陰離子、二價(jià)陽(yáng)離子和抗高密度脂蛋白的抗體或二氧化硅。
7.對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇進(jìn)行定量的方法，該方法包括以下步驟(a)將檢樣與選自下述(i)、(ii)和(iii)中的任一個(gè)試劑或試劑組反應(yīng)的步驟，(i)硫酸α-環(huán)糊精、硫酸葡聚糖、鎂離子和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚、(ii)兩性表面活性劑和具有羧基或磺酸基的脂肪族胺、(iii)聚陽(yáng)離子；(b)然后，將上述檢樣和可與膽固醇特異性反應(yīng)的氧化還原酶和電子介體反應(yīng)的步驟；(c)將通過(guò)上述步驟(b)而還原的上述電子介體進(jìn)行電化學(xué)氧化、得到氧化電流值的步驟。
8.對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇進(jìn)行定量的方法，該方法包括以下步驟(a)將檢樣與聚陰離子、二價(jià)陽(yáng)離子和抗高密度脂蛋白的抗體或二氧化硅反應(yīng)的步驟，(b)然后，將上述檢樣和可與膽固醇特異性反應(yīng)的氧化還原酶和電子介體反應(yīng)的步驟，(c)將通過(guò)上述步驟(b)而還原的上述電子介體進(jìn)行電化學(xué)氧化、得到氧化電流值的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一種只要將檢樣送入一次就能對(duì)低密度脂蛋白中的膽固醇進(jìn)行電化學(xué)定量的傳感器。該傳感器具有在絕緣性基板上形成的至少包含作用電極和對(duì)應(yīng)電極的電極系、在包含上述電極系的上述基板上形成的酶層和形成于向上述電極系供給試液的通路中的上述酶層的上游側(cè)的試劑層,上述酶層至少含有氧化還原酶和電子介體且上述試劑層含有與除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白結(jié)合、形成水溶性復(fù)合體的試劑等可抑制除了低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的膽固醇與氧化還原酶的反應(yīng)性的試劑。
文檔編號(hào)G01N33/92GK1337005SQ00802824
公開(kāi)日2002年2月20日 申請(qǐng)日期2000年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月22日
發(fā)明者渡邊基一, 湯川系子, 南海史朗 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社