專利名稱：傳感器平臺、裝有該平臺的裝置以及使用該平臺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及樣品分析領(lǐng)域，尤其但并不是專用于親合性檢測領(lǐng)域，例如通常被稱為DNA，蛋白質(zhì)，肽和抗體芯片(antibody chip)的技術(shù)。本發(fā)明的一個方面涉及一種能夠用于分析樣品的傳感器平臺。本發(fā)明的另一個方面涉及使用該傳感器平臺的裝置。本發(fā)明的又一方面涉及使用該傳感器平臺分析樣品的方法。
背景技術(shù)：
用于分析二維陣列樣品的技術(shù)是已知的。其中的一種技術(shù)被稱為ELISA分析，是在抗體與抗原之間強烈的生化反應(yīng)的基礎(chǔ)上進行的。特別的單克隆或多克隆抗體被固定在基質(zhì)(substrate)上，且與附加的物質(zhì)(complimentary species)發(fā)生反應(yīng)。附加熒光標記的標簽，通過酶連接的抗體激活，用光照射樣品以便引起熒光。對此熒光進行檢測，且此熒光的強度表示出親合性反應(yīng)。
WO98/27430中描述了另一種已知技術(shù)。按照這種技術(shù)大量不同的物質(zhì)在基板上被按陣列固定。通過光刻手段將該物質(zhì)固定在基板上。向物質(zhì)中加入熒光團標記的標簽。準備樣品，并且與被固定的物質(zhì)起反應(yīng)，使用聚焦的激光束對整個芯片(chip)進行掃描?；蛘咧苽錁悠?，并且使用熒光團標記的標簽對其進行改性，與被固定的物質(zhì)起反應(yīng)，并且使用聚焦的激光束對整個芯片進行掃描。光電檢測器檢測到熒光信號，并產(chǎn)生2D圖案。在各個樣品之間這種圖案的變化提供以基因表達方面差別的指示，從而提供關(guān)于藥理學(xué)和毒理學(xué)的信息。
另一種已知技術(shù)是基于瞬息波檢測器。這些檢測器使用被收集在一相當薄層中的相干激光，產(chǎn)生所謂的瞬逝電磁場，其在實際物理檢測器的外部擴展到一個很小的距離。該場可以與附著在檢測器表面上的分子相互作用。這種瞬息激勵或相互作用被限制在一個非常接近于波導(dǎo)附近的區(qū)域，對于可見光一般為距離表面0.5微米。瞬息場在空間上保持定位，不會將它們所存儲的能量轉(zhuǎn)移到其它區(qū)域。激光與分子的相互作用可以被用于許多不同的方面。包括1.對瞬息場產(chǎn)生的熒光的檢測。
2.檢測樣品分子與俘獲分子結(jié)合時所發(fā)生的折射率的變化。
3.表面等離子體諧振的檢測。
一種已知的使用瞬息場的特殊傳感器為平面波導(dǎo)傳感器。該平面波導(dǎo)傳感器包括一平的基片，在該平的基片上形成一薄的波導(dǎo)層。部分波導(dǎo)層中包含有光柵，激光束入射到光柵上，并且從該光柵發(fā)射出激光束，使得激光束穿過波導(dǎo)層到達遠離光柵的傳感區(qū)域。波導(dǎo)傳感器可以按物質(zhì)敏感方式使用(參照前面的2，3)，或者與熒光激發(fā)和檢測相結(jié)合具有高靈敏度(參照前面的1)。俘獲分子被固定在傳感區(qū)域上，然后在附加具有相似親和力(競爭)的標記分子的條件下，使被分析物(樣品)與傳感區(qū)域/俘獲分子相接觸。或者，被分析物分子可以與固定的俘獲分子結(jié)合起來，并且通過另外一個標記物質(zhì)與俘獲的被分析物分子的相互作用引入熒光標簽。照射進波導(dǎo)層中的激光導(dǎo)致熒光團的瞬息激發(fā)，從而允許對分析物進行定量分析。檢測所發(fā)射的熒光，而且熒光的強度提供已經(jīng)在被分析物中存在的親合對象與所固定的俘獲分子之間發(fā)生相互作用的指示。應(yīng)該注意到在這種類型的設(shè)置中，激光輻射于波導(dǎo)內(nèi)部傳播相當長的距離，而且耦合光柵與傳感區(qū)域在幾何上被分開(參見WO95/33197和WO95/33198)。
EP-0455067A2描述了一種采用折射率變化檢測原理的平面波導(dǎo)傳感器。在整個平臺上形成平臺淺槽，將偏振的相干光耦合到透明波導(dǎo)層中，在一段距離之后該光被耦合出去。當被分析物分子與俘獲分子結(jié)合在一起時，出射耦合光束的角度發(fā)生改變。
US-A-5738825中給出了另一個折射率型的例子。該平臺包含與微滴定度(microtiter)平板的凹槽相接觸的單個光柵。
EP178083披露了表面等離子體諧振(SPR)，其中入射光子的能量被轉(zhuǎn)換為電能作為表面等離子體波。與本發(fā)明的平臺不同，該傳感器結(jié)構(gòu)要求一金屬層，且在臨界角下所反射的光量為或近似為零，與之相反本發(fā)明中所反射的強度達到幾乎100％。
所有前面的技術(shù)都具有多個缺點。其中一些速度非常慢，因為每個樣品必須被分別激發(fā)。其它的技術(shù)如平面波導(dǎo)，允許一次激發(fā)多于一個樣品，不過因為不同俘獲元素之間的熒光串擾，由于波導(dǎo)損耗所導(dǎo)致的激勵光強度的局部變化，以及光柵耦合效率變化所導(dǎo)致的局部耦合力改變，不能提供完整可靠的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種技術(shù)，允許以一種非常靈敏、可靠和定量的方式同時對多個樣品進行分析。
與平面波導(dǎo)傳感器不同，本發(fā)明沒有表現(xiàn)出熒光串擾，并且很好地限定了局部光強。本發(fā)明允許真正的多路復(fù)用，即轉(zhuǎn)換器(transducer)不要求成堆的下部結(jié)構(gòu)(如平面波導(dǎo)的情形)，并且可以將其看作一通用的平臺，其中根據(jù)要求可以在技術(shù)可行的限度內(nèi)改變識別元件的尺寸和數(shù)量，而不需要改變芯片的結(jié)構(gòu)(不必象平面波導(dǎo)那樣將波紋區(qū)域與傳感區(qū)域分開)。另外，與現(xiàn)有熒光技術(shù)相比，本發(fā)明所發(fā)出的熒光強度超過大約100倍。該實驗裝置非常簡單，僅需要對入射光束的角度進行簡單調(diào)節(jié)。本發(fā)明中所描述的轉(zhuǎn)換器可以順利地用于傳統(tǒng)熒光顯微鏡，共焦顯微鏡和激光掃描器中。另外，對于具有寬諧振寬度[在半最大值處限定的全寬度，F(xiàn)WHM(半最大值處帶寬)]和諧振位置處于或接近正入射時，不能使用角度調(diào)節(jié)。
平臺的制造過程相當簡單(廉價)，并且可以通過各個裝置的適當改變來很容易地提高現(xiàn)有系統(tǒng)(即熒光掃描器，顯微鏡，熒光微滴度平板讀出器等)的性能。
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供一種用于樣品分析的平臺，包括一具有折射率(n1)的光學(xué)透明基板，一形成在該基板的一個表面上的薄的光學(xué)透明層，所述透明層具有一大于(n1)的折射率(n2)；所述平臺中引入一或多個包含周期性溝槽的波紋結(jié)構(gòu)，由其限定一或多個傳感區(qū)域，每個傳感區(qū)域?qū)?yīng)一或多個俘獲元件，所述溝槽被賦于一定的輪廓、尺寸和取向，使得或者a)入射到所述平臺上的相干光被衍射成單獨的光束或衍射級，其相互干涉導(dǎo)致透射光束的減少以及入射光的異常高的反射，從而在一或多個傳感區(qū)域表面處產(chǎn)生一增強的瞬息場；或者b)入射在所述平臺上的相干的線性偏振光被衍射成單獨的光束或衍射級，其相互干涉導(dǎo)致幾乎所有透射光束消失以及入射光的異常高的反射，從而在一或多個傳感區(qū)域的表面處產(chǎn)生一增強的瞬息場。
根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供一種平臺，包括一具有折射率(n1)的光學(xué)透明基板，形成在該基板的一個表面上的一薄的光學(xué)透明層，所述透明層具有大于(n1)的折射率(n2)；所述平臺在透明層中引入一基本上在整個平臺上的波紋結(jié)構(gòu)，或者在平臺上設(shè)置的多個分離的波紋結(jié)構(gòu)，所述波紋結(jié)構(gòu)包括基本上平行的單衍射或多重衍射的周期性溝槽，并且溝槽表示一或多個傳感區(qū)域，其中(a)溝槽的深度在3nm至光學(xué)透明層厚度的范圍內(nèi)，(b)光學(xué)透明層的厚度在30至1000nm范圍內(nèi)，(c)波紋結(jié)構(gòu)的周期在200至1000nm范圍內(nèi)，(d)溝槽深度與光學(xué)透明層厚度之比在0.02至1的范圍內(nèi)，并且(e)溝槽寬度與溝槽周期之比在0.2至0.8范圍內(nèi)。在使用中該設(shè)置可以是這樣的，使溝槽具有一定的輪廓、尺寸和取向，使得或者a)入射到平臺上的相干光被衍射成單獨的光束或衍射級，其相互干涉導(dǎo)致透射光束的減少和入射光的異常高的反射，從而在一或多個傳感區(qū)域的表面處產(chǎn)生一增強的瞬息場；或者b)入射在所述平臺上的相干的線偏振光被衍射成單獨的光束或衍射級，其相互干涉導(dǎo)致幾乎所有透射光束消失以及入射光的異常高的反射，從而在一或多個傳感區(qū)域的表面處產(chǎn)生一增強的瞬息場。
如此處所使用的，取向被理解為是指線性偏振光的電場矢量平行于或垂直于溝槽。如此處所使用的，相干光被理解為是指該輻射的相干長度，即具有規(guī)定相位關(guān)系的入射光束的空間擴展，與平臺厚度相比此相干長度更大。
在入射光束(小于1μm)的波長范圍內(nèi)，瞬息場按指數(shù)規(guī)律衰減。
本發(fā)明的一個重要的方面在于平臺的使用，在平臺中可以產(chǎn)生所謂的瞬息諧振。在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)對異常反射現(xiàn)象進行了理論上的描述，如SS Wang和R Magnusson在應(yīng)用光學(xué)(Vol.32，No.14，1993年5月10日，第2606至2613頁)中標題為“導(dǎo)模諧振濾波器的理論和應(yīng)用”的論文中，和O.Parriaux等人在Pure & Applied Optics5，(1996)(第453-469頁)中題為“作為波導(dǎo)功能元件的耦合光柵”中所描述的。如在這些論文中所解釋的那樣，在平面介電層衍射光柵中可能發(fā)生諧振現(xiàn)象，其中當衍射光柵的溝槽具有足夠深度并且輻射以一特定角度入射在波紋結(jié)構(gòu)上時，光能在反射和透射波之間幾乎100％地切換。在本發(fā)明中在平臺的傳感區(qū)域中采用這種現(xiàn)象，其中該傳感區(qū)域包括足夠深度的衍射溝槽，并且引起光以一定角度入射在平臺的傳感區(qū)域上，從而在該傳感區(qū)域發(fā)生瞬息諧振。這就在傳感區(qū)域中產(chǎn)生一增強的瞬息場，其被用來激發(fā)被研究樣品。應(yīng)該注意到100％切換指的是使用平行光束和線性偏振相干光來產(chǎn)生，也可以使用非平行聚焦激光束的非偏振光來獲得一增強瞬息場的效果。
在諧振條件下，單獨的光束以這樣一種方式進行相互干涉，使透射光束消失(相消干涉)，且反射光束相長干涉產(chǎn)生異常高的反射。
對于前面提到的波紋層結(jié)構(gòu)，通過選擇適當參數(shù)，激發(fā)能保持高度定位。在文獻中將這種結(jié)構(gòu)描述為光子能帶隙結(jié)構(gòu)，其折射率周期性空間變化的材料使電磁輻射不能沿任何方向傳播。光子帶隙結(jié)構(gòu)允許出現(xiàn)高度定位的模式，參見例如C.Adlard，E.R.Pike和S.Sarkar在PhisicalReview Letters[第79卷第9期，第1585-87頁(1997)]上發(fā)表的題為“單光子狀態(tài)的定位”的文章。這種結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出相當大的傳播損耗，相當于模式定位在μm范圍內(nèi)。
與由例如玻璃或聚合物構(gòu)成的光學(xué)被動平臺不同，本發(fā)明的平臺可以認為是光學(xué)主動的。此處，光學(xué)主動意味著通過能量限制增加激發(fā)光束的電磁場。
該平臺的基板可以由無機材料，如玻璃、SiO2，石英，Si形成?；蛘咴摶蹇梢杂捎袡C材料，如聚合物，最好是聚碳酸酯(PC)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚酰亞胺(PI)，聚苯乙烯(PS)，聚乙烯(PE)，聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚氨酯(PU)構(gòu)成。這些有機材料對于點護理(POC)和個人化的醫(yī)療應(yīng)用來說尤其優(yōu)選，因為玻璃在這種環(huán)境中不能被接受。與玻璃相比可以更加容易地形成(壓印)塑料基板。在一個例子中該基板由玻璃構(gòu)成。
光學(xué)透明層可以由無機材料構(gòu)成。或者可以由有機材料構(gòu)成。在一個例子中該光學(xué)透明層是一種金屬氧化物，如Ta2O5，TiO2，Nb2O5，ZrO2，ZnO或HfO2。該光學(xué)透明層為非金屬物質(zhì)。
或者該光學(xué)透明層可以由有機材料制成，如聚酰胺，聚酰亞胺，聚丙烯(PP)，PS，PMMA，聚丙烯酸，聚丙烯醚，聚硫醚，聚苯硫醚和其衍生物(參見例如S S.Hardecker等人，J.Of Polymer Science BPolymer Physics，Vol.31，1951-63，1993)。
衍射溝槽的深度可以在3nm至光學(xué)透明層厚度的范圍內(nèi)，最好為10nm至光學(xué)透明層厚度，例如30nm至光學(xué)透明層的厚度。光學(xué)透明層的厚度在30至1000nm范圍內(nèi)，例如50至300nm，最好為50-200nm，波紋結(jié)構(gòu)的周期可以在200至1000nm范圍內(nèi)，例如200至500nm，最好為250-500nm，溝槽深度與光學(xué)透明層厚度之比可以處于0.02至1范圍內(nèi)，例如0.25至1，最好為0.3至0.7，而且溝槽寬度與溝槽周期之比(“占空比”)可以處于0.2至0.8范圍內(nèi)，例如0.4至0.6。
溝槽截面通?？蔀榫匦??；蛘撸瑴喜劭梢詾檎沂交蜾忼X形截面。表面結(jié)構(gòu)通?？蔀閷ΨQ的。優(yōu)選的幾何結(jié)構(gòu)包括矩形，正弦和梯形截面?；蛘?，溝槽可以具有鋸齒形截面(閃耀光柵)或具有其它非對稱幾何結(jié)構(gòu)。在另一方面，溝槽深度可以改變，例如在周期調(diào)制中溝槽深度發(fā)生變化。
該平臺可以是正方形或矩形的，而且溝槽可以沿平臺線性擴展從而覆蓋表面?；蛘咂脚_可以為盤狀，而且溝槽可以為圓形或線形。
溝槽可以形成在基板表面上。或者溝槽可以形成在光學(xué)透明層的表面上。作為另一種可選方案，溝槽可以同時形成在基板的表面上和光學(xué)透明層的表面上，基板表面為界面。
可以對于一個特定的激發(fā)波長和一種特定類型的偏振對單個傳感區(qū)域的波紋表面最優(yōu)化。通過適當?shù)姆椒?，如幾個相互平行或垂直的周期性結(jié)構(gòu)的重疊，可以得到適用于平臺的多波長應(yīng)用的周期性表面起伏，(“多顏色”應(yīng)用)。或者，可以針對不同波長和/或偏振方向?qū)σ粋€平臺上的單個傳感區(qū)域進行最優(yōu)化。
光學(xué)透明層的表面可以包括一或多個波紋化傳感區(qū)域，其中每個波紋化傳感區(qū)域可以攜帶一或多個俘獲元件。
每個俘獲元件可以包含能夠進行親合反應(yīng)的單獨的俘獲分子和/或俘獲分子的混合。各個俘獲元件的形狀可以是矩形，圓形，橢圓形或任何其它形狀。單個俘獲元件的面積在1μm2到10mm2之間，例如在20μm2到1mm2，最好在100μm2到1mm2之間?？梢詫⒎@元件設(shè)置成規(guī)則的兩維陣列。俘獲元件中心到中心(ctc)的距離可以在1μm至1mm之間，例如5μm到1mm，最好為10μm到1mm。
每個傳感區(qū)域上俘獲元件的數(shù)量在1到1,000,000之間，最好在1到100,000之間。在另一方面，可以不限制待固定在平臺上的俘獲元件的數(shù)量，并且可以相當于例如構(gòu)成感興趣的物種或生物體的基因組的基因、DNA序列、DNA基元、DNA微衛(wèi)星(micro satelite)、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、蛋白質(zhì)或細胞碎片的數(shù)量，或者它們的選擇或組合的數(shù)量。在另一個方面，本發(fā)明的平臺可以包含兩個或多個物種例如小老鼠和大老鼠的基因組。
為了能夠固定俘獲分子，該平臺可以包含一設(shè)置在光學(xué)透明層表面處的粘合促進層。該粘合促進層還可包括一多微孔層(陶瓷，玻璃，Si)，來進一步增加分析和檢測效力，或者包括一個凝膠層，該凝膠層可以用做實現(xiàn)俘獲元件固定和樣品分析的介質(zhì)，從而進一步增加分析和檢測效力，或者在凝膠電泳的意義上允許分析混合物的分離。該平臺可以形成有多個傳感區(qū)域，每個傳感區(qū)域具有其自身的衍射溝槽。
本發(fā)明平臺的特征在于，由于波紋平臺的特性，進入光學(xué)透明層的光能被立即衍射出該層。因而沒有導(dǎo)波發(fā)生或者可以忽略導(dǎo)波。一般傳播距離為100μm或更小，最好為10μm或更小。這是一個非常驚人的短距離。傳播距離是輻射能量減小到1/e時所經(jīng)過的距離。
本發(fā)明的第三個方面在于提供用于分析樣品的裝置，該裝置包括根據(jù)第一或第二方面的平臺，用于產(chǎn)生光束和用于引導(dǎo)光束、使光束以某一角度入射到平臺上的裝置，使得在平臺中發(fā)生瞬息諧振，從而在平臺的傳感區(qū)域中產(chǎn)生一增強的瞬息場，以及用于檢測設(shè)置在平臺傳感區(qū)域上的材料特性的裝置。入射光在平臺上的全反射的角度限制了適合于產(chǎn)生諧振條件的角度范圍。最佳角度小于45°，例如30°或更小，例如20°至10°或更低，例如0.1°至9.9°。該角度可能等于或近似正入射。光發(fā)生裝置可以包括一個用于發(fā)射相干激光束的激光器。其它適合的光源包括放電燈或低壓燈，例如Hg或Xe，其所發(fā)射的譜線具有足夠大的相干長度，以及發(fā)光二極管(LED)。該裝置還可能包括用于引導(dǎo)激光束的光學(xué)元件，使得激光束以一定角度θ入射在平臺上，以及用于形成相干光束偏振平面的元件，例如適合于透過線偏振光?？梢杂杀磉_式θ＝n-λ/A來限定θ，其中Λ為衍射溝槽的周期，λ為入射光的波長，n為光學(xué)透明層的有效折射率。
可以使用的激光器的例子有氣體激光器，固態(tài)激光器，染料激光器，半導(dǎo)體激光器。如果需要，可以通過非線性光學(xué)元件對發(fā)射波長進行倍頻。特別適合的激光器為發(fā)射275至753nm之間波長的氬離子激光器，氪離子激光器，氬/氪離子激光器，以及氦/氖激光器。非常適合的激光器為二極管激光器或半導(dǎo)體材料的倍頻二極管激光器，這些激光器具有小尺寸和低功率消耗。
另一種適合的激勵類型使用VCSEL’s(垂直腔面發(fā)射激光器)，可以分別激勵平臺上的識別元件。
可以將檢測裝置設(shè)置成用于檢測發(fā)光如熒光?？梢杂眠@種方法來標記親合對象，以便在將分析物分子與俘獲分子相結(jié)合時發(fā)生福斯特(Frster)熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)。取決于層系統(tǒng)的折射率值和相應(yīng)的菲涅爾系數(shù)，發(fā)光強度的最大值可能相對最大異常反射位置發(fā)生輕微的偏移。
樣品可以使用未稀釋的或者帶有添加溶劑的。適合的溶劑包括水，含水緩沖溶液，蛋白質(zhì)溶液，天然或人工低聚物或聚合物溶液，以及有機溶劑。適合的有機溶劑包括酒精，酮，酯，脂肪族羥，醛類，乙腈或腈。
增溶劑或添加劑可以包括，并且可以是有機或無機化合物或生化反應(yīng)劑，如焦碳酸二乙酯，苯酚，甲酰胺，SSC(檸檬酸鈉/氯化鈉)，SDS(十二烷基硫酸鈉)，緩沖反應(yīng)劑，酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，RNAase，有機或無機聚合物。
樣品還可以包括不溶于所使用的溶劑的成分，如顏料粒子，分散劑和天然及合成低聚物或聚合物。
用做標記的熒光染料可以被化學(xué)地或物理地，例如通過靜電，與一或多個存在于分析物溶液中和/或固定在平臺上的親合結(jié)合對象(或它們的衍生物)相結(jié)合。在親合反應(yīng)中所包含的天然產(chǎn)生的低聚物或聚合物如DNA，RNA，糖類，蛋白質(zhì)或縮胺酸，以及人工合成的低聚物或聚合物的情況下，還適合于添加染料?？梢酝ㄟ^生物相互作用如生物素/抗生物素蛋白結(jié)合或諸如HIS-tag偶合的金屬絡(luò)合物形成，將發(fā)光物質(zhì)附著在分析物溶液中存在的親合對象上。
可以將一或多個發(fā)光標記附著在分析物溶液中存在的親合對象上，附著在固定在平臺上的俘獲元件上，或者同時附著在分析物溶液中存在的親合對象和固定在平臺上的俘獲元件上，來定量地確定一或多個親合結(jié)合對象的存在。可以選擇發(fā)光標記的光譜特性，使其符合福斯特能量轉(zhuǎn)移或光致電子轉(zhuǎn)移條件。從而受體和供體的距離和與濃度相關(guān)的發(fā)光可以被用于分析物分子的定量分析。
可以在分子間和/或分子內(nèi)這種結(jié)合成親合反應(yīng)中所包含的分子的供體與受體之間相互作用的基礎(chǔ)上進行親合結(jié)合對象的定量分析。發(fā)光供體和受體的分子內(nèi)組合共價地與親合結(jié)合對象相鏈接，分子信標(Molecular Beacons)[S.Tyagi等人，Nature Biotechnology(天然生物工程技術(shù))，1996，14，303-308]改變了親合反應(yīng)中供體與受體之間的距離，還可以被用做用于分析物溶液的俘獲分子或添加劑。另外，可以使用pH和潛在敏感的發(fā)光物質(zhì)或?qū)γ富钚悦舾械陌l(fā)光物質(zhì)，如發(fā)光衍生物的酶媒介形成。
轉(zhuǎn)移熒光球(Transfluorospheres)或其衍生物可以被用做熒光標記，并且化學(xué)發(fā)光或電子發(fā)光分子可以被用做標記。
為了附著在一或多個親合對象上，對在400nm至1200nm范圍內(nèi)發(fā)光的發(fā)光化合物進行功能化或改性，如下列物質(zhì)的衍生物聚苯和雜芳族化合物1，2-二苯乙烯，香豆素，呫噸染料，次甲基染料，噁嗪染料，若丹明，熒光素，香豆素，1，2-二苯乙烯，芘，苝，菁藍，氧雜菁藍，酞菁，紫菜堿，水楊酸菁藍(naphthalopcyanines)，偶氮苯衍生物，聯(lián)苯聯(lián)苯乙烯，過渡金屬絡(luò)合物例如聚吡啶基/釕絡(luò)合物，三(2，2’-聯(lián)吡啶基)氯化釕，三(1，10-菲咯啉)氯化釕，三(4，7-聯(lián)苯-1，10-菲咯啉)氯化釕，和聚吡啶基(polypyridy)/吩嗪/釕絡(luò)合物，如八乙基-鉑-卟啉，銪和鋱絡(luò)合物可以被用做發(fā)光標記。
適用于血液或血漿分析的染料為具有吸收和發(fā)射波長在400nm至1000nm范圍內(nèi)的染料。另外可以使用適合于雙或三光子激勵的發(fā)光物質(zhì)。
適用于本發(fā)明的染料可以包括用于共價結(jié)合的官能團，例如諸如熒光素異硫氰酸鹽的熒光素衍生物。還可適用的是從Amersham生命科學(xué)得克薩斯有限公司和Molecular Probes有限公司買到的有用的熒光染料。
其它適合的染料包括用脫氧核苷三磷酸鹽(dNTP)改性的染料，能夠被酶催化引入到RNA或DNA鏈中。其它適合的染料包括Quantum Dot粒子或小珠(Quantum Dot公司，Palo Alto，CA)或其衍生物，或者過渡金屬絡(luò)合物的衍生物，可以在一個和相同限定波長處被激勵，衍生物在可識別的波長下表現(xiàn)出熒光發(fā)射。
可以通過直接結(jié)合發(fā)光標記檢測分析物，或者通過與附加發(fā)光標記的物質(zhì)進行競爭，或者通過結(jié)合到用做一個和/或多個分析物物質(zhì)和/或俘獲元件的標記的發(fā)光供體與發(fā)光/電子受體的與濃度-，距離-，ph-，電位-，或氧化還原電位相關(guān)的相互作用來間接地檢測分析物?？梢詼y量供體的發(fā)光和/或猝滅劑的發(fā)光，來定量分析待分析物。
用相同的方式可以按這種方法來標記親合對象，使電子轉(zhuǎn)移或光致電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致對分析物分子與俘獲分子相結(jié)合基礎(chǔ)上的熒光進行抑制。
用于熒光的適當?shù)臋z測器包括CCD-攝象機，光電倍增管，雪崩光電二極管，光電二極管，混合光電倍增管。
可以將檢測裝置設(shè)置來另外檢測折射率的變化。
可以將入射光束設(shè)置來照射傳感區(qū)域或一個共同平臺上的所有傳感區(qū)域。或者可以將光束設(shè)置成僅照明待分析傳感區(qū)域的一個小的子區(qū)域，并且可以對光束和/或平臺進行設(shè)置使它們可以進行相對運動以便掃描平臺的傳感區(qū)域。
因而，可以以適當方式設(shè)置檢測裝置，以在單個曝光步驟中獲得整個傳感區(qū)域的發(fā)光信號強度?；蛘呖梢詫z測和/或激勵裝置進行設(shè)置以便逐步掃描傳感區(qū)域。
該裝置可以包括一貼著(against)平臺的傳感區(qū)域定位的盒，以使樣品與傳感區(qū)域相接觸。該盒可以包含其它裝置以便以小規(guī)模的方式執(zhí)行樣品制備、稀釋、濃縮、混合、生物/化學(xué)反應(yīng)、分離(參見WO97/02357)。該裝置可以包括用于包含多個待研究樣品的微滴定型裝置。
本發(fā)明的第四個方面提供了一種用于分析一種或多種樣品的方法，包括將樣品與根據(jù)第一或第二方面的平臺的傳感區(qū)域相接觸，用光束照射該平臺使得在平臺的傳感區(qū)域中發(fā)生瞬息諧振，并檢測從傳感區(qū)域發(fā)出的輻射。該方法可以包括向被研究樣品添加熒光誘發(fā)材料，并且檢測由增強的瞬息場激勵樣品在所述樣品中誘發(fā)的熒光?；蛘咴摲椒梢园ㄏ虮谎芯繕悠分刑砑訜晒庹T發(fā)或抑制材料，和/或?qū)⒈谎芯繕悠忿D(zhuǎn)變成熒光或抑制衍生物，并且檢測固定在檢測平臺上的所述樣品由增強瞬息場激勵而產(chǎn)生的熒光。
可以相信，提供一種傳感器平臺，其中每個傳感區(qū)域具有固定在其上的不只一個類型的俘獲元件或分子，是一個新穎和富于創(chuàng)造性的概念。無論對于為瞬息諧振模式還是更傳統(tǒng)的諸如波導(dǎo)模式而設(shè)計的平臺來說，這種概念都適用。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種用于樣品分析的平臺，所述平臺具有一或多個傳感區(qū)域，每個傳感區(qū)域用于接收一或多個俘獲元件，當用相干光對該平臺進行照射時，其相互作用可提供親合反應(yīng)的指示，其中每個俘獲元件包括兩種或多種類型的俘獲分子。
現(xiàn)在將僅通過例子，特別是參照附圖對本發(fā)明進行描述。在附圖中

圖1為示意圖，說明用于分析根據(jù)本發(fā)明的平臺的光學(xué)參數(shù)和瞬息諧振條件的質(zhì)量控制裝置；圖2為示意圖，說明根據(jù)本發(fā)明的傳感器平臺；圖3為示意圖，表示相對于平臺的瞬息場分布；圖4a和4b為表示芯片盒的示意圖；圖5表示本發(fā)明一個實例中的陣列布局圖；圖6示意性地表示出根據(jù)本發(fā)明一個實例的用于測量熒光的配置；圖7表示現(xiàn)有技術(shù)和本發(fā)明所得到的結(jié)果的比較；圖8說明了平臺的其它形式；圖9a到9c表示使用目前的平臺在例5所描述的諧振條件下，在30pMPM分析物的培育、再生和30pM MM分析物之后得到的熒光圖象；圖10表示使用目前的平臺在超熒光(epifluorescence)和例6所描述的諧振條件下得到的熒光圖象和數(shù)據(jù)。
現(xiàn)在將根據(jù)對樣品中所激發(fā)的發(fā)光的確定來描述本發(fā)明。這種確定包含了構(gòu)成本發(fā)明一個方面的傳感器平臺的使用，不過應(yīng)該理解這種平臺的使用不必限定于所描述的特定應(yīng)用。在詳細描述平臺之前，將對其進行概要說明，其中該平臺可以被用于確定樣品的發(fā)光。
下面是說明中所使用的限定術(shù)語。
平臺包含一或多個傳感區(qū)域的整個變換器/芯片，傳感區(qū)域能夠通過諧振效應(yīng)產(chǎn)生一瞬息場，并包含一或多個俘獲元件的整個波紋區(qū)域，俘獲元件包含一或多種俘獲分子種類(species)的單個傳感標記(sensing spot)，俘獲分子能夠進行親合反應(yīng)的單個分子。
參照圖1表示出根據(jù)本發(fā)明一個方面的平臺(10)，可以接收來自激光器(11)的相干光，該激光經(jīng)過透鏡組(12，14)被進行擴束，產(chǎn)生一被擴束的平行光束(16)，并且該光束被偏振片(18)偏振。如同下面更加詳細地解釋的那樣，平臺(10)具有一傳感區(qū)域，俘獲分子固定在傳感區(qū)域上。光波長通常處于UV到NIR范圍內(nèi)，最好在350nm至1000nm范圍內(nèi)。
該裝置還包括一檢測器(20)用來檢測透過平臺(10)的光，一CCD攝象機(21)用來檢測所反射的光，以及一數(shù)據(jù)處理單元(22)。
在該裝置的使用過程中，高度平行、擴束的相干線偏振激光束(16)入射在平臺(10)的傳感區(qū)域上，并且透過該平臺的光被檢測器(20)檢測，而且所反射的光被CCD攝象機(21)記錄。被擴束的激發(fā)光束的直徑大于平臺(10)的尺寸。通過旋轉(zhuǎn)平臺來調(diào)節(jié)光束在平臺上的入射角度，直到檢測器(20)實際檢測到?jīng)]有光透過平臺。這表明在平臺的傳感區(qū)域中存在發(fā)生瞬息諧振的諧振位置。在這種條件下，由攝象機(21)所記錄的反射光強度達到最大值，數(shù)據(jù)處理單元(22)從攝象機得到數(shù)據(jù)用于進行處理。
現(xiàn)在參見附圖2，該平臺(10)的實施例包括一玻璃基板(30)，在其頂面中蝕刻了多個溝槽(31)。在基板(30)的上表面上沉積一層光學(xué)透明的金屬氧化物(32)，且在該層(32)中也形成了溝槽(33)。該基板(30)可以由玻璃構(gòu)成，如Schott制造的AF45玻璃，并且通常厚度為0.5mm-1.0mm。應(yīng)該理解其它有機或無機材料，只要是光學(xué)透明的均可以用做基板。
光學(xué)透明層是一介電透明金屬氧化物薄膜，如在633nm波長下具有大約2.2的高折射率即比基板折射率高很多的Ta2O5。該層的厚度通常在50至200nm或更大的范圍內(nèi)，例如50至300nm。波紋結(jié)構(gòu)(31)和(33)的周期在200-1000nm范圍內(nèi)，例如200至500nm，一般為250-500nm。波紋結(jié)構(gòu)/衍射溝槽的深度可以在3nm至光學(xué)透明層厚度的范圍內(nèi)，最好為10nm至光學(xué)透明層的厚度。金屬氧化物可以是若干例子諸如Ta2O5，TiO2，Nb2O5，ZrO2，ZnO或HfO2中任意一種。
在如圖2所示的平臺中，當偏振激光的平行光束以特定入射角入射其上時，在層(32)中發(fā)生稱之為異常反射的效應(yīng)。當發(fā)生這種效應(yīng)時基本上沒有光透過平臺(10)，實際上所有的光在層(32)中反射，使此相干激光被限制在非常薄的金屬氧化物層(32)中。所產(chǎn)生的高激光場部分地泄露到層(32)外面，產(chǎn)生瞬息場，該瞬息場瞬逝激發(fā)處于層(32)表面上或非常鄰近處的熒光材料。應(yīng)該注意，僅當采用具有特定或更大深度的衍射溝槽(31，33)時能夠得到這種諧振條件，還應(yīng)該注意這種波紋結(jié)構(gòu)的輻射損失非常高，從而實際上在金屬氧化物層(32)內(nèi)沒有發(fā)生最佳波長范圍內(nèi)任何電磁輻射的波導(dǎo)。最好是溝槽的深度至少為10nm，不過在更淺溝槽時就開始產(chǎn)生瞬息諧振。然而，假設(shè)被研究樣品處于諧振發(fā)生處的層(32)附近，可以使用增強的瞬息場來激勵發(fā)光，如樣品中的熒光。
本平臺的一個重要特征在于在諧振位置處該瞬息場的幅度比現(xiàn)有技術(shù)的裝置(相當于失諧條件的超熒光)大近似100個量級。
這意味著發(fā)光強度，例如可以從樣品中產(chǎn)生的熒光，也可以被增加100倍?？梢詫⑵脚_的功能看做起體光柵作用的衍射結(jié)構(gòu)，它衍射光，并且衍射光束干涉產(chǎn)生諧振條件，其中從第一界面所反射的光和從作為層(32)上表面的頂面所反射的光相長干涉，產(chǎn)生反射最大值。在諧振條件下，激光能量基本上被限制在薄層(32)的厚度內(nèi)，從而增加了電場強度。對于給定激光波長和波紋結(jié)構(gòu)周期，此諧振具有角度依賴性。角度依賴性諧振通常在半最大高度(FWHM)處具有的寬度＞0.1°最好是0.5°或更大，例如1.0°或更大。這種諧振寬度取決于溝槽深度，占空度和波紋結(jié)構(gòu)的幾何形狀。與波導(dǎo)光柵的耦合行為相比，所描述諧振的FWHM比幅值大許多量級。
應(yīng)該理解，可以通過適當?shù)膫鹘y(tǒng)技術(shù)在平臺上形成衍射溝槽(31，33)。一種實現(xiàn)該目的的方法為通過照相技術(shù)蝕刻溝槽。在這種技術(shù)中，在基板表面上沉積深度大約為1μm的光刻膠成分，然后通過使用雙光束干涉測量術(shù)/全息或者使用相位掩模在光刻膠中寫入相當于形成溝槽的周期性結(jié)構(gòu)，然后使用氬氣體通過活性離子蝕刻技術(shù)對光刻膠進行刻蝕，最后從表面剝除剩余光刻膠材料。這種技術(shù)可以用于形成溝槽(31)和(33)。引入波紋結(jié)構(gòu)的其它方法包括浮凸印花，電子束寫入，激光切割，LIGA方法。
為了制備圖2所描述類型的平臺，以便該平臺可以用于諸如圖6所說明的測量中，應(yīng)該采用下述多個步驟。
第一步是清潔平臺，以從平臺表面去除雜質(zhì)?？梢酝ㄟ^多種方法來實現(xiàn)該清潔步驟，例如通過紫外清潔器，通過等離子體清洗，或者通過使用諸如酸性物，堿(bases)，溶劑，氣體和液體進行化學(xué)清洗。
一旦已經(jīng)完成平臺的清潔，下一步是向金屬氧化物層的表面施加一層粘合促進劑。由于沉積在平臺上的俘獲元件本身不可能穩(wěn)定地附著在金屬氧化層上，因而施加該層至平臺上。有多種形成該層的方法。一種方法是形成一層硅烷分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，另一種方法是使用稱之為自組裝單分子層(SAM)。這些已知技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。例如在Colloids and Interface Science 6(L Boksanyi，O Liardon，EKovats，1976，95-237)中描述的可能包含液態(tài)或氣態(tài)相的硅烷化。例如，Abraham Ulman(1991，Academic Press inc.)在“超薄有機薄膜”中描述的自組裝單分子層的構(gòu)成。另外，還有其它適合于固定俘獲元件的方法，如-使用反應(yīng)基對芯片表面進行化學(xué)改性，以及使用適當?shù)你暯游飳Ψ@分子進行化學(xué)改性(U.Maskos和E.M.Southern，Nucleic AcidsResearch 1992，vol.20，1679-84)，-使用光致反應(yīng)鏈/團對表面和俘獲分子進行改性(WO98/27430和WO91/16425)，-通過庫侖相互作用進行固定(EP 0 472 990A2)，-在螯合反應(yīng)中通過標記進行連接(如蛋白質(zhì)-標記，HIS-標記)，-以及多種其它方法，例如如Klaus Mosbacher(主編)的Method inEnzymology Academic Press，紐約，Vol.137(1988)，“固定的酶和細胞”中所描述的，-等離子體引發(fā)包含官能團/委應(yīng)基的粘合促進層的固定/產(chǎn)生，能夠使俘獲分子或衍生的俘獲分子直接連接，或者通過化學(xué)鏈接或光化學(xué)鏈接使俘獲分子或衍生的俘獲分子間接連接。
例如可以通過具有3-(丙氧基縮水甘油)三甲氧基硅烷(GOPTS)的硅烷化來制造粘合促進層。包含親核性基團如胺類的化合物可以與硅烷的環(huán)氧樹脂官能起反應(yīng)來進行共價固定。由于抗體由氨基酸組成，所以這種硅烷化可以被用于例如包含多個氨基的抗體的固定。另外，作為俘獲分子的DNA/RNA/PNA鏈(strand)也可以由氨基進行改性，以便使這些俘獲分子共價地附著在平臺上，如應(yīng)用例4所示(SNP識別)。在這個例子中，具有氨基的寡核苷酸已經(jīng)被共價地固定在平臺的表面處。不過，為了實現(xiàn)這個目的可以對其它類型的俘獲分子進行固定。
另外，為了改變表面特性可以對粘合促進層進行進一步地化學(xué)改性。例如，為了控制平臺的疏水/親水平衡，硅烷化過的GOPTS平臺能夠與功能化的飽和或未飽和的有機/雜—有機/無機分子/衍生物發(fā)生反應(yīng)，即改變平臺的接觸角。另外，可以使用離子化合物或潛在的離子化合物在平臺的表面處產(chǎn)生正電荷或負電荷?？梢酝ㄟ^共價或物理吸附或帶電分子的庫侖相互作用或上述方法的混合將俘獲分子與改性的表面/平臺相結(jié)合。在下面的實施例2中對此進行了說明，其中使用3-氨基-1-丙醇來改性第二反應(yīng)步驟中硅烷化GOPTS平臺的表面特性，以便固定DNA/RNA/PNA俘獲分子。在這個例子中，在平臺表面上引入的氮(胺基)被質(zhì)子季銨化，因而提供正電荷與DNA的負電荷反應(yīng)相互作用(聚電解質(zhì)特性)。除了3-氨基-1-丙醇以外，還可以使用其它的胺類有機衍生物，如脂肪族胺或支化脂肪族胺，或者包含芳香族或非芳香族環(huán)狀結(jié)構(gòu)的胺類，或者包含雜原子的胺類，或者包含官能團的胺類，或者包含其化合物的胺類，來固定俘獲分子，例如DNA/RNA/PNA鏈。
可以使用功能化的有機分子來提供烴鏈，給平臺提供更大的疏水性，可以使用極性基為平臺提供更大的親水性，或者可以使用離子基或潛在離子基來引入電荷。例如，可以使用聚乙二醇(PEG)或其衍生物為平臺提供更大的親水性，防止蛋白質(zhì)到平臺/表面的非特殊的吸收。
可以將反應(yīng)基或光活性基附在平臺的表面上，可以用作進一步反應(yīng)步驟的固定基。
通過用雙親的烷基磷酸酯(例如硬脂基磷酸酯)對平臺進行處理可以獲得適用于固定抗體的作為粘合促進層的SAM。磷酸酯(鹽)首基與平臺表面處的羥基反應(yīng)，導(dǎo)致形成雙親的烷基磷酸酯(鹽)的有序的單分子層。磷酸氫(Hydrophophic)烷基鏈為平臺的表面提供了疏水性，使抗體能夠進行物理吸附，如實施例6所示(多重免疫測定)。
SAM還可以用于其它俘獲分子的固定，例如用于DNA/RNA/PNA鏈。在這種情形中，可以使用雙親的磷酸酯(鹽)/利用例如胺基或環(huán)氧樹脂基改性的磷酸酯(鹽)。俘獲分子可以直接與SAM結(jié)合，例如與胺改性的SAM結(jié)合，或者在平臺與胺類的有機衍生物例如脂肪族胺或分支脂肪族胺，或包含芳香族或非芳香族環(huán)狀結(jié)構(gòu)的胺類，或者包含雜原子的胺類，或者包含官能團的胺類，或者包含其化合物的胺類，或者任何其它有機，雜—有機和/或無機分子(例如環(huán)氧樹脂改性的SAM)反應(yīng)之后進行結(jié)合。
粘合促進層可以由多層組成，以便控制表面特性，例如疏水性，接觸角，電荷密度。另外，使用上述方法中任何一種附著在平臺上的層可以提供或引入化學(xué)官能度，或者是下一個隨后的層要求的，或者用于鏈接俘獲分子或衍生的俘獲分子。也可以將化學(xué)鏈接分子或光化學(xué)鏈接分子的附著看作一個中間層，能夠使俘獲分子附著在平臺上。
這種具有不同官能度的層/分子的受控結(jié)合總體上歸因于超分子化學(xué)[J-M.Lehn，超分子化學(xué)—領(lǐng)域和展望。分子、超分子和分子器件(NobelLecture，8.12.1987)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，27，89，1988.]。所得到的超分子結(jié)構(gòu)提供了一種功能，其不同于用于各個層的單個分子的功能。對于本發(fā)明，中間層也可以將發(fā)光物質(zhì)引入這種層系中，可以在俘獲分子或改性的俘獲分子被附著在平臺上之前，被用做福斯特能量轉(zhuǎn)移(FRET)，或者光致電子轉(zhuǎn)移，或者潛在敏感發(fā)光物質(zhì)意義上的能量供體或能量受體/猝滅劑。
對于前面所描述的表面處理方法，可以使用下面的有機或無機分子及其衍生物胺類，改性的胺類，杰弗胺類(jeffamines)，脂肪族胺，酒精，酸，醛類，酮，酰胺，酐，磷酸鹽(酯)，膦酸鹽(酯)，硫酸鹽(酯)，磺酸鹽(酯)，硫醇，包含化合物的雜原子，芳香族和脂肪族有機官能化分子，芳香族和脂肪族雜—有機分子，天然和人工合成聚合物，硅烷，用化學(xué)或光化學(xué)反應(yīng)基改性的分子，其衍生物和功能化的例如所列出各種的ω-功能化衍生物。
原則上，對于組成一層或多層的層結(jié)構(gòu)的構(gòu)成，對于所使用的具有所有上述表面處理的分子，要求化學(xué)反應(yīng)基和/或具有特殊物理或電化學(xué)特性(例如電荷)的化學(xué)族。
可以采用化學(xué)/光化學(xué)相互作用(例如添加劑，親核性/親電子性置換，自由基之間的反應(yīng)，凝結(jié)，與有機/雜—有機/無機羥基衍生物的反應(yīng)，或光致反應(yīng)，或熱致反應(yīng)，Lewis酸/堿原則)，和/或物理/電化學(xué)相互作用(例如庫侖相互作用，疏水/親水相互作用)，和/或生物相互作用(例如抗原/抗體，雜化作用，Streptavidin/Avidin-Biotine相互作用，激動劑/拮抗劑相互作用)，和/或光化學(xué)/光物理相互作用，用于結(jié)合這種層系/粘合促進層中所采用的分子/成分。
還可以通過在平臺的表面上沉積一個多微孔層或凝膠來實現(xiàn)粘合促進，該多微孔層或凝膠的表面特性/功能便于俘獲元件的沉積，縮短了所需要的培養(yǎng)時間，增強了后續(xù)測量的靈敏度。多微孔層可以包括有機化合物，如聚合物，單體，分子集合和超分子集合，或者可以包括無機化合物，如玻璃，石英，陶瓷，硅和半導(dǎo)體。
可以通過使用例如3-(丙氧基縮水甘油)三甲氧基硅烷(GOPTS)的硅烷化來制造粘合促進層。為了改變表面特性可以對粘合促進層進行進一步化學(xué)改性。例如，硅烷化的GOPTS平臺可以與功能化的飽和的或未飽和的有機分子發(fā)生反應(yīng)，以便控制平臺的疏水/親水平衡，從而改變平臺的接觸角。
一旦已經(jīng)在平臺上形成該粘合促進層，必須采用另外的一或多個清潔步驟來去除該層的制備過程中所使用的過量的化學(xué)材料。在清潔之后，平臺準備好接收俘獲元件。
在沉積在平臺上之前，在粘合促進層的3-D表面上形成俘獲或識別元件的二維陣列?？梢允褂枚喾N方法來沉積該俘獲元件陣列。用于沉積俘獲元件的技術(shù)包括噴墨式打印機，其具有壓電致動器，電磁致動器，壓力閥/電磁閥致動器或其它測力傳感器；使用熱電致動器的噴氣泡(bubble jet)打印機；或激光致動器；環(huán)形銷打印機；銷測位儀裝置；如WO90/03382或WO92/10092中所描述的芯片內(nèi)合成；非常大規(guī)模的固定聚合物合成(VLSIPS)如WO98/27430中所描述的；固定在粘合促進層表面處的特殊設(shè)計光反應(yīng)基的光催化/光去保護；微接觸打印機；微接觸書寫筆；畫筆或俘獲元件的轉(zhuǎn)移/沖壓墊片；通過從諸如PMMA原版例如使用PDMS(聚二甲氧基硅烷)或通過微機械或機械裝置，或者通過用于俘獲元件本地輸送的蝕刻技術(shù)通過鑄造得到微流體通道和流體單元；通過光切割形成俘獲元件結(jié)構(gòu)；或者使用其中一種前面提到的技術(shù)或者任何其它光固定技術(shù)將俘獲元件沉積在凝膠墊片上。
可沉積在平臺上的俘獲或識別元件可以有許多，并且可以是各種各樣的。通常來說，所使用的俘獲分子應(yīng)該能夠發(fā)生親合反應(yīng)。可以用在本平臺中的識別或俘獲分子的例子如下核苷酸，寡核苷酸(和其化學(xué)衍生物)DNA(雙鏈或單鏈)a)線性(和其化學(xué)衍生物)
b)環(huán)狀(例如質(zhì)粒，粘粒，BACs，ACs)總RNA，信使(messenger)RNA，cRNA，線粒體RNA，人工RNA，aptamers PNA(肽核酸)多克隆，單克隆，重組，工程化抗體，抗原，半抗原，抗體FAB亞基(如果需要則進行改性)蛋白質(zhì)，修飾的蛋白質(zhì)，酶，酶輔因子或抑制劑，蛋白質(zhì)復(fù)合物，植物血凝素，組氨酸標記的蛋白質(zhì)，用于組氨酸標記成分(HIS-tag)的螯合劑，標記的蛋白質(zhì)，人工抗體，分子印記，質(zhì)體膜受體，整個細胞，細胞碎片和細胞亞結(jié)構(gòu)，突觸，激動劑/拮抗劑，細胞，細胞器如微粒體小分子如苯二氮雜類(benzodiazapines)，前列腺素，抗生素，藥物，代謝物，藥物代謝物天然產(chǎn)品碳水化合物和衍生物天然和人工配體類固醇，激素肽天然或人工聚合物分子探針天然和人工受體及其化學(xué)衍生物螯合反應(yīng)劑，冠醚，配體，超分子集合指示劑(pH，電位，膜電位，氧化還原電位)組織樣品(組織微陣列)。
可以使用多種方法使俘獲分子的活性或密度最優(yōu)化?？梢詫⑵渖铣练e有俘獲元件的平臺在飽和水蒸汽環(huán)境下培養(yǎng)一規(guī)定時間，以便使印刷的軌跡回濕。這可使俘獲分子的密度最優(yōu)化，即增加每單位面積可能的結(jié)合位置。隨后可以對所培養(yǎng)的芯片烘烤一定時間，例如對于cDNA俘獲分子在80℃下烘烤一分鐘。可以用少量純凈水或任何其它適當液體或溶液將平臺噴濕，以避免過量未結(jié)合材料所造成的俘獲元件的交叉污染。在這些過程之后，可以將所制備的平臺保存在干燥器中以備使用。在使用芯片之前，可能要求使用0.1至10ml雜化緩沖液或其它適當?shù)娜芤?液體對其進行另外的沖洗步驟，復(fù)活/復(fù)水干燥的俘獲元件，并且進一步去除過量的未結(jié)合俘獲元件/緩沖劑殘余物。在DNA俘獲分子的情形中，發(fā)現(xiàn)當在50至85℃之間的溫度處執(zhí)行沖洗時，沖洗過程最有效。
可以使用雜化站所，如Genomic Solutions Inc.，Michigan，US的GeneTAC雜交站自動進行芯片操作的處理步驟。
所描述的特殊測量技術(shù)為涉及特定熒光的發(fā)光。在進行測量時，將被研究樣品放在平臺的傳感區(qū)域上，在平臺上設(shè)置有俘獲元件。為了得到熒光，在測量開始之前將熒光物質(zhì)加入系統(tǒng)?？梢詫晒馕镔|(zhì)加入樣品，例如作為被標記的親合對象，不過還可以將熒光物質(zhì)附著在平臺上的俘獲元件上。測量是基于這個事實，即通過與被分析物或待研究樣品發(fā)生相互作用而改變從包含被標記俘獲分子的俘獲元件和/或從被標記的親合對象發(fā)出熒光?？梢允褂貌煌詈桶l(fā)射波長的標簽，存在一種或幾種不同的標簽，標簽1用于對照實驗，標簽2用于實驗。
圖3示意性地表示出在諧振位置處瞬息場的能量分布，以及它是如何擴展到金屬氧化層(32)表面之外，使得能夠激發(fā)處于傳感區(qū)域的表面鄰近處的熒光物質(zhì)，例如附著于俘獲分子的熒光物質(zhì)或者附著于與俘獲分子(38)結(jié)合的分子的熒光物質(zhì)。在大約一微米范圍內(nèi)，瞬息場呈指數(shù)減小至零。
應(yīng)該理解到在執(zhí)行分析時進行一或多個測量。一種可能是樣品與俘獲元件接觸之前的背景測量。在樣品已經(jīng)與俘獲元件相接觸或者在樣品與俘獲元件接觸之后可以進行第二個測量。為了比較多個樣品，例如基因表達實驗中“control(控制)”和“treated(處理)”樣品，在實施例2所描述的“control”實驗之后芯片可以被再生，可以進行另外的背景測量和將“treated”樣品施加給芯片之后/過程中的測量。為了得到有關(guān)親合對象的反應(yīng)動力信息，可以將完整的一組測量作為培養(yǎng)時間和/或后沖洗時間函數(shù)進行記錄。圖6表示用于這種測量的典型裝置。將圖2中所示的平臺調(diào)節(jié)到獲得瞬息諧振的角度，并且使用CCD攝象機(66)測量從平臺表面發(fā)出的熒光。這就表示從沉積在平臺上的俘獲元件陣列上每個位置發(fā)出熒光?？梢詫ζ溥M行分析，推論在俘獲元件與被研究樣品之間發(fā)生的反應(yīng)的親合性。
圖6中所示的裝置在一次曝光中收集了全部發(fā)光，例如熒光，一次曝光中整個平臺的圖象，在測量過程中不必要運動任何部分。這種非掃描裝置可能會非常簡單和廉價，尤其適合于點護理應(yīng)用或便攜系統(tǒng)。另一種典型的裝置利用光學(xué)元件將相干激光限制在微米范圍內(nèi)，從而提高焦點中的電場，并對傳感區(qū)域進行掃描。
應(yīng)該理解，可以使用本技術(shù)對多種樣品進行分析。通常樣品被完全溶解以便分析，這可能包括一種或多種被檢測物質(zhì)。樣品可以是凈化和被處理的組織的溶液，或者從活體解剖和實驗研發(fā)中得到的其它材料，包括用于診斷目的的樣品。樣品還可以是生物媒質(zhì)，如蛋黃，體液或其組成部分，如血液，血清和尿。還可以為地表水，溶液或從天然或合成媒質(zhì)中的提取物，如土壤或植物的一部分，來自生物方法的液體或合成液體。
為了進行測量，可以將樣品放入圖4a和4b所示類型的樣品盒中。該盒包括一由諸如PMMA的聚合物制成的外殼(41)。已經(jīng)將這種聚合物加工成限定一個中心隔室(44)，中心隔室的尺寸相當于平臺的尺寸。在隔室(44)中形成另一個凹陷來限定一小室(46)，通過O-形環(huán)(47)對小室(46)的邊緣進行密封。小室(46)在其頂部和底部是敞開的。可以通過流送線(45)將被分析溶液引入到O-形環(huán)(47)中的小室(46)內(nèi)?？梢酝ㄟ^閥門(43)控制流送線(45)中的流量。該盒包括一個蓋子(49)，蓋子設(shè)置在外殼上面并固定于外殼(41)上，以封閉盒的頂部。蓋子(49)包括一位于隔室(46)上的窗(50)，從而允許輻射穿過蓋子進入盒(46)。
在使用該盒時，外殼(41)鄰接平臺的表面設(shè)置，在平臺上形成有俘獲元件，使得蓋子(49)遠離該表面。這使得隔室(46)與平臺的傳感區(qū)域相通。然后通過流送線(45)將被研究樣品加到隔室(46)中，使得與平臺表面上的俘獲元件相接觸。然后如前所述在多個俘獲點處對所產(chǎn)生的熒光進行測量。
圖8說明平臺可選擇的形狀。
可以用多種方法設(shè)置傳感元件，例如矩形，圓形，正六邊形同心，橢圓形，線形或錯綜復(fù)雜的形狀。傳感區(qū)域可以是矩形，圓形或任何其它形狀。溝槽可以被設(shè)置成等間距直線，或者等間距圓形，或者可以相當于這種結(jié)構(gòu)的一部分。
平臺可以是矩形或盤形或者為任何其它幾何結(jié)構(gòu)。該平臺包括一或多個傳感區(qū)域，每個傳感區(qū)域包括一或多個俘獲元件，并且每個俘獲元件可以包括一或多個被標記的或沒有被標記的俘獲分子。
該平臺還適合于微滴定型平板/裝置以在單個微滴定穴(well)中執(zhí)行一或多個分析。對于所有平板類型96，384，1536，或者更高數(shù)量的微滴定穴都可以實現(xiàn)，與各個微滴定平板的尺寸無關(guān)。
下面是平臺的特例1.3-D平臺的物理性能異常反射1a.平臺1基因芯片變換器平臺包括一0.7mm厚的平面透明基板(Schott制造的玻璃AF45)。在該基板中使用光刻方法(沉積光刻膠，＜1μm；通過雙光束干涉/全息在光刻膠中寫入周期性結(jié)構(gòu)；使用氬氣體用活性離子刻蝕來蝕刻光刻膠；剝離殘余光刻膠)蝕刻一周期性表面結(jié)構(gòu)。
該表面結(jié)構(gòu)的形狀接近于正弦形。單個結(jié)構(gòu)的寬度(周期)為360nm。溝槽的深度為大約38nm。
在均勻結(jié)構(gòu)的玻璃表面上面沉積一絕緣的透明金屬氧化物薄膜(Ta2O5)，該金屬氧化物薄膜在633nm波長下具有大約2.2的高折射率。通過離子電鍍法來沉積金屬氧化物薄膜。層厚為130nm。由于高能量和各向異性沉積過程，玻璃表面的主要結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)移到金屬氧化物層的頂面。
當高度平行、擴束的相干激光束以特殊的角度θ(對應(yīng)于所謂的諧振位置)照射到變換器上時，幾乎所有的光被變換器平臺反射，0級透射強度被減小到小于1％(與任意角度處的90-95％相比)。
幾乎所有的光均被反射的諧振條件的寬度Δθ，與波長λ(633nm，固定的)和輻射損失系數(shù)α成正比。輻射損失系數(shù)受光柵溝槽深度、波紋結(jié)構(gòu)的幾何結(jié)構(gòu)和占空度的影響，且隨著溝槽深度的增加幾乎呈二次方增加。對于我們的情形(激光波長633nm，130nm金屬氧化物層，38nm溝槽深度)，輻射損失系數(shù)大約為2000/cm，即在這種層系中所引導(dǎo)的激光束的傳播距離，在由該周期結(jié)構(gòu)衍射出平臺之前，為1/2000cm＝5μm。這是一個相當短的距離。從而在這些條件下沒有波導(dǎo)發(fā)生。通過改進平臺主要參數(shù)，可以進一步減小傳播距離。
作為諧振效應(yīng)的特征，對于4mm直徑區(qū)域?qū)⑵叫泄馐?TE偏振)的強度調(diào)節(jié)為100μW(Newport NRC1835功率計)。平臺法線與入射光束之間的角度被旋轉(zhuǎn)為偏離異常反射的中心位置(諧振條件)1至2度。中心位置處于2.5°。然后以5/1000°步進速度(Newport NRC控制器PM500)對平臺進行旋轉(zhuǎn)，并改變監(jiān)測到的透射光束的功率。在諧振角下，少于1％(＜1μW)的初始透射光束到達檢測器。入射激光束的功率被完全反射(鏡面反射光束接近100％)。
在我們的情形中，對于異常反射的半最大值處的全寬度(FWHM)為0.9°。在整個傳感器表面上(18mm×18mm)反射的均勻性優(yōu)于90％。
1b.平臺2表面結(jié)構(gòu)的形狀接近于矩形。單個結(jié)構(gòu)的寬度(周期)為360nm。溝槽的深度為大約52nm。在均勻結(jié)構(gòu)的玻璃表面上沉積一層介電透明金屬氧化物薄膜(Ta2O5)，該金屬氧化物薄膜在633nm波長處具有大約2.15的高折射率。通過濺射來形成金屬氧化物薄膜。層厚為150nm。由于高能量和各向異性沉積過程，玻璃的主要結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)移到金屬氧化物層的頂面。
當高度平行、擴束的相干激光束以相當于諧振位置的特殊角θ照射到傳感器上時，幾乎所有的光都被傳感器平臺反射，0級透射光強度被減小到小于1％(與任意角度處的90-95％相比)。
幾乎所有的光均被反射的諧振條件的寬度Δθ，與輻射損失系數(shù)α成正比。對于我們的情形(激光波長633nm，150nm金屬氧化物層，52nm溝槽深度)，輻射損失系數(shù)大約為2000/cm，即在這種層系統(tǒng)中所引導(dǎo)的激光束的傳播距離，在由周期結(jié)構(gòu)衍射出平臺之前，為1/2000cm＝5μm。從而在這些條件下，沒有波導(dǎo)發(fā)生。
作為諧振效應(yīng)的特征，對于4mm直徑區(qū)域?qū)⑵叫泄馐?TE偏振)的強度調(diào)節(jié)為600μW(Newport NRC1835功率計)。平臺法線與入射光束之間的角度被旋轉(zhuǎn)為偏離異常反射位置(諧振條件)4度。然后以5/1000°步進速度(Newport NRC控制器PM500)對平臺進行旋轉(zhuǎn)，改變監(jiān)測到的透射光束的功率。在諧振角，少于0.5％(＜3μW)的初始透射光束到達檢測器。入射激光束的功率被完全反射(鏡面反射光束接近100％)。
由于根據(jù)與平臺1相比更深的溝槽，擴展了平臺2的諧振寬度，+1和-1衍射級的諧振曲線相互重疊，在法線入射處產(chǎn)生單一極寬的諧振。對于異常反射半最大諧振值的全寬度(FWHM)在我們的情形中為4.2°。在整個傳感器表面(18mm×18mm)上反射的均勻性優(yōu)于95％。
2.用于基因表達分析的例子a)制備參照圖2所描述的類型的傳感器平臺(尺寸18mm×18mm2)首先被在三氯甲烷(FLUKA，“purriss.”)中超聲處理兩次，然后在異丙醇(Merch，“Uvasol”)中處理兩次，每次15分鐘。然后將該平臺在真空中干燥，并且用UV清潔劑(Boeckel industries Inc，model 135500)清潔30分鐘。將鄰二甲苯加熱到75℃(攪拌)，并且將2％v/v 3-環(huán)氧丙氧基丙基-三甲氧基硅烷(Fluka，“purum”)以及0.2％v/v N-乙基二異丙基胺(Fluka，“purum”)加入到加熱的溶劑中(攪拌)。將該平臺安裝在框架中，然后在75℃下在溶液中培養(yǎng)7小時(攪拌)。隨后，將該平臺放入新鮮的乙腈(Fluka，“HPLC等級”)中超聲處理三次，每次15分鐘。然后將該平臺在2％v/v 3-氨基-1-丙醇(Fluka，“purum”)溶液中在乙腈中超聲處理15分鐘，然后在室溫下在相同溶液中培養(yǎng)一整夜(攪拌)。第二天，首先在新鮮的異丙醇(Fluka，“HPLC等級”)中將該平臺超聲處理三次15分鐘，隨后在新鮮的甲醇(Merck，“Uvasol”)中處理三次15分鐘。最后，干燥該平臺，并將其保存在真空干燥器中。
b)識別元件的固定使用噴墨打印機(Microdrop GmbH，Norderstedt，德國)將包括10個不同cDNA的陣列(每個cDNA10重復(fù)為CYP 450 1A1，CYP 450 2B1EST.，CYP 450 2B1，CYP 450 2B2，CYP 450 3A1 humen，CYP 450 3A2，CYP 450 4A1，β-肌動蛋白，GAPDH，外標物)印在平臺上。cDNA溶液的濃度為50ng/μL。直徑(10個噴墨液滴/位置)為大約250μm，斑點之間的間距大約為500μm。從而，10×10陣列的整個尺寸大約為5×5mm2。圖5示意性地表示出所固定的cDNA斑點的排列和說明。陣列被印制在尺寸為(18×18mm2)的平臺的中心。隨后，在飽和水蒸汽氛圍中在密封容器內(nèi)將該平臺培養(yǎng)一整夜。第二天，將所培養(yǎng)的芯片烘烤一預(yù)定時間，比如說在80℃下烘烤一分鐘。然后用去離子水沖洗該平臺，并使用氮氣進行干燥。
c)檢測設(shè)備圖6中示意性地表示出所使用的檢測設(shè)備。激勵激光器(61)(HeNe激光器，633nm，1.3mW)和20×擴束器(64)共同(62)固定在角度計(63)上。二向色反射鏡(68)將擴束的激光光束朝向平臺(67)引導(dǎo)。激光束的旋轉(zhuǎn)中心處于平臺(67)的金屬氧化物層的平面內(nèi)。從平臺表面發(fā)射的熒光經(jīng)過二向色反射鏡(68)被收集。另外使用熒光濾色片(65)將熒光(69)從激勵光中分離出來。使用裝配有Nikon Noct鏡頭(數(shù)值孔徑1.2)的冷卻的CCD攝象機(Astrocam EEV 30/11)測量從平臺表面發(fā)出的熒光圖象。角度計允許調(diào)節(jié)入射的擴束的激光束相對平臺的表面法線的角度。在瞬息諧振條件(即調(diào)節(jié)入射的擴束激光束的角度，使透過平臺的光表現(xiàn)為最小)下拍攝熒光圖象。
d)芯片盒圖4示意性地表示出將該平臺安裝在由PMMA/聚合物制造的特別設(shè)計的盒(41)中。凹陷(44)區(qū)域的尺寸為(18×18×0.7mm3)，培養(yǎng)室(46)為0.2mm深。培養(yǎng)室中的溶液通過0.5mm直徑的流通道(45)進行交換，流通道穿入PMMA中。通過進口/出口(42)交換盒的內(nèi)含物。將平臺設(shè)置在該盒的相應(yīng)的凹陷區(qū)中，使傳感區(qū)域朝向培養(yǎng)室。固定蓋子(49)，按壓平臺使之密封。蓋子中銑出的/微切削加工出的窗口(50)允許激勵光的照射和獲取平臺表面的熒光圖象。盒子的閥門到閥門之間的體積為大約14μL。
e)變性單元使用熱電元件控制流體盒中平臺的變性(79℃)，培養(yǎng)(42℃)，再生(79℃)和清洗(42℃)溫度。
f)樣品制備使用2組老鼠(每組3只)用于當前研究。使用80mg苯巴比妥，鈉鹽，在每千克活體重量(0.9％w/v NaCl)溶液中處理一組老鼠(treated)，并且僅使用0.9％NaCl處理第二組老鼠(control)。連續(xù)進行4天處理。在4天末，動物被殺死，使用液氮迅速凍結(jié)肝臟樣品，并保存在-80℃下。
隨后，分離總RNA/mRNA并通過反向翻譯標記成第一鏈cDNA(采用標記的脫氧核苷酸，與用于控制和處理的熒光標簽相同或不同)，凈化并溶解于20μL雜化緩沖劑中。
g)分析過程使用Cavro步進噴水器將緩沖劑和溶液抽取/吸出到盒中。執(zhí)行下面的步驟測量老鼠中的CYP450電感應(yīng)1)在79℃下使用1ml雜化緩沖劑(HB)預(yù)沖洗30分鐘，對與HB接觸的平臺的背景1進行測量。
2)將“control”樣品注入盒中，在79C下變性30分鐘，然后在42℃下培養(yǎng)一整夜。
3)在42℃下使用1mL HB后沖洗10分鐘，測量與HB接觸的平臺的“control”強度。
4)再生在79℃下使用1mL雜化緩沖劑(HB)沖洗30分鐘，測量與HB接觸的平臺的背景2。
5)將“treated”樣品注入盒中，在79℃下變性30分鐘，然后在42℃下培養(yǎng)一整夜。
6)在42℃下使用1mL HB后沖洗10分鐘，測量與HB接觸的平臺的“treated”強度。
在瞬息諧振條件下對所有熒光圖象進行測量。
h)數(shù)據(jù)處理計算所有斑點的凈強度(control-背景1和treated-背景2)，并且在外標物強度的幫助下對treated數(shù)據(jù)組的所有強度進行歸一化。通過除法計算出各個基因之間的表達比率(重疊改變)重疊改變＝歸一化的treated/controll計算出每10個重復(fù)實驗的平均值。
i)結(jié)果在瞬息諧振條件下測量的ER-芯片通常表示大約100倍的增強強度和改進的信號/背景比值。
下表中概括了重疊改變的平均值

3.說明增強放大的例子根據(jù)剛描述的例子制備和處理平臺。在對樣品2進行培養(yǎng)之后，參照圖6，使用前面所描述的CCD攝象機檢測裝置拍攝2個圖象。在不調(diào)節(jié)瞬息諧振條件的超熒光模式下拍攝第一幅圖象(圖7a中的“超熒光”)。在瞬息諧振條件下(7b中的“ER增強”)拍攝第二幅圖象，即調(diào)節(jié)入射激光束相對表面法線的角度直到透過芯片的光表現(xiàn)為最小。圖象分布(凈信號)表明使用ER-增強所測得的強度比傳統(tǒng)超熒光所得到的強度大大約100倍。
在前面所描述的例子中，使用單個樣品單元(41)使樣品與平臺的傳感區(qū)域相接觸。應(yīng)該理解，可以使用微滴定型樣品容器來補償具有多個傳感區(qū)域的平臺，以允許對多個樣品進行測量，從而改善測量效率。
4.用于識別單核苷酸多態(tài)性(SNP)的寡核苷酸微芯片a.芯片制備參照圖2所描述的類型的傳感器平臺(尺寸18×18mm2)首先在三氯甲烷(FLUKA，“purum”)中超聲處理兩次，然后在異丙醇(Merck，“Uvasol”)中處理兩次，每次15分鐘。然后在真空干燥器中干燥該平臺，并在UV清潔劑中清潔30分鐘(Boeckel Industries Inc，model 135500型)。將鄰二甲苯加熱到75℃(攪拌)，并且將2％v/v環(huán)氧丙氧基丙基-三甲氧基硅烷(Fluka，“purum”)和0.2％v/v N-乙基二異丙胺(Fluka，“purum”)添加到加熱的溶劑中(攪拌)。然后將該平臺安裝在框架中，并在75℃下在溶液中培養(yǎng)7小時(攪拌)。隨后，使用新鮮的乙腈(Fluka，“HPLC等級”)對該平臺沖洗三次，每次15分鐘。最后干燥該平臺并將該平臺保存在真空下。
b.俘獲元件的固定將兩種不同的氨基改性的寡核苷酸(俘獲探針)在硅烷化過的平臺上印制成方格狀排列(5×5＝25個斑點)。GMS 417環(huán)形針陣列用于印刷(Genetic Microsystems，Boston，MA)。用做俘獲分子的寡核苷酸的濃度為100nmol/ml。斑點的直徑為125微米，中心到中心的距離為500微米。2寡核苷酸被稱為cPM(“俘獲最佳匹配”)和cMM(“俘獲失配”)，其差別僅在于一個基cPM3‘CACAATTCCACA5‘-NH2cMM3‘CACAACTCCACA5‘-NH2cPM和cMM在5‘端標記以氨基，使得寡核苷酸能夠與環(huán)氧功能化的平臺共價結(jié)合。該陣列印制在尺寸為(18×18mm2)的平臺的中心。隨后在飽和水蒸汽氛圍中在密封容器中將該平臺培養(yǎng)一整夜。第二天對芯片進行干燥，并用1ml含水50％的尿素溶液沖洗該平臺?；蛘?，使用含水牛血清溶液(BSA，1mg/ml)。在對芯片進行分塊之后，用去離子水沖洗該芯片，然后用氮氣流進行干燥。
c.檢測裝置使用前面例子中所描述的CCD裝置。
d.芯片盒使用前面例子中所描述的盒。
e.被分析物/樣品兩個被Cy5-標記的稱為PM(“最佳匹配”)和MM(“失配”)的順序為被固定的俘獲寡核苷酸cPM和cMM的寡核苷酸用做被分析物PMCy5-5‘GTGTTAAGGTGT3‘MMCy5-5‘GTGTTGAGGTGT3‘被分析物溶液的濃度均為30pM。
f.分析過程首先用1ml雜化緩沖劑(HB)沖洗平臺兩次，在沖洗過程之間有1分鐘的延遲。隨后將大約15微滴定PM被分析物溶液(30pM)注入到流體盒中。在30分鐘的培養(yǎng)之后，用1ml HB沖洗該平臺，在芯片的諧振位置拍攝熒光圖象(圖9a中的“PM”)。隨后，通過注入2×1ml的含水50％尿素溶液，在注入之間有2分鐘延遲，去除所結(jié)合的被熒光標記的寡核苷酸(攪拌)。在另外的2分鐘之后，通過注入2×1ml HB對芯片進行清洗，兩次注入之間延遲2分鐘，并且在芯片的諧振位置拍攝熒光圖象(圖9b中的“再生”)。最后，將大約15個微滴定MM被分析物溶液(30pM)注入流體盒中。在30分鐘的培養(yǎng)之后，用1ml的HB再次對平臺進行沖洗，并在芯片的諧振位置處拍攝熒光圖象(圖9c中的“MM”)。所有步驟均在室溫下執(zhí)行。
g.數(shù)據(jù)處理對于兩個實驗(培養(yǎng)30pM PM被分析物和30pM MM被分析物)計算2不同組俘獲點(cPM和cMM)的平均強度。另外，計算平均強度差cPM-cMM和比值cPM/cMM。
h.結(jié)果下表中概括了計算得出的所有數(shù)據(jù)?？梢詮乃玫降臄?shù)據(jù)清楚地識別兩個被Cy-5標記的PM和被Cy-5標記的MM、其差別僅在于一個基(SNP)的寡核苷酸被分析物。

5.用于抗體免疫分析的例子主要抗體被空間地溶解固定(例如方格圖案)在傳感器平臺的表面上。通過后續(xù)培養(yǎng)使被檢測抗原與熒光標記的次級抗體結(jié)合(用于被檢測的各個抗原的第二抗原決定基表位的檢測)，首先使用包含不同濃度各種抗原的被分析物，然后使用熒光標記的次級抗體。
或者，可以在預(yù)培養(yǎng)階段混合抗原(被分析物)與熒光標記的次級抗體，允許熒光標記的次級抗體與抗原發(fā)生絡(luò)合。在這個預(yù)培養(yǎng)步驟之后，使用該混合物培養(yǎng)該傳感器平臺表面。
使用ER-裝置定量分析與表面結(jié)合的熒光標記的免疫絡(luò)合物(使用適當?shù)木彌_劑，PBS進行預(yù)沖洗如果需要進行后沖洗)。
6.用于多重免疫分析的蛋白質(zhì)-微芯片a.芯片制備將前面所述類型的傳感器平臺(尺寸18×18mm2)在三氯甲烷(FLUKA，“purriss.”)中超聲處理兩次，隨后在異丙醇(Merck，“Uvasol”)中處理兩次，每次15分鐘。在真空中干燥該平臺，并在UV清潔劑中清洗30分鐘(Boeckel工業(yè)公司135500型)。將芯片放置在一個小容器中，并在0.5毫摩爾十八烷基磷酸鹽的丙醇溶液中保存24小時。然后，用5ml異丙醇沖洗該芯片來去除過量的烷基磷酸鹽，并在氮氣流中進行干燥。該過程在平臺的表面處產(chǎn)生了一種烷基磷酸鹽的自聚集單分子層(SAM)。該粘合促進層使該平臺具有疏水性(接觸角大約為100°)，并且通過疏水相互作用對平臺上的蛋白質(zhì)進行吸附。
b.俘獲元件的固定在飽和水蒸汽氛圍中將兩種不同的單克隆抗體，抗—人體絨毛膜促性腺激素(抗-hCG)和抗—白介素(抗-IL6)按方格狀排列(4×4陣列，每個抗體8個點)印到疏水的平臺上。俘獲抗體溶液的濃度分別為400和100微克/毫升。使用噴墨打印機進行印制(Microdrop，Norderstedt，德國)。點的直徑為150微米，中心到中心的距離為320微米。在飽和水蒸汽氛圍中在密封容器內(nèi)將所印制的陣列培養(yǎng)2小時。隨后，干燥該芯片，并用包含10％牛血清白蛋白(BAS)，5％蔗糖和0.02％疊氮化鈉的10ml磷酸鹽緩沖的鹽溶液(PBS)進行沖洗。通過BSA的吸附作用該沖洗步驟保護芯片的疏水性表面，并使在俘獲元件被固定之后，該表面更具親水性。因此，該保護步驟防止蛋白質(zhì)與平臺的非特定結(jié)合，而且非特定結(jié)合會導(dǎo)致背景熒光的增加。在保護之后，使用去離子水沖洗芯片并用氮氣干燥芯片。將該平臺保存在冷藏箱中備用。
c.檢測裝置使用例2中所描述的CCD裝置。
d.芯片盒使用例2中所描述的盒。
e.被分析物/樣品制備3種被分析物溶液I)包含500ng/ml Cy-5標記的IL6的溶液，抗原II)包含50ng/ml Cy-5標記的人類絨毛膜促性腺激素(hCG)的溶液，抗原III)包含50ng/ml IL6和100ng/ml用Cy5標記的多元性繁殖系抗-IL6抗體的預(yù)培養(yǎng)混合物(1小時)，包含1％BSA的PBS pH7.0，用做被分析物的溶劑。
f.分析過程制備三個平臺(如6b所描述的)用于被分析物的培養(yǎng)，將平臺安裝在盒中并用包含1％BSA的1毫升PBS pH7.0沖洗平臺。隨后，將大約15微滴定被分析物溶液I)，II)和III)注入流體盒中。對于I)和II)，每種的培養(yǎng)時間為2小時。對于被分析物III)，培養(yǎng)時間為12小時。在對被分析物培養(yǎng)之后，用包含1％BSA的1毫升PBS pH7.0沖洗該平臺。在非諧振條件下拍攝熒光圖象(超熒光，大約偏離諧振角7°)，并在諧振條件下對每個芯片進行拍攝(諧振時，入射光相對法線大約為2.5°)。圖10中表示出所得到的圖象和數(shù)據(jù)。所有步驟均在室溫下進行。
g.數(shù)據(jù)處理在Imagene Array軟件(Biodiscovery，Los Angeles，CA)的幫助下計算點的平均強度和背景。圖10中的點平均表示用背景校正的感興趣的各個俘獲元件的平均強度。另外，噪音被計算出作為背景與熒光圖象的標準偏差。從而，圖10中的信號/噪音相當于背景標準偏差上的點平均之比。
h.結(jié)果圖10中概括了計算得出的所有數(shù)據(jù)。圖10中概括了在超熒光模式和諧振條件下所得到的圖象和數(shù)據(jù)。行I)和II)表示被固定的單克隆俘獲抗體與被標記的抗原(分別為Cy-5標記的IL6和hCG)之間免疫反應(yīng)的結(jié)果。行III)相當于被固定的單克隆抗體(抗-IL6)與預(yù)培養(yǎng)的IL6抗原和相對IL6的Cy5-標記的次級多元性繁殖系抗體的混合物之間的三明治型免疫反應(yīng)。
對于行I)的結(jié)果，信號強度從超熒光模式中的讀數(shù)46增加到平臺的諧振模式中的讀數(shù)1100。這相當于相對點平均值增強大約24倍。信號/噪音比從7.0(超熒光)增加到69.2(諧振)，相當于10倍。
對于行II)的結(jié)果，信號強度從超熒光模式中的讀數(shù)32增加到平臺的諧振模式中的讀數(shù)646。這相當于相對點平均值增強了大約20倍。信號/噪音比從5.0(超熒光)增加到75.1(諧振)，相當于15倍。
對于行III)的結(jié)果，信號強度從超熒光模式中的讀數(shù)25增加到平臺的諧振模式中的讀數(shù)296。這相當于相對點平均值增強大約12倍。信號/噪音比從3.8(超熒光)增加到44.1(諧振)，相當于12倍。
對于所有3個分析來說，處于諧振模式的芯片與非諧振模式(超熒光)模式的同一芯片相比，點平均和信號/噪音比都高一個量級。行I)和II)的熒光圖象是互補的(方格形排列)。使用的所有芯片具有相同組的俘獲元件，即單克隆抗-hCG和單克隆抗-IL6。
應(yīng)該理解對于所描述的實施例可能有多種可選方案。
本平臺的另一個特征在于允許并行獲得更大批的數(shù)據(jù)。并且該平臺可以多次使用。在升高溫度下使用有機溶劑和/或趙托吡卡(chaotropic)反應(yīng)劑(鹽溶液)可以對被固定的親合絡(luò)合物進行再生，同時基本上完全地保持結(jié)合力。
在前面所給出的描述中，整個傳感區(qū)域的面積被照射。還可能使用未擴束的聚焦激光束，掃描傳感區(qū)域，使得目標俘獲元件依次被激活。這種設(shè)置允許使用比CCD攝象機更廉價的光電檢測器，例如可以使用光電倍增管或雪崩光電二極管。并且由于激光能量被更有效地限制，這種設(shè)置將進一步增強靈敏度。
還可能根據(jù)本發(fā)明設(shè)計平臺，用做顯微鏡用載玻片，從而允許它們和熒光顯微鏡一起使用。
還可以將該平臺設(shè)計為與大型微觀射流系統(tǒng)(microfluidic system)一起使用，如WO97/02357中所描述的。
在前面的描述中，已經(jīng)描述了平臺在激勵和傳感熒光中的應(yīng)用。應(yīng)該理解可以將該平臺用于通過發(fā)光的改變檢測親合反應(yīng)的裝置中。還應(yīng)該理解該平臺可以用于通過折射率變化檢測親合反應(yīng)的裝置中。
根據(jù)本發(fā)明的平臺可以用于多種應(yīng)用中，下面為非排他性列表。
-基因表達-基因組學(xué)-藥物基因組學(xué)-毒理基因組學(xué)-毒理蛋白質(zhì)組學(xué)-遺傳學(xué)-藥物遺傳學(xué)-毒理遺傳學(xué)-外顯子/內(nèi)含子表達分布-人類白細胞抗原(HLA)定型-剪接變體的分析-蛋白質(zhì)組學(xué)(芯片上蛋白質(zhì)分析)-病人監(jiān)視(藥物，代謝物和標記)-點護理，“個人化藥物”-診斷學(xué)-用于蛋白質(zhì)組學(xué)的芯片上2d凝膠或通常的2d分離-SNP(單核苷酸多態(tài)性)，小量測序-高處理量篩選-組合化學(xué)法-蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用-分子間相互作用-基于芯片的蛋白質(zhì)—抗體和肽相互作用-綠色熒光蛋白(GFP)-原位雜交-共焦顯微術(shù)-熒光相關(guān)光譜術(shù)(FCS)-傳統(tǒng)顯微術(shù)-MALDI-TOF MS
權(quán)利要求
1.一種用于樣品分析的平臺，包括一光學(xué)透明的折射率為(n1)的基板，一在該基板的一個表面上形成的薄的、光學(xué)透明層，所述透明層具有比折射率(n1)大的折射率(n2)；所述平臺中引入一或多個包含周期性溝槽的波紋結(jié)構(gòu)，該波紋結(jié)構(gòu)限定一或多個傳感區(qū)域，每個傳感區(qū)域?qū)?yīng)一或多個俘獲元件，所述溝槽被賦于一定的形狀、尺寸和取向，使得或者a)入射在所述平臺上的相干光被衍射成單獨的光束或衍射級，其干涉導(dǎo)致透射光束的減小和入射光的異常高的反射，從而在一或多個傳感區(qū)域的表面處產(chǎn)生一增強的瞬息場；或者b)入射在所述平臺上的相干的線偏振光被衍射成單獨的光束或衍射級，其干涉導(dǎo)致幾乎所有的透射光束消失，以及入射光的異常高的反射，從而在一或多個傳感區(qū)域的表面處產(chǎn)生一增強的瞬息場。
2.一種平臺，包括一具有折射率(n1)的光學(xué)透明基板，一在該基板的一個表面上形成的薄的、光學(xué)透明層，所述透明層具有比折射率(n1)大的折射率(n2)；所述平臺在透明層中引入一基本上在整個平臺上的波紋結(jié)構(gòu)，或者設(shè)置在平臺上的多個分離的波紋結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包括基本平行的單衍射或多次衍射的周期性溝槽，由其表示一或多個傳感區(qū)域，其中(a)溝槽的深度在3nm到光學(xué)透明層厚度范圍內(nèi)，(b)光學(xué)透明層的厚度在30至1000nm范圍內(nèi)，(c)波紋結(jié)構(gòu)的周期在200至1000nm范圍內(nèi)，(d)溝槽深度與光學(xué)透明層厚度之比在0.02至1范圍內(nèi)，以及(e)溝槽寬度與溝槽周期之比在0.2至0.8范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的平臺，在使用中該裝置被設(shè)計成賦于溝槽一定形狀、尺寸和取向，使得或者a)入射在平臺上的相干光被衍射成單獨的光束或衍射級，其干涉導(dǎo)致透射光束的減小和入射光的異常高的反射，從而在一或多個傳感區(qū)域的表面處產(chǎn)生一增強的瞬息場；或者b)入射在所述平臺上的相干的線偏振光被衍射成單獨的光束或衍射級，其干涉導(dǎo)致幾乎所有透射光束消失以及入射光的異常高的反射，從而在一或多個傳感區(qū)域的表面處產(chǎn)生一增強的瞬息場。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該平臺的基板由無機材料形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該基板由有機材料形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的平臺，其中該基板由玻璃、SiO2、石英或Si形成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的平臺，其中該基板由有機聚合物例如PP，PC，PMMA，PI，PS，PE，PET或PU形成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該光學(xué)透明層由無機材料形成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該光學(xué)透明層由有機材料形成。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的平臺，其中該光學(xué)透明層為金屬氧化物如Ta2O5，TiO2，Nb2O5，ZrO2，ZnO或HfO2。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的平臺，其中該光學(xué)透明層由聚酰胺，聚酰亞胺，PP，PS，PMMA，聚丙烯酸，聚丙烯酯，聚硫醚或聚苯硫醚和其衍生物形成。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或4到10中任一權(quán)利要求當從屬于權(quán)利要求1時所述的平臺，其中衍射溝槽的深度在3nm至光學(xué)透明層厚度范圍內(nèi)，最好在10nm至光學(xué)透明層厚度范圍內(nèi)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的平臺，其中該光學(xué)透明層的厚度在30至1000nm范圍內(nèi)，衍射溝槽的周期在200至1000nm范圍內(nèi)，溝槽深度與光學(xué)透明層厚度之比處于0.02至1范圍內(nèi)，溝槽寬度與溝槽周期之比處于0.2至0.8范圍內(nèi)，導(dǎo)致極短的傳播距離。
14.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該溝槽通常為矩形截面。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到13中任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該溝槽具有正弦形、梯形或鋸齒形截面。
16.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該平臺為正方形或矩形，且此溝槽沿平臺線性延伸。
17.根據(jù)權(quán)利要求1到15中任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該平臺為盤形，該溝槽為圓形或線形。
18.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該溝槽形成在基板的表面上。
19.根據(jù)權(quán)利要求1到17中任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該溝槽形成在光學(xué)透明層的表面上。
20.根據(jù)權(quán)利要求1到17中任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該溝槽同時形成在基板的表面上和光學(xué)透明層的表面上。
21.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的平臺，其中對于一特定激勵波長和/或特定類型的偏振，對于波紋化表面的一或多個傳感區(qū)域進行最優(yōu)化。
22.根據(jù)權(quán)利要求1到20中任一權(quán)利要求所述的平臺，其中對于不同波長和/或偏振取向，對于該一或多個傳感區(qū)域的波紋化表面進行最優(yōu)化。
23.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該光學(xué)透明層的表面包括一或多個傳感區(qū)域，其中每一個傳感區(qū)域攜帶一或多個俘獲元件。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的平臺，其中每個俘獲元件包含能夠發(fā)生親合反應(yīng)的單個俘獲分子和/或俘獲分子的混合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的平臺，其中該俘獲元件排列成二維矩陣。
26.根據(jù)權(quán)利要求23到25中任一權(quán)利要求所述的平臺，包括一設(shè)置在光學(xué)透明層表面處的粘合促進層，以便固定俘獲分子。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的平臺，其中該粘合促進層包括一或多個無機和/或有機分子或其衍生物，提供附加的化學(xué)、物理、光譜和/或光物理、光化學(xué)/生物/生化特性，以便控制所產(chǎn)生的粘合促進層系統(tǒng)的整個功能特性。
28.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該平臺由多個傳感區(qū)域構(gòu)成，每個傳感區(qū)域具有它自己的衍射溝槽或多個重疊的溝槽，適于彩色激勵和樣品的檢測。
29.根據(jù)權(quán)利要求1到23中任一權(quán)利要求所述的平臺，其中不限制擬固定在平臺上的俘獲元件或分子的數(shù)量，并且相應(yīng)于貢獻給(contributeto)感興趣的物種或生物體的基因組的基因、DNA序列、DNA基元、DNA微衛(wèi)星、單核苷酸多態(tài)性、蛋白質(zhì)或細胞碎片，或者其中的選擇或其組合的數(shù)量。
30.根據(jù)權(quán)利要求23到29中任一權(quán)利要求所述的平臺，其中該俘獲元件或分子包括下面的一或多個核苷酸，寡核苷酸(和其化學(xué)衍生物)DNA(雙鏈或單鏈)a)線性(和其化學(xué)衍生物)b)環(huán)狀(例如質(zhì)粒，粘粒，BAC，YAC)總RNA，信使RNA，cRNA，線粒體RNA，人工RNA，aptamers PNA(肽核酸)多克隆、單克隆、重組、工程化抗體，抗原，半抗原，抗體FAB亞基(如果需要則進行修飾)蛋白質(zhì)，修飾的蛋白質(zhì)，酶，酶輔因子或抑制劑，蛋白質(zhì)復(fù)合物，植物血凝素，組氨酸標記的蛋白質(zhì)，用于組氨酸標記成分(HIS-tag)的螯合劑，標記的蛋白質(zhì)，人工抗體，分子印記，質(zhì)體膜受體，整個細胞，細胞碎片和細胞亞結(jié)構(gòu)，突觸，激動劑/拮抗劑，細胞，細胞器如微粒體小分子如苯二氮雜類，前列腺素，抗生素，藥物，代謝物，藥物代謝物天然產(chǎn)品碳水化合物和衍生物天然和人工配體類固醇，激素肽天然或人工聚合物分子探針天然和人工受體及其化學(xué)衍生物螯合反應(yīng)劑，冠醚，配體，超分子集合指示劑(pH，電位，膜電位，氧化還原電位)組織樣品(組織微陣列)。
31.一種用于分析樣品的裝置，包括根據(jù)前面任一權(quán)利要求的平臺，其中包括用于產(chǎn)生光束和用于引導(dǎo)光束以使光束以一定角度入射到平臺上，導(dǎo)致在平臺中發(fā)生瞬息諧振，從而在平臺的傳感區(qū)域中產(chǎn)生增強的諧振場的裝置，以及用于檢測設(shè)置在平臺的傳感區(qū)域上或傳感區(qū)域附近的材料特性的裝置。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的裝置，其中該光產(chǎn)生裝置包括一用于發(fā)射相干激光束的激光器。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的裝置，其中該光產(chǎn)生裝置包括一放電燈或一低壓燈，如Hg或Xe燈或發(fā)光二極管。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的裝置，包括用于引導(dǎo)激光束以使激光束以角度θ入射在平臺上的光學(xué)元件，且角度θ由表達式θ＝n-λ/Λ定義，其中Λ為衍射溝槽的周期，λ為光波長，n為光學(xué)透射層的有效折射率。
35.根據(jù)權(quán)利要求31到34中任一權(quán)利要求所述的裝置，其中該檢測裝置被設(shè)置來檢測發(fā)光，如熒光，磷光，化學(xué)發(fā)光和電子發(fā)光。
36.根據(jù)權(quán)利要求31和35中任一權(quán)利要求所述的裝置，其中該檢測裝置被設(shè)置來另外檢測折射率變化或?qū)烧叩慕Y(jié)合進行檢測。
37.根據(jù)權(quán)利要求31到36中任一權(quán)利要求所述的裝置，其中該入射光束被設(shè)置來照明所有或每個傳感區(qū)域。
38.根據(jù)權(quán)利要求31到36中任一權(quán)利要求所述的裝置，其中該光束被設(shè)置來照明被分析的傳感區(qū)域的子區(qū)域，并且該光束和平臺被設(shè)置成使得它們可以進行相對運動，以在平臺的傳感區(qū)域上進行有效的光束掃描。
39.根據(jù)權(quán)利要求31到38中任一權(quán)利要求所述的裝置，包括一貼著(against)平臺的傳感區(qū)域定位的盒，以使樣品與傳感區(qū)域相接觸。
40.根據(jù)權(quán)利要求31到38中任一權(quán)利要求所述的裝置，包括一用于包含多個被研究樣品的微滴定型裝置。
41.一種用于分析一種或多種樣品的方法，包括使樣品與根據(jù)權(quán)利要求1到30中任一權(quán)利要求的平臺的傳感區(qū)域相接觸，用光束照射該平臺，導(dǎo)致在平臺的檢測區(qū)域中發(fā)生瞬息諧振，并且檢測從傳感區(qū)域發(fā)出的輻射。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，包括向被研究樣品中加入熒光誘發(fā)材料，并且通過用增強的瞬息場激發(fā)樣品，檢測所述樣品中產(chǎn)生的熒光。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中該熒光誘發(fā)材料包括一發(fā)光標記。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中該發(fā)光標記包括為了附著在一或多個親合對象上，對在400nm至1200nm范圍內(nèi)發(fā)光的發(fā)光化合物進行功能化或修飾，包括下列一或多種的衍生物聚苯和雜芳族化合物1，2-二苯乙烯，香豆素，呫噸染料，次甲基染料，噁嗪染料，若丹明，熒光素，香豆素，1，2-二苯乙烯，芘，苝，菁藍，氧雜菁藍，酞菁，紫菜堿，水楊酸菁藍(naphthalopcyanines)，偶氮苯衍生物，聯(lián)苯乙烯聯(lián)苯，過渡金屬絡(luò)合物例如聚吡啶基/釕絡(luò)合物，三(2，2’-聯(lián)吡啶基)氯化釕，三(1，10-菲咯啉)氯化釕，三(4，7-聯(lián)苯-1，10-菲咯啉)氯化釕，和聚吡啶基/吩嗪/釕絡(luò)合物，如八乙基-鉑-卟啉，銪和鋱絡(luò)合物量于點粒子/珠或其衍生物。
45.根據(jù)權(quán)利要求41到44中任一權(quán)利要求所述的方法，用于下面任何一或多個之中-基因表達-基因組學(xué)-藥物基因組學(xué)-毒理基因組學(xué)-毒理蛋白質(zhì)組學(xué)-遺傳學(xué)-藥物遺傳學(xué)-毒理遺傳學(xué)-外顯子/內(nèi)含子表達分布-人類白細胞抗原(HLA)定型-剪接變體的分析-蛋白質(zhì)組學(xué)(芯片上蛋白質(zhì)分析)-病人監(jiān)視(藥物，代謝物和標記)-點護理，“個人化藥物”-診斷學(xué)-用于蛋白質(zhì)組學(xué)的芯片上2d凝膠-SNP(單核苷酸多態(tài)性)，小量測序-高處理量篩選-組合化學(xué)法-蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用-分子間相互作用-基于芯片的蛋白質(zhì)—抗體和肽相互作用-綠色熒光蛋白(GFP)-原位雜交-共焦顯微術(shù)-熒光相關(guān)光譜術(shù)(FCS)-傳統(tǒng)顯微術(shù)-MALDI-TOF MS
46.一種用于樣品分析的平臺，所述平臺具有一或多個傳感區(qū)域，每個傳感區(qū)域用于接收一或多個俘獲元件，當用相干光照射該平臺時，可以相互作用，以提供親合反應(yīng)的表示，其中每個俘獲元件包括兩個或更多類型的俘獲分子。
全文摘要
一種用于樣品分析的傳感器平臺,包括一折射率為(n
文檔編號G01N21/55GK1369059SQ00811268
公開日2002年9月11日 申請日期2000年7月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月5日
發(fā)明者沃弗岡·E·G·布達啟, 戴爾特·紐斯切夫 申請人:諾瓦提斯公司