專利名稱：測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體的檢測，具體涉及利用簡單方法檢測樣品中經(jīng)感染或接種等引發(fā)產(chǎn)生的新合成抗體，所述簡單方法涉及在檢測抗體存在之前裂解淋巴細胞。
長期以來一直用ELISA來檢測和測定抗體(或抗原)的水平。最常見的情況是，將ELISA用作血清學(xué)分析，但是它也可用于研究抗原或抗體的免疫化學(xué)特性，還經(jīng)常用于，例如，免疫反應(yīng)的評估及定性，另外還可在雜交瘤技術(shù)中用于通過細胞培養(yǎng)研究抗體的產(chǎn)生。
ELISA試驗使用簡單，敏感且相對快速，但是它僅僅能夠?qū)悠分邪锌贵w的存在進行簡單地測定；它無法將應(yīng)答抗原而即時合成的抗體與感染或被動轉(zhuǎn)移后業(yè)已存在的抗體區(qū)分開來。盡管在一些情況下，僅需獲得抗體存在與否的信息就足以，但是在其它情況下，例如在接種過程中，或者在嬰兒感染的診斷中，卻需要能夠測定在檢測時所檢測的靶抗體是否被淋巴細胞急速合成，從而將其與被動轉(zhuǎn)移的母源抗體區(qū)分開來。這在經(jīng)典ELISA方法中是無法實現(xiàn)的。
因而發(fā)展出了其它能夠檢測即時抗體合成的方法。值得一提的有酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)測定(也稱斑點ELISA或ELISA-噬斑測定)，綜述參見，例如，Czerkinsky等，ELISA及其它固相免疫測定，D.M.Kenneny和S.J.Challacombe編著，1988，第10章，217-239。該技術(shù)以ELISA方法為基礎(chǔ)，可對分泌抗一種或多種靶抗原之抗體的淋巴細胞計數(shù)。所述ELISPOT基本上是ELISA方法的一種變體，因而可以通過以下方法來獲得抗體分泌細胞(ASC)，即在用靶抗原包被過的經(jīng)專門改進的ELISA孔中培養(yǎng)淋巴細胞，用酶-底物復(fù)合物代替標(biāo)準(zhǔn)ELISA試劑，該酶-底物復(fù)合物可在分泌細胞近處生成顯色沉淀(斑點)。然后可通過斑點計數(shù)來測算出抗體分泌細胞的數(shù)目。可在培養(yǎng)基中加入蛋白質(zhì)合成的抑制劑，以確保所檢測到的斑點是由體外保溫期間的抗體從頭合成途徑生成的。
盡管ELISPOT技術(shù)在研究體液免疫應(yīng)答動力學(xué)中非常有用，并可用于檢測經(jīng)免疫受試者外周循環(huán)中瞬時出現(xiàn)的自發(fā)ASC，但該方法的某些特性限制了它在臨床診斷中的應(yīng)用。首先，由于每個樣品的斑點都須單個測量，耗時且費力，該方法尤其不適用于大量樣品的分析，例如臨床診斷試驗室中的操作。其次，只測定每個樣品中的抗體分泌細胞的數(shù)目，一般來說，這理論上講需要大量樣品，例如，幾毫升。另外ELISPOT測定板也很昂貴，而且該測定不易自動化。
WO 96/26443描述了一種改良的ELISA試驗，該試驗可用于檢測即時抗體合成。在該試驗中，分離淋巴細胞然后進行培養(yǎng)，測定該培養(yǎng)過程中生成的抗體水平。因此，為了能對保溫過程中分泌的抗體進行測定，該技術(shù)需要在約37℃下保溫待測樣品的淋巴細胞。平均保溫時間為2-5小時，這就極大地限制了該測定的操作速度。另外保溫還需要在測試位點提供適當(dāng)?shù)难b置，以便其能在測試步驟前立即完成。這通常意味著淋巴細胞的測試必須在樣品離體后很短的時間內(nèi)完成，不可以通過例如冷凍貯存樣品，因為這會導(dǎo)致細胞活力的下降。通過在0℃的冰上儲存或稍差一點在4℃保存純化后的細胞，也只能在相當(dāng)短的時間內(nèi)保持活力。
因此，可以看出，盡管抗體檢測技術(shù)有著諸多的優(yōu)點，但是仍需對測定技術(shù)進一步改良，以期達到簡單、快速、經(jīng)濟、高效，這樣才能確保自發(fā)分泌抗體的精確定量，這種改良后的測定技術(shù)可區(qū)分從頭合成的抗體，并可用于樣品，例如血樣的診斷。本發(fā)明滿足了這種需要。
上述技術(shù)中，培養(yǎng)時間的選擇要與下述考慮相符，即必須獲得足夠大的抗體滴度從而保證獲得能用于免疫診斷的測定結(jié)果。
文獻中已經(jīng)公開了下述內(nèi)容抗體(免疫球蛋白)的生物合成發(fā)生在B淋巴細胞(見Roitt I，Brostoff J，Male D.＂免疫學(xué)＂，第4版， Mosby出版，倫敦1996，6.12-6.13)，隨后它們被分泌入血流中抵抗感染。當(dāng)被抗體分泌細胞(ASC)分泌時，抗體分子完整裝配(以IgG分子為例，兩條重鏈與兩條輕鏈通過二硫鍵連接在一起)并糖基化。抗體生物合成的限速步驟為胞內(nèi)轉(zhuǎn)運以及經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體糖基化(約需1小時或1小時以上)，而免疫球蛋白的多條重鏈和輕鏈的生物合成僅需數(shù)分鐘即可完成?？傊铣杉胺置诓襟E約需2小時(Melchers，1971，組織化學(xué)雜志，3，p389-397)。由于免疫球蛋白快速分泌出細胞，因而以前從沒認(rèn)識到功能抗體，抑或部分合成抗體(例如，糖基化之前)能夠大量存在于淋巴細胞中。而且還未認(rèn)識到樣品中淋巴細胞的裂解能夠產(chǎn)生足量的“新合成抗體”從而使得免疫診斷得以進行。
但是，人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，淋巴細胞的細胞內(nèi)容物含有足量的抗體，使得當(dāng)在免疫應(yīng)答急性階段對樣品進行分析時，可以對受試者體內(nèi)快速合成的抗體進行檢測甚至定量。通常，這與抗體分泌細胞在外周血中出現(xiàn)的預(yù)期時間間隔大致相同。因而可以提供可用于診斷的有用信息。
有利之處在于，由于測定無需保溫淋巴細胞，這避免了在測定前對樣品，例如純化的淋巴細胞制品的長期保溫。
本發(fā)明所述測定試驗還提供了一種可信賴的測定方法，其中在準(zhǔn)備測定前可以先將樣品儲存起來，例如，冰箱保存(優(yōu)選保存在大約4℃或在0℃以下凍存)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道全血優(yōu)選冰箱保存(例如，如下文所述)而不可凍存以防細胞裂解。但是，在進行本發(fā)明的測定之前可以凍存或冰箱保存樣品，例如純化后的淋巴細胞，而不會干擾實驗結(jié)果。因此，可以在測定前長時間地保存樣品，甚至可以用會影響細胞活力的方法(例如，用與血清或血漿樣品存儲相類似的方法)保存樣品。因此，本發(fā)明所述測定方法在樣品收集、存儲及處理方面具有顯著的優(yōu)勢，具體而言就是可以明顯地延長野外獲得試樣測定前的保存時間從而滿足實驗測試需要。
因此，一方面，本發(fā)明提供了一種測定樣品中應(yīng)答免疫原而新合成抗體的存在或含量的方法，該方法包括獲得含有淋巴細胞的樣品；裂解所述淋巴細胞從而釋放與淋巴細胞相關(guān)的抗體或其部分；以及對釋放出的抗體或其部分進行檢測，從而測定出所述樣品中新合成抗體的存在或含量。
本文中使用的“新合成的抗體”一詞是指具有抗原活性的抗體(即能夠識別并結(jié)合與免疫原相對應(yīng)的抗原)，所述抗體作為即時免疫應(yīng)答的一部分，由淋巴細胞應(yīng)答體內(nèi)免疫原的存在而產(chǎn)生或在其中合成。因此，淋巴細胞合成所述抗體發(fā)生在體內(nèi)因免疫原呈遞所激發(fā)的免疫應(yīng)答過程中，即合成發(fā)生在含淋巴細胞樣品取離受試動物體的時候或之前。
本文中提及的與所述淋巴細胞相關(guān)的抗體或其部分是指新合成的抗體，或其部分，其具有抗原活性(即能夠識別并結(jié)合免疫原)，并且還未分泌出細胞。如上文所述，盡管分泌途徑的時程長短不一，但是通常對應(yīng)于前2小時產(chǎn)生的抗體(如果細胞保存條件合適，那么在細胞裂解之前，該過程將完全發(fā)生在體內(nèi)或至少部分在體外發(fā)生)。盡管抗體可以在細胞內(nèi)快速合成(例如，1-2分鐘，盡管分泌要更慢一些)，但是構(gòu)成抗體的游離鏈或未經(jīng)糖基化或僅部分糖基化的抗體或抗體鏈還是可以出現(xiàn)在淋巴細胞中，因此，只有裂解這些淋巴細胞，它們才能被釋放。如果前文所述的“部分”具有上文所述的抗原活性，那么它們也可被檢測到，或應(yīng)包括在對新合成抗體存在或含量的測定中。從淋巴細胞中釋放出的抗體或其部分包括新合成的抗體。這類新合成抗體水平的測定為測定應(yīng)答于某一特定免疫原而生成的活性抗體，即作為例如即時慢性或急性免疫應(yīng)答的一部分而產(chǎn)生的抗體的含量提供了相關(guān)信息。因此，本發(fā)明還提供了一種通過將新合成抗體水平與合適的對照樣品相比來檢測活性抗體存在或含量的方法。
所述的含有淋巴細胞的樣品可以取自在取樣前經(jīng)免疫原免疫過的任何動物，優(yōu)選哺乳動物，例如人。通常，用本發(fā)明所述方法檢測免疫應(yīng)答時，該應(yīng)答應(yīng)是由近來的感染或接種引發(fā)的，因而應(yīng)在暴露于免疫原后數(shù)周或數(shù)天內(nèi)取樣。從受試者體內(nèi)取樣的最佳時機取決于感染的特性或所接種疫苗的類型，而且進一步還由受試者的免疫應(yīng)答機制的效力來決定，也可應(yīng)個體而不同。但是，取樣的時機應(yīng)當(dāng)為受試者免疫系統(tǒng)的淋巴細胞處于應(yīng)答靶免疫原的急速抗體合成階段。因此，通常認(rèn)為為了從本發(fā)明所述測定中得到有意義結(jié)果，應(yīng)當(dāng)在受試者接種免疫原3周內(nèi)取樣，優(yōu)選在感染或接種后8-12天取樣，但是，某些情況下，在感染或接種1-5天內(nèi)，或更特別地為2-3天內(nèi)就有足量的抗體合成。
所述樣品可以是血樣或取自受試者淋巴系統(tǒng)的樣品。通常，任一種所述樣品可以是血樣或取自受試者淋巴系統(tǒng)的樣品。通常，任一種含有來自于受試者免疫系統(tǒng)的淋巴細胞的體液或組織樣品都是合適的。需要指出的是，雖然在臨床或?qū)嶒炛锌梢苑奖愕貜氖茉囌咧腥〉昧馨突蛲庵苎侨我环N淋巴或淋巴樣組織或任一種含有淋巴細胞的血液同樣都是合適的，包括取自淋巴結(jié)或淋巴腺的樣品或者取自扁桃體等淋巴小結(jié)的樣品。外科介入技術(shù)的發(fā)展使得可以從受試者中取得活檢材料，適當(dāng)時使用該技術(shù)還可以得到可用于本發(fā)明方法的樣品。在實施本發(fā)明的測定方法之前，依據(jù)淋巴細胞的來源確定是否需要對淋巴細胞進行分離和純化。但是，當(dāng)需要或希望進行時，可對淋巴細胞進行純化。因此，優(yōu)選地，測定中所用樣品為用本領(lǐng)域已知技術(shù)從上述一種來源中制備而來的淋巴細胞制品。
“裂解”淋巴細胞是指含有任何合成抗體的細胞內(nèi)容物從細胞膜和內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的限制中釋放出來，從而可以用任何便捷的生化或化學(xué)方法進行檢測。已知免疫球蛋白是在經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的途徑中合成和分泌的。因此，有必要強調(diào)，裂解必須從這些內(nèi)部結(jié)構(gòu)中釋放。因此，可以用已知的細胞裂解方法裂解淋巴細胞，所述方法應(yīng)能使膜區(qū)室中的內(nèi)容物釋放出來，例如通過細胞裂解，例如用物理裂解方法，例如反復(fù)凍融或者是使用細胞裂解緩沖液或溶液的化學(xué)方法。
本發(fā)明中所用的術(shù)語“檢測”及“測定存在或含量”包括抗體生成水平的定性和定量測定，意味著獲得樣品中抗體生成量的絕對值，還有抗體生成水平的指數(shù)、比率、百分比或類似指示，以及半定量或定性測定。術(shù)語“測定存在”還包括下述情況陰性結(jié)果表示不含合成抗體，是評定受試者免疫應(yīng)答的指標(biāo)。例如，陰性結(jié)果表示對靶免疫原缺乏免疫應(yīng)答，或者如果血清中存在針對靶免疫原的抗體的話，則表示慢性感染。
新合成抗體的檢測使得能夠測定此類特異于一種或多種免疫原的抗體水平，而并非能測定細胞中出現(xiàn)的所有抗體。
合成抗體的檢測可以采用任一種能夠鑒定可與引發(fā)免疫應(yīng)答的靶免疫原結(jié)合的抗體的方法。因此，任一種能生成可反映靶抗體存在與否的信號的檢測技術(shù)都可使用。例如，可使用酶聯(lián)測定，測定過程中由底物生成的可溶或不溶產(chǎn)物，其量可以測定。
通過固相結(jié)合測定方法，例如ELISA，可以方便地對所述合成抗體進行測定，其中抗體可與測定中所用抗原結(jié)合，盡管所用抗原不同于先前刺激免疫應(yīng)答所使用的免疫原。因此，盡管測定中所用抗原與先前刺激了或正在刺激體內(nèi)抗體生成的免疫原二者之間憑借相同或很相似的表位與待測抗體結(jié)合，但是在其它方面抗原和免疫原可以不同。因此，本發(fā)明方法中使用的抗原可以是含有相關(guān)免疫原(例如，取自感染個體)的全部或某些部分的物質(zhì)，或者來自相同或類似物質(zhì)的純化部分，類似地，可以用合成方法制備抗原，例如通過化學(xué)合成或重組表達，所述抗原與天然抗原相比，具有添加或缺失部分。因此，融合蛋白，或者只表達有適當(dāng)表位的分子都可使用。
本發(fā)明提供了已知抗體測定技術(shù)所不具備的一些優(yōu)點。首先，與檢測血清抗體水平的技術(shù)(例如血清ELISA)不同，本發(fā)明所述測定可以對指示現(xiàn)時感染/免疫刺激的抗體進行檢測，可以將新生兒體內(nèi)的母源和新生兒抗體區(qū)分開來。樣品中的淋巴細胞可以直接用于本發(fā)明所述的測定方法，而不必經(jīng)過任何其它形式的預(yù)處理或刺激，例如用抗原體外刺激。因而取樣時淋巴細胞內(nèi)合成的抗體可被檢測到。(使用該方法，即使使用少量樣品，也可將應(yīng)答靶免疫原產(chǎn)生的自發(fā)即時抗體合成與淋巴細胞的旁觀者活化區(qū)分開來)另外，所述測定也可以在下述淋巴細胞上實施所述細胞在自發(fā)產(chǎn)生和分泌，或正在開始分泌抗體的階段，未刺激細胞啟動任何記憶就已經(jīng)破裂。這不同于其它已知的方法，這些已知方法使用了體外抗原刺激，這些刺激增加了試驗的靈敏度，但是卻啟動了細胞記憶，因而這些已知的方法并非是檢測應(yīng)答即時感染或近期接種而急速生成或新合成的抗體的準(zhǔn)確或適當(dāng)?shù)募夹g(shù)。
另一方面，本發(fā)明采用了自發(fā)抗體分泌，使得可以利用受試抗原對指示即時感染的血液抗體進行檢測；在感染或接種等以后的前幾周內(nèi)，血漿淋巴細胞可以分泌抗受試抗原的抗體。用本發(fā)明所述方法檢測這類抗體可以對感染進行診斷或測定，或者能監(jiān)測對接種的抗體應(yīng)答等等。
因此，本發(fā)明另一方面提供了一種診斷或監(jiān)測免疫原對人或者非人動物或所述動物的感染的方法，該方法使用本發(fā)明所述的方法，參照合適對照和/或參照樣品用測定免疫原感染的存在或程度。
本發(fā)明所述方法特別適用于嬰兒和新生兒，重要之處在于該方法可以將新合成抗體與被動轉(zhuǎn)移的母源抗體區(qū)分開來?？梢杂枚喾N相關(guān)抗原通過同一個試驗或多個單獨試驗對含有淋巴細胞的同一樣品中的抗幾種不同感染原的抗體進行分析，因而可以使用與患者臨床癥狀一致的相關(guān)接觸抗原。
在感染診斷中，能夠?qū)⒓磿r抗體合成與先前感染保留下來的抗體區(qū)分開來具有重要意義。體外抗原刺激喚醒免疫記憶有悖于旨在鑒定即時急性感染的試驗的初衷，因而現(xiàn)有技術(shù)中基于抗原刺激的方法不具有上述的優(yōu)點。另外，包括抗原刺激這一步驟也會抵消本發(fā)明所述測定方法的時間優(yōu)勢，與現(xiàn)有技術(shù)中的方法相比，本發(fā)明所述測定方法可以快速完成。
第二，與檢測抗體分泌細胞或活性分泌抗體技術(shù)不同，在本發(fā)明中，盡管急速抗體合成提供了檢測的基本參數(shù)，但無需將樣品置于能夠促進抗體合成和/或分泌的條件下。這就極大地簡化了試驗，與WO96/26443中公開的已知測定方法相比，具有很大的優(yōu)勢，所述已知方法需要取樣后保溫淋巴細胞，還需在試驗中保持條件以使淋巴細胞持續(xù)分泌抗體。
本發(fā)明的一個重要優(yōu)點是避免了任一保溫步驟或特定的測定條件，這就意味著取樣后能夠快捷處理樣品，以裂解或溶解得到的細胞，然后可在測定前將裂解液存儲，例如凍存或冰箱保存一段時間。
或者，如上所述，裂解細胞前，可以將樣品，例如全血或純化制品保存，例如凍存或冰箱保存(依樣品確定)一段時間，例如幾小時或幾天，例如4小時以上。例如，如果必要或需要的話，可以在處理樣品裂解細胞前，將純化后的淋巴細胞制品凍存一段時間，例如數(shù)小時或數(shù)天，或者冰箱保存，例如數(shù)小時。因此例如，在處理以裂解或溶解細胞之前可以將純化后的淋巴細胞在4℃下保存數(shù)小時，例如4-6小時。
但是，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，一些樣品，例如全血制品可以冰箱保存更長時間而不會給細胞帶來不良影響及干擾試驗結(jié)果。例如，已發(fā)現(xiàn)全血樣品可以冰箱(例如4℃)保存至少6天，如果需要的話，在開始純化淋巴細胞之前，樣品可以在室溫(18-25℃)下間歇保存至少6小時，而不會影響試驗的進行。這一點在下述情況下特別有用當(dāng)常規(guī)或增補血漿/血清測試方法的結(jié)果還沒有得出之前，需要將試驗全血樣品保存在實驗室中，并貯存于冰箱內(nèi)。令人驚奇或出乎意料的是，由于保存過程中保持了淋巴細胞的物理完整性，因而能夠保證隨后從儲存血樣中純化出淋巴細胞(如果需要的話)以及裂解淋巴細胞，而不會明顯減少被檢測的抗體。
因此，在裂解淋巴細胞前的一個優(yōu)選實施方案中，例如樣品是血液時，該樣品可以保存數(shù)天，例如長達約6天或更長，尤其是當(dāng)在約4℃的冰箱保存時，甚至允許從冰箱中取出樣品，2或多次間斷性置于室溫，例如4-6小時，而不會給試驗結(jié)果帶來不良影響。當(dāng)血樣保存在冰箱中但是不可避免地要短時間地室溫下置于試驗臺上時，本發(fā)明所述方法特別有用。令人奇怪的是，發(fā)現(xiàn)細胞活力并無太大影響以致干擾或阻止本發(fā)明所述測定方法得到滿意的結(jié)果。在另一個優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)使用純化后的淋巴細胞樣品時，這些樣品可以在低于4℃的條件下儲存(例如幾天或更長)或者保存于4℃以上(例如6小時)。用于本發(fā)明所述測定方法的各種樣品都可以儲存，這一點使得本發(fā)明所述方法特別適用于大型的診斷實驗室，這樣可以一次使用大量樣品，從而使昂貴的自動化試驗設(shè)備，例如ELISA裝置能夠得到最大限度地利用。另外值得一提的是樣品可以帶到很多不同地點，以及郵寄或遞送到中心診斷實驗室，用于按照與其它類型實驗中分析化學(xué)血清樣品時建立起的方法相類似的方法進行分析。
因此，從另一方面來看，本發(fā)明提供了一種測定樣品中應(yīng)答免疫原而新合成抗體的存在或含量的方法，該方法包括測定含淋巴細胞樣品中釋放出來的抗體或其部分，所述淋巴細胞已經(jīng)被裂解從而使得與淋巴細胞相關(guān)的合成抗體或其部分被釋放了出來，因而能夠測定所述樣品中新合成抗體的存在與含量。
本發(fā)明的一個重要優(yōu)勢在于只需小量樣品。在本發(fā)明所述方法中，淋巴細胞的數(shù)目少至100,000個，或者甚至低于50,000個都可以產(chǎn)生可檢測信號。由于例如1ml血液中含有1×106個淋巴細胞，如果用本發(fā)明所述方法來分析取自血液的淋巴細胞，那么僅僅50或100μl血液就可以提供足以滿足實施本發(fā)明所需的淋巴細胞。即使將適當(dāng)?shù)膶φ諏嶒?例如，空白對照和陽性對照)考慮在內(nèi)，也僅需要150～300μl就可滿足診斷的需要。很明顯一旦試驗標(biāo)準(zhǔn)化，那么至少一些對照樣品就可免去。因此，本發(fā)明所述試驗需要，例如50-500μl，優(yōu)選100-300μl，常用100-200μl的含淋巴細胞樣品，體積與樣品來源的總體積相當(dāng)。因此本發(fā)明所述方法可以用，例如5×104～5×105，優(yōu)選1～2×105個淋巴細胞。這與經(jīng)典診斷試驗不同，經(jīng)典診斷試驗通常需要幾ml的血清或其它體液。這在血液取樣只能獲得少量樣品的情況下特別有用，例如將本發(fā)明所述方法用于新生兒時，只需要μl體積的樣品，例如可以從合適位點的毛細血管取血，例如從耳垂、指尖或足跟。
因此，本發(fā)明所述方法允許使用小量血樣(例如，μl體積，小于1ml，優(yōu)選少于500μl，例如小于100μl)用未經(jīng)刺激的淋巴細胞直接檢測自發(fā)或從頭合成的抗體，而無需在測定前預(yù)培養(yǎng)淋巴細胞。
用于本發(fā)明所述檢測方法的抗體針對的抗原或免疫原包括細菌及病毒抗原。臨床上重要的抗原包括，但是不限于下述實例，單純皰疹病毒、巨細胞病毒、人免疫缺損病毒(HIV)和任一型肝炎病毒以及弓形體和EB病毒(EBV)。但是，通常，本發(fā)明的方法可以檢測任一種作為激發(fā)顯著抗體應(yīng)答(例如急性期)的感染或接種結(jié)果而出現(xiàn)的免疫原。當(dāng)慢性感染在淋巴細胞中引發(fā)可檢測水平的靶抗體時，這些抗體的檢測也可以采用本發(fā)明所述方法。因此，例如，抗任一種可用常規(guī)ELISA方法檢測的免疫原的抗體都可以用本發(fā)明所述方法進行檢測?？勾祟惪乖目贵w的檢測方法可以用于快速確定患者是否感染，例如用于血液篩選或用于確定和/或監(jiān)測感染。
因此，本發(fā)明進一步提供了一種診斷或監(jiān)測細菌或病毒對人或者非人動物或所述動物的一部分的感染的方法，其中該方法包括從所述動物體中獲得含有淋巴細胞的樣品，用本發(fā)明所述方法測定與淋巴細胞相關(guān)的，新合成的抗所述細菌或病毒的抗體或其部分，與合適的對照和/或參照樣品對照測定出所述細菌或病毒感染存在與否或感染程度。
本發(fā)明所述方法因其操作簡單而特別有用，尤其是在復(fù)雜的試驗設(shè)備無法獲得時，例如在野外時可以使用。由于無需象其它測定方法那樣保溫樣品，所以該方法易于自動化，另外，在復(fù)雜設(shè)備無法獲得時可以相對快速和簡單地進行細胞裂解和抗體檢測。
現(xiàn)在對本發(fā)明所述方法作進一步的詳細描述。優(yōu)選地，該方法第一步包括從樣品中分離淋巴細胞。但是如前所述，淋巴細胞制品并非一定要純化，也可以使用已除去大量血漿抗體的制品。優(yōu)選地，這類制品中的抗體含量可以低于樣品中血漿抗體總量的15％，例如低于5％，優(yōu)選地低于1％，便捷地，也可以使用基本不含血漿的制品(例如，低于5％(v/v))，例如，無血清制品。淋巴細胞制品可以用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)來制備，例如用過濾方法或者使用吸附劑物質(zhì)的技術(shù)或淋巴細胞制備試劑盒來制備。因此，例如，各種全血制品都可以便捷地用來獲得淋巴細胞，例如，肝素化血液，EDTA-血液，等等，這類樣品可以在臨床試驗室中用常規(guī)方法制得。應(yīng)當(dāng)理解的是所有富集或純化制品必須包含樣品中存在的淋巴細胞，所述制品出自這些樣品，從而可以檢測自發(fā)或從頭開始的抗體生成。
優(yōu)選地，可以用標(biāo)準(zhǔn)的淋巴細胞分離介質(zhì)分離淋巴細胞，例如，Lymphoprep(Nycomed Pharma AS，奧斯陸，挪威)，或者用免疫磁性分離(IMS)或者類似的基于固相的分離系統(tǒng)或其它一般技術(shù)。在用IMS或類似分離技術(shù)時，可以使用固相，例如用特異于某一類白細胞的抗體包被過的磁珠，來選擇性地分離出有用的淋巴細胞。當(dāng)使用分離后的淋巴細胞時，可以在使用前用標(biāo)準(zhǔn)洗滌方法洗滌細胞。優(yōu)選地，洗滌所述淋巴細胞以除去細胞分離后出現(xiàn)的任一血漿抗體。通常，為了實施本發(fā)明，淋巴細胞中血漿抗體的污染應(yīng)降至最低限度，優(yōu)選每100μl樣品中低于20ng的血漿IgG，即血漿的最終稀釋度為大約為1∶50,000，例如，每100μl樣品中血清IgG的含量低于約0.5ng。但是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)為了實現(xiàn)這一目的，充分洗滌細胞并非必不可少。例如，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)全血樣品用緩沖液3倍稀釋后在大致相同于自旋的條件下簡單離心，即可得到基本不含污染的血清/血漿抗體的淋巴細胞制品。詳見實施例3。
通常而言，本發(fā)明所述方法不需在測定前對來自樣品的淋巴細胞進行保溫。但是應(yīng)當(dāng)知道如果淋巴細胞在裂解前要在能夠繼續(xù)生成或分泌抗體的條件下短時間放置，本發(fā)明所述方法仍可用來評估與淋巴細胞相關(guān)的新合成抗體。
如果要獲得分離的淋巴細胞，并已經(jīng)按上述方法處理待測樣品，就可以裂解所述樣品以釋放出其中新合成的抗體。該步驟可以采用本領(lǐng)域任一已知的便捷技術(shù)來完成，只要該方法能有效破裂外膜及內(nèi)膜結(jié)構(gòu)而不影響釋放后的抗體與其互補表位結(jié)合的能力即可，例如用去污劑、離液劑、含有例如EDTA的裂解緩沖液，或者其它裂解方法，例如超聲或利用剪切力的物理破碎。但是通常優(yōu)選使用裂解緩沖液這一最簡單最便捷的方法，例如如實施例中所述，即含有去污劑，如0.5％脫氧膽酸鹽的緩沖液?？梢杂眠m當(dāng)?shù)牧呀饩彌_液來穩(wěn)定釋放后的抗體，例如控制pH或降解。因此如果有必要，可以使用含有蛋白酶抑制劑的緩沖液。其它裂解方法包括例如使用反復(fù)凍融或甚至使用液氮。這樣即可制備到其中含有釋放后的抗體的裂解液，以用于后續(xù)步驟。應(yīng)當(dāng)理解的是，為了在樣品中獲得足量可供檢測的新合成抗體，要將盡可能多的細胞裂解以釋放出其中的抗體。優(yōu)選地，裂解方法適合于這一目的，樣品中至少有40％或50％，更優(yōu)選至少60％，70％或80％以及更優(yōu)選至少90％或95％的淋巴細胞被裂解。裂解淋巴細胞后，用可以檢測靶抗體的合適方法來評估樣品中的抗體含量。為了便于實現(xiàn)這一點，將樣品與載有合適結(jié)合配對物的固相接觸，以固定待測抗體。方便地，所述結(jié)合配對物是可以被待檢抗體或其部分識別的抗原(免疫原)或抗原群(即一種或多種抗原)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種測定樣品中新合成的抗體存在及含量的方法，該方法包括將等份的所述樣品，或者任選地將等份的，直接分離自所述樣品的淋巴細胞與一種或多種可被待檢抗體識別的抗原結(jié)合，優(yōu)選抗原攜帶在固相上，其中上述淋巴細胞已被裂解，釋放出了與所述淋巴細胞相關(guān)的抗體或其部分；檢測抗體與所述抗原的結(jié)合；以及與對照和/或參照樣品比較所述抗體的結(jié)合，從而測定出應(yīng)答所述抗原而新合成抗體的存在或含量。在上述方法中，對照或參照樣品可以是適當(dāng)?shù)年幮曰蜿栃詫φ瘴铮缈瞻?、常?guī)樣品或摻加樣品。
其它的結(jié)合配對物也可以使用，例如A蛋白、G蛋白或可識別及結(jié)合待檢測抗體的抗體。在后一種情況下，無需高度特異性結(jié)合，這是因為在此測定方法的實施方案中，通過隨后結(jié)合能特異性結(jié)合待測抗體的抗原而引入特異性。因此，在所有實施方案中，都會制備出特異性的抗原-抗體復(fù)合物。這類優(yōu)選被固定在一種固相支持物上的復(fù)合物的存在能在本發(fā)明所述方法的檢測步驟中被測定出來。因此在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述方法的檢測步驟包括通過形成抗原抗體復(fù)合物來檢測釋放后的抗體或其部分，其中所述抗原(優(yōu)選不是一種抗體)包括或包含免疫原或含有所述免疫原的至少一個表位的部分。
實施本發(fā)明時，所述固相可以是本領(lǐng)域熟知的任一支持物或基質(zhì)，所述支持物或基質(zhì)目前被廣泛使用，用于固定、分離等。這些支持物或基質(zhì)可以采用顆粒、片層、凝膠、濾膜、薄膜或微量滴定條帶、管或板等，以及也可以是由聚合物材料制備而成。但是，為了操作容易和簡單，可以便捷地使用標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板或孔，優(yōu)選使用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA板。
所述固相可以經(jīng)改進而用于檢測特異于一系列不同抗原的抗體。因此，例如，因此，例如可用經(jīng)不同抗原包被的合適固相材料，如硝酸纖維素或類似材料的盤狀或條狀物等，同時將它們添加到不含任何接觸抗原的微量滴定孔或其它合適容器中。然后，可以用抗體結(jié)合檢測方法來區(qū)別不同抗原?？杀憬莸厥褂脢A心-型測定方法時，所述固相上載有一種或多種可被待測抗體或其部分(靶抗體)識別的抗原(固相抗原)?；蛘?，所述固相可以攜帶一種或者多種抗體(固相抗體)，該抗體可識別待測抗體或其部分(靶抗體)。為了實施本發(fā)明所述的檢測方法，適當(dāng)時可根據(jù)所述固相支持物是否載有上述抗體或抗原，將可被固定在所述固相上的靶抗體識別的一種或多種抗原與所述固相接觸，或者，將一種或多種抗體與所述固相接觸，該抗體能夠識別固定在所述固相的靶抗體。這些后來被結(jié)合到固相支持物上的抗原或抗體可以被適當(dāng)?shù)貥?biāo)記，使得可進行下文所述的檢測。
每套盤狀物各用與某一特定臨床狀況或癥狀相關(guān)的抗原包被，使用多套這樣的盤狀物可以從多個可疑病原體中鑒別出究竟是哪個引發(fā)了疾病。然后將上述盤狀物置于分開的孔中單個處理。由于可以使用同樣少的血樣同時對多種不同抗原(得自相同病原體或得自與每個病例的臨床癥狀或狀況相關(guān)的不同病原體)進行測試，因而這是一種特別節(jié)省原料的方法。另外一種替代方法是使用多個裂解后的淋巴細胞樣品，即在分開的孔中添加這些樣品，每個孔用不同的結(jié)合配對物(例如抗原或抗體)包被，然后進行試驗。
與結(jié)合配對物結(jié)合的技術(shù)，例如抗原與固相結(jié)合的技術(shù)也是眾所周知的，這些技術(shù)在文獻中有大量的描述。多種標(biāo)準(zhǔn)的抗原包被方法的描述可參見，例如ELISA和其它固相免疫測定，理論和實踐分冊；1988，D.M.Kemeny & S.J.Challacombe，John Wiley & Sons編著。如果需要，也可以用標(biāo)準(zhǔn)方法洗滌及封閉微量滴定板。因此，例如，將標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板置于合適的緩沖液中，例如置于含結(jié)合配對物，例如濃度為0.01～150μg/ml蛋白質(zhì)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，于4℃將滴定板保溫過夜，然后用合適的封閉介質(zhì)(通常為中性緩沖液，例如PBS，其中含有封閉蛋白質(zhì)，例如小牛血清或出自奶粉的蛋白質(zhì))進行封閉，再在例如37℃下保溫1～5小時，這樣簡單的操作就可以將這些標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板，例如ELISA板用結(jié)合配對物包被起來。除去封閉溶液，這些滴定板就可供使用。
但是，為了方便起見，本發(fā)明所述方法使用的材料可以以試劑盒的形式提供，其中所述的固相載體已用結(jié)合配對物包被并已被適當(dāng)封閉。
可以在接觸步驟前將裂解后的淋巴細胞樣品懸液稀釋，為了方便起見可以使用一系列細胞/樣品稀釋液。通常用其中含有裂解后的淋巴細胞的緩沖液作為稀釋液進行稀釋。
然后檢測抗體與抗原的結(jié)合情況。為了方便起見，檢測步驟，亦即信號讀取，可以在溶液中進行。但是也可以產(chǎn)生不能在溶液中讀取的不溶性產(chǎn)物或信號。只要能夠生成可讀信號，任何檢測抗體結(jié)合的已知方法都可使用；例如根據(jù)熒光、化學(xué)發(fā)光、比色法或酶反應(yīng)來產(chǎn)生可讀信號。當(dāng)不使用固相時，釋放后的抗體可以用其它任一敏感的血清學(xué)方法，例如光散射(例如，比濁法)和共振方法來檢測。為了方便起見，可以用免疫測定作為檢測手段，優(yōu)選使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。但是，ELISA之外的其它測試方法也在本發(fā)明用來檢測抗體的方法范圍之內(nèi)。使用經(jīng)包被的，例如用裂解后的淋巴細胞懸液覆蓋后的盤狀物或玻璃板的技術(shù)也是合適的。本領(lǐng)域中已知的任何檢測抗體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如可生成不溶或可溶產(chǎn)物的技術(shù)都可經(jīng)調(diào)整后用于本發(fā)明所述方法，進行定量分析抑或定性(例如，有/無)試驗。
免疫測定技術(shù)，特別是ELISA，已為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，其描述見文獻(參見例如ELISA和其它固相免疫測定，理論和實踐分冊；1988，D.M.Kemeny & S.J.Challacombe，John Wiley & Sons編著)。
在與裂解后的淋巴細胞樣品接觸后，加入酶-抗體偶聯(lián)物(例如在ELISA檢測方法中)，該偶聯(lián)物可與已結(jié)合了固相上的抗原的抗體相結(jié)合。類似地，如果待測抗體通過一種結(jié)合配對物，例如通過抗不同種類抗體的抗體非特異性地與固相結(jié)合，可以加入酶-抗原偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物可與固定后的待檢抗體特異性地結(jié)合。然后加入酶底物以生成可檢測信號。本發(fā)明中為了方便起見可使用可溶性底物，生成可在溶液中檢測的信號。由于本發(fā)明方法加速并簡化了大量樣品的操作和處理，并可估計抗體產(chǎn)量，因而是有利的，盡管如上所述，無需絕對定量，但如果需要可以得到定性或半定量的結(jié)果。為了方便起見，可以選用能產(chǎn)生可分光光度檢測的信號的底物，所述信號可通過例如用標(biāo)準(zhǔn)ELISA板閱讀儀讀取吸收度來簡便地讀取。實際上，也可用標(biāo)準(zhǔn)ELISA試劑，這樣做的好處是可以使本發(fā)明所述測定與臨床實驗室中常規(guī)使用的現(xiàn)有方法及技術(shù)匹配。但是，也可以使用其它檢測/信號生成系統(tǒng)，產(chǎn)生可用熒光、化學(xué)發(fā)光等檢測的信號。
還可以用免疫-酶放大方法加強信號及增強靈敏度，例如用抗生物素蛋白-生物素方法，例如Sigma公司的Extravidin系統(tǒng)?？捎蒙锼鼗牡诙贵w作為ELISA試劑，與過氧化物酶抗生物素蛋白復(fù)合物結(jié)合。由于一個抗生物素蛋白分子能結(jié)合數(shù)個生物素分子，所以用抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶復(fù)合物可增加過氧化物酶分子的表面濃度，從而使得該方法更加靈敏。
為了方便起見，裂解淋巴細胞和檢測抗體結(jié)合這兩個步驟所用的材料和工具也可以與被結(jié)合配對物包被的固相一起以試劑盒的方式提供。
可用其它測定方法來增補本發(fā)明所述測定方法得到的信息。有關(guān)預(yù)先存在的血清/血漿抗體的其它有用信息可從經(jīng)典ELISA試驗中獲取。此外，從血樣中分離淋巴細胞后，可使用本發(fā)明所述測定方法中所用的用相同的結(jié)合配對物包被的固相來檢測剩余血漿液中的預(yù)先存在的抗體。
為了保證本發(fā)明所述測定方法的結(jié)果可信，可加入合適的對照，來測定新合成抗體的存在或含量。例如，為了查明測試孔中記錄的信號不是來自于隨機及非特異性(旁觀者)活化的淋巴細胞，需使用陰性對照抗原。該抗原出自最不可能引發(fā)患者急性疾病的感染性病原體，例如，破傷風(fēng)類毒素。在所有環(huán)境中的任何情況下，此類旁觀者的活化的淋巴細胞的數(shù)目都會大大低于要得到本發(fā)明所述方法陽性結(jié)果所需的淋巴細胞數(shù)目。設(shè)計本發(fā)明時已將這一點考慮在內(nèi)。
如上所述，因其操作容易，快速并簡便，本發(fā)明所述測定方法可用于診斷或其它臨床或獸醫(yī)學(xué)用途，例如魚類養(yǎng)殖。除樣品需要量小之外，另一個優(yōu)點是只需一個樣品，而非間隔2-3周取得的血清樣品對，而大多數(shù)常規(guī)血清學(xué)試驗都需要這樣做。無需復(fù)雜設(shè)備，該測定方法易于自動化。此外，如果需要的話，還可測試不同的免疫球蛋白同種型。
上述的本發(fā)明測定方法提供了一種評估即時感染存在與否或程度的方法，該方法對特異于某一特定抗原的抗體的自發(fā)表達進行分析。很明顯，該方法適用于評定這類疾病的病情，該疾病是已知的，或者可獲得與相關(guān)免疫原有關(guān)的抗原，從而可提供特異性的感染標(biāo)記。但是，在一些臨床情況下，并不能對特定疾病進行鑒定，和/或無法獲得測定可用的適當(dāng)抗原。這類情況下，可調(diào)整測定方法，用其來評定感染的非特異性標(biāo)記的存在或程度。因此，例如，對于含淋巴細胞的樣品，例如全血或者其中經(jīng)純化或富集后的淋巴細胞制品，可以對其中生成的感染標(biāo)記進行檢測，所述標(biāo)記如細胞因子或干擾素，例如IL-2，IL-4或γ干擾素。
因此，從另一方面來看，本發(fā)明提供了一種對樣品中應(yīng)答免疫原而產(chǎn)生的感染標(biāo)記的存在或含量進行測定的方法，該方法包括獲得含淋巴細胞的樣品；裂解所述淋巴細胞從而釋放出待檢的感染標(biāo)記；以及檢測上述釋放出的感染標(biāo)記，從而測定出所述樣品中感染標(biāo)記的存在或含量。
為了實施該方法，可以使用帶有合適俘獲分子的固相，例如抗待檢感染標(biāo)記的抗體。當(dāng)檢測固定在固相上的所述感染標(biāo)記的存在時，可以使用上述方法，例如用標(biāo)記后的抗體或配體。在該方法中，可以選用適當(dāng)?shù)墓潭ńM分或檢測分子鑒定特異性標(biāo)記。因此，例如，可以將樣品中的所有蛋白質(zhì)都固定在固相支持物上，然后用標(biāo)記后的特異性抗體或配體進行檢測?；蛘?，可以用一種特異性結(jié)合配對物固定相關(guān)感染標(biāo)記，然后可以對該感染標(biāo)記進行適當(dāng)正或負標(biāo)記，例如在前一種情況下將其與感染標(biāo)記上出現(xiàn)但并非該分子獨有的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，或者在后一種情況下，標(biāo)記固相上的未結(jié)合的結(jié)合配對物。用于實施該方法的試劑盒也是本發(fā)明的一部分。


圖1顯示的是流感疫苗臨床試驗的結(jié)果，其中用淋巴細胞裂解方法對取自9個受試者(編號為2-10的人)的樣品進行了測試。每個條形圖左手邊的標(biāo)度是以ng計的H3N2 IgG，橫坐標(biāo)為接種后的天數(shù)。點線與每個條形圖重疊處顯示的是以右手邊標(biāo)注的針對A/Nanchong病毒的HI滴度。
詳細描述見實施例1和2。
現(xiàn)在結(jié)合下列非限制性實施例對本發(fā)明作更詳細的描述。
分離淋巴細胞收集肝素化的外周靜脈血樣。根據(jù)廠商說明，用Lymphoprep(Nycomed Pharma AS，Oslo)分離淋巴細胞，不同之處僅在于在第一次離心前用二倍量(而非等量)的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)混合肝素化的血樣。再將細胞沉淀物多洗滌兩次。用Blue Dextrane排除法在血細胞計數(shù)儀中進行淋巴細胞計數(shù)。
裂解淋巴細胞用裂解緩沖液10mM Tris HCl(pH7.4)裂解級數(shù)量的淋巴細胞，所述緩沖液內(nèi)含有0.5％脫氧膽酸鹽，2μg/ml胃蛋白酶抑制劑A(Sigma P-4265，批號18H0551)，2μg/ml亮抑酶肽(Sigma L-0649，批號77H86221)，0.5％抑肽酶(Sigma A-6279，批號87H7010)，1mM PMSF(Sigma P-7626，批號48H1265)(參照Spector DL，GoldmanRD，LeinwandLA，細胞，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，紐約，1998，Vol 174.6)，然后用于ELISA試驗(見表1)。
包被和封閉ELISA板F-型Greiner微量板，中等結(jié)合能力，Cat#655001(批號98260148)，D-72636 Frickenhausen，德國。用來測試流感抗體的病毒抗原(由Solvay-Duphar，荷蘭惠贈)有A/Nanchang/933/95(H3N2)表面抗原，10μg/ml溶于PBS，100μl/孔。B/Harbin/07/94表面抗原，10μg/ml溶于PBS，100μl/孔。測試用的常規(guī)IgG抗體山羊抗-人IgG(γ-鏈特異性)Sigma I-7883(批號76H8895)，用PBS做1∶500倍的稀釋，100μl/孔。4℃包被過夜。用含有10％胎牛血清(FCS)的PBS室溫下封閉1小時。在所有后續(xù)步驟之間，均用含0.05％Tween 20的PBS洗滌免疫滴定板5次。
樣品的板上布局流感IgG抗體和常規(guī)IgG抗體以及人IgG標(biāo)準(zhǔn)品的測試在同一塊免疫滴定板上進行。所有樣品均進行重復(fù)試驗。
測試樣品待檢樣品LOH“血清”(用血漿進行1∶3稀釋)。清潔并用含0.05％Tween 20和5％FCS的PBS(稀釋液)10倍稀釋，100μl/孔。IgG標(biāo)準(zhǔn)品Sigma I-4506(批號96H8840)10μg IgG/ml，用含0.05％Tween 20和5％FCS的PBS(稀釋液)10倍稀釋，100μl/孔。
將300μl終細胞沉淀置于含1∶9,368稀釋度血清的PBS溶液中。向該沉淀中加入700μl PBS(＝1∶3.33稀釋)。終沉淀有2.0×107細胞，血清污染度為1∶31,200。測試的終上清液為1∶9,370血清稀釋度。
細胞溶解物將溶解物細胞濃度調(diào)至800,000，200,000和50,000個細胞/孔，100μl/孔。
表1.用于測試的細胞溶解物的混合物
經(jīng)計算，相對于終細胞洗液的細胞制品的血清抗體污染度為對于800,000個細胞而言為1∶8.4(10.6％)，相對于200,000個細胞而言為1∶33.7(2.9％)，相對于200,000個細胞而言為1∶134.8(0.7％)。
所有抗體樣品均在室溫下保溫90分鐘。
第二抗體生物素-標(biāo)記的山羊抗-人IgG(γ-鏈特異性)Sigma B-1140(批號96H8886)，用含0.05％Tween20和5％FCS的PBS作1∶500倍的稀釋，100μl/孔。室溫下保溫60分鐘。
偶聯(lián)ExtrAvidin過氧化物酶偶聯(lián)物，Sigma E-2886(批號28H4824)，用含0.05％Tween20和5％FCS的PBS作1∶1000倍的稀釋，100μl/孔。室溫下保溫60分鐘。
顯色片狀底物(o-Penylene diamine dihydrochloride)，Sigma P-8287(批號88H8250)。將1片底物(10mg)溶于25ml 0.1M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，pH5.0，并加有20μl強雙氧水(30％H2O2)。加入100μl/孔底物溶液，加入50μl/孔量的1M H2SO4，10分鐘后觀察反應(yīng)。在492nm下用Titertek Multiskan PLUS閱讀儀(Flow Laboratories)讀取光密度值。結(jié)果從用IgG標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線中推算出IgG的量。所有測試樣品均做重復(fù)試驗，取光密度的平均值用于下列計算。
表2.血清IgG抗體抗體血清抗體(μg/ml) ％常規(guī)IgG 2,365 100.0乙型流感病毒 703.0甲型流感病毒 112 4.8表3.IgG抗體從裂解后的淋巴細胞中釋放
表4.概括外周血淋巴細胞及血清中檢測到的IgG
結(jié)論從表3中可以清楚地看出，受試者LOH感染的是甲型流感病毒。用這些數(shù)據(jù)，可以認(rèn)為100,000個淋巴細胞/孔中能產(chǎn)生大約20ng/ml的甲型流感IgG抗體，而生成乙型流感病毒IgG抗體的量為2ng/ml。從實踐角度看，前一個細胞濃度可生成便于測量的針對甲型流感病毒特異性抗體的ELISA信號，但是對于乙型流感病毒就不能生成這樣的信號。與從血清中測得的流感病毒抗體水平(表2)不同，甲型流感病毒和乙型流感病毒抗體的水平非常接近。這類血清抗體最可能是預(yù)先存在的交叉-反應(yīng)抗體，該抗體起因于先前接觸流感病毒。很多年前人們就已經(jīng)知道，以后再次接觸異源病毒可以再次激活流感記憶，這就是所謂的“抗原記錄(antigenic sin)”，多數(shù)情況是發(fā)生初始免疫過程的淋巴組織中的局部“旁觀者”效應(yīng)。
我們試驗中來自裂解后淋巴細胞的抗體也能生成針對乙型流感病毒抗原(即不是使受試者LOH不舒服的病毒)的可測量ELISA信號，盡管該信號很小，產(chǎn)生該信號的原因可能是由于甲型流感病毒的免疫攻擊使記憶淋巴細胞被非特異性重新活化而導(dǎo)致的。但是，據(jù)信這種記憶細胞異常重新活化是流感相關(guān)現(xiàn)象，并不適用于其它感染性病原體。因此，可以肯定的是，來自待檢感染性病原體與其它病原體的不同抗原生成的信號之間的區(qū)別是顯而易見的。
在本發(fā)明方法中，對于每種待檢的抗原特異性抗體約需要100μl肝素化血液(等于100,000個淋巴細胞)，因而取自毛細血管中的血樣也可以使用。實施例2動力學(xué)這是一個臨床流感疫苗試驗。9位健康的受試者的登記情況為其中6位女性年齡在24～27歲之間(平均26.2歲)，3位男性年齡在24-31歲之間(平均28.3歲)。醫(yī)生告知了他們有關(guān)接種的禁忌癥，他們均表示無此類禁忌癥。他們以前均未接種過流感疫苗。所有疫苗都完成了試驗，依照下述方法收集外周血樣。給受試者接種有批號的三價滅活全病毒疫苗(Vaxigrip)，其中含有A/悉尼/5/97(H3N2)一樣病毒，含有15μg血凝素/劑量；A/北京/262/95(H1N1)-樣病毒，含有15μg血凝素/劑量；B/北京/184/93-樣病毒，含有15μg血凝素/劑量；購自Meriex Serums & Vaccines(法國)公司。
按照實施例1中的方法制備肝素化血樣。所有操作均同實施例1中所述，不同之處僅在于通過將淋巴細胞試管置于液氮和流水下反復(fù)凍融(2次)來裂解淋巴細胞。
此外，用受體-破壞酶處理后的血漿樣品進行血凝抑制(HI)試驗，操作按照下列文獻中的標(biāo)準(zhǔn)方法進行，Kendal等，1982，＂實驗室監(jiān)控流感的概念和方法＂，Viral Disease Unit，WHO，日內(nèi)瓦，使用4個血凝單位的A/Nanchang病毒和0.7％的火雞紅細胞。2倍稀釋血漿進行測試，記錄的滴度為完全抑制病毒血凝的最大稀釋度的倒數(shù)。
使用的樣品有免疫當(dāng)天，免疫后7天以及免疫后13天收取的樣品。結(jié)果圖1顯示的是使用下述溶液得到的抗相關(guān)A/Nanchang/933/95(H3N2)表面抗原的IgG的量(以ng計)(見實施例1)，即這些溶液有取自9個接種受試者(條形圖)中每個人的300K個裂解后淋巴細胞制備而成的。它們是依據(jù)從裂解后的淋巴細胞中獲得的流感特異性IgG抗體的量繪制而成的。左手邊ng IgG標(biāo)度對于全部受試者是不同的。疊加顯示的為抗A/Nanchang病毒的HI滴度(點線)。國際標(biāo)準(zhǔn)為滴度≥40就可視為有保護作用。結(jié)論通常，HI抗體與病毒中和抗體一起被視為“最標(biāo)準(zhǔn)的”的流感抗體。根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)，HI滴度≥40即視為有保護作用。圖1顯示9個受試者中有4位(即第2，第5-7位受試者)在第7天獲得了這樣的抗體，除第3和第10位受試者外，所有受試者在第13天時均獲得了這類的HI滴度。在第7天時，所有受試者的裂解后的淋巴細胞中都檢測到了高水平的流感特異性IgG，但是在第7天時5位(第3、4、8-10位)受試者只檢測到了來自裂解后的淋巴細胞的抗體，而未檢測到達到保護水平的HI抗體。
另外，由于第13天時大部分受試者都具有了顯著水平的血清抗體，所以這類抗體在第7天出現(xiàn)以及在第13天消失的現(xiàn)象表明了流感IgG抗體的特異性。
實施例2清楚地表明從裂解后的淋巴細胞檢測到的抗體未被淋巴細胞沉淀中俘獲的血清抗體污染，這一點在實施例1中有同樣清楚的顯示。
表5. 4℃下保存血液4天，然后室溫下保存4小時。對來自裂解后淋巴
所有項目均為492nm處光密度x1000以及血漿抗體的HI滴度。＂細胞＂為從來自100μl血液的裂解淋巴細胞中獲得的抗體。結(jié)果接種前已發(fā)現(xiàn)該受試者具有顯著的抗A/悉尼/5/97(H3N2)疫苗組分的HI滴度，從第0天到第9天，淋巴細胞中釋放出的抗體并未顯著增加，HI滴度也未顯著增大。對于H1N1組分A/北京/262/95應(yīng)答的HI疫苗是微弱的，這一點從細胞測定中也可看出。最明顯的應(yīng)答是抗乙型流感病毒組分B/北京/184/93的應(yīng)答，這種情況下，HI滴度從＜10升至40。這在細胞測定中也得到了驗證。
將血樣4℃下放置4天，然后室溫下放置4小時，不會影響來自裂解后的淋巴細胞的記錄的抗體活性。立即試驗得到的結(jié)果與保存4天后得到的結(jié)果無顯著差異。
其它試驗也表明，在類似條件下(冰箱保存，間以室溫下6小時的放置)即使6天后也不會影響對來自裂解后淋巴細胞的抗體的測量。
權(quán)利要求
1.一種對樣品中應(yīng)答免疫原而生成的新合成抗體的存在或含量進行檢測的方法，該方法包括檢測含淋巴細胞樣品中釋放出的抗體或其部分，所述淋巴細胞已裂解因而釋放出了其中的與淋巴細胞相關(guān)的合成抗體或其部分，從而可以對所述樣品中新合成抗體的存在或含量進行測定。
2.權(quán)利要求1所述的方法，該方法包括以下步驟獲得含有淋巴細胞的樣品；裂解所述淋巴細胞從而釋放出與淋巴細胞相關(guān)的抗體或其部分；以及對釋放出的抗體或其部分進行檢測，從而測定出所述樣品中新合成抗體的存在或含量。
3.如權(quán)利要求1或2所述方法，其中所述的樣品為淋巴或外周血。
4.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中采用物理裂解方法或細胞裂解緩沖液或溶液裂解淋巴細胞。
5.權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述抗體或其部分的檢測是通過與一種或多種抗原的結(jié)合實現(xiàn)的，所述抗原可識別所述抗體或其部分。
6.權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中釋放出的抗體的檢測是通過固相結(jié)合測定試驗完成的。
7.權(quán)利要求6中所述方法，其中所述固相上攜帶有一種或多種抗原(固相抗原)，該抗原能夠被待檢抗體或其部分(靶抗體)識別。
8.權(quán)利要求6中所述方法，其中所述固相上攜帶有一種或多種抗體(固相抗體)，該抗體能夠識別待檢抗體或其部分(靶抗體)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中該方法可用于嬰兒或新生兒血樣，將其中新合成的抗體與被動轉(zhuǎn)移的母源抗體區(qū)分開來。
10.權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中在裂解淋巴細胞前或者在裂解后但檢測前，將所述樣品保存在約4℃或以下。
11.權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中用于該方法的所述血樣或者用于制備本發(fā)明所用淋巴細胞的血樣，其體積可小于1ml。
12.權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其中從所述樣品分離出的淋巴細胞可直接用于該方法。
13.權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述的檢測步驟是通過免疫測定，優(yōu)選為ELISA進行的。
14.權(quán)利要求6-13中任一項所述的方法，其中將一種或多種抗原與所述固相接觸，該抗原可被固定在所述固相上的靶抗體識別。
15.權(quán)利要求6-13中任一項所述的方法，其中將一種或多種抗體與所述固相接觸，該抗體可被固定在所述固相上的靶抗體識別。
16.權(quán)利要求1-15中任一項所述的方法，其中所述檢測步驟中使用可溶底物，該底物能生成分光光度分析法可檢測的信號。
17.權(quán)利要求1-16中任一項所述的方法，其中使用陰性對照抗原。
18.權(quán)利要求6-17中任一項所述的方法，其中使用多個固相，每個固相各帶有一種不同的靶抗原。
19.一種診斷或監(jiān)測免疫原對人或者非人動物或該動物的一部分的感染的方法，其中該方法包括從所述動物體中獲得含有淋巴細胞的樣品，用權(quán)利要求1-18中任一項所述的方法測定新合成的，抗所述免疫原的，與淋巴細胞相關(guān)的抗體或其部分的存在或含量，與合適的對照和/或參照樣品對照測定出所述免疫原感染的存在或感染程度。
20.權(quán)利要求1-19中任一項所述的方法，其中所述免疫原是一種細菌或病毒抗原，診斷或檢測的是細菌或病毒源的感染。
21.權(quán)利要求20中的方法，其中所述抗原得自選自下列的病毒單純皰疹病毒、巨細胞病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和任一型肝炎病毒以及弓形體和EB病毒(EBV)。
22.一種對樣品中應(yīng)答免疫原而產(chǎn)生的感染標(biāo)記的存在或含量進行測定的方法，該方法包括獲得含淋巴細胞的樣品；裂解所述淋巴細胞從而釋放出待檢的感染標(biāo)記；以及用權(quán)利要求1-18中任一項所述的方法，檢測上述釋放出的感染標(biāo)記，從而測定出所述樣品中感染標(biāo)記的存在或含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對樣品中應(yīng)答免疫原而生成的新合成抗體存在或含量進行檢測的方法,該方法對含淋巴細胞樣品中釋放出的抗體或其部分進行檢測,通過裂解淋巴細胞釋放出了其中的與淋巴細胞相關(guān)的合成抗體或其部分,從而測定出所述樣品中新合成抗體的存在或含量,本發(fā)明還提供了利用該方法的診斷方法以及實施該方法的試劑盒。該方法還可經(jīng)改進后用于非特異性感染標(biāo)記的檢測。
文檔編號G01N33/569GK1355887SQ00808978
公開日2002年6月26日 申請日期2000年6月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月14日
發(fā)明者拉斯·R·哈海姆 申請人:普拉斯馬柯特有限公司