專利名稱：結(jié)合肝素的拮抗劑在緩激肽釋放的抑制中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防由哺乳動(dòng)物體內(nèi)緩激肽釋放導(dǎo)致的疾病的方法，所述哺乳動(dòng)物特別是一種產(chǎn)生肝素結(jié)合蛋白的哺乳動(dòng)物，這種肝素結(jié)合蛋白與肝素結(jié)合蛋白拮抗劑結(jié)合，該方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物給予有效減少哺乳動(dòng)物體內(nèi)緩激肽釋放的用量的肝素結(jié)合蛋白拮抗劑。此外，本發(fā)明涉及用于測(cè)定哺乳動(dòng)物是否產(chǎn)生與肝素結(jié)合蛋白拮抗劑結(jié)合的肝素結(jié)合蛋白的方法和試劑盒以及一種用于檢測(cè)肝素結(jié)合蛋白拮抗劑的方法。
背景技術(shù)：
炎癥急性炎癥反應(yīng)由幾個(gè)特征組成，包括血管管徑和緊張性的改變以及導(dǎo)致富含蛋白質(zhì)之滲出物形成的血管通透性的增加(Lewis在《炎癥中的介質(zhì)》(Mediators of Inflammation)中所述，Wright，Bristol，U.K.，1986)。一旦中性粒細(xì)胞(PMN)接受了趨化信號(hào)，它們就移近血管內(nèi)皮細(xì)胞并通過(guò)在內(nèi)皮和中性粒細(xì)胞表面上合成的特異性粘附分子與所述內(nèi)皮細(xì)胞粘附。在中性粒細(xì)胞結(jié)合在內(nèi)皮細(xì)胞上之后，存在誘導(dǎo)血管通透性并使中性粒細(xì)胞遷移入間質(zhì)組織空間的內(nèi)皮裂隙通道。
接觸相(contact phase)系統(tǒng)包括三種酶因子因子X(jué)I(F XI)、因子X(jué)II(F XII)和血漿前激肽釋放酶(pre-kallekrein)(PK)和分別與F XI和PK形成等摩爾復(fù)合物的非酶輔因子H-激肽原(HK)。接觸相存在于單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上。由內(nèi)皮細(xì)胞和諸如高嶺土等非細(xì)胞性荷負(fù)電表面暴露的特異性結(jié)合位點(diǎn)統(tǒng)稱“接觸相”，它們?cè)试S在局部裝配關(guān)鍵成分。酶原F XII向活性酶F XIIa的轉(zhuǎn)化激活接觸相系統(tǒng)自身(Colman等，1986，《標(biāo)準(zhǔn)腫瘤學(xué)和血液學(xué)綜述》(Crit.Rev.Oncol.Hematol.)557-85)。表面結(jié)合的F XII和通過(guò)HK錨定該表面的PK的相互激活會(huì)產(chǎn)生F XIIa和PKa，由此放大起始信號(hào)。然后因子X(jué) IIa激活因子X(jué)I且啟動(dòng)凝固的固有途徑。已知PK還水解HK而產(chǎn)生有效力的九肽、即緩激肽(Kaplan和Silverberg，1987，《血液》(Blood)701-15)。據(jù)認(rèn)為激肽是產(chǎn)生疼痛的炎性過(guò)程的主要介質(zhì)、它們誘發(fā)血管舒張并因直接對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用而增加血管通透性，從而使內(nèi)皮細(xì)胞回縮并使中性粒細(xì)胞遷移和血漿成分滲出成為可能(Oyvin等，1970，Experentia 26843-844)。還有文獻(xiàn)提及局部產(chǎn)生前列腺素和一氧化氮NO(Hall，1992，《藥理療法》(Pharmacol.Ther.)56131-190)。因此，激活接觸相系統(tǒng)可以產(chǎn)生多種有害影響，例如炎癥、敗血性休克、成人呼吸窘迫綜合征、彌漫性血管內(nèi)凝血、因心血管外科手術(shù)導(dǎo)致的手術(shù)后出血。
特別地，當(dāng)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合時(shí)，通過(guò)內(nèi)毒素的存在并通過(guò)細(xì)菌感染可以激活接觸相系統(tǒng)(Colman等在1997《血液》(Blood)903819-3843中綜述)。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在膿毒病中，激活因子X(jué)II和前激肽釋放酶可產(chǎn)生裂解，這種裂解會(huì)使它們活化成與C1-抑制劑快速反應(yīng)而形成因子X(jué)IIa-C1-抑制劑和激肽釋放酶-C1-抑制劑復(fù)合物的酶。在模擬的心肺分流術(shù)中觀察到激肽釋放酶-C1-抑制劑復(fù)合物的形成顯著增加。
有人發(fā)現(xiàn)抑酶肽(一種纖溶酶和血漿激肽釋放酶的抑制劑)可在心臟手術(shù)后減少出血并減少手術(shù)后增加的出血時(shí)間。特別地，發(fā)現(xiàn)抑酶肽可減少模擬的體外分流模型中的激肽釋放酶-C1-抑制劑和C1-C1-抑制劑復(fù)合物(Wachtfogel等，1993，《胸腔心血管手術(shù)雜志》(J.Thorac.CardiovascSurg.)1061)。當(dāng)將抑酶肽加入到灌注了肝素抗凝的全血的心肺分流回路中時(shí)，抑酶肽確實(shí)補(bǔ)充了肝素的作用(Bannan等，1998，《英國(guó)血液學(xué)雜志》(Brit.J.Haem.)101455-461)。因此，抑酶肽對(duì)那些被發(fā)現(xiàn)具有肝素結(jié)合回路的出血具有附加的止血有利作用。
當(dāng)將內(nèi)皮細(xì)胞儲(chǔ)存在器官保護(hù)溶液中時(shí)抑酶肽還可以提高內(nèi)皮細(xì)胞在含氧量低的冷儲(chǔ)存條件下的存活力并改善在完整器官模型中對(duì)肺和心肌的保存(Sunamori等，1991，《胸腔手術(shù)年鑒》(Ann.Thor.Surg.)52971-978和Roberts等，1998，《胸腔手術(shù)年鑒》66225-230)。此外，盡管發(fā)現(xiàn)緩激肽可增加血管通透性，但是抑酶肽降低了這種通透性和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(O’Brien等，1997，《加拿大生理學(xué)與藥理學(xué)雜志》(Can.J.Physiol.Pharmacol.)75741-749和Dwenger等，1995，《歐洲臨床化學(xué)和臨床生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.)34207-214)。肝素結(jié)合蛋白近來(lái)已經(jīng)確定了分離自人和豬的外周中性粒細(xì)胞的兩種極為相關(guān)蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)H.Flodgaard等，1991，《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Biochem.)197535-547；J.Pohl等，1990，《FEBS通訊》(FEBS Lett.)272200ff.)。這兩種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的高度相似性，但由于195位活性絲氨酸和57位活性組氨酸的選擇性突變(胰凝乳蛋白酶編號(hào)方式(B.S.Hartley“絲氨酸蛋白酶中的同源性”(Homologies in Serine-Proteinases)-Phil.Trans.Roy.Soc.)系列257，1970，p.77ff.))，這些蛋白質(zhì)缺乏蛋白酶活性。已經(jīng)將這些蛋白質(zhì)根據(jù)其對(duì)肝素的高度親合性而分別命名為人肝素結(jié)合蛋白(hHBP)和豬肝素結(jié)合蛋白(pHBP)。
Schafer等(Schafer等，1984，《感染性免疫》(Infect.Immun.)53651)已經(jīng)根據(jù)抗菌活性命名了蛋白質(zhì)陽(yáng)離子抗微生物蛋白質(zhì)(CAP37)。HBP與LPS的類(lèi)脂A成分以及內(nèi)毒素強(qiáng)力結(jié)合(Kass＝0.8×109M-1)。已經(jīng)提示HBP的殺菌作用是由于結(jié)合類(lèi)脂A所導(dǎo)致的(Petersen等，1993，《歐洲生物化學(xué)雜志》B214271-279；Flodgaard等，1994，《細(xì)胞生物化學(xué)雜志》(J.Cell.Biochem.)增刊18A摘要E505；Pereira等，1993，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)904733-4737)。推定的天然HBP的類(lèi)脂A/LPS結(jié)合位點(diǎn)是定位在HBP上堿性與酸性區(qū)(patch)之間的不帶電區(qū)，其包括20-26位和41-43位的殘基。在類(lèi)脂A/LPS結(jié)合位點(diǎn)上，Phe25、Cys26、Cys42和Phe43形成一種適合于結(jié)合脂肪酸鏈或類(lèi)脂A的葡糖胺基糖環(huán)的疏水袋。緊接此袋的是離子袋和親水袋(Asn20、Gln21和Arg23)，這種離子袋和親水袋很適合于結(jié)合類(lèi)脂A中葡糖胺基連接的磷酸基(Iversen等，1997，《天然結(jié)構(gòu)生物學(xué)》(Nature Struct.Biology)4265-268)。
此外，在糞便性腹膜炎的動(dòng)物模型中，已經(jīng)證實(shí)HBP治療可以挽救小鼠免受致命損傷(Mercer-Jones等，1996，在《外科手術(shù)論壇》中所述，pp.105-108；和Wickel等，1997，第4屆創(chuàng)傷休克和膿毒病的免疫后果的國(guó)際討論會(huì)-(4thInternational Congress on the Immune Consequences of Trauma，Shock and Sepsis)，Munich，Germany，pp.413-416)。已經(jīng)有人提出可以將肝素結(jié)合蛋白或其結(jié)合LPS的部分用于治療敗血性休克(WO95/28949，美國(guó)專利號(hào)5,458,874，5,607,916和5,650,392)。
HBP最初是因其抗生素特性和LPS結(jié)合特性而被研究(Gabay等，1989，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)865610-5614和Pereira等，1993，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)904733-7)。然而，目前累積的證據(jù)支持了HBP除其抗菌作用外還因其對(duì)補(bǔ)充和激活單核細(xì)胞的影響(Pereira等，1990，《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)851468-1476和Rasmussen等，1996，F(xiàn)EBS通訊390109-112)、對(duì)補(bǔ)充T細(xì)胞的影響(Chertov等，1996，《生物化學(xué)雜志》(J.Bio.Chem.)2712935-2940)而參與炎癥的進(jìn)展。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HBP可誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞收縮(stergaard和Flodgaard，1992，《白細(xì)胞生物學(xué)雜志》(J.Leuk.Biol.)51316-323)。在這方面，WO 93/05396中公開(kāi)了一種通過(guò)使HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞與疑為HBP抑制劑的物質(zhì)及能夠與HBP發(fā)生相互作用的組織或細(xì)胞一起保溫來(lái)篩選HBP抑制劑的方法；相互作用減少(例如內(nèi)皮細(xì)胞收縮)表明該物質(zhì)是一種HBP抑制劑。
WO99/26647號(hào)申請(qǐng)中公開(kāi)了肝素結(jié)合蛋白在調(diào)節(jié)或預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的用途。該申請(qǐng)還公開(kāi)了HBP可以使大鼠胰島瘤細(xì)胞從IL-1誘發(fā)的凋亡中獲救。
還發(fā)現(xiàn)人肝素結(jié)合蛋白而非豬肝素結(jié)合蛋白可與抑酶肽(BPTI)結(jié)合(Petersen等，歐洲生物化學(xué)雜志214271-279)。特別地，BPTI仍然能夠以Kd＝0.1×10-6M結(jié)合HBP(Petersen等，1993，歐洲生物化學(xué)雜志B214271-279)。已經(jīng)將HBP的P1特異性確定為主要是Lys或Leu(Kiczak等，1999，《生物化學(xué)》(Biol.Chem.)380101-105)。已經(jīng)提示HBP中影響B(tài)PTI結(jié)合的最主要?dú)埢荊ly169、Gly175、Ser192和Asp201，相當(dāng)于胰蛋白酶中的Asp189、Ser195、Gly216和Asp226(Petersen等，1993，歐洲生物化學(xué)雜志B214271-279)。Kiczak等1999，生物化學(xué)380101-106使用噬菌體展示法構(gòu)建了抑酶肽P1側(cè)鏈上的突變體的文庫(kù)。他們發(fā)現(xiàn)HBP對(duì)P1 Lys和對(duì)不帶電的P1氨基酸Leu、Thr、Met、Gln表現(xiàn)出強(qiáng)親和力。
發(fā)明簡(jiǎn)述已經(jīng)令人意外地發(fā)現(xiàn)肝素結(jié)合蛋白(HBP)可作為中性粒細(xì)胞誘發(fā)的血管滲漏和伴有緩激肽形成的接觸相系統(tǒng)的活化中的信號(hào)連接，且它特別在PK介導(dǎo)的HK裂解中起作用從而獲得緩激肽序列。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HBP拮抗劑可降低內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。本文所定義的“HBP拮抗劑”是與肝素結(jié)合蛋白結(jié)合并抑制肝素結(jié)合蛋白的作用的物質(zhì)。
本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防由哺乳動(dòng)物、特別是人類(lèi)患者、特別是產(chǎn)生與HBP拮抗劑結(jié)合的HBP的哺乳動(dòng)物體內(nèi)緩激肽釋放所導(dǎo)致的疾病的方法，該方法包括對(duì)有相應(yīng)需要的所述哺乳動(dòng)物給予有效調(diào)節(jié)或減少所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)緩激肽釋放的用量的哺乳動(dòng)物肝素結(jié)合蛋白拮抗劑。所述疾病包括但不限于系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合征、局部缺血再灌注(ischemia reperfusion)、過(guò)敏反應(yīng)和同種異體移植物排斥。這類(lèi)疾病還包括成人呼吸窘迫綜合征、即系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合征的一種副作用。過(guò)敏反應(yīng)可以因心肺分流術(shù)、肺部外科手術(shù)、頭部外傷和嚴(yán)重整體外傷過(guò)程中PMN的不適宜活化而發(fā)生。通過(guò)防止HBP與內(nèi)皮細(xì)胞和/或與接觸相系統(tǒng)接觸可以調(diào)節(jié)或減少緩激肽的釋放。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，HBP拮抗劑調(diào)節(jié)或減少激肽釋放酶介導(dǎo)的H-激肽原的裂解，該裂解獲得緩激肽序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及HBP拮抗劑在制備用于治療帶有與HBP拮抗劑結(jié)合的HBP的患者體內(nèi)系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合征、局部缺血再灌注(ischemia reperfusion)、過(guò)敏反應(yīng)和同種異體移植物排斥的藥劑中的應(yīng)用?？梢詫BP拮抗劑進(jìn)一步用于治療系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合征并發(fā)癥、即成人呼吸窘迫綜合征或制備用于治療該病的藥劑。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防由哺乳動(dòng)物、特別是人類(lèi)患者、特別是產(chǎn)生與HBP拮抗劑結(jié)合的HBP的哺乳動(dòng)物體內(nèi)緩激肽釋放所導(dǎo)致的疾病的方法，該方法包括對(duì)有相應(yīng)需要的所述哺乳動(dòng)物給予有效調(diào)節(jié)或減少所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)緩激肽釋放的用量的結(jié)合HBP的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域或其類(lèi)似物或其衍生物。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防由哺乳動(dòng)物、特別是人類(lèi)患者、特別是產(chǎn)生與結(jié)合HBP上至少一種表位的單克隆抗體結(jié)合的HBP的哺乳動(dòng)物體內(nèi)緩激肽釋放所導(dǎo)致的疾病的方法，其中所述表位結(jié)合前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物并激活緩激肽的釋放；該方法包括對(duì)有相應(yīng)需要的所述哺乳動(dòng)物給予有效調(diào)節(jié)或減少所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)緩激肽釋放的用量的結(jié)合HBP上至少一種表位的單克隆抗體，其中所述表位結(jié)合前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物并激活緩激肽。
本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)HBP拮抗劑的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟(a)在有HBP存在以及有和沒(méi)有疑為所述拮抗劑的物質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞；和(b)檢測(cè)所述物質(zhì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的任何影響；其中所述內(nèi)皮細(xì)胞的通透性與當(dāng)在有HBP而沒(méi)有所述物質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)時(shí)所述細(xì)胞的通透性相比降低表明所述物質(zhì)是一種拮抗劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟(a)使HBP與能與HBP發(fā)生相互作用的第一種物質(zhì)和疑為HBP拮抗劑的第二種物質(zhì)一起保溫；和(b)檢測(cè)疑為拮抗劑的所述第二種物質(zhì)對(duì)HBP與所述第一種物質(zhì)的相互作用的任何影響。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種鑒定與HBP、特別是人HBP的至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體的方法，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟(a)在有HBP存在以及有和沒(méi)有懷疑與HBP、特別是人HBP的至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體存在的情況下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放；和(b)檢測(cè)所述物質(zhì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的任何影響；其中所述內(nèi)皮細(xì)胞的通透性與當(dāng)在有HBP而沒(méi)有所述抗體存在的情況下培養(yǎng)時(shí)所述細(xì)胞的通透性相比降低表明所述抗體是與HBP上至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟(a)在有HBP存在以及有和沒(méi)有懷疑與HBP、特別是人HBP上至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體存在的情況下培養(yǎng)前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放；和(b)檢測(cè)所述抗體對(duì)緩激肽釋放的任何影響，緩激肽釋放減少表明所述抗體與HBP上的至少一種所述表位結(jié)合。
本發(fā)明還涉及用于測(cè)定哺乳動(dòng)物是否產(chǎn)生與HBP拮抗劑結(jié)合的HBP的方法和試劑盒。所述方法包括下列步驟(a)從所述哺乳動(dòng)物、特別是人類(lèi)患者體內(nèi)分離HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織；(b)使與HBP發(fā)生相互作用的物質(zhì)、組織、細(xì)胞或其成分及所述HBP拮抗劑與所述HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織一起保溫；和(c)檢測(cè)所述肝素結(jié)合拮抗劑對(duì)HBP與所述物質(zhì)、組織、細(xì)胞或其成分的相互作用的影響；相互作用減少表明所述HBP與所述HBP拮抗劑結(jié)合。檢測(cè)試劑盒包括(a)HBP拮抗劑；(b)天然HBP；和(c)與HBP發(fā)生相互作用的物質(zhì)、組織、細(xì)胞或其成分。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及用于測(cè)定哺乳動(dòng)物、特別是人類(lèi)患者是否產(chǎn)生與結(jié)合天然HBP、特別是人HBP上至少一種(on)表位的單克隆抗體結(jié)合的HBP的方法和試劑盒，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放；所述方法包括下列步驟(a)從所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織；(b)在有或沒(méi)有所述抗體存在的情況下使所述HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織與內(nèi)皮細(xì)胞一起培養(yǎng)；和(c)檢測(cè)所述抗體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的任何影響，通透性降低表明所述HBP與所述抗體結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟(a)從所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織；(b)在有或沒(méi)有所述抗體存在的情況下使所述HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物一起保溫；和(c)檢測(cè)所述HBP對(duì)緩激肽從前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物中釋放的任何影響，緩激肽釋放減少表明所述HBP與所述抗體結(jié)合。本發(fā)明的試劑盒包括(a)與天然HBP、特別是人HBP上的至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放；(b)天然人HBP；和(c)與固體支持物結(jié)合的前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示與第二抗體山羊抗小鼠F(ab)2交聯(lián)的CD18的影響。
圖2表示HBP(25-75μg/ml)對(duì)單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性的劑量依賴性效應(yīng)。
圖3顯示使用HBP多克隆抗血清對(duì)HBP誘發(fā)的EC通透性增加的抑制作用。
圖4顯示抗HBP抗體在PMN分泌對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的作用中的影響。
圖5顯示使用針對(duì)緩激肽的單克隆抗體MBK3對(duì)緩激肽誘導(dǎo)型和HBP誘導(dǎo)型EC通透性增加的抑制作用。在0時(shí)對(duì)與mAb MBK3(40μg/ml)一起預(yù)溫的EC單層的薄層側(cè)給予緩激肽(100nM；圖5a)或HBP(75μg/ml；圖5b)。
圖6表示使用針對(duì)血漿激肽釋放酶的單克隆抗體PKH4對(duì)HBP誘發(fā)的EC通透性增加的抑制作用。HBP(75μg/ml；實(shí)心符號(hào))或緩激肽(100nM；空心符號(hào))。
圖7表示肽HKH20處理對(duì)HBP誘發(fā)的EC通透性增加的抑制作用。
圖8表示肽SDD31處理對(duì)HBP誘發(fā)的EC通透性增加的抑制作用。
圖9表示抑酶肽處理對(duì)HBP誘發(fā)的EC通透性增加的抑制作用。
圖10人單核細(xì)胞的I1-6釋放。在有圖中所示量的LPS和/或天然HBP/[R23S，F(xiàn)25E]HBP/[G175Q]HBP存在的情況下將所述單核細(xì)胞在1ml不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。
圖11(A)使用3H-LPS飽和天然HBP、[R23S，F(xiàn)25E]HBP和[G175Q]HBP和(B)使用固定的、濃度遞增的未標(biāo)記BPTI競(jìng)爭(zhēng)對(duì)125I-BPTI的結(jié)合。(C)以％0nM未標(biāo)記BPTI表示的125I-BPTI的濃度。HBP與[R23S，F(xiàn)25E]HBP之間在結(jié)合上的表觀差異在“結(jié)果”部分討論。條形(bar)表示標(biāo)準(zhǔn)差。
發(fā)明詳述肝素結(jié)合蛋白在本文的上下文中，術(shù)語(yǔ)“肝素結(jié)合蛋白”(“HBP”)指(i)蛋白水解失活的；(ii)儲(chǔ)存在多形核白細(xì)胞嗜天青顆粒中；和(iii)可作為單核細(xì)胞化學(xué)引誘物和/或激活單核細(xì)胞的蛋白質(zhì)。優(yōu)選HBP來(lái)自哺乳動(dòng)物、特別是人。特別地，HBP是一種成熟人HBP，它與表示為SEQ ID NO1的氨基酸序列具有至少約80％的同一性、更優(yōu)選至少約90％、甚至更優(yōu)選至少約95％，最優(yōu)選至少約97％(下文的“同源多肽”)，它們定性地保留了所述HBP的活性。SEQ ID NO1Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala Ser Ile Gln Ash Gln Gly ArgHis Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln SerGln Asn Pro Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln SerArg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Gln Asn Leu Asn AspLeu Met Leu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Leu Pro Leu ProLeu Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly Ser Gln Arg SerGly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val Asn Val Thr Val Thr Pro Glu Asp Gln Cys ArgPro Asn Asn Val Cys Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly Asp Gly Gly ThrPro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe Ser Leu Gly Pro Cys Gly Arg GlyPro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg Asp Trp Ile Asp Gly Val Leu Asn Asn Pro GlyPro Gly Pro Ala所述同源多肽的氨基酸序列因插入或缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和/或用不同氨基酸殘基取代了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而不同于表示為SEQ IDNO1的氨基酸序列。優(yōu)選氨基酸的改變屬于最小性質(zhì)上的改變，其為不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，一般為1-約30個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，諸如氨基末端的甲硫氨酸殘基最高約達(dá)20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或另一種功能而有利于純化的小的延伸，諸如聚組氨酸段、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
保守取代的實(shí)例是在堿性氨基酸(諸如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(諸如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(諸如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(諸如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(諸如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(諸如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的各組范圍。那些通常不改變比活性的氨基酸取代在本領(lǐng)域中是公知的且由例如H.Neurath和R.L.Hill在1979蛋白質(zhì)，Academic Press，New York中描述。最常見(jiàn)互換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly以及它們的反向互換。
該術(shù)語(yǔ)特別用來(lái)包括HBP的肽片段、特別是具有與天然HBP相似的趨化作用的片段。此外，在本發(fā)明方法中使用的HBP與諸如抑酶肽和/或針對(duì)天然人HBP的單克隆抗體等HBP拮抗劑結(jié)合。成熟形式的天然人HBP具有表示為SEQ ID NO1的氨基酸序列且另外它是(i)蛋白水解失活的；(ii)儲(chǔ)存在多形核白細(xì)胞的嗜天青顆粒中；并(iii)可作為單核細(xì)胞的化學(xué)引誘物和/或激活單核細(xì)胞的蛋白。
HBP可以分離自血小板，使用美國(guó)專利號(hào)5,814,602中所述方法可以從人血液中獲得。更具體地說(shuō)，所述蛋白質(zhì)可通過(guò)對(duì)血小板提取物的分級(jí)分離而產(chǎn)生。使用肝素-Sepharose進(jìn)行的柱層析可以方便地達(dá)到這一目的。這類(lèi)層析方法包括首先將血小板提取物上樣至該柱，再用0.5M-3M NaCl進(jìn)行梯度洗脫，產(chǎn)生兩個(gè)洗脫峰。第一個(gè)在1.2M NaCl前后的峰可以在280nm測(cè)定為較大蛋白質(zhì)峰，公知它本身是血小板因子(PF4)。在1.8M NaCl前后，蛋白質(zhì)的量低于所用系統(tǒng)的檢測(cè)極限，但該區(qū)域中的級(jí)分具有血管生成活性。另外通過(guò)C4柱上的微內(nèi)徑反相HPLC來(lái)純化活性級(jí)分，可以在214nm處測(cè)到一個(gè)完全純的蛋白質(zhì)峰，該蛋白質(zhì)與現(xiàn)有的、用不同類(lèi)型血小板所得豬或人的HBP相同。
如果將HBP用于檢測(cè)HBP拮抗劑，那么它應(yīng)優(yōu)選通過(guò)如下的重組DNA方法獲得。編碼HBP的核酸序列可以通過(guò)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法如，S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，1981，四面體通訊(Tetrahedron Letters)221859-1869所述膦酰胺法；或Matthes等，1984，歐洲分子生物學(xué)組織雜志(EMBO Journal)3；801-805所述方法來(lái)合成。根據(jù)膦酰胺(phosphoamidite)法，在例如自動(dòng)DNA合成儀中合成寡核苷酸、將其純化、退火、連接并克隆入合適的載體。
用于分離或克隆編碼本發(fā)明方法中使用的肝素結(jié)合蛋白的核酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的，包括從基因組DNA中分離、由cDNA制備或其組合。由這類(lèi)基因組DNA克隆本發(fā)明的核酸序列可以通過(guò)如下方式實(shí)現(xiàn)，例如使用眾所周知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來(lái)檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段。參見(jiàn)，例如Innis等，1990，方法與應(yīng)用指南(A Guide to Methods and Application)，Academic Press，New York?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法，諸如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。
然后將核酸序列插入重組表達(dá)載體中，這種重組表達(dá)載體可以是可便利地進(jìn)行重組DNA過(guò)程的任意載體。對(duì)載體的選擇通常依賴于它將被引入的宿主細(xì)胞。因此，該載體可以是自主復(fù)制載體，即以染色體外實(shí)體形式存在的載體，其復(fù)制與染色體的復(fù)制無(wú)關(guān)，例如質(zhì)粒。另一方面，載體可以是當(dāng)引入宿主細(xì)胞時(shí)，整合入宿主細(xì)胞基因組并與它所整合入的染色體一起復(fù)制的一種載體。
編碼SEQ ID NO1、SEQ ID NO2的核酸序列可以可操作地與編碼異源原序列(pro)和/或信號(hào)序列的核酸連接。另一方面，可以將分別編碼SEQ IDNOS4(信號(hào)序列+成熟HBP)和6(信號(hào)序列+原序列+成熟HBP)、SEQ IDNOS3和5的核酸插入重組載體中。SEQ ID NO2atcgttggcg gccggaaggc gaggccccgc cagttcccgt tcctggcctc cattcagaat caaggcaggc acttctgcgggggtgccctg atccatgccc gcttcgtgat gaccgcggcc agctgcttcc aaagccagaa ccccggggtt agcaccgtggtgctgggtgc ctatgacctg aggcggcggg agaggcagtc ccgccagacg ttttccatca gcagcatgag cga-gaatggc tacgaccccc agcagaacct gaacgacctg atgctgcttc agctggaccg tgaggccaacctcaccagca gcgtgacgat actgccactg cctctgcaga acgccacggt ggaagccggc accagatgccaggtggccgg ctgggggagc cagcgcagtg gggggcgtct ctcccgtttt cccaggttcg tcaacgtgac tgtgacccccgaggaccagt gtcgccccaa caacgtgtgc accggtgtgc tcacccgccg cggtggcatc tgcaatgggg ac-gggggcac ccccctcgtc tgcgagggcc tggcccacgg cgtggcctcc ttttccctgg ggccctgtgg ccgaggccctgacttcttca cccgagtggc gctcttccga gactggatcg atggcgtttt aaacaatccg ggaccggggc cagcctagSEQ ID NO3ggctccagcc cccttttgga catcgttggc ggccggaagg cgaggccccg ccagttcccg tcctggcct ccattcagaatcaaggcagg cacttctgcg ggggtgccct gatccatgcc cgcttcgtga tgaccgcggc cagctgcttc caaagccagaaccccggggt tagcaccgtg gtgctgggtg cctatgacct gaggcggcgg gagaggcagt cccgccagac gttttccatcagcagcatga gcgagaatgg ctacgacccc cagcagaacc tgaacgacct gatgctgcttcagctggacc gtgaggccaa cctcaccagc agcgtgacga tactgccact gcctctgcag aacgccacggtggaagccgg caccagatgc caggtggccg gctgggggag ccagcgcagt ggggggcgtc tctcccgttttcccaggttc gtcaacgtga ctgtgacccc cgaggaccag tgtcgcccca acaacgtgtg caccggtgtg ctcacccgccgcggtggcat ctgcaatggg gacgggggca cccccctcgt ctgcgagggc ctggcccacg gcgtggcctc cttttccctggggccctgtg gccgaggccc tgacttcttc acccgagtgg cgctcttccg agactggatc gatggcgttt taaacaatccgggaccgggg ccagcctagSEQ ID NO4Gly Ser Ser Pro Leu Leu Asp Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe LeuAla Ser Ile Gln Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met ThrAla Ala Ser Cys Phe Gln Ser Gln Asn Pro Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp LeuArg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly Tyr AspPro Gln Gln Asn Lau Asn Asp Lau Met Leu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr SerSer Val Thr Ile Leu Pro Leu Pro Leu Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val AlaGly Trp Gly Ser Gln Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val Asn Val Thr ValThr Pro Glu Asp Gln Cys Arg Pro Asn Asn Val Cys Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly IleCys Asn Gly Asp Gly Gly Thr Pro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe SerLeu Gly Pro Cys Gly Arg Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg Asp Trp Ile AspGly Val Leu Asn Asn Pro Gly Pro Gly Pro AlaSEQ ID NO5atgacccggc tgacagtcct ggccctgctg gctggtctgc tggcgtcctc gagggccggc tccagccccc ttttggacatcgttggcggc cggaaggcga ggccccgcca gttcccgttc ctggcctcca ttcagaatca aggcaggcac ttctgcgggggtgccctgat ccatgcccgc ttcgtgatga ccgcggccag ctgcttccaa agccagaacc ccggggttag caccgtggtgctgggtgcct atgacctgag gcggcgggag aggcagtccc gccagacgtt ttccatcagc agcatgagcgagaatggcta cgacccccag cagaacctga acgacctgat gctgcttcag ctggaccgtg aggccaacct caccag-cagc gtgacgatac tgccactgcc tctgcagaac gccacggtgg aagccggcac cagatgccag gtggccggctgggggagcca gcgcagtggg gggcgtctct cccgttttcc caggttcgtc aacgtgactg tgacccccga ggaccagtgtcgccccaaca acgtgtgcac cggtgtgctc acccgccgcg gtggcatctg caatggggac gggggcacccccctcgtctg cgagggcctg gcccacggcg tggcctcctt ttccctgggg ccctgtggcc gaggccctga cttcttcacccgagtggcgc tcttccgaga ctggatcgat ggcgttttaa acaatccggg accggggcca gcctagSEQ ID NO6Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala-Gly Leu Leu Ala Ser Ser Arg Ala Gly Ser SerPro Leu Leu Asp Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala Ser IleGln Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr Ala AlaSer Cys Phe Gln Ser Gln Asn Pro Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg ArgArg Glu Arg Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly Tyr Asp Pro GlnGln Asn Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr Ser Ser ValThr Ile Leu Pro Leu Pro Leu Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala GlyTrp Gly Ser Gln Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val Asn Val Thr Val ThrPro Glu Asp Gln Cys Arg Pro Asn Asn Val Cys Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly Ile CysAsn Gly Asp Gly Gly Thr Pro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe Ser LeuGly Pro Cys Gly Arg Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg Asp Trp Ile Asp GlyVal Leu Asn Asn Pro Gly Pro Gly Pro Ala編碼HBP的核酸序列也可以可操作地連接合適的終止子，諸如人生長(zhǎng)激素終止子(Palmiter等，出處同上)。載體可以進(jìn)一步包括其它元件。這些元件包括據(jù)聚腺苷酸化信號(hào)(例如來(lái)自SV 40或腺病毒5 E1b區(qū))、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列(例如SV 40增強(qiáng)子)和翻譯增強(qiáng)子序列(例如編碼腺病毒VA RNA的序列)。重組表達(dá)載體還可以包括使載體在所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述載體還可以包括選擇標(biāo)記，例如一種基因、其產(chǎn)物補(bǔ)充宿主細(xì)胞中的缺陷，諸如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或產(chǎn)生耐藥性的基因，所述藥物例如是新霉素、遺傳霉素、氨芐青霉素或潮霉素。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，HBP可如下生成，在允許表達(dá)HBP的條件下，將含有編碼成熟HBP及其之前的N-末端延伸的DNA序列的宿主細(xì)胞在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并從所述培養(yǎng)基中回收N-末端延伸型的HBP。
N-末端延伸可以是約5-約25個(gè)氨基酸殘基、特別是約8-約15個(gè)氨基酸殘基的序列。N-末端序列中氨基酸殘基的性質(zhì)并不關(guān)鍵。
為了有利于生產(chǎn)成熟HBP，一般優(yōu)選編碼N-末端延伸型HBP的DNA序列包括編碼蛋白酶切割位點(diǎn)的DNA序列，所述蛋白酶切割位點(diǎn)位于編碼N-末端延伸的DNA序列與編碼成熟HBP的DNA序列之間。合適的蛋白酶切割位點(diǎn)的實(shí)例是帶有所述氨基酸序列的腸激酶切割位點(diǎn)、帶有所述氨基酸序列的因子X(jué)a切割位點(diǎn)。
另一方面，可以在允許表達(dá)HBP的條件下于合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有編碼成熟HBP及其之前的信號(hào)序列的DNA的宿主細(xì)胞，并從所述培養(yǎng)基中回收成熟HBP。
用于連接分別編碼HBP或N-末端延伸型HBP、Δpro-HBP(信號(hào)+成熟HBP)、啟動(dòng)子和終止子的核酸序列并使它們插入含有復(fù)制所必需信息的合適載體的方法對(duì)在本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的(參見(jiàn)，例如Sambrook等，出處同上)。
引入了表達(dá)載體的宿主細(xì)胞可以是能夠產(chǎn)生HBP的任意細(xì)胞且優(yōu)選是真核細(xì)胞，諸如無(wú)脊椎動(dòng)物(昆蟲(chóng))細(xì)胞或脊椎動(dòng)物細(xì)胞、例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、特別是昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是可以在用編碼哺乳動(dòng)物HBP的核酸轉(zhuǎn)染后在厭氧條件下培養(yǎng)的細(xì)胞。在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是腺病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或來(lái)源于胚胎細(xì)胞的細(xì)胞。正如本文所定義的，來(lái)源于胚胎細(xì)胞的細(xì)胞是獲自胚胎細(xì)胞原代培養(yǎng)物的細(xì)胞或來(lái)自胚胎細(xì)胞原代培養(yǎng)物原始傳代的細(xì)胞系的細(xì)胞。這類(lèi)腺病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或來(lái)源于胚胎的細(xì)胞的實(shí)例是人胚胎腎(HEK)細(xì)胞、特別是HEK 293細(xì)胞。所述昆蟲(chóng)細(xì)胞可以是例如，鱗翹目或果蠅屬的細(xì)胞。
用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞和表達(dá)引入所述細(xì)胞的DNA序列的方法描述在下列文獻(xiàn)中例如Kaufman和Sharp，1982，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)159601-621；Southern和Bergm，1982，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志(J.Mol.Appl.Genet.)1327-341；Loyter等，1982，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(79422-426；Wigler等，1978，細(xì)胞14725；Corsaro和Pearson，1981，體細(xì)胞遺傳學(xué)(Somatic CellGenetics)7603；Graham和van der Eb，1973，病毒學(xué)(Virology)52456；Fraley等，1980，JBC 22510431；Capecchi，1980，細(xì)胞22479；Wiberg等，1983，NAR 117287；和Neumann等，1982，歐洲分子生物學(xué)組織雜志1；841-845。可以如美國(guó)專利號(hào)4,745,051中所述用桿狀病毒載體適當(dāng)轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞。
用于培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適合于使哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的任意常用培養(yǎng)基，諸如含血清或不含血清而含有適當(dāng)添加物的培養(yǎng)基或適合于使哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可獲自商品供應(yīng)商或可以按照公開(kāi)的配方(參見(jiàn)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)制備。然后篩選這些細(xì)胞的抗生素抗性。隨后，用諸如趨化試驗(yàn)等本領(lǐng)域中公知的試驗(yàn)和分析單核細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放的試驗(yàn)來(lái)分析所選克隆的HBP活性(例如，參見(jiàn)Rasmussen等，1996，F(xiàn)EBS通訊390109-112)。
由所述細(xì)胞產(chǎn)生的HBP然后可以通過(guò)常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收，其包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞；用硫酸銨等鹽類(lèi)沉淀上清液或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)成分；用各種層析方法如離子交換層析、親和層析等進(jìn)行純化。
如果HBP是N-末端延伸型HBP，在從培養(yǎng)基中回收后，用適當(dāng)?shù)鞍酌噶呀釴-末端延伸型HBP有利于產(chǎn)生成熟(和有活性的)HBP。適當(dāng)酶的實(shí)例包括但不限于腸激酶和因子X(jué)a。HBP拮抗劑HBP拮抗劑可以是抗HBP的多克隆或單克隆抗體?？梢詫⑾铝蟹椒ㄓ糜讷@得抗HBP多克隆抗體。為了生產(chǎn)抗體，可以用HBP、優(yōu)選人HBP注射使各種宿主動(dòng)物被免疫，這些動(dòng)物包括但不限于家兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。在一個(gè)實(shí)施方案中，HBP可以與牛血清清蛋白(BSA)或匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)等免疫原性載體偶聯(lián)。根據(jù)宿主的不同種類(lèi)，可以使用各種佐劑來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述佐劑包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑；礦物膠如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)，諸如溶血卵磷脂、多聚醇類(lèi)(pluronic polyol)、聚陰離子；肽類(lèi)；油乳劑；匙孔血藍(lán)蛋白；二硝基苯酚；和BCG(卡介苗)和小棒桿菌等強(qiáng)效人類(lèi)佐劑。
下列方法可用于獲得與HBP、特別是人HBP的至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是人單克隆抗體?？梢允褂猛ㄟ^(guò)傳代細(xì)胞系培養(yǎng)而生產(chǎn)抗體分子的任意技術(shù)。這些技術(shù)包括但不限于最初由Kohler和Milstein開(kāi)發(fā)的雜交瘤技術(shù)(1975，自然256495-497)以及trioma技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，今日免疫學(xué)(Immunology Today)472)和生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，在單克隆抗體和癌癥治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中所述，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以應(yīng)用目前的技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生單克隆抗體(PCT/US90/02545；Green，1999，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)23111-23和美國(guó)專利號(hào)5,625,126和5,633,425)。根據(jù)本發(fā)明，可以使用人抗體且可以通過(guò)使用人雜交瘤(Cole等，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)802026-2030)或通過(guò)在體外用EBV轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞(Cole等，1985，在單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96中所述)獲得人抗體。
根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利號(hào)4,946,778)適于生產(chǎn)HBP特異性單鏈抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案應(yīng)用構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)的技術(shù)(Huse等，1989，科學(xué)2461275-1281)快速而簡(jiǎn)便地鑒定具有所需HBP特異性的單克隆Fab片段。
可以通過(guò)公知技術(shù)生產(chǎn)含有抗體分子獨(dú)特型的抗體片段。例如，這類(lèi)片段包括但不限于可以通過(guò)用胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’).sub.2片段；可以通過(guò)還原F(ab’).sub.2片段的二硫鍵而產(chǎn)生的Fab’片段；和可以通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段。
在抗體的生產(chǎn)中，對(duì)所需抗體的篩選可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)來(lái)完成，如放射免疫分析；ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))；“夾心”免疫分析；放射免疫測(cè)量試驗(yàn)；凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)；免疫擴(kuò)散試驗(yàn)；原位免疫測(cè)定法(例如，使用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記)；蛋白質(zhì)印跡；沉淀反應(yīng)；凝集試驗(yàn)(例如，凝膠凝集試驗(yàn)、血凝試驗(yàn))；補(bǔ)體固定試驗(yàn)；免疫熒光分析；蛋白A試驗(yàn)；和免疫電泳試驗(yàn)等。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)第一抗體上的標(biāo)記來(lái)檢測(cè)抗體結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)第二抗體或試劑與第一抗體的結(jié)合來(lái)檢測(cè)第一抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，對(duì)所述第二抗體進(jìn)行標(biāo)記。用于在免疫分析中檢測(cè)結(jié)合的許多方式在本領(lǐng)域中是公知的且它們屬于本發(fā)明的范圍。
另一方面，可以使用噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生抗HBP抗體的文庫(kù)(例如，參見(jiàn)Koscienlska等，1998，Acta Biochimica Polinica 45705-720)。可以對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行篩選并可以將最強(qiáng)的結(jié)合者用作HBP拮抗劑。
HBP拮抗劑還可以是含有與HBP結(jié)合的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的多肽。包括Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的肽一般含有約60個(gè)殘基并在二硫鍵中有6個(gè)特殊間隔的半胱氨酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，如果HBP是人HBP，那么Kunitz型抑制劑可以是也稱作BPTI的與HBP結(jié)合的抑酶肽或其類(lèi)似物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抑酶肽類(lèi)似物在12-19位和34-39位上帶有突變，特別優(yōu)選突變發(fā)生在15-19位上?？梢允褂玫钠渌?lèi)似物公開(kāi)在下列參考文獻(xiàn)中美國(guó)專利5,162,498、5,316,923、5,395,922、5,514,585、5,510,249、5,591,603、5,618,915、5,621,074、5,673,090、5,618,696和5,576,294。在一個(gè)最具體的實(shí)施方案中，所述突變是A16H、K15A、I18M、I19S、R17T。
可以使用各種方法獲得包括Kunitz型結(jié)構(gòu)域的多肽的較大文庫(kù)(107-109)。例如，可以對(duì)各個(gè)使用易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)(Saiki等，1988，科學(xué)93487-491)。當(dāng)Taq聚合酶在擴(kuò)增時(shí)引入錯(cuò)誤的核苷酸時(shí)，在這種條件下運(yùn)行的PCR反應(yīng)將會(huì)在每種相應(yīng)Kunitz型結(jié)構(gòu)域中隨機(jī)引入不正確的核苷酸。可以在噬菌體顆粒上展示該文庫(kù)以便篩選與HBP的最佳結(jié)合者。
另一方面，可以通過(guò)應(yīng)用簡(jiǎn)并寡核苷酸使特異性環(huán)發(fā)生突變(Schier等，1996，基因169147-153)。在PCR反應(yīng)中將合成的隨機(jī)寡核苷酸引入Kunitz型結(jié)構(gòu)域，可生成在特定的環(huán)中帶有變體的文庫(kù)。
在另一方法中，可以通過(guò)DNA改組產(chǎn)生文庫(kù)(Stemmer等，1994，自然370389-391)?？梢詫⑦@種方法用于同源Kunitz型結(jié)構(gòu)域之間的重組。簡(jiǎn)言之，將編碼每種變體的DNA混合并切割成小片段。然后將這些片段在常規(guī)PCR反應(yīng)中重新裝配。在該反應(yīng)過(guò)程中，這些小片段因?yàn)樗鼈儽舜嘶パa(bǔ)而彼此連接，致使所包含的基因發(fā)生重組。檢測(cè)方法通過(guò)測(cè)定疑為HBP拮抗劑的物質(zhì)是否與HBP結(jié)合可以檢測(cè)肝素結(jié)合蛋白(HBP)拮抗劑，其通過(guò)(a)使與HBP發(fā)生相互作用的第一種物質(zhì)和疑為HBP拮抗劑的第二種物質(zhì)與HBP一起保溫；和(b)檢測(cè)疑為拮抗劑的所述第二種物質(zhì)對(duì)HBP與所述第一種物質(zhì)的相互作用的任何影響；其中HBP與第一種物質(zhì)的相互作用減少表示第二種物質(zhì)是HBP拮抗劑。
可以標(biāo)記HBP或第一種物質(zhì)。該標(biāo)記優(yōu)選自酶、著色或發(fā)熒光的物質(zhì)、放射性同位素和復(fù)合試劑。
用作標(biāo)記物質(zhì)的酶的實(shí)例是過(guò)氧化物酶類(lèi)(諸如辣根過(guò)氧化物酶)、磷酸酶類(lèi)(諸如酸性或堿性磷酸酶)、B-半乳糖苷酶、尿素酶、葡糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰膽堿酯酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、葡糖-6-磷酸脫氫酶、b-葡糖苷酶、蛋白酶類(lèi)、丙酮酸脫羧酶、酯酶類(lèi)、螢光素酶等。
酶自身不可檢測(cè)，必須與底物結(jié)合以催化反應(yīng)，其終產(chǎn)物是可檢測(cè)到的。可以用于本發(fā)明方法中的底物的實(shí)例包括過(guò)氧化氫/四甲基聯(lián)苯胺或氯萘酚或鄰苯二胺(o-phehylenediamine)或3-(對(duì)羥苯基)丙酸或魯米諾、羥基吲哚磷酸酯(indoxyl phosphate)、對(duì)硝基苯基磷酸酯、硝基苯基半乳糖、4-甲基傘形基(umbelliferyl)-D-吡喃半乳糖苷或螢光素。
另一方面，被標(biāo)記的物質(zhì)可以包括著色或發(fā)熒光的物質(zhì)(包括金顆粒)、著色或發(fā)熒光的膠乳顆粒、染料顆粒、熒光素、藻紅蛋白或藻藍(lán)蛋白。
可以用于本目的的放射性同位素可以選自125I、131I、111In、3H、32P、14C和35S?？梢杂忙?計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器按照本領(lǐng)域中公知的方式測(cè)定這些同位素發(fā)出的放射活性。
可以用于本目的的復(fù)合試劑可以選自生物素(與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白形成復(fù)合體)、抗生物素蛋白(與生物素形成復(fù)合體)、蛋白A(與免疫球蛋白形成復(fù)合體)和凝集素(與碳水化合物受體形成復(fù)合體)。由于所述復(fù)合物并不可以直接被檢測(cè)到，所以必須標(biāo)記與復(fù)合試劑一起形成復(fù)合體的物質(zhì)。標(biāo)記可以使用上述用于(fro)標(biāo)記酶的標(biāo)記物質(zhì)中的任意一種來(lái)進(jìn)行。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以通過(guò)使用例如Amersham Pharmacia Biotech的SPA技術(shù)來(lái)檢測(cè)HBP拮抗劑與HBP的結(jié)合。簡(jiǎn)單地說(shuō)，來(lái)自臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的生物素化胞質(zhì)膜與鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)的PVT SPA珠結(jié)合。這些珠可以獲自Amersham Pharmacia Biotech。將標(biāo)記的人激肽原(例如3H、125I)加入到所述膜上，直到激肽原的結(jié)合位點(diǎn)飽和為止。以不斷增加的濃度加入HBP以便置換標(biāo)記的激肽原并測(cè)定所摻入的標(biāo)記的減少。繪制標(biāo)準(zhǔn)置換曲線。測(cè)試HBP拮抗劑抑制HBP介導(dǎo)的置換胞質(zhì)膜上放射性激肽原的能力。特別地，用高達(dá)過(guò)量摩爾的各種濃度的HBP拮抗劑與HBP一起保溫并測(cè)定HBP抑制HBP介導(dǎo)的從所述膜中置換標(biāo)記型激肽原的能力。
另一方面，可以通過(guò)在有HBP存在和有和沒(méi)有疑為拮抗劑的物質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)檢測(cè)HBP拮抗劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述拮抗劑是一種與HBP、優(yōu)選人HBP的至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是一種人單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，在37℃下先將所述抗體和HBP預(yù)保溫約10分鐘，再與內(nèi)皮細(xì)胞一起保溫。通過(guò)如下文實(shí)施例中所述測(cè)定跨內(nèi)皮電阻或測(cè)定清蛋白清除量來(lái)測(cè)定所述物質(zhì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。通透性降低表明所述物質(zhì)確實(shí)起HBP拮抗劑的作用。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以通過(guò)將抗體與HBP和前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物一起保溫來(lái)檢測(cè)與HBP的至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放。正如在實(shí)施例章節(jié)進(jìn)一步詳述的，HBP與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合，由此刺激緩激肽的釋放。與HBP的至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體會(huì)減少或阻止緩激肽釋放。使用例如免疫分析等本領(lǐng)域中公知的方法可以檢測(cè)緩激肽的釋放。
在一個(gè)實(shí)施方案中，包被緩沖液含有0.05％吐溫、15.9mM碳酸鈉、35mM碳酸氫鈉，pH9.6。加入H-激肽原并在4℃下保溫過(guò)夜。除去包被緩沖液并用含有約50M鋅的Tris緩沖液(pH7.4)洗滌平板。然后加入前激肽釋放酶并在室溫下將該混合物保溫1小時(shí)。隨后加入HBP的Tris緩沖液溶液，約5分鐘后，開(kāi)始每間隔約10分鐘取樣、持續(xù)約1小時(shí)，并分析緩激肽的釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用市售ELISA試驗(yàn)(MARKIT-M Bradykin，Dainippon Pharmaceutical Co.Ltd.)檢測(cè)緩激肽的釋放。在這類(lèi)試驗(yàn)中，使樣品中的緩激肽和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的緩激肽與由微條孔上包被的抗家兔IgG抗體(山羊)俘獲的抗BK抗體(家兔)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)。根據(jù)與抗緩激肽抗體結(jié)合的過(guò)氧化物酶標(biāo)記型緩激肽的酶活性來(lái)確定緩激肽的濃度。
另一方面，可以將前激肽釋放酶和H-激肽原按等摩爾量加入到單層內(nèi)皮細(xì)胞中并在37℃下保溫1小時(shí)。隨后加入HBP，約5分鐘后開(kāi)始每間隔約10分鐘取樣、持續(xù)約1小時(shí)，且從加入HBP后的并使用上述方法檢測(cè)緩激肽的釋放。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將前激肽釋放酶和H-激肽原按等摩爾量加入到含有ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制劑的血漿溶液中并在37℃下保溫1小時(shí)。隨后加入HBP，約5分鐘后，開(kāi)始每間隔約10分鐘取樣、持續(xù)約1小時(shí)并使用上述方法檢測(cè)緩激肽的釋放。治療方法本發(fā)明的組合物包括水溶液的一部分。該溶液優(yōu)選是生理上可接受的，使得除將所需的構(gòu)建體輸送給患者外，該溶液也不會(huì)對(duì)患者的電解質(zhì)和容量平衡產(chǎn)生不利影響。用于該組合物的含水介質(zhì)由此可以包括、例如pH7-7.4的生理鹽水(0.9％ NaCl，0.15M)或它的其它可藥用鹽。有效溶液可以通過(guò)制藥領(lǐng)域熟在的任何方法制備，例如《Remington氏藥物科學(xué)》(Remington’sPharmaceutical Science)(Gennaro，A.編輯)，Mack Pub.，1990中所述。
HBP拮抗劑的濃度范圍很寬，即從低于約0.5％(諸如從1％開(kāi)始)到高至15-20％(重量比)。所述組合物的單位劑量一般可以含有約10mg-約1g的HBP拮抗劑。可以通過(guò)體外或體內(nèi)方法測(cè)定治療有效劑量。
可通過(guò)局部、皮下或通過(guò)靜脈注射來(lái)給予HBP拮抗劑。臨床醫(yī)師會(huì)根據(jù)具體病情和所治療的具體個(gè)體開(kāi)據(jù)處方劑量。根據(jù)由臨床主管醫(yī)師確定的參數(shù)來(lái)謹(jǐn)慎采用和調(diào)整劑量以及給藥頻率。優(yōu)選的給藥途徑例如可以是經(jīng)腹膜內(nèi)注射。腹膜內(nèi)靜脈注射HBP拮抗劑可以每24小時(shí)進(jìn)行一次，劑量范圍在0.1-100mg/kg體重、尤其是0.5-50mg/kg體重、特別是1-25mg/kg體重?？梢悦?4小時(shí)給予1-4次劑量或通過(guò)導(dǎo)管連續(xù)給藥。另一方面，可以通過(guò)在外科手術(shù)過(guò)程中連續(xù)靜脈輸注來(lái)給予治療，然后在手術(shù)后繼續(xù)治療1-4天。
僅將HBP拮抗劑給予那些產(chǎn)生與HBP拮抗劑結(jié)合的HBP的患者。為了確定患者是否產(chǎn)生了這類(lèi)HBP，使用上述方法從患者血液的血小板中分離患者的HBP?？梢允褂蒙鲜龇椒▉?lái)檢測(cè)HBP與HBP拮抗劑(例如一種單克隆抗體)的結(jié)合或HBP對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響，并將它們與天然HBP的影響進(jìn)行比較。另一方面，還可以使用WO93/05396中所述方法測(cè)定在有或沒(méi)有HBP拮抗劑存在的情況下，HBP對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞收縮或單核細(xì)胞凝集的影響。細(xì)胞收縮或凝集程度下降表明存在HBP與HBP拮抗劑的相互作用?？梢杂糜跍y(cè)定患者是否產(chǎn)生這類(lèi)HBP的檢測(cè)試劑盒包括(a)HBP拮抗劑；(b)HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞；和(c)與HBP發(fā)生相互作用的物質(zhì)、組織、細(xì)胞或其成分。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織分離自患者。使HBP或產(chǎn)生所述HBP的細(xì)胞或組織與內(nèi)皮細(xì)胞一起保溫，在有或沒(méi)有與HBP的至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體存在的情況下測(cè)定對(duì)通透性的影響，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放。將這種影響與天然人HBP的影響進(jìn)行比較。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，天然人HBP可以是與這類(lèi)單克隆抗體結(jié)合的重組HBP。另一方面，在有前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物存在和有單克隆抗體存在的情況下培養(yǎng)HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織。測(cè)定單克隆抗體對(duì)緩激肽釋放的影響。在有抗體存在的情況下緩激肽釋放減少表示患者產(chǎn)生了與所述抗體結(jié)合的HBP。在這類(lèi)情況中，檢測(cè)試劑盒包括(a)與HBP上的至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放；(b)天然人HBP；和(c)與固體支持物結(jié)合的前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物。
實(shí)施例實(shí)施例1活化的中性粒細(xì)胞通過(guò)經(jīng)β2整聯(lián)蛋白的信號(hào)傳輸引發(fā)內(nèi)皮屏障功能的改變材料和方法試劑培養(yǎng)基-199、RPMI-1640(含有L-谷氨酰胺)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶-EDTA、磷酸緩沖鹽水(PBS)和Hanks平衡鹽溶液(HBSS)均來(lái)自LifeTechnologies(Gaithersburg，MD，USA)。明膠、膠原酶、青霉素、鏈霉素、過(guò)氧化氫酶、牛血清清蛋白(BSA)、N-甲?；?甲硫氨基-亮氨?；?苯丙氨酸(fMLP)、Evans藍(lán)染料、十六烷基三甲基溴化銨和四甲基聯(lián)苯胺獲自SigmaChemical Co.(St.Louis.MO，USA)。H2O2獲自E.Meck(Darmstadt，Germany)。生物基質(zhì)I獲自Biomedical Teohnologies Inc.(Stoughton，MA，USA)，而葡聚糖70(Macrodex)和 Ficoll-Paque來(lái)自Pharmacia Biotech AB(Uppsala，Sweden)?；A(chǔ)培養(yǎng)基由M-199和的1∶1混合物組成，其中補(bǔ)充了20％的加熱失活的FBS、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)。針對(duì)β2-整聯(lián)蛋白共有β-鏈(CD18)的單克隆抗體IB4由Rockefeller大學(xué)的Samuel D.Wright博士贈(zèng)送給Pharmacia & Upjohn(Uppsala，Sweden)的Claes Lundberg博士提供，識(shí)別整聯(lián)蛋白αm鏈(CD11b)的mAb 60.1由Karolinska Institutet的ManuelPatarroyo博士提供，mAb DREG 200(抗-L-選擇蛋白)是Stanford大學(xué)EugeneButcher所贈(zèng)，mAb SK11(抗-L-選擇蛋白)來(lái)自Becton Dickson(San Josi，CA)，mAb G44-26(抗-CD44)獲自PharMingen(San Diego，CA)。山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2獲自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.(West Grove，PA)，家兔抗小鼠IgG的FITC-偶聯(lián)型F(ab’)2片段來(lái)自Dako/A/S(Glostrup，丹麥)。內(nèi)皮細(xì)胞分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)并如文獻(xiàn)所述進(jìn)行培養(yǎng)(Gautam等，1998，英國(guó)藥物學(xué)雜志(Brit.J.Pharm.)1251109-1114)。通過(guò)短暫(2分鐘)的胰蛋白酶-EDTA處理(0.25％胰蛋白酶/0.01％EDTA)使第一至第五代HUVEC或BAEC脫附并將其重新鋪在0.2μm孔徑大小的Anopore無(wú)機(jī)膜或3.0μm孔徑大小的聚碳酸酯膜(Tissue Culture inserts，10mm；NUNC，Roskilde，丹麥)上。為了促進(jìn)細(xì)胞分化并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的粘附，將膜用50μl生物基質(zhì)I(167μg/ml)預(yù)處理并風(fēng)干。以2×105個(gè)細(xì)胞/膜的密度接種EC并在37℃和含5％CO2的潮濕空氣下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每日顯微鏡觀察，EC生長(zhǎng)至鋪滿單層，測(cè)量通過(guò)單層的電阻(Gautam等，1998，英國(guó)藥物學(xué)雜志1251109-1114)。EC屏障功能的測(cè)定用兩種不同方法評(píng)估刺激誘導(dǎo)的EC通透性的改變。為了測(cè)定跨內(nèi)皮電阻(TEER)，將插入有EC的膜轉(zhuǎn)入電阻測(cè)定室(具體內(nèi)容參見(jiàn)Gautam等，1998，英國(guó)藥物學(xué)雜志1251109-1114)。將分別充入2ml和400μl培養(yǎng)基的測(cè)定室(下部/內(nèi)腔(luminal)隔室)及膜插入物(上部/內(nèi)腔隔室)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。在37℃下用準(zhǔn)確置于每一隔室內(nèi)彼此相關(guān)聯(lián)并與單層細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的位置的電極測(cè)定穿過(guò)EC單層的電阻。通過(guò)扣除在接種內(nèi)皮細(xì)胞前測(cè)定的包被了生物基質(zhì)的相應(yīng)裸膜的電阻可獲得各EC單層的電阻。
在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，將Evans藍(lán)染料偶聯(lián)的清蛋白(EBA)用作EC單層的大分子通透性的標(biāo)記。在刺激EC前，將上部隔室內(nèi)的培養(yǎng)基換成含有EBA的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基含有混合了終濃度為0.67mg/ml的Evans藍(lán)染料的4％BSA)。按照分光光度法測(cè)定620nm處光吸收值來(lái)確定上部和下部隔室的液體樣品中的EBA濃度(Titertek Multiskan MCC；Flow Laboratories，Solna，Sweden)。按照下列關(guān)系式計(jì)算清蛋白的清除V1＝A2×V2×1/A1，其中V1是清除體積(即內(nèi)腔培養(yǎng)基因清蛋白擴(kuò)散至內(nèi)腔以外(abluminal)隔室中而清除了清蛋白之后的理論體積)，V2是內(nèi)腔以外體積，而A1和A2分別是內(nèi)腔培養(yǎng)基及內(nèi)腔以外培養(yǎng)基的吸收值。從應(yīng)答各自特異性刺激而獲得的清除體積中扣除無(wú)任何刺激時(shí)的基線清除體積(平均0.08±0.03μl/分鐘)。PMN的制備和定量人PMN如所述(Gautam等，1998，英國(guó)藥物學(xué)雜志1251109-1114)分離自富含白細(xì)胞的血漿，以2-5×107個(gè)細(xì)胞/ml的濃度將其重新懸浮于培養(yǎng)基中。PMN的純度＞98％，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色排除法測(cè)定的其存活率＞95％。PMN在加入到EC單層前，與抗細(xì)胞表面分子的單克隆抗體一起保溫30分鐘，所述單抗隨后與第二mAb交聯(lián)(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法)。
在某些實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)PMN在應(yīng)用前的溫度轉(zhuǎn)變可上調(diào)CD11b/CD18的細(xì)胞表面表達(dá)。在4℃和有抗CD18 mAb IB4存在的情況下將PMN保溫10分鐘、轉(zhuǎn)至37℃下10分鐘，然后回到4℃下再10分鐘，隨后洗滌兩次。按照相同方案但使用載體而非抗體制備不經(jīng)抗體處理的PMN。
PMN對(duì)EC的粘附和跨內(nèi)皮細(xì)胞的遷移通過(guò)檢測(cè)PMN特異性酶髓過(guò)氧化物酶(MPO)來(lái)進(jìn)行定量。簡(jiǎn)言之，使PMN在0.5％十六烷基三甲基溴化銨中裂解并離心，用分光光度法將上清液中的酶活性測(cè)定為MPO催化的H2O2-四甲基聯(lián)苯胺氧化還原反應(yīng)中發(fā)生的650nm處吸收值的改變(Suzuki等，1983，生物化學(xué)年鑒(Anal.Biochem.)132345-352)。粘附和遷移的PMN的MPO活性分別與加入到EC單層中的PMN總數(shù)的MPO活性相關(guān)。實(shí)驗(yàn)步驟在將膜插入物轉(zhuǎn)入電阻測(cè)定室(保持在37℃下)前，用補(bǔ)充了10mM Hepes的新鮮培養(yǎng)基(37℃)取代插入物和室內(nèi)的培養(yǎng)基。在某些實(shí)驗(yàn)中，將EC單層在刺激前與10μg/ml除莠霉素A于37℃一起保溫15分鐘并洗滌兩次。將含有或不含與細(xì)胞表面分子結(jié)合的單克隆抗體的PMN(2×106)加入到上部隔室內(nèi)(PMN∶EC之比＝10∶1)并使之在EC單層上沉淀10分鐘。用加入到下部隔室的fMLP(10-7M)或通過(guò)第二抗體，即山羊抗小鼠IgG F(ab’)2片段與細(xì)胞表面分子的抗體交聯(lián)來(lái)誘導(dǎo)PMN的活化。在刺激開(kāi)始前和刺激開(kāi)始后的每分鐘測(cè)定跨內(nèi)皮電阻，直到達(dá)到電阻變化的平臺(tái)期，然后每間隔5分鐘測(cè)定一次。在研究跨過(guò)EC單層的清蛋白通透性和PMN遷移的實(shí)驗(yàn)中，插入物中的培養(yǎng)基含有EBA。攻擊后，每隔5-10分鐘將膜插入物轉(zhuǎn)入含有新鮮培養(yǎng)基的新孔中。所有保溫均在37℃下進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在4℃下以425g將下部的孔離心20分鐘并分析上清液中的EBA含量。通過(guò)分析孔中剩余沉淀的MPO活性來(lái)對(duì)已經(jīng)遷移過(guò)單層的PMN進(jìn)行定量。抽吸膜插入物中的培養(yǎng)基以便對(duì)未粘附的PMN進(jìn)行定量，從插入物中取出含有EC的膜以便對(duì)粘附的PMN級(jí)分進(jìn)行定量。
在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，在37℃下，將用抗CD18 mAb IB4(6μg/2×106個(gè)細(xì)胞)預(yù)處理30分鐘的純化型PMN用含或不含山羊抗小鼠F(ab’)2的培養(yǎng)基培養(yǎng)10分鐘。通過(guò)在室溫下以300×g離心15分鐘使PMN沉淀，潷析含有PMN分泌產(chǎn)物的不含細(xì)胞的上清液以便用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)下文)或與EC單層一起使用。在后一種設(shè)定中，將膜/EC插入物中的培養(yǎng)基換成含有PMN分泌物的培養(yǎng)基，如上所述記錄對(duì)TEER和清蛋白通透性的影響。在某些情況中，含有PMN分泌物的培養(yǎng)基在應(yīng)用前進(jìn)行加熱培養(yǎng)(80℃、15分鐘)。EC胞內(nèi)[Ca2+]和f-肌動(dòng)蛋白形成的測(cè)定用Ca2+敏感性熒光探針fluo-3/AM(Molecular Probes Europe BV，Leiden，荷蘭)測(cè)定EC胞內(nèi)游離Ca2+的改變。在37℃下用加入到頂部和基底外側(cè)部表面的fluo-3/AM(含有2％FCS和10mM HEPES的HBSS溶液3μM)將膜上鋪滿的BAEC單層培養(yǎng)30分鐘。將所述單層洗滌3次并用新鮮HBSS室溫避光培養(yǎng)20分鐘以使染料酯完全水解。將抗CD18或抗-L-選擇蛋白處理的PMN加入到EC中，如上所述用第二抗體mAb誘導(dǎo)受體交聯(lián)。在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，用含有PMN分泌物的培養(yǎng)基(見(jiàn)上文)在無(wú)PMN時(shí)刺激EC。用激光掃描共焦成象系統(tǒng)(Insight Plus；Meridian Instruments Inc.，Okemon，Michigan)連續(xù)記錄熒光強(qiáng)度，從而測(cè)定應(yīng)答這些刺激時(shí)EC[Ca2+]的改變。
為了分析EC中應(yīng)答PMN活化所致的f-肌動(dòng)蛋白形成，將在生物基質(zhì)包被的蓋玻片上長(zhǎng)滿的EC單層與進(jìn)行了CD18抗體交聯(lián)的PMN或與等同于上述方法的含PMN分泌物的培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)15分鐘。用IB4-處理的PMN所培養(yǎng)的EC作對(duì)照。在室溫下將所述單層在3.7％甲醛的PBS溶液中固定10分鐘、洗滌兩次，用0.2％ Triton X-100的PBS溶液滲透(4℃下1分鐘)。將細(xì)胞洗滌兩次，37℃下用FITC-偶聯(lián)型鬼筆環(huán)肽對(duì)肌動(dòng)蛋白纖絲染色20分鐘。再進(jìn)行3次洗滌后，用激光掃描共焦成象系統(tǒng)(Insight Plus；MeridianInstruments Inc.，Okemon，Michigan)觀測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為了研究PMN分泌產(chǎn)物對(duì)體內(nèi)微血管通透性的作用，對(duì)倉(cāng)鼠頰囊微循環(huán)進(jìn)行活體顯微鏡檢。如文獻(xiàn)詳述(Raud & Lindbom，1994，微循環(huán)免疫學(xué)(Immunology of the Microcirculation)，Academic Press，1994，第7章)，使已麻醉的敘利亞(Syrian)金黃倉(cāng)鼠的左頰囊外翻，以備在用保持生理溫度、pH和氣壓的碳酸氫鹽緩沖液連續(xù)過(guò)量灌注的情況下進(jìn)行顯微鏡觀察。靜脈注射(250mg/kg體重)FITC-偶聯(lián)型葡聚糖(分子量150000)作為血漿示蹤物以觀察對(duì)大分子的血管通透性改變。使用Leitz Orthoplan顯微鏡在低放大倍數(shù)的熒光下觀察暴露的頰囊中的微脈管系統(tǒng)并將其記錄在圖像(Video)中。通過(guò)監(jiān)控記錄，停止過(guò)量灌注并將37℃下含有CD18交聯(lián)誘發(fā)的PMN分泌的1ml培養(yǎng)基局部施用在所述頰囊上。在平行實(shí)驗(yàn)中，使用不進(jìn)行交聯(lián)但抗CD18處理的PMN培養(yǎng)基。結(jié)果將用抗CD18 mAb(IB4)預(yù)處理的PMN(2×106)加入到EC/膜插入物(EC的內(nèi)腔側(cè)/電阻室上部隔室)中，靜置10分鐘。與第二抗體山羊抗小鼠F(ab)2交聯(lián)的CD18引發(fā)TEER的顯著降低，其在1分鐘內(nèi)顯現(xiàn)，在15分鐘后到其最大值(對(duì)照值為36±13)且在整個(gè)觀察期內(nèi)保持這一水平(圖1)。單獨(dú)用IB4處理PMN或在沒(méi)有IB4存在的情況下用第二抗體mAb處理PMN均沒(méi)有使TEER發(fā)生任何改變。
在另外的實(shí)驗(yàn)中研究在導(dǎo)致跨EC單層之大分子通量和PMN遷移的增加中CD18交聯(lián)的量。將用飽和濃度的IB4預(yù)處理的PMN加入到EC/膜插入物中并使之在含有EBA的培養(yǎng)基中靜置10分鐘。以類(lèi)似方式用山羊抗小鼠F(ab)2誘導(dǎo)CD18交聯(lián)，按有規(guī)律的間隔將含有PMN/EBA的膜插入物轉(zhuǎn)移至含有新鮮培養(yǎng)基的新孔中。在沒(méi)有第二抗體存在的情況下，存在微小而連續(xù)的清蛋白清除，0.08±0.03μl.分鐘-1(平均值±SD，n＝13)，它不會(huì)隨時(shí)間發(fā)生改變且實(shí)際上與在含有未處理的PMN的膜插入物中發(fā)現(xiàn)的自發(fā)性清除率相當(dāng)。相反，CD18交聯(lián)所激發(fā)的PMN活化引起清蛋白清除率增加，它隨時(shí)間逐步增加(圖1)。清蛋白清除量的凈增從第一個(gè)5分鐘期間的0.5±0.1μl提高至60分鐘后的20.0±4.5μl(平均值±SD，n＝10)的總量。不同于增加的清蛋白清除量，CD18交聯(lián)沒(méi)有產(chǎn)生可測(cè)定的PMN對(duì)EC的粘附或跨內(nèi)皮細(xì)胞的遷移(圖1)。對(duì)CD18交聯(lián)后60分鐘時(shí)不同隔室內(nèi)的MPO活性的分析顯示，所加入的PMN 91±6％(平均值±SD，n＝9)回收在上部隔室內(nèi)的培養(yǎng)基中，而在EC/膜單元或下部隔室內(nèi)的培養(yǎng)基中沒(méi)有檢測(cè)到顯著的MPO活性。對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)洗滌的透明(transparent)膜的直接鏡檢證實(shí)不存在與EC單層粘附的PMN。
用Ca2+敏感性熒光團(tuán)fluo-3標(biāo)記單層內(nèi)皮細(xì)胞并通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡檢監(jiān)測(cè)受刺激誘發(fā)的EC[Ca2+]改變。向EC單層中加入抗CD18處理的PMN沒(méi)有導(dǎo)致EC[Ca2+]發(fā)生改變。然而，CD18與第二抗體mAb的交聯(lián)引起EC中胞質(zhì)游離[Ca2+]快速增加，這種增加在約100秒后到達(dá)最高點(diǎn)且然后緩慢下降。抗體以相同方式與L-選擇蛋白交聯(lián)不能誘導(dǎo)EC[Ca2+]發(fā)生任何改變，而用fMLP刺激未處理的PMN后觀察到與由CD18交聯(lián)誘導(dǎo)的類(lèi)似的Ca2+-應(yīng)答(參見(jiàn)，Gautam等，1998，英國(guó)藥物學(xué)雜志1251109-1114)。胞內(nèi)Ca2+-活性改變與EC對(duì)PMN活化的功能性應(yīng)答之間的因果關(guān)系通過(guò)用鈣螯合劑BAPTA AM預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。這種處理完全抑制了EC細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的升高和應(yīng)答CD18交聯(lián)所導(dǎo)致的TEER改變。
在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，EC單層與PMN一起培養(yǎng)且然后用FITC-偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽對(duì)肌動(dòng)蛋白纖絲染色。共聚焦激光掃描顯微鏡檢顯示在沒(méi)有第二抗體存在的情況下用IB4-處理的PMN所培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞顯示極少的應(yīng)力纖維和沿該細(xì)胞與相鄰細(xì)胞直接接觸之邊緣的肌動(dòng)蛋白薄帶。另一方面，用進(jìn)行了CD18交聯(lián)的PMN培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞顯示出f-肌動(dòng)蛋白含量以及應(yīng)力纖維的數(shù)量和密度的顯著增加。
為了研究由PMN分泌的因子是否可以控制最終導(dǎo)致EC通透性增加的那些應(yīng)答，用山羊抗小鼠F(ab’)2將用抗CD18 mAb IB4預(yù)處理并經(jīng)洗滌已除去未結(jié)合抗體的PMN(2×106)保溫30分鐘且然后通過(guò)溫和離心使之沉降。向EC單層中添加不含細(xì)胞的上清液引起TEER下降和清蛋白清除的增加，兩者具有等同于加至EC的PMN中發(fā)生CD18交聯(lián)后的變化幅度和耗時(shí)。此外，所述上清液使EC[Ca2+]和f-肌動(dòng)蛋白含量與分布發(fā)生改變。此外，對(duì)倉(cāng)鼠頰囊的體內(nèi)制備物局部給予含有PMN分泌物的上清液引起血漿從后毛細(xì)血管和小靜脈中迅速滲漏。在施用后1.5分鐘內(nèi)即可觀察到滲漏點(diǎn)且在約5分鐘后顯示出最大的反應(yīng)。在用緩沖液洗滌組織后，滲漏緩慢減少。這種對(duì)微血管通透性的作用在加熱處理PMN-衍生的分泌物后消失，表明是一種熱敏感因子負(fù)責(zé)其通透性增加活性。對(duì)頰囊施用不進(jìn)行交聯(lián)但經(jīng)IB4-處理的PMN不會(huì)產(chǎn)生任何可觀察到的血漿滲漏。討論多形核白細(xì)胞在急性炎癥中粘附至內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)表面并回到血管外組織中關(guān)鍵依賴于β2整聯(lián)蛋白的功能。大分子的血管通透性的增加伴隨此細(xì)胞應(yīng)答而被誘導(dǎo)，導(dǎo)致血漿滲出和水腫形成。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)為活化型PMN內(nèi)經(jīng)由β2整聯(lián)蛋白的跨膜(外-內(nèi))信號(hào)傳輸與這些細(xì)胞誘導(dǎo)EC屏障功能障礙的能力之間的因果關(guān)系提供了證據(jù)。已證實(shí)抗體誘導(dǎo)的β2整聯(lián)蛋白的連接與聚集引起與在化學(xué)引誘物刺激PMN后觀察到的相似的EC通透性增加。這種細(xì)胞通訊在沒(méi)有PMN與EC的物理性結(jié)合的情況下發(fā)生，從而表明PMN粘附和結(jié)構(gòu)連接本身不會(huì)將信號(hào)直接轉(zhuǎn)入EC，由此介導(dǎo)通透性應(yīng)答。而是，β2整聯(lián)蛋白的配體結(jié)合通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)啟動(dòng)PMN的分泌和化學(xué)信使的釋放，這一過(guò)程能夠使EC通透性發(fā)生PMN-依賴性改變。此外，已證實(shí)通過(guò)該途徑誘導(dǎo)的血管通透性改變是EC的涉及細(xì)胞骨架重排和可逆性胞間隙形成的活性酪氨酸激酶依賴性應(yīng)答的結(jié)果，表明PMN-衍生因子在這一方面的非裂解性功能。
為了更具體地研究該過(guò)程中活化PMN可以將信號(hào)轉(zhuǎn)入EC的機(jī)理，通過(guò)CD11/CD18的抗體交聯(lián)來(lái)模擬PMN/EC相互作用和β2整聯(lián)蛋白的粘附依賴性接合(engagement)。通過(guò)β2整聯(lián)蛋白的抗體交聯(lián)、避免化學(xué)引誘物誘導(dǎo)的細(xì)胞活化，已經(jīng)證實(shí)β2整聯(lián)蛋白受體本身通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)傳輸而接合和聚集可引起EC通透性增加。由于這種應(yīng)答在不考慮PMN與EC粘附的情況下發(fā)生，所以PMN與EC之間的信號(hào)轉(zhuǎn)移并非歸因于CD11/CD18與EC表面上對(duì)應(yīng)受體之間的相互作用，而是必須通過(guò)釋放PMN-衍生的信使分子來(lái)完成。在PMN懸浮液中發(fā)生CD18交聯(lián)后獲得的不含細(xì)胞的上清液誘導(dǎo)EC超通透性的能力可進(jìn)一步支持所述理論。實(shí)施例2將中性粒細(xì)胞衍生的HBP(HBP)鑒定為中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的血管血漿滲漏中的信號(hào)連接物在實(shí)施例1中，經(jīng)由β-2整聯(lián)蛋白的PMN粘附是PMN誘導(dǎo)的對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性之影響的先決條件且Ca2+依賴性跨膜信號(hào)通過(guò)這種粘附激活β-2整聯(lián)蛋白誘導(dǎo)的可溶性因子的分泌，其直接引發(fā)EC屏障功能的改變。
正如本文實(shí)施例2中所述，將該可溶性因子確定為人HBP。實(shí)施例2還描述了HBP與接觸相系統(tǒng)的相互作用的特征。材料和方法試劑培養(yǎng)基-199、RPMI-1640(含有L-谷氨酰胺)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶-EDTA、磷酸緩沖鹽水(PBS)和Hanks平衡鹽溶液來(lái)自LifeTechnologies(Gaithersburg，MD，USA)。明膠、膠原酶、青霉素、鏈霉素、牛血清清蛋白(BSA)、Evans藍(lán)染料和FITC-偶聯(lián)型鬼筆環(huán)肽獲自SigmaChemical Co.(St.Louis.MO，USA)。Fluo-3/AM獲自Molecular Probes(Eugene，OR，USA)。生物基質(zhì)I來(lái)自Biomedical Technologies Inc.(Stoughton，MA，USA)。葡聚糖70(Macrodex)和Ficoll-Paque來(lái)自Pharmacia BiotechAB(Uppsala，Sweden)?；A(chǔ)培養(yǎng)基由M-199和RPMI-1640的1∶1混合物組成，其中RPMI-1640補(bǔ)充了20％的加熱失活的FBS、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)。針對(duì)β2-整聯(lián)蛋白中共有β-鏈(CD18)的單克隆抗體IB4由Roekefeller大學(xué)的Samuel D.Claes博士贈(zèng)送給的Pharmacia &Upjohn(Uppsala，Sweden)的Claes Lundberg博士提供。山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2獲自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.(West Grove，PA)。
按照下列步驟制備多克隆HBP抗體。給新西蘭白家兔皮下注射50μg用弗氏完全佐劑(FCA)乳化的人肝素結(jié)合蛋白(HBP)，隨后加強(qiáng)注射3次50μg用弗氏不完全佐劑(FIA)乳化的人HBP、每隔兩周一次。在最后一次注射后10天，對(duì)動(dòng)物取血并分離血清。
按照下列步驟制備單克隆HBP抗體。通過(guò)皮下注射20μg純化的人HBP的FCA溶液、隨后注射兩次20μg的人HBP的FIA溶液使RBF小鼠來(lái)免疫。給高反應(yīng)者小鼠通過(guò)靜脈內(nèi)加強(qiáng)注射20μg的HBP并在3天后采集脾。使脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Fox細(xì)胞系融合。在HBP特異性ELISA中篩選產(chǎn)生抗HBP抗體的上清液。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)FACS方法篩選與巨噬細(xì)胞胞內(nèi)部分結(jié)合的陽(yáng)性細(xì)胞系?？寺￡?yáng)性細(xì)胞系并在上述兩種試驗(yàn)中再次測(cè)試。通過(guò)蛋白A親和層析來(lái)純化單克隆抗體。內(nèi)皮細(xì)胞如Jaffe等在1973臨床研究雜志522745-2756中所述從新鮮臍帶中分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，用Booyse等在1975，血栓素質(zhì)性出血(Thromb.Diath.Haemmorrh.)24825-839中所述方法略加改良來(lái)分離牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用0.25％膠原酶溶液將臍靜脈或牛主動(dòng)脈的內(nèi)腔培養(yǎng)10分鐘，用PBS洗去未脫壁的內(nèi)皮細(xì)胞。使采集的細(xì)胞沉淀并重新懸浮于培養(yǎng)基中、接種在組織培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)并在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。每隔48小時(shí)換一次培養(yǎng)基，直到培養(yǎng)物長(zhǎng)滿為止(3-5天)。將第一至第五代中的HUVEC或BAEC用于本實(shí)驗(yàn)。EC的鑒定和純度測(cè)定基于圓石形態(tài)和因子VIII/vWf抗原的鑒定(Booyse等，1975，血栓素質(zhì)性出血24825-839)。細(xì)胞中的因子VIII/vWf染色均勻。在通透膜上的接種通過(guò)短暫(2分鐘)的胰蛋白酶-EDTA處理(0.25％胰蛋白酶/0.01％ EDTA)使培養(yǎng)的EC脫壁，將其重新鋪在0.2μm孔徑的Anopore無(wú)機(jī)膜或3.0μm孔徑的聚碳酸酯膜(Tissue Calture inserts，10mm；NUNC，Roskilde，丹麥)上。為了促進(jìn)細(xì)胞分化并促進(jìn)EC的粘附，將膜用50μl生物基質(zhì)I(167μg/ml)處理并使之風(fēng)干。以2×105個(gè)細(xì)胞/膜的密度接種EC并在37℃和含5％CO2的潮濕空氣中于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。EC長(zhǎng)成鋪滿的單層細(xì)胞，如每日顯微鏡觀察并測(cè)定跨單層的電阻所估計(jì)的?？鐑?nèi)皮電阻(TEER)的測(cè)定為了測(cè)定跨EC單層的電阻，將膜插入物轉(zhuǎn)入電阻測(cè)定室(ENDOHM-12；World Precision Instruments，Sarasota，F(xiàn)L，USA)，該電阻測(cè)定室已被改變以便確保在重復(fù)測(cè)量期間將電極準(zhǔn)確置于彼此相關(guān)并與膜插入物相關(guān)的位置。該室(下部隔室)和膜插入物(上部隔室)分別充有2ml和400μl培養(yǎng)基。在37℃下使用置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中的儀器進(jìn)行全部測(cè)定。使用與電阻室中電極連接的歐姆計(jì)(EVOM；World Precision Instruments，Sarasota，F(xiàn)L，USA)直接讀取電阻。通過(guò)扣除在接種內(nèi)皮細(xì)胞前測(cè)定的包被了生物基質(zhì)的相應(yīng)裸膜的電阻可獲得各EC單層的電阻。清蛋白清除的測(cè)定將Evans藍(lán)染料偶聯(lián)型清蛋白(EBA)用作EC單層的大分子通透性標(biāo)記。將終濃度為0.67mg/ml的該染料與含有4％ BSA的培養(yǎng)基混合。在分析清蛋白通透性的實(shí)驗(yàn)中，將上部隔室內(nèi)的培養(yǎng)基換成含有EBA的培養(yǎng)基。通過(guò)按照分光光度法測(cè)定620nm處的吸收值來(lái)確定上部和下部隔室的液體樣品中的EBA濃度(Titertek Multiskan·MCC；Flow Laboratories，Solna，Sweden)。按照下列關(guān)系式計(jì)算清蛋白的清除V1＝A2×V2×1/A1，其中V1是清除體積(即上部培養(yǎng)基因白蛋白擴(kuò)散至基底外側(cè)隔室而具有的理論體積)，V2是基底外側(cè)體積，而A1和A2分別是上部和基底外側(cè)培養(yǎng)基的吸收值。從應(yīng)答各自特異性刺激而獲得的清除體積中扣除在沒(méi)有任何刺激的情況下的基線清除體積0.08±0.01μl/分鐘。PMN的分離與活化使通過(guò)葡聚糖沉淀從人全血中獲得的白細(xì)胞豐富的血漿小心置于Ficoll-Paque上層并以400g離心30分鐘。將含有PMN的沉淀重新懸浮并用冰冷的PBS洗滌兩次(400g，7分鐘)。以2-5×106個(gè)細(xì)胞/ml的終濃度將PMN重新懸浮于培養(yǎng)基中。PMN的純度＞98％且通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)定的存活率＞95％。
如上所述誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表面上CD18分子的抗體交聯(lián)。簡(jiǎn)言之，用10μg/ml的抗CD18 mAb IB4的HBSS溶液將純化的PMN(5×106/ml)培養(yǎng)30分鐘。在培養(yǎng)期間，使溫度從4℃轉(zhuǎn)變到37℃以便增加CD11/CD18的表面表達(dá)。將所述細(xì)胞洗滌兩次，通過(guò)添加山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2片段(按1∶20稀釋)完成CD18的交聯(lián)。通過(guò)在室溫下以300g離心15分鐘使PMN沉淀，收集不含細(xì)胞的上清液。在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，在將用mAb IB4預(yù)培養(yǎng)的PMN加入到EC單層中后誘導(dǎo)CD18的抗體交聯(lián)(參見(jiàn)下文)。實(shí)驗(yàn)步驟在將膜插入物轉(zhuǎn)入電阻測(cè)定室(保持在37℃下)前，用補(bǔ)充了10mM Hepes的新鮮培養(yǎng)基(37℃)取代插入物和所述室內(nèi)的培養(yǎng)基。將HBP(25-100μg/ml)或PMN分泌產(chǎn)物加入到上部或下部隔室，每分鐘測(cè)定一次跨內(nèi)皮電阻，直到達(dá)到平臺(tái)期，然后每隔5分鐘測(cè)定一次。在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，將用mAbIB4(10μg/ml)預(yù)培養(yǎng)的PMN(2×106)加入到上部隔室中(PMN∶EC之比＝10∶1)并使之沉淀10分鐘。通過(guò)經(jīng)加入按1∶20稀釋的山羊抗小鼠IgG F(ab’)2使白細(xì)胞CD18進(jìn)行抗體交聯(lián)從而誘導(dǎo)PMN的活化。在研究跨EC單層的清蛋白通透性的實(shí)驗(yàn)中，插入物中的培養(yǎng)基含有EBA。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每隔5-10分鐘將膜插入物轉(zhuǎn)入含有新鮮培養(yǎng)基的新孔中。所有的培養(yǎng)均在37℃下進(jìn)行。在本實(shí)驗(yàn)后，抽吸下部孔中的培養(yǎng)基并分析EBA含量。EC胞內(nèi)Ca2+和F-肌動(dòng)蛋白分布的測(cè)定用Ca2+敏感性熒光探針fluo-3/AM測(cè)定EC細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的改變。在37℃下，用加入到上部和基底外側(cè)表面的fluo-3/AM溶液(含有2％FCS和10μM HEPES的3μM HBSS溶液)將在生物基質(zhì)I包被的膜上長(zhǎng)滿的HUVEC或BAEC單層培養(yǎng)30分鐘。將該單層洗滌3次，在使染料酯完全水解成其鈣敏感性游離酸形式前，將其用新鮮的HBSS室溫避光培養(yǎng)20分鐘。用加入到上部表面的HBP刺激EC。通過(guò)使用激光掃描共焦成象系統(tǒng)(Insight Plus；Meridian Instruments Inc.，Okemon，Michigan)連續(xù)記錄熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定應(yīng)答HBP刺激所致的EC[Ca2+]改變。
為了分析應(yīng)答PMN所致的EC中f-肌動(dòng)蛋白的分布，在37℃下用HBP或只用載體將在生物基質(zhì)包被的蓋玻片上長(zhǎng)滿的EC單層培養(yǎng)15分鐘。將所述單層用培養(yǎng)基洗滌兩次并在室溫下于3.7％甲醛的PBS溶液中固定。EC用0.2％ Triton X-100的PBS溶液滲透(4℃下1分鐘)、洗滌兩次并在37℃下用FITC-偶聯(lián)型鬼筆環(huán)肽對(duì)肌動(dòng)蛋白纖絲染色20分鐘。將內(nèi)皮細(xì)胞再用PBS洗滌3次并用激光掃描共焦成象系統(tǒng)觀測(cè)。蛋白質(zhì)印跡分析將純化的HBP或PMN分泌物的樣品加入到SDS樣品緩沖液中并煮沸5分鐘。將所述樣品加入到SDS聚丙烯酰胺梯度凝膠(3-10％)上進(jìn)行電泳。將蛋白質(zhì)電泳式轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)以便進(jìn)行免疫印跡分析。通過(guò)在牛奶中將硝酸纖維素膜保溫2小時(shí)來(lái)封閉其它結(jié)合位點(diǎn)。使用蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)檢測(cè)HBP。結(jié)果活化的PMN釋放HBP通過(guò)CD18的抗體交聯(lián)來(lái)活化混懸液中的PMN。將PMN離心，收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE。使用直接針對(duì)HBP的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析可在PMN分泌物中鑒別出27kD的一條明顯帶。使用家兔IgG對(duì)照沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異性帶。HBP增加EC單層的通透性向上部隔室加入HBP(75μl/ml)引起跨內(nèi)皮電阻顯著降低，其在1分鐘內(nèi)顯現(xiàn)，在15分鐘后達(dá)到其最大值(對(duì)照的30％±3％)，且在整個(gè)觀察期間均保持不變(圖2)。用HBP攻擊還導(dǎo)致EC大分子通透性的增加，其表現(xiàn)為清蛋白清除的進(jìn)行性增強(qiáng)，在60分鐘內(nèi)產(chǎn)生20.4±3.4μl的凈清除體積(圖2)。EC對(duì)HBP刺激的應(yīng)答顯然是劑量依賴性的，正如通過(guò)用25和50μg/ml HBP使穩(wěn)態(tài)TEER不明顯降低所例示(圖2)。然而，所述應(yīng)答中發(fā)生改變的速率就所有HBP劑量而言是相同的。
用來(lái)自單層細(xì)胞基底外側(cè)的HBP刺激EC(將HBP加入到下部隔室中)引起與上部刺激類(lèi)似的EC通透性改變，不過(guò)，這種情況是在稍高的濃度下發(fā)生。HBP的中和作用減弱PMN誘導(dǎo)的EC通透性的增加用抗HBP的家兔抗血清純化型IgG中和所述蛋白質(zhì)的活性。在用HBP(75μl/ml)刺激前，向EC單層中添加HBP抗體(50μl/ml)明顯減弱了TEER中被誘發(fā)的改變和對(duì)大分子的通透性。TEER改變的發(fā)生有一定的潛伏期，可達(dá)到對(duì)照的75％±5％(圖3)，顯著抑制HBP所誘導(dǎo)系的應(yīng)答至約65％。類(lèi)似地，清蛋白的流出量被抑制了約60％，在60分鐘內(nèi)凈清除體積達(dá)到8.64±1.74μl(圖3)。用非特異性家兔IgG(50μl/ml)處理對(duì)HBP誘導(dǎo)的TEER降低沒(méi)有影響，在15分鐘后達(dá)到對(duì)照的31％±5％。
測(cè)定HBP抗體是否也能抑制由活化PMN引發(fā)的EC屏障功能的改變。通過(guò)白細(xì)胞CD18的抗體交聯(lián)來(lái)活化懸浮液中的PMN并將它們離心。將含有PMN分泌產(chǎn)物的上清液(參見(jiàn)材料和方法章節(jié))轉(zhuǎn)至EC單層。在有抗HBP抗體時(shí)，TEER的降低和大分子通透性的增加與無(wú)抗HBP時(shí)對(duì)PMW分泌物刺激的應(yīng)答相比明顯受到抑制(圖4)。當(dāng)將PMN加至EC單層并因此使PMN分泌產(chǎn)物直接接觸EC單層后誘導(dǎo)CD18的抗體交聯(lián)時(shí)，獲得了幾乎相同的作用。HBP的刺激可增加EC細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+用激光掃描共焦顯微鏡術(shù)測(cè)定是否EC通過(guò)胞質(zhì)Ca2+增加來(lái)應(yīng)答HBP刺激。向載有Ca2+敏感性熒光團(tuán)fluo-3/AM的長(zhǎng)滿的HUVEC或BAEC單層中添加HBP(75μl/ml)可誘發(fā)熒光強(qiáng)度的快速增加，其在1分鐘內(nèi)達(dá)到最大值，然后逐步下降到基線水平。這種胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)移清楚地表明了EC對(duì)HBP刺激的活性應(yīng)答。HBP的刺激可誘導(dǎo)對(duì)EC微絲的識(shí)別用FITC-偶聯(lián)型鬼筆環(huán)肽對(duì)用HBP(75μl/ml)或僅用培養(yǎng)基培養(yǎng)15分鐘的已長(zhǎng)滿的EC單層染色肌動(dòng)蛋白微絲，用激光掃描共焦顯微鏡觀測(cè)。與顯示出低密度F-肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維和沿細(xì)胞邊緣顯著密集的外周帶的未處理之EC相比，在F-肌動(dòng)蛋白含量和HBP刺激型EC的分布方面存在明顯改變。跨越細(xì)胞的F-肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的密度增加和外周帶破裂表明HBP刺激導(dǎo)致EC細(xì)胞骨架的重排。HBP可增加體內(nèi)血管通透性給倉(cāng)鼠頰囊微脈管局部施用HBP(75μl/ml)，可在2分鐘內(nèi)產(chǎn)生后毛細(xì)血管和較大的小靜脈中熒光示蹤物的可視滲漏斑點(diǎn)。在攻擊后的7-10分鐘時(shí)觀察到了最大滲漏反應(yīng)。然后滲漏緩慢下降并在30分鐘內(nèi)完全消失。用針對(duì)緩激肽的單克隆抗體MBK3抑制緩激肽誘導(dǎo)型和HBP誘導(dǎo)型EC通透性增加在0時(shí)對(duì)已用抗緩激肽單抗MBK3(40μg/ml)預(yù)培養(yǎng)的EC單層細(xì)胞內(nèi)腔側(cè)給予緩激肽(100nM；圖5a)或HBP(75μg/ml；圖5b)(Haasemann等，1991，免疫學(xué)雜志1473882-3982)。MBK3完全阻止了由緩激肽或HBP誘導(dǎo)的EC通透性增加。通過(guò)對(duì)組胺誘導(dǎo)型通透性改變的抑制作用的缺乏證明mAb作用的特異性(在用緩激肽或HBP刺激后15分鐘時(shí)給予組胺)，N＝6。用針對(duì)血漿激肽釋放酶的單克隆抗體PKH4抑制HBP誘導(dǎo)型EC通透性增加在0時(shí)對(duì)已用mAb PKH4(40μg/ml)預(yù)培養(yǎng)的EC單層細(xì)胞內(nèi)腔側(cè)給予HBP(75μg/ml；實(shí)心符號(hào))或緩激肽(100nM；空心符號(hào))。結(jié)果如圖6示。PKH4阻止了由HBP誘導(dǎo)的EC通透性增加，但沒(méi)有阻止由緩激肽誘導(dǎo)的通透性改變。PKH4-處理不影響由組胺誘導(dǎo)的通透性改變(在用HBP刺激后15分鐘時(shí)給予組胺)，N＝6。通過(guò)肽HKH20處理來(lái)抑制HBP誘導(dǎo)型EC通透性增加用HKH20(3μg/ml)將EC單層培養(yǎng)30分鐘，這種處理可替換表面結(jié)合型H-激肽原。在洗滌后，在0時(shí)對(duì)EC細(xì)胞內(nèi)腔側(cè)給予HBP(75μg/ml)、15分鐘后給予緩激肽(100nM)。使HK通過(guò)結(jié)構(gòu)域5和6錨定EC表面，其中結(jié)構(gòu)域5最為重要。在結(jié)構(gòu)域5中對(duì)人HK與EC結(jié)合所必需的最小氨基酸序列由具有下列序列的20個(gè)氨基酸肽(HKH20)來(lái)代表HKHGHGHHKKNKGKKNGKH(SEQ ID NO7)(人H-激肽原479-498)。這種肽抑制HK與EC的結(jié)合(Hasan等，1995，生物化學(xué)雜志27019256-19261；和Herwald等，1996，生物化學(xué)雜志27113040-13047)。結(jié)果如圖7中所示。EC經(jīng)HKH20處理可阻止HBP誘導(dǎo)型EC通透性增加，但不能阻止由隨后給予緩激肽誘導(dǎo)的通透性改變，N＝6。通過(guò)肽SDD31處理來(lái)抑制HBP誘導(dǎo)型EC通透性增加用SDD31(3μg/ml)將EC單層培養(yǎng)30分鐘。SDD31也稱作HK31，它是一種來(lái)源于人H-激肽原(HK)結(jié)構(gòu)域6的肽，它阻斷HK與血漿激肽釋放酶和因子X(jué)II的結(jié)合(Tait等，1986，生物化學(xué)雜志26115396-15401；和Vogel等，1990，生物化學(xué)雜志26512494-12502)。它具有序列SDDDWIPDIQTDPNGLSFNPISDFPDTTSPK(SEQ ID NO8)(人H-激肽原565-595)。洗滌后，在0時(shí)對(duì)EC內(nèi)腔側(cè)給予HBP(75μg/ml)、15分鐘后給予緩激肽(100nM)。結(jié)果如圖8中所示。EC經(jīng)SDD31處理大大阻止了HBP誘導(dǎo)的EC通透性增加，EC對(duì)緩激肽直接刺激的應(yīng)答在SDD31處理后可以持續(xù)下去，N＝6。通過(guò)抑酶肽處理來(lái)抑制HBP誘導(dǎo)的EC通透性增加在0時(shí)對(duì)已用抑酶肽預(yù)培養(yǎng)(100μg/ml；30分鐘)的EC單層細(xì)胞內(nèi)腔側(cè)給予HBP(75μg/ml)。結(jié)果如圖9中所示。抑酶肽處理大大阻止了HBP誘導(dǎo)的EC通透性增加，但對(duì)隨后給予緩激肽(100nM)所誘導(dǎo)的通透性改變沒(méi)有阻止作用，N＝6。
HBP突變體(G175N)因突變而不能結(jié)合抑酶肽，但其三維結(jié)構(gòu)和特異性表面電荷分布沒(méi)有改變。當(dāng)在滲漏模型中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，這種突變體誘導(dǎo)緩激肽的釋放并增加EC通透性。然而，添加抑酶肽無(wú)抑制作用。使用豬HBP獲得了相似的結(jié)果，所述豬HBP與人HBP極為同源但因已退化的催化裂隙中R的存在而不能與抑酶肽結(jié)合。實(shí)施例3肝素結(jié)合蛋白的兩種突變體已經(jīng)生產(chǎn)了兩種人HBP突變體[R23S，F(xiàn)25E]HBP和[G175Q]HBP以便研究推定型類(lèi)脂A/LPS結(jié)合位點(diǎn)和BPTI(牛胰腺胰蛋白酶抑制劑)結(jié)合位點(diǎn)上殘基的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。G175Q突變不改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)，但結(jié)合BPTI的能力已消除，且該突變體對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的細(xì)胞因子從人單核細(xì)胞中的釋放僅介導(dǎo)極為有限的刺激作用。類(lèi)脂A/LPS結(jié)合特性與天然HBP的結(jié)合特性相當(dāng)。R23S、F25E突變不會(huì)影響類(lèi)脂A/LPS和BPTI的結(jié)合或脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的細(xì)胞因子從人單核細(xì)胞中的釋放。材料和方法突變蛋白的構(gòu)建Pwo DNA聚合酶來(lái)自Boehringer Mannheim，BamH1和T4 DNA連接酶來(lái)自New England Biolabs，草地夜蛾(sf9)細(xì)胞和pVL1393轉(zhuǎn)移質(zhì)粒來(lái)自Invitrogen，TC100和SE900-II產(chǎn)于Novo Nordisk A/S，胎(Foetal)牛血清(FCS)來(lái)自GibcoBRL。所有其它化學(xué)品均屬于可獲得的最精細(xì)(finest)級(jí)。[R23S，F(xiàn)25E]HBP突變體使用PCR重疊延伸技術(shù)構(gòu)建[R23S，F(xiàn)25E]HBP突變體(Ho，S.N.Hunt，H.D.，Horton，R.M.，Pullen，J.K.和Pease，L.R.(1989)基因(Amst.)7751-59)。通過(guò)使用寡核苷酸1+2和3+6經(jīng)PCR制備兩種部分重疊的突變片段，使用寡核苷酸1+6連接所得片段(表1)。將天然人HBP cDNA用作PCR反應(yīng)的模板。所得的cDNA編碼19個(gè)氨基酸的原肽、222個(gè)氨基酸的成熟部分和3個(gè)氨基酸的C-末端延伸部分。將BamH1位點(diǎn)引入突變cDNA的每一側(cè)以備克隆。將突變的片段連入pVL1393轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(Invitrogen)。使用Qiagen中型制備(midiprep)試劑盒制備用于轉(zhuǎn)染的DNA。在純化后，對(duì)所述插入片段進(jìn)行測(cè)序。表1用于構(gòu)建[R23S，F(xiàn)25E]HBP和[G175Q]HBP突變體的寡核苷酸序號(hào) 序列1. 5’-CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGG-3’(SEQ ID NO9)2. 5’-GGCACCCCCGCACTCGTGGCTGCCTTGATTCTG-3’(SEQ ID NO10)3. 5’-CAGAATCAAGGCAGCCACGAGTGCGGGGGTGCC-3’(SEQ ID NO11)4. 5’-GAGGGGGGTGCCCTGGTCCCCATTGCA-3’(SEQ ID NO12)5. 5’-TGCAATGGGGACCAGGGCACCCCCCTC-3’(SEQ ID NO13)6. 5’-CCGGGGATCCAACTAGGCTGGCCCCGGTCCCGG-3’(SEQ ID NO14)[G175Q]HBP突變體一般如上所述構(gòu)建該構(gòu)建體。通過(guò)使用寡核苷酸1+4和5+6經(jīng)PCR制備兩種部分重疊的突變片段，使用寡核苷酸1+6連接所得的片段(表1)。表達(dá)和純化將sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞維持在補(bǔ)充了10％FCS的TC100培養(yǎng)基中。在感染前，將該培養(yǎng)基換成不含血清的SF900-II。如文獻(xiàn)中對(duì)天然人HBP所述在不含血清的培養(yǎng)基中表達(dá)兩種突變體，并從培養(yǎng)物上清液中純化突變體(Rasmussen，P.B.，Bjφrn，S.，Hastrup，S.，Nielsen，P.F.，Norris，K.，Thim，L.，Wiberg，F(xiàn).C.，和Flodgaard，H.(1996)，F(xiàn)EBS通訊390109-112)。測(cè)定LPS誘導(dǎo)的IL-6從單核細(xì)胞中的釋放分離人單核細(xì)胞并如所述處理(Rasmussen，P.B.，Bjφrn，S.，Hastrup，S.，Nielsen，P.F.，Norris，K.，Thim，L.，Wiberg，F(xiàn).C.，和Flodgaard，H.(1996)，F(xiàn)EBS通訊390109-112)，但不包括從培養(yǎng)基中除去1％的非必需氨基酸。測(cè)定3H-LPS與HBP的結(jié)合通過(guò)如(Linde，V.，Bjφrn，S.，Kastrup，J.S.，和Flodgaard，H.，2000，生物技術(shù)(Biotechniques)28；218-222)所述的閃爍近似性分析技術(shù)測(cè)定對(duì)脂多糖(3H-LPS)的親和力。將全部樣品重復(fù)進(jìn)行測(cè)試、一式三份。對(duì)3I-BPTI與HBP結(jié)合的測(cè)定使用基本上如對(duì)LPS分析所述的SPA試驗(yàn)評(píng)價(jià)對(duì)BPTI的親和力(Linde，V.，Bjφrn，S.，Kastrup，J.S.，和Flodgaard，H.，2000，生物技術(shù)28；218-222)但試驗(yàn)方法略有改動(dòng)。將3H-LPS交換成3I-BPTI(由Novo Nordisk A/S制備)并將緩沖液改變成包括0.05％ BSA和0.05％ Triton X-100的PBS(20mM磷酸鹽pH 7.4和150mM NaCl)。通過(guò)用固定的濃度增加的未標(biāo)記BPTI進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性研究來(lái)測(cè)定HBP和突變體的相對(duì)親和力。結(jié)果生物學(xué)鑒定比較兩種突變體與天然HBP的生物活性中，以劑量依賴性方式促進(jìn)體外LPS-誘導(dǎo)的ll-6從人單核細(xì)胞中釋放的能力。用閃爍近似性試驗(yàn)(SPA)測(cè)定兩種突變體和HBP的LPS親和力(Linde，V.，Bjφrn，S.，Kastrup，J.S.，和Flodgaard，H.，2000，生物技術(shù)28；218-222)。兩種突變體以飽和方式結(jié)合3H-LPS，它們的表觀Kd(約0.7g/mL)與天然HBP中所見(jiàn)相似(圖11a)。此外，按照相似的閃爍近似性試驗(yàn)測(cè)定兩種突變體和天然HBP對(duì)BPTI的親和力，其中將3I-BPTI用作HBP的配體。[R23S，F(xiàn)25E]HBP突變體和[G175Q]HBP結(jié)合BPTI，而[G175Q]HBP突變體未見(jiàn)結(jié)合(圖11b)。通過(guò)添加固定的濃度增加的未標(biāo)記BPTI所進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性研究表明3I-BPTI以約7nM的相似表觀IC50值結(jié)合HBP和[R23S，F(xiàn)25E]HBP。如圖11c所示，[R23S，F(xiàn)25E]HBP顯然具有比HBP更大的結(jié)合能力。這種差異可能是由于[R23S，F(xiàn)25E]HBP結(jié)合所用不同形式的碘化BPTI的能力所造成的。然而，較大的結(jié)合能力沒(méi)有影響3I-BPTI的親和力。此外，已經(jīng)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)研究了3H-LPS置換結(jié)合天然HBP的3I-BPTI及反向置換的能力通過(guò)添加多達(dá)5μg/mL的未標(biāo)記LPS來(lái)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)3I-BPTI的結(jié)合。通過(guò)添加多達(dá)50mM的未標(biāo)記BPTI來(lái)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)3H-LPS的結(jié)合。在兩種情況中均沒(méi)有觀察到抑制作用，這表明LPS和BPTI結(jié)合位點(diǎn)定位在HBP分子的不同部分上。
體外生物活性試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)與[R23S，F(xiàn)25E]HBP和天然HBP相反，[G175Q]HBP對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的細(xì)胞因子從人單核細(xì)胞中的釋放僅介導(dǎo)極有限的刺激作用(圖10)。
本文所述和要求保護(hù)的本發(fā)明并不局限于本文所公開(kāi)的特殊實(shí)施方案的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方案用來(lái)解釋本發(fā)明的幾個(gè)方面。任何相同的實(shí)施方案均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)際上，可以根據(jù)上述描述對(duì)包括本文表明和描述的實(shí)施方案在內(nèi)的本發(fā)明作各種修改，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。這類(lèi)修改也屬于所附權(quán)利要求的范圍。
本文引入了各種參考文獻(xiàn)，將其全部公開(kāi)內(nèi)容引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防或治療由哺乳動(dòng)物中緩激肽釋放導(dǎo)致的疾病的方法，其中所述哺乳動(dòng)物產(chǎn)生與HBP拮抗劑結(jié)合的HBP，所述方法包括對(duì)有相應(yīng)需要的所述哺乳動(dòng)物給予有效減少所述哺乳動(dòng)物中緩激肽釋放的用量的哺乳動(dòng)物HBP拮抗劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中所述HBP拮抗劑的用量為約10mg-約1g/單位劑型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中所述HBP拮抗劑的用量為約0.1-100mg/kg體重。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中所述HBP拮抗劑的用量為約0.5-50mg/kg體重。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中所述HBP拮抗劑的用量為約1-25mg/kg體重。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中所述疾病選自系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合征、局部缺血再灌注、過(guò)敏反應(yīng)和同種異體移植物排斥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中所述疾病是成人呼吸窘迫綜合征。
8.哺乳動(dòng)物HBP拮抗劑在制備用于預(yù)防或治療由哺乳動(dòng)物中緩激肽釋放導(dǎo)致的疾病的藥劑中的用途，其中所述哺乳動(dòng)物產(chǎn)生能與HBP拮抗劑結(jié)合的HBP。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述用途，其中所述HBP拮抗劑的用量為約10mg-約1g/單位劑型。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述用途，其中所述HBP拮抗劑的用量為約0.1-100mg/kg體重。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述用途，其中所述HBP拮抗劑的用量為約0.5-50mg/kg體重。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述用途，其中所述HBP拮抗劑的用量為約1-25mg/kg體重。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述用途，其中所述疾病選自系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合征、局部缺血再灌注、過(guò)敏反應(yīng)和同種異體移植物排斥。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述用途，其中所述疾病是成人呼吸窘迫綜合征。
15.一種用于治療或預(yù)防由哺乳動(dòng)物中緩激肽釋放導(dǎo)致的疾病的方法，其中所述哺乳動(dòng)物產(chǎn)生與抑酶肽或其類(lèi)似物結(jié)合的HBP，所述方法包括對(duì)有相應(yīng)需要的所述哺乳動(dòng)物給予有效減少所述哺乳動(dòng)物中緩激肽釋放的用量的抑酶肽或其類(lèi)似物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述方法，其中所述抑酶肽類(lèi)似物是在15-19位上含有至少一個(gè)突變的抑酶肽變體。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述方法，其中所述疾病選自系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合征、局部缺血再灌注、過(guò)敏反應(yīng)和同種異體移植物排斥。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述方法，其中所述疾病是成人呼吸窘迫綜合征。
19.抑酶肽或其類(lèi)似物在制備用于減少哺乳動(dòng)物中緩激肽釋放的藥劑中的用途，其中所述哺乳動(dòng)物產(chǎn)生能與抑酶肽或其類(lèi)似物結(jié)合的HBP。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述用途，其中所述抑酶肽類(lèi)似物是在15-19位上含有至少一個(gè)突變的抑酶肽變體。
21.抑酶肽或其類(lèi)似物在制備用于治療帶有能與抑酶肽或其類(lèi)似物結(jié)合的HBP的患者體內(nèi)的系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合征、局部缺血再灌注、過(guò)敏反應(yīng)和同種異體移植物排斥的藥劑中的用途。
22.抑酶肽或其類(lèi)似物在制備用于治療帶有能與抑酶肽或其類(lèi)似物結(jié)合的HBP的患者體內(nèi)的成人呼吸窘迫綜合征的藥劑中的用途。
23.一種用于預(yù)防或治療由哺乳動(dòng)物中緩激肽釋放導(dǎo)致的疾病的方法，其中所述哺乳動(dòng)物能產(chǎn)生與結(jié)合至少一種HBP表位的單克隆抗體結(jié)合的HBP，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放，所述方法包括對(duì)有相應(yīng)需要的所述哺乳動(dòng)物給予能結(jié)合至少一種HBP表位的單克隆抗體，其中所述表位以有效減少所述哺乳動(dòng)物中緩激肽釋放的量與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類(lèi)患者且所述HBP是人HBP。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述方法，其中所述單克隆抗體是人單克隆抗體。
26.結(jié)合至少一種HBP表位的單克隆抗體在制備用于預(yù)防或治療由哺乳動(dòng)物中緩激肽釋放導(dǎo)致的疾病的藥劑中的用途，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽；其中所述哺乳動(dòng)物產(chǎn)生能與結(jié)合至少一種HBP表位的所述單克隆抗體結(jié)合的HBP，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述用途，其中所述哺乳動(dòng)物是人類(lèi)患者且所述HBP是人HBP。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述用途，其中所述單克隆抗體是人單克隆抗體。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述用途，其用于制備可有效治療系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合征、局部缺血再灌注、過(guò)敏反應(yīng)和同種異體移植物排斥的藥劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述用途，其用于制備可有效治療成人呼吸窘迫綜合征的藥劑。
31.一種鑒定HBP拮抗劑的方法，所述方法包括下列步驟(a)在有HBP存在以及有和沒(méi)有疑為所述拮抗劑的物質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞；和(b)檢測(cè)所述物質(zhì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的任何影響；其中所述內(nèi)皮細(xì)胞的通透性與當(dāng)在有HBP而沒(méi)有所述物質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)時(shí)所述細(xì)胞的通透性相比降低，則表明所述物質(zhì)是一種拮抗劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述方法，其中在步驟(a)中，內(nèi)皮細(xì)胞首先在有HBP存在的情況下培養(yǎng)并測(cè)定所述細(xì)胞的通透性，然后在有所述物質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述方法，其中在步驟(a)中，首先在有所述物質(zhì)的情況下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，然后在有所述HBP存在的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述方法，其中在有HBP的情況下培養(yǎng)一種內(nèi)皮細(xì)胞樣品，然后在有HBP和所述物質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)第二種樣品。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述方法，其中所述哺乳動(dòng)物HBP是人HBP。
36.一種用于鑒定HBP拮抗劑的方法，該方法包括下列步驟(a)使HBP與那些能與HBP發(fā)生相互作用的第一種物質(zhì)和疑為HBP拮抗劑的第二種物質(zhì)一起培養(yǎng)；和(b)檢測(cè)疑為拮抗劑的所述第二種物質(zhì)對(duì)HBP與所述第一種物質(zhì)相互作用的任何影響；其中所述HBP與所述第一種物質(zhì)之間相互作用的減弱指示所述第二種物質(zhì)是HBP拮抗劑。
37.一種鑒定與天然HBP上至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體的方法，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放；所述方法包括下列步驟(a)在有HBP存在以及有和沒(méi)有疑為所述拮抗劑的物質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞；和(b)檢測(cè)所述物質(zhì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的任何影響；其中所述內(nèi)皮細(xì)胞的通透性與當(dāng)在有HBP而沒(méi)有所述物質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)時(shí)所述細(xì)胞的通透性相比降低，表明所述單克隆抗體與所述HBP上的至少一種表位結(jié)合。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述方法，其中所述天然HBP是人HBP。
39.一種鑒定與天然HBP上至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體的方法，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放；所述方法包括下列步驟(a)在有HBP存在以及有和沒(méi)有懷疑與所述HBP上至少一種表位結(jié)合的單克隆抗體存在的情況下保溫前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物；和(b)檢測(cè)所述抗體對(duì)緩激肽釋放的任何影響；緩激肽釋放的減少表明所述抗體與所述HBP上的至少一種表位結(jié)合。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述方法，其中所述前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物與固體支持物結(jié)合。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述方法，進(jìn)一步包括在有內(nèi)皮細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)步驟(a)中的混合物。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述方法，進(jìn)一步包括在有血小板存在的情況下培養(yǎng)步驟(a)中的混合物。
43.權(quán)利要求39所述方法，其中所述天然HBP是天然人HBP。
44.根據(jù)權(quán)利要求39所述方法，其中緩激肽的釋放使用一種免疫測(cè)定法來(lái)檢測(cè)。
45.一種用于測(cè)定哺乳動(dòng)物是否產(chǎn)生與HBP拮抗劑結(jié)合的HBP的方法，該方法包括下列步驟(a)從患者體內(nèi)分離HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織；(b)使與HBP發(fā)生相互作用的物質(zhì)、組織、細(xì)胞或其成分和所述HBP拮抗劑與所述HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織一起保溫；和(c)檢測(cè)所述HBP拮抗劑對(duì)HBP與所述物質(zhì)、組織、細(xì)胞或其成分的相互作用的影響；相互作用減弱表明所述HBP與所述HBP拮抗劑結(jié)合。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述方法，其中所述HBP首先與所述拮抗劑一起保溫，然后與能與HBP發(fā)生相互作用的物質(zhì)、組織、細(xì)胞或其成分一起保溫。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述方法，其中所述HBP首先與能與HBP發(fā)生相互作用的物質(zhì)、組織、細(xì)胞或其成分一起保溫，然后與所述拮抗劑一起保溫。
48.一種試劑盒，它包括(a)HBP拮抗劑；(b)HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞；和(c)一種與HBP發(fā)生相互作用的物質(zhì)、組織、細(xì)胞或其成分。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述檢測(cè)試劑盒，其中所述HBP被標(biāo)記。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述檢測(cè)試劑盒，其中所述檢測(cè)試劑盒包括與HBP發(fā)生相互作用的一種物質(zhì)。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述檢測(cè)試劑盒，其中所述物質(zhì)是H-激肽原。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述檢測(cè)試劑盒，其中所述物質(zhì)被標(biāo)記。
53.根據(jù)權(quán)利要求50所述檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一步包括珠。
54.一種用于測(cè)定哺乳動(dòng)物是否產(chǎn)生與結(jié)合天然HBP上至少一種表位的單克隆抗體結(jié)合的HBP的方法，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放；該方法包括下列步驟(a)從所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織；(b)在有或沒(méi)有所述抗體存在的情況下使所述HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織與內(nèi)皮細(xì)胞一起培養(yǎng)；和(c)檢測(cè)所述抗體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的任何影響；通透性降低表明所述HBP與所述抗體結(jié)合。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類(lèi)患者。
56.根據(jù)權(quán)利要求54所述方法，其中所述天然HBP是天然的人HBP。
57.一種用于測(cè)定哺乳動(dòng)物是否產(chǎn)生與結(jié)合天然HBP上至少一種表位的單克隆抗體結(jié)合的HBP的方法，其中所述表位與前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物結(jié)合并激活緩激肽的釋放；該方法包括下列步驟(a)從所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織；(b)使所述HBP或產(chǎn)生HBP的細(xì)胞或組織與前激肽釋放酶-激肽原復(fù)合物一起培養(yǎng)；和(c)檢測(cè)所述HBP對(duì)緩激肽從前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物中釋放的任何影響；緩激肽釋放減少表明所述HBP與所述抗體結(jié)合。
58.一種檢測(cè)試劑盒，它包括(a)與HBP表位結(jié)合的單克隆抗體；(b)天然人HBP；和(c)與固體支持物結(jié)合的前激肽釋放酶-H-激肽原復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防由所述哺乳動(dòng)物,尤其可產(chǎn)生HBP的哺乳動(dòng)物體內(nèi)緩激肽釋放所致疾病的方法,其中該HBP可與HBP拮抗劑、例如結(jié)合至少一種人HBP表位的單克隆抗體結(jié)合,該方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物給予有效減少哺乳動(dòng)物體內(nèi)緩激肽釋放的用量的HBP拮抗劑。此外,本發(fā)明涉及用于測(cè)定哺乳動(dòng)物是否產(chǎn)生與HBP拮抗劑、例如結(jié)合至少一種人HBP表位的單克隆抗體結(jié)合的HBP的方法和試劑盒以及一種檢測(cè)HBP拮抗劑的方法。
文檔編號(hào)G01N33/566GK1349410SQ00806871
公開(kāi)日2002年5月15日 申請(qǐng)日期2000年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月29日
發(fā)明者漢斯·J·弗洛德加德, 倫納特·林德博姆, 索倫·比約恩 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司