国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      用于測(cè)定和/或監(jiān)視離子通道電生理學(xué)性質(zhì)的基底及方法

      文檔序號(hào):6100737閱讀:523來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:用于測(cè)定和/或監(jiān)視離子通道電生理學(xué)性質(zhì)的基底及方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種基底及方法,該基底及方法通過(guò)建立一種電生理學(xué)測(cè)量構(gòu)形(measuring configuration)用來(lái)測(cè)定和/或監(jiān)視含離子通道的組織(structure)中的離子通道的電生理學(xué)性質(zhì),這種含離子通道的組織通常是諸如細(xì)胞那樣的含有脂質(zhì)膜的組織;在所述測(cè)量構(gòu)形中,圍繞在測(cè)量電極周圍的細(xì)胞膜形成一高電阻的絕緣帶(seal),這使它可以用來(lái)測(cè)定和監(jiān)視流經(jīng)細(xì)胞膜的電流。該基底通常是一用來(lái)研究細(xì)胞膜中的電事件的儀器的一部分,例如是一種通過(guò)膜片箝術(shù)來(lái)研究生物膜中的離子傳輸通道的儀器的一部分。更具體地說(shuō),本發(fā)明涉及一種用在這類膜片箝位儀器中的基底,這種基底具有高的處理能力并僅需少量的試驗(yàn)化合物、少量的液態(tài)載體,并通過(guò)同時(shí)對(duì)大量細(xì)胞作獨(dú)立的平行試驗(yàn)的方法而可在短時(shí)間內(nèi)完成許多試驗(yàn)任務(wù)。
      背景技術(shù)
      Neher、Sakmann、和Steinback在“細(xì)胞外的膜片鉗位,解析通過(guò)生物膜中各個(gè)開放通道的電流用的方法”(“The Extracellular PatchClamp,A Method for Resolving Currents Through Individual OpenChannels in Biological Membranes”),Pflueger Arch.375;219-278,1978中提出了將薄膜的一膜片電絕緣起來(lái)并在電壓箝位的條件下研究該膜片處的離子通道的總體思想。他們發(fā)現(xiàn),將一含有乙酰膽堿(ACh)的細(xì)導(dǎo)管壓向肌肉細(xì)胞膜表面便可看到電流的離散跳躍,這種電流跳躍是由被ACh所激活的離子通道的開和閉引起的。然而,他們的工作是有限的,因?yàn)榧?xì)導(dǎo)管的玻璃和細(xì)胞膜之間的絕緣帶的電阻(10到50兆歐)大大地小于離子通道的電阻(10千兆歐)。由該絕緣帶所造成的電噪聲與其電阻成反比,該絕緣帶的電導(dǎo)小于ACh通道的電導(dǎo),其噪聲已經(jīng)大到足以將流經(jīng)離子通道的電流掩蓋掉。這還破壞細(xì)導(dǎo)管內(nèi)的電壓箝位,由于大的電流通過(guò)絕緣帶而使細(xì)導(dǎo)管內(nèi)的電壓不同于浴槽中的電壓值。
      然而發(fā)現(xiàn),只要對(duì)玻璃細(xì)導(dǎo)管精致地進(jìn)行拋光并對(duì)細(xì)導(dǎo)管內(nèi)部進(jìn)行抽吸,便可在細(xì)胞表面上得到一電阻非常高(1到100千兆歐)的絕緣帶。此千兆歐絕緣帶使噪聲水平降低了一數(shù)量級(jí),在這個(gè)噪聲水平下可以對(duì)生物學(xué)感興趣的大多數(shù)離子通道進(jìn)行研究并且大大地拓寬了可以進(jìn)行研究的電壓范圍。這種經(jīng)過(guò)改進(jìn)的絕緣帶稱作“千兆絕緣帶”,而這種細(xì)導(dǎo)管稱作“膜片導(dǎo)管”。有關(guān)千兆絕緣帶的更詳細(xì)的描述可見于O.P.Hamill,A.Marty,E.Neher,B.Sakmann,及F.J.Sigworth的“Imporved patch-clamp techniques for high resolutioncurrent recordings from cells and cell-free membrane patches”,Pflüeger Arch.391,85-100,1981。Neher和Sakmann還由于發(fā)展膜片箝術(shù)方面的成就而獲得1991年度的諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
      離子通道是跨膜的蛋白質(zhì),這種蛋白質(zhì)促使無(wú)機(jī)離子傳輸跨過(guò)細(xì)胞膜。離子通道參于許多生理過(guò)程諸如形形色色的生成及計(jì)時(shí)作用電勢(shì)(generating and timeing action potentials)、突觸的傳遞、激素的分泌、肌肉的收縮等等。許多藥物通過(guò)調(diào)制離子通道來(lái)行使其特有的效用。例如,諸如苯妥英及拉莫三嗪之類的抗癲癇化合物對(duì)腦中的電壓相關(guān)Na+通道起阻滯作用,硝苯地平及硫氮酮(Diltiazem)類的抗高血壓藥物對(duì)平滑肌細(xì)胞中的電壓相關(guān)Ca2+通道起阻滯作用,而優(yōu)降糖和甲糖寧之類的胰島素釋放刺激質(zhì)則對(duì)胰腺中的ATP調(diào)節(jié)K+通道起阻滯作用。除了化學(xué)誘導(dǎo)的離子通道活性調(diào)節(jié)外,膜片箝術(shù)還使科學(xué)家能夠?qū)﹄妷合嚓P(guān)的離子通道進(jìn)行操縱。這包括調(diào)整膜片導(dǎo)管中的電極的極性及改變?cè)〔廴芤褐械柠}的成分以調(diào)節(jié)溶液中自由離子的水平。
      膜片箝術(shù)代表了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的主要發(fā)展,因?yàn)樵擁?xiàng)技術(shù)可以測(cè)量通過(guò)單個(gè)離子通道蛋白質(zhì)的離子流量,還可以研究單個(gè)離子通道對(duì)藥物的響應(yīng)。簡(jiǎn)單地說(shuō),在標(biāo)準(zhǔn)的膜片箝術(shù)中使用了一種很細(xì)的(直徑約0.5到2微米)玻璃導(dǎo)管,該膜片導(dǎo)管的頂部壓在細(xì)胞膜表面上,導(dǎo)管的頂部和細(xì)胞緊密地保持密封而將很少幾個(gè)離子通道蛋白質(zhì)隔離在細(xì)胞膜的微小區(qū)域內(nèi)。
      這些通道的活性可以是單獨(dú)地進(jìn)行測(cè)量(單通道記錄)或交替地測(cè)量,還可以將膜片弄破以測(cè)量整個(gè)細(xì)胞膜的通道活性(全細(xì)胞記錄)??梢杂美缦?qū)Ч軆?nèi)施加負(fù)壓的方法弄破細(xì)胞膜來(lái)以高的電導(dǎo)率訪問(wèn)細(xì)胞內(nèi)部以實(shí)施全細(xì)胞測(cè)量。
      在進(jìn)行單通道記錄和全細(xì)胞記錄時(shí),可以將一箝位電壓跨接在細(xì)胞膜的兩邊來(lái)顯示單個(gè)通道子型(subtypes)的活性。在電壓箝位技術(shù)中,經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜的電流是在膜的兩邊加有恒定的電勢(shì)的條件下進(jìn)行測(cè)量的。或者更準(zhǔn)確地說(shuō),放大器要準(zhǔn)確地供應(yīng)一電流,該電流必須使細(xì)胞膜維持一由實(shí)驗(yàn)確定的電勢(shì)。因此,由離子通道的開、閉所引起的電流將不會(huì)對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行再充電。


      圖1表示現(xiàn)有技術(shù)的一標(biāo)準(zhǔn)的電壓箝位放大器基本工作原理的簡(jiǎn)圖,這種放大器包括諸如HEKA Elektronik出售的EPC-9放大器。在細(xì)導(dǎo)管4內(nèi)設(shè)有一電極6,該電極6與反饋放大器的負(fù)端相關(guān)聯(lián),同時(shí),在放大器的正端(Stim.In.)上接上一箝位電壓(相對(duì)于接地的浴槽電極8)并通過(guò)電壓監(jiān)視器的輸出來(lái)使其符合要求。由于所測(cè)量的細(xì)導(dǎo)管電壓和箝位電壓據(jù)推測(cè)二者是等同的,細(xì)導(dǎo)管電極上將作用一恒定的修正的電勢(shì)而一電流則被迫通過(guò)大反饋電阻。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)換后,通過(guò)電流監(jiān)視器輸出的模擬電壓來(lái)使電流符合要求。
      這種實(shí)驗(yàn)中的時(shí)間分辨率及電壓調(diào)控是令人印象深刻的,通常是在毫秒或甚至微秒范圍內(nèi)。然而,這種膜片箝術(shù)作為一通用方法用來(lái)進(jìn)行藥理學(xué)篩選遇到一主要障礙是一天中所能試驗(yàn)的化合物的數(shù)量有限(通常不超過(guò)1或2個(gè))。另外一主要障礙為改變圍繞在細(xì)胞及膜片周圍的溶液的速率非常慢。
      決定膜片箝術(shù)處理能力的主要限制因素是細(xì)胞和細(xì)導(dǎo)管的定位及箝位,以及供應(yīng)系統(tǒng)的性能,該系統(tǒng)將溶解了的化合物導(dǎo)引到細(xì)胞及膜片上。
      在常用的膜片箝位裝置中,放置在實(shí)驗(yàn)腔室中的細(xì)胞要連續(xù)地灌注一種生理鹽溶液。在該腔室中建立細(xì)胞和細(xì)導(dǎo)管之間的連接是非常費(fèi)時(shí)而困難的工作?;衔锓旁谂c一閥門相關(guān)聯(lián)的幾個(gè)供應(yīng)瓶中,將儀器的進(jìn)口連到該閥門上便可施加化合物。所需的運(yùn)載液體和待試樣品的體積是很大的。
      已經(jīng)提出了幾種高處理能力的膜片箝位測(cè)量系統(tǒng)。這些系統(tǒng)通常包括一具有許多位點(diǎn)的基底,該位點(diǎn)適于將細(xì)胞固定在測(cè)量構(gòu)形中,該測(cè)量構(gòu)形可以確定細(xì)胞膜的電性能。
      授予Rensselaer的US5,187,096公開了一種用于監(jiān)視細(xì)胞的細(xì)胞基質(zhì)阻抗的儀器。細(xì)胞直接培養(yǎng)在電極上然后再覆蓋上許多小隔室,這樣,就不可能對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量。
      授予Leland Stanford的WO 98/54294公開了一種帶有井的基底,該井上包含了電極陣列。該帶有井及電極(金屬電極)的基底是用硅材料以CVD(化學(xué)汽相淀積)及蝕刻技術(shù)制作的,并且整個(gè)電極表面上包含有硅氮化物的鈍化層。細(xì)胞直接培養(yǎng)在電極陣列上。該基底適于進(jìn)行電生理學(xué)性能測(cè)量。該專利還公開了許多測(cè)量電路的建議。
      授予Cenes的WO 99/66329公開了一種基底,該基底的各側(cè)設(shè)有電極,并且有一些小孔排列在基底的井上?;子霉璨牧现圃觳⒂眉す夥椒ㄣ@孔,基底表面上可以覆蓋以防粘接材料。將細(xì)胞放在小孔上,小孔四周設(shè)有防粘接層,用抽吸方法或電的方法將細(xì)胞導(dǎo)入小孔內(nèi),這樣的基底適于在細(xì)胞表面上建立起千兆絕緣帶。為了提供一種全細(xì)胞測(cè)量構(gòu)形,可以用電磁場(chǎng)或化學(xué)方法來(lái)透過(guò)細(xì)胞。一井上的所有小孔因而也是所有的可測(cè)量細(xì)胞共用一工作電極和一參考電極,見圖1,因此不能對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量。
      授予Vogel等人的WO 99/31503公開了一種測(cè)量器件,該器件分成兩個(gè)部分,在基底(載體)的一井上設(shè)有小孔。在該小孔的兩側(cè)包括兩個(gè)電極并且適于在該小孔的開口上放上一細(xì)胞。該基底上可以具有親水性區(qū)域及疏水性區(qū)域以將細(xì)胞導(dǎo)引到小孔開口的位置上。
      發(fā)明概述本發(fā)明提供一種基底及方法,該基底及方法優(yōu)選用于測(cè)定或監(jiān)視諸如細(xì)胞膜等含離子通道的組織中通過(guò)離子通道的電流;該基底及方法具有高處理能力和高可靠性,該基底及方法可在細(xì)胞或細(xì)胞膜實(shí)際所感受的條件下來(lái)實(shí)施測(cè)定或監(jiān)視。因此,使用本發(fā)明的基底和方法所測(cè)定的結(jié)果(例如細(xì)胞膜受到不同試驗(yàn)化合物的作用而引起的離子通道活性的變化)可以相信是主要的真實(shí)結(jié)果而不是測(cè)量系統(tǒng)所導(dǎo)入的假象,在研究細(xì)胞膜在給定條件下有關(guān)電導(dǎo)或電容等電生理學(xué)現(xiàn)象時(shí),本發(fā)明的基底和方法所提供的測(cè)量結(jié)果可以作為有效的依據(jù)。
      這些優(yōu)點(diǎn)是由于該基底及方法采用具有如下特征的可逆電極(reversible electrodes),不管是測(cè)量電極還是參考電極來(lái)直接測(cè)定通過(guò)一或多個(gè)離子通道的電流,這種電極通常是諸如氯化銀電極那樣的銀/銀鹵化物電極。
      本發(fā)明的基底及方法不但可以用來(lái)測(cè)量細(xì)胞膜而且還可用于諸如人造薄膜那樣的其它含離子通道的組織。本發(fā)明允許同時(shí)進(jìn)行幾個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn),例如對(duì)一些離子轉(zhuǎn)移通道及薄膜進(jìn)行電生理學(xué)測(cè)量。本發(fā)明基底構(gòu)成為一完整而易于掌握的微型系統(tǒng),該系統(tǒng)僅使用少量的運(yùn)載液體(一種和細(xì)胞等滲壓的生理食鹽溶液,通常為摩爾滲壓濃度為150毫摩爾的NaCl或其它適用的鹽溶液)及小量的試驗(yàn)樣品。
      按照一方面,本發(fā)明涉及一種平面的基底,其具有一第一表面部分及一和第一表面部分相反的第二表面部分,該第一表面部分具有許多位點(diǎn)(site),其中每個(gè)位點(diǎn)都適于固定(hold)一含離子通道的組織,并具有一與之相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極,該基底還帶有一或多個(gè)參考電極;所述測(cè)量電極及對(duì)應(yīng)的一或多個(gè)參考電極當(dāng)他們通過(guò)電解質(zhì)相互接觸(electrolytic contact with each other)并在其間施加一電位差時(shí),其中的一種電極便會(huì)發(fā)出離子而另一種電極會(huì)接受離子,便會(huì)在兩種電極之間產(chǎn)生電流;每個(gè)所述位點(diǎn)都適于在被固定在該位點(diǎn)的含離子通道的組織和該位點(diǎn)的一表面部分之間提供一高電阻值的絕緣帶;該絕緣帶提供后,便將下述兩個(gè)區(qū)域隔離開,一個(gè)區(qū)域由含離子通道的組織的一側(cè)所界定并通過(guò)電解質(zhì)與測(cè)量電極相接觸,另一個(gè)區(qū)域由含離子通道的組織的另一側(cè)所界定并通過(guò)電解質(zhì)與對(duì)應(yīng)的參考電極相接觸;因此可以測(cè)定和/或監(jiān)視流過(guò)兩種電極之間的含離子通道的組織中的離子通道的電流;這兩種電極通過(guò)晶片加工工藝與基底集成為一體。
      按照另一方面,本發(fā)明涉及一種方法,該方法為建立一種全細(xì)胞測(cè)量構(gòu)形,用于測(cè)定和/或監(jiān)視一或多個(gè)含離子通道的組織的一或多個(gè)離子通道的電生理學(xué)性能。該方法包括下列步驟提供一如上所述的基底;向一或多個(gè)位點(diǎn)提供運(yùn)載液體,該運(yùn)載液體中包含一或多個(gè)含離子通道的組織;將至少一個(gè)含離子通道的組織定位到相應(yīng)數(shù)目的位點(diǎn)上;檢驗(yàn)固定在位點(diǎn)上的含離子通道的組織和該位點(diǎn)的待提供高電阻絕緣帶的表面部分之間的高電阻絕緣帶,其方法為在與該位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極和一參考電極之間連貫地施加一第一電位差,隨后監(jiān)測(cè)流經(jīng)該測(cè)量電極和該參考電極之間的第一電流并將該第一電流值與一預(yù)定的閾值電流值相比較,如果該第一電流值至多也不超過(guò)該預(yù)定的閾值則驗(yàn)證該位點(diǎn)在含離子通道的組織和該位點(diǎn)表面部分之間存在一合格的絕緣帶,并且在已被驗(yàn)證的位點(diǎn)上建立一種全細(xì)胞測(cè)量構(gòu)形,由此便可對(duì)流過(guò)測(cè)量電極和參考電極之間的含離子通道的組織的離子通道的第三電流進(jìn)行測(cè)定和/或監(jiān)視。
      溶液中的含離子通道的組織可以用主動(dòng)或被動(dòng)的手段將其導(dǎo)引到基底上的一位點(diǎn)上。當(dāng)含離子通道的組織與位點(diǎn)(例如基底上一電極周圍區(qū)域)接觸時(shí),該接觸表面便在該位點(diǎn)處(例如電極周圍區(qū)域)形成一高電阻的絕緣帶(千兆絕緣帶),于是便可利用相應(yīng)的電極來(lái)測(cè)量該離子通道的電生理學(xué)性能。這種電生理學(xué)性能可以是通過(guò)含離子通道的組織膜的部分區(qū)域的電流,該部分區(qū)域是指由千兆絕緣帶所包圍的區(qū)域。
      在本文中“千兆絕緣帶”一詞通常是指其電阻值至少為1千兆歐的絕緣帶,并且這通常是指最小尺寸絕緣帶的值,但對(duì)某些電流較大的測(cè)量類型來(lái)說(shuō)閾值可以更低些。
      為了建立全細(xì)胞測(cè)量構(gòu)形,可以在與每個(gè)已被驗(yàn)證位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極和參考電極之間施加一第二電位差脈沖串并監(jiān)視在測(cè)量電極和參考電極之間流過(guò)的第二電流,且當(dāng)該第二電流超過(guò)一預(yù)定的閾值時(shí)便中斷第二電位差脈沖串,借此將含離子通道的組織的最靠近測(cè)量電極的部分弄破(rupturing)。
      作為替代,也可通過(guò)使含離子通道的組織的最靠近測(cè)量電極的部分與一微孔形成物質(zhì)相互作用的方法來(lái)獲得全細(xì)胞測(cè)量構(gòu)形。
      應(yīng)當(dāng)指出,本文中“全細(xì)胞測(cè)量構(gòu)形”一詞不僅是指這樣一種測(cè)量構(gòu)形,其中一完整的細(xì)胞與測(cè)量位點(diǎn)上的基底相接觸并且已被刺破,或通過(guò)一種微孔形成物質(zhì)使其敞開而與細(xì)胞內(nèi)部電接觸;而且還指這樣一種測(cè)量構(gòu)形,其中經(jīng)過(guò)切割的細(xì)胞膜膜片這樣布置,以使細(xì)胞膜外表面“朝上”面對(duì)著將要施加的試驗(yàn)樣品。
      由于與一位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極是基底上許多電極中之一,并且所述含離子通道的組織也只是溶液中許多含離子通道的組織中之一,因此有可能在一基底上獲得許多如此配備的測(cè)量裝置。典型的測(cè)量包括在該測(cè)量裝置上添加特定的試驗(yàn)樣品,因此各個(gè)測(cè)量裝置都應(yīng)當(dāng)相互隔開,以免試驗(yàn)樣品相混以及各裝置之間導(dǎo)電。
      附圖簡(jiǎn)介下面將參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述,其中圖1所示為一典型的已知的電壓箝位測(cè)量電路原理圖;圖2所示為一基底實(shí)例的示意圖,該基底具有多個(gè)用來(lái)固定細(xì)胞膜或人造膜的帶有電極的位點(diǎn);圖3A至3D所示為本發(fā)明各個(gè)基底實(shí)施例的側(cè)向剖面圖,圖中展示了用品片加工工藝(淀積/光刻/蝕刻工藝)制得的各個(gè)層;圖4A所示為另一基底設(shè)計(jì)的側(cè)向剖面圖,該基底具有多個(gè)用來(lái)固定細(xì)胞膜或人造膜的帶有電極的位點(diǎn);
      圖4B所示為圖4A所示結(jié)構(gòu)的頂視圖;圖5表示一被疏水性材料區(qū)域包圍的位點(diǎn)的閉合(close up)圖;圖6表示一帶有一和一系列觸點(diǎn)連接的電極陣列的試驗(yàn)域(testconfinement);圖7所示為當(dāng)細(xì)胞和基底之間(例如電極周圍區(qū)域)形成千兆絕緣帶時(shí)用于檢測(cè)的程序的流程圖。
      附圖中各個(gè)標(biāo)號(hào)所指內(nèi)容如下

      優(yōu)選實(shí)施例描述本發(fā)明涉及一種帶有大量含電極位點(diǎn)的基底,該位點(diǎn)適于固定細(xì)胞或其它含離子通道的組織,使在細(xì)胞膜和基底之間的界面上形成一圍繞電極的千兆絕緣帶,以致可以用來(lái)測(cè)定或監(jiān)視細(xì)胞膜的電生理學(xué)性能。應(yīng)當(dāng)理解,這里所用“細(xì)胞”或“細(xì)胞膜”二詞的意義通常隨上下文的內(nèi)容而定,可能是指諸如另一種含離子通道的脂質(zhì)膜或含離子通道的人造膜等任何其它的含離子通道的組織。電生理學(xué)性能可以是指,例如,流經(jīng)離子通道的電流或含離子通道膜的電容。這里有可能將各種試驗(yàn)樣品(通常為藥物學(xué)藥品)各自獨(dú)立地加到各個(gè)持有細(xì)胞的位點(diǎn)上,由此可以在各個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行單獨(dú)的實(shí)驗(yàn),在實(shí)驗(yàn)中可以測(cè)量一離子通道對(duì)所加試驗(yàn)樣品的響應(yīng)。為了進(jìn)行各種單獨(dú)的實(shí)驗(yàn),可以將不同的試驗(yàn)樣品分別加到不同的持有細(xì)胞的位點(diǎn)上。一種特定的試驗(yàn)樣品所加到或準(zhǔn)備加到的區(qū)域稱作一試驗(yàn)域,一試驗(yàn)域中可以包括一或多個(gè)持有細(xì)胞的位點(diǎn)。
      本發(fā)明的基底通常是一臺(tái)儀器中使用的一部件,該儀器的用途是測(cè)量諸如細(xì)胞那樣的脂質(zhì)膜中的離子通道的電生理學(xué)性能。
      該儀器被設(shè)計(jì)用來(lái)在短時(shí)期內(nèi)完成大量的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。為此提供了一種微型系統(tǒng),該系統(tǒng)具有許多試驗(yàn)域,每個(gè)試驗(yàn)域中具有多個(gè)帶有測(cè)量電極的位點(diǎn)以及適用的試驗(yàn)樣品供應(yīng)裝置。每個(gè)試驗(yàn)域還包括一些手段來(lái)實(shí)施細(xì)胞的定位、千兆絕緣帶的建立、已建立的千兆絕緣帶的位點(diǎn)辨認(rèn)、測(cè)量電極以及一或多個(gè)參考電極。因此該儀器的每一試驗(yàn)域都可以進(jìn)行一項(xiàng)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn),并且可以由一諸如計(jì)算機(jī)那樣的中央控制單元來(lái)控制所有這些實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備及測(cè)量過(guò)程。由于試驗(yàn)域的尺寸很小,因此本發(fā)明在實(shí)施測(cè)量時(shí)僅需很少量的運(yùn)載液體及試驗(yàn)樣品。本發(fā)明還提供了幾個(gè)不同的測(cè)量程序,這包括對(duì)細(xì)胞碎屑和人造膜的測(cè)量。
      具有多個(gè)帶有測(cè)量電極(此后簡(jiǎn)稱“電極”)位點(diǎn)的基底可以有多種構(gòu)形形式,其中的三種展示在圖2A到2C中,更多的則如圖3A至3D及圖4A到4B所示。這些實(shí)施例之間的差別在于基底上的各個(gè)位點(diǎn)的設(shè)計(jì)。各個(gè)位點(diǎn)都適于固定一諸如細(xì)胞那樣的含離子通道的組織,因此位點(diǎn)表面的材料是非常適于與細(xì)胞(或組織)膜一起生成如現(xiàn)有技術(shù)所述的絕緣帶。這種材料包括硅、塑料、純硅石、以及其它的玻璃諸如石英、硼硅酸玻璃或硅石中摻雜了下列組中的一或多個(gè)組元Be、Mg、Ca、B、Al、Ga、Ge、N、P、As及其中任何一的氧化物?;椎谋倔w可以用任何適于采用晶片加工工藝的材料制作,諸如硅、塑料、純硅石、以及其它的玻璃諸如石英、硼硅酸玻璃或硅石中摻雜了下列組中的一或多個(gè)組元Be、Mg、Ca、B、Al、Ga、Ge、N、P、As。在現(xiàn)階段,硅是優(yōu)選的基底材料。
      在如圖2A到2C所示的設(shè)計(jì)中,位點(diǎn)14排列在基底12的局部平坦的表面上。所謂局部平坦是指基底表面上可能會(huì)有某些子結(jié)構(gòu)13,但是他們的尺度大于一或多個(gè)位點(diǎn),如圖2B所示。位點(diǎn)及電極16可以單獨(dú)地或成群地排列在這些子結(jié)構(gòu)內(nèi)。
      圖2A到2C所示三種設(shè)計(jì)的制造方法彼此類似。圖2A及2B簡(jiǎn)單地包括圖2C基本設(shè)計(jì)的某些細(xì)部。下面結(jié)合圖3A及圖6來(lái)描述這些設(shè)計(jì)的制造過(guò)程。
      在基底表面上形成導(dǎo)電材料線18包括三個(gè)步驟,第一步是在基底上淀積一層導(dǎo)電材料。向基底表面或本說(shuō)明書中涉及的任何其它表面上淀積各種材料的技術(shù)可以采用下列技術(shù)中的一種物理汽相淀積技術(shù),包括1)涂敷汽相材料,2)濺射,3)激光消融;化學(xué)汽相淀積技術(shù),包括1)大氣壓化學(xué)汽相淀積(APCVD),2)低壓化學(xué)汽相淀積(LPCVD),3)等離子體增強(qiáng)化學(xué)汽相淀積(PECVD)以及4)光增強(qiáng)化學(xué)汽相淀積;以及旋轉(zhuǎn)涂敷及生長(zhǎng)技術(shù)。第二步為以光刻方法來(lái)界定各個(gè)單獨(dú)的導(dǎo)線;第三步為用蝕刻方法將所述導(dǎo)線以外的導(dǎo)電材料去除。在界定導(dǎo)線時(shí)最好一部分導(dǎo)線形成通向觸點(diǎn)20的線路而另外一部分形成測(cè)量電極零件16陣列及一或多個(gè)參考電極8。電極零件陣列不必是一有序的圖形。觸點(diǎn)及電極零件最好是導(dǎo)線的兩端,但也可以是例如導(dǎo)電條圖形的任何部分。優(yōu)選的是,所述導(dǎo)電材料由金屬或摻雜硅組成。
      為了制作電極及觸點(diǎn),每個(gè)導(dǎo)線上除了電極零件或觸點(diǎn)以外的其余部分要用一種諸如二氧化硅或氮化硅及二氧化硅復(fù)合層那樣的親水性隔離薄膜22包覆起來(lái)。其實(shí)施方法為首先用硅的熱氧化、物理或化學(xué)汽相淀積、或旋轉(zhuǎn)涂敷等技術(shù)在整個(gè)表面上覆蓋一層隔離薄膜,然后用光刻和蝕刻工藝將部分隔離薄膜去除而暴露出導(dǎo)線的電極16和8及觸點(diǎn)20。為了使電接觸情況更良好,電極及觸點(diǎn)上可以涂覆銀層24。作為替代,在需要淀積多層材料薄層的場(chǎng)合下可以采用剝離(lift-off)技術(shù)。此時(shí),先在基底上淀積一層光敏膠,然后以光線透過(guò)一遮光板來(lái)照射光敏膠層以界定所需形成的圖形,隨后進(jìn)行蝕刻。先在基底上以汽相淀積方法沉積一層材料(通常是金屬),然后溶解光敏膠,而在所界定的圖形上金屬便留存下來(lái)。此時(shí)基底便呈圖7所示狀態(tài),其中連接電極和觸點(diǎn)的薄導(dǎo)電體線18被隔離薄膜所覆蓋。
      圖3A所示為一備選的實(shí)施例,含電極位點(diǎn)或位點(diǎn)群的周圍用組合淀積方法全部覆蓋了一層如太氟隆一類的疏水性材料,隨后進(jìn)行光刻而形成所需的疏水性區(qū)域。疏水性材料的淀積方法可以是旋轉(zhuǎn)涂覆、化學(xué)汽相淀積、或等離子體增強(qiáng)化學(xué)汽相淀積。圖2A所示為該疏水性區(qū)域的一可能的應(yīng)用實(shí)例。
      最后,在使用之前,用電解處理的方法在電極16上形成一層銀的氯化物層28。本發(fā)明基底中的測(cè)量電極和參考電極通常都要用此法進(jìn)行處理以形成諸如銀/銀氯化物電極那樣的銀/銀鹵化物電極。
      以上所述加工方法同樣可以用在圖3B至3D那樣的許多不同構(gòu)形的電極上。這些不同的構(gòu)形意味著要采用某些不同的晶片加工工藝,然而對(duì)晶片加工專業(yè)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō),如何針對(duì)電極的具體構(gòu)形來(lái)選擇不同的晶片加工工藝是顯而易見的事。
      圖3B所示為持有一細(xì)胞2的位點(diǎn)的閉合圖,圖中在AgCl層28的周圍形成了絕緣帶25。在電極的制作過(guò)程中,在淀積硅層22之前,先在銀的頂部24形成一大體積的AgCl,因而可以保證AgCl的大量供應(yīng)。
      圖3C所示為另一實(shí)施例,其中測(cè)量電極位于一井27內(nèi),因此在膜和井27的銳邊之間形成了絕緣帶。取決于井27的具體尺寸,本實(shí)施例中膜和工作電極之間允許有更大的間距并且允許有更大體積的運(yùn)載液體圍繞在電極周圍。
      圖3D所示為又一實(shí)施例。其中工作電極象圖3C實(shí)施例一樣地位于一井27內(nèi),在位點(diǎn)上還設(shè)有一開有小孔的物體,當(dāng)在該物體上放有細(xì)胞并且將該物體溶解掉時(shí)便成為一全細(xì)胞測(cè)量構(gòu)形。
      在圖4A所示的構(gòu)形中,位點(diǎn)位于一井的底部,該井是基底上的一帶一定幾何形狀的結(jié)構(gòu)。該井的功能有兩個(gè),一是便于將細(xì)胞2定位到位點(diǎn)上,另一是形成一與四周隔離的試驗(yàn)域,在本實(shí)施例中該試驗(yàn)域僅包括一位點(diǎn)。
      在圖4A所示的基底上,井的形狀是一截尾錐體,有一小孔或通道從截尾錐體的狹窄一端延伸到基底底面,于是該井和該小孔便形成一漏斗。在基底底面上靠近小孔處設(shè)有測(cè)量電極16,而參考電極8則設(shè)在井的側(cè)表面上,如圖4A所示。最好在基底的底面上設(shè)立一條對(duì)所述小孔進(jìn)行抽吸的管道32。在一優(yōu)選實(shí)施例中,此管道通到基底的上面一側(cè),并可以包括通向測(cè)量電極的導(dǎo)線。
      上面所說(shuō)的“底面”僅僅是指圖上的方向。在符合本發(fā)明的實(shí)際使用中,基底的第一表面不一定非得朝上其第二表面不一定非要朝下。換句話說(shuō),在這種非常小的結(jié)構(gòu)中重力本質(zhì)上不起作用,作為例子,圖4A所示構(gòu)形當(dāng)按圖示方向旋轉(zhuǎn)180度或任何其它角度后照樣仍可使用。
      圖4A中所示的井的形狀基本上是一頂點(diǎn)上帶有一孔30的截尾錐體凹坑。錐體的底面為一正方形。為了給一細(xì)胞留出空間,錐體的頂角為2×54.7°,晶片的厚度d=350~650微米,錐體頂點(diǎn)的邊長(zhǎng)w為約30微米。在錐體的頂邊處包覆了一層厚度h為約3微米的二氧化硅膜,該膜上形成了一直徑a為約0.1到10微米的小孔,作為例子a=1~5微米。
      包括一或多個(gè)井的基底可以用幾種十分不同的方法來(lái)制造。下面敘述兩種不同的制造基底片基的工藝最先氧化工藝及最后氧化工藝。
      最先氧化工藝●在整個(gè)基底表面上生長(zhǎng)出3微米的濕熱SiO2。
      ●在基底的底面一側(cè)用光學(xué)掩模及反作用離子蝕刻(Reactive IonEtching)方法制作小孔使其穿透氧化物而到達(dá)硅基底。
      ●在基底的兩側(cè)用LPCVD方法沉積硅的氮化物以用作蝕刻的遮蔽物。
      ●在基底的上側(cè)的氮化物上用光學(xué)掩模和反作用離子蝕刻和濕氧化物蝕刻(經(jīng)緩沖的含氟的酸)方法界定一窗口以形成錐體的底面。
      ●用各向異性蝕刻方法透過(guò)該窗口在硅基底上形成一側(cè)面斜度為54.7°的錐體凹坑。
      ●用熱H3PO4來(lái)停止對(duì)氮化物的蝕刻。
      ●在硅晶片的毛面上生長(zhǎng)1微米的濕熱SiO2以將錐體的側(cè)面絕緣起來(lái)。其它區(qū)域則不考慮生長(zhǎng)SiO2。
      最后氧化工藝●在基底的底面一側(cè)的硅中用摻雜或外延生長(zhǎng)方法摻入硼以形成約1微米厚的蝕刻終止層。
      ●在基底的兩側(cè)用LPCVD方法沉積硅的氮化物以用作蝕刻的遮蔽物。
      ●在基底的上側(cè)的氮化物上用光學(xué)掩模和反作用離子蝕刻和濕氧化物蝕刻(經(jīng)緩沖的含氟的酸)方法界定一窗口以形成錐體的底面。
      ●用各向異性蝕刻方法透過(guò)該窗口在硅基底上形成一側(cè)面斜度為54.7°的錐體凹坑。蝕刻終止于摻硼的終止層上而形成一約1微米厚的硅膜。
      ●用熱H3PO4來(lái)停止對(duì)氮化物的蝕刻。
      ●用光學(xué)掩模和反作用離子蝕刻方法在底面一側(cè)的硅膜上界定小孔。
      ●在整個(gè)基底上生長(zhǎng)濕熱SiO2以將硅膜轉(zhuǎn)變成氧化物。在這一道工序中由于SiO2也形成在所述小孔的內(nèi)面上而使小孔收縮,因此可以制得比光刻工藝更小的孔。
      在上述兩種制造工藝中主要關(guān)心的是加工過(guò)程中帶有小孔的SiO2膜在最終的高溫氧化工序中的機(jī)械穩(wěn)定性??晒┻x擇的是,在材料(這里是SiO2)表面上可以覆蓋一層硅的氮化物以防止導(dǎo)電。
      現(xiàn)在就可以來(lái)形成測(cè)量電極及參考電極了。底面一側(cè)上的測(cè)量電極可以用標(biāo)準(zhǔn)的淀積及光刻技術(shù)來(lái)形成。參考電極則最好用汽化導(dǎo)電材料透過(guò)一遮蔽擋板或用電泳抗蝕(electrophoretic resist)技術(shù)來(lái)形成。
      另外還有可能在基底中或在基底上制作一向上述漏斗添加液體的液流通道,并在基底上的其它地方給出一通向/離開漏斗的進(jìn)出口。備選的是,該液流通道可以用通常的蝕刻技術(shù)形成在第二基底中,該第二基底準(zhǔn)備放置到上述基底的頂上。
      以上所述諸零件最好安排成所有與進(jìn)口及出口向連接的零件都安排在組件的上方以便于接近,就象圖4B中與測(cè)量電極16和參考電極8相關(guān)聯(lián)接的抽吸出口32那樣。這種優(yōu)選構(gòu)形適于將一具有相似的但相反的進(jìn)出口的裝置加到組件的頂上。
      重要的一點(diǎn)是本發(fā)明基底上可以采取某種手段來(lái)形成如圖2所示的和周圍隔離的試驗(yàn)域15。試驗(yàn)域的體積最好小到毫微升級(jí),這是通常所考慮的試驗(yàn)樣品的必須量,這些樣品常常是很昂貴的;另外,溶液是靠擴(kuò)散作用來(lái)混合均勻的,而擴(kuò)散均勻所需時(shí)間是隨著樣品體積的減小而減少的。
      在圖2A中,試驗(yàn)域的界定是如前面已敘述那樣通過(guò)用表面材料在基底上界定出疏水性區(qū)26和親水性曲14的方法來(lái)實(shí)施的。如果表面被一種如鹽溶液那樣的水成溶液所濕潤(rùn)(但不流溢),該溶液將自我限制在親水性區(qū)域內(nèi),由此便界定了試驗(yàn)域。每個(gè)親水性區(qū)域包括幾個(gè)帶有電極16的位點(diǎn)14并且可以包括更小尺度的疏水性區(qū)域。
      在圖2B所示的基底中,試驗(yàn)域被形成在基底表面上的子結(jié)構(gòu)13所界定。該子結(jié)構(gòu)可以用下述方法形成在基底上先在基底表面上覆蓋一層抗蝕劑,然后用光刻方法在上面界定出井口,進(jìn)行蝕刻后再將剩余的抗蝕劑從基底上去除,這樣便作好了形成位點(diǎn)及電極的準(zhǔn)備。
      圖2C所示的基底上覆蓋有電極,但沒有任何子結(jié)構(gòu)實(shí)體。這種情況下,試驗(yàn)域是用一第二結(jié)構(gòu)17來(lái)界定的,第二結(jié)構(gòu)17上帶有凹陷的子結(jié)構(gòu)/隔室。進(jìn)行測(cè)量之前要將第二結(jié)構(gòu)17放到基底頂上并使其與基底緊密接觸,這樣便形成了幾個(gè)封閉的隔室,每個(gè)隔室中包括一或多個(gè)帶有電極的位點(diǎn)。如果方便,相似的結(jié)構(gòu)也可以放到圖2A及2B所示任何一種基底的頂上。
      在圖2所示的所有實(shí)施例中,每個(gè)試驗(yàn)域中都要設(shè)一參考電極。這可以以兩種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)一是其中有一位點(diǎn)中的電極特別大,以致沒有一細(xì)胞能夠完全遮蓋它;二是控制投入的細(xì)胞數(shù)要少與試驗(yàn)域中的位點(diǎn)數(shù),以致這些細(xì)胞不能遮蓋所有的電極。該第二方法允許將其中任何一測(cè)量電極用作參考電極。
      取決于帶電極基底的具體形狀,可以選取下述方法中的一種來(lái)向基底中添加細(xì)胞運(yùn)載液體及細(xì)胞。在一優(yōu)選實(shí)施例中,以一種分配系統(tǒng)或滴管系統(tǒng)從上方接近每個(gè)試驗(yàn)域來(lái)供應(yīng)運(yùn)載液滴及細(xì)胞,該分配或滴管系統(tǒng)可以采用諸如一噴墨打印機(jī)頭或噴泡打印機(jī)(bubble jetprinter)頭。另一可能的方法是使用一種n方格吸液分配器(nQUADaspirate dispenser)或任何其它適于投遞小量液體的滴管分配器。還有一種替代方法為將運(yùn)載液及細(xì)胞加到整個(gè)基底上(例如將含細(xì)胞的運(yùn)載液灌注到整個(gè)基底上或?qū)⒒籽蜎])從而使運(yùn)載液及細(xì)胞到達(dá)每個(gè)試驗(yàn)域。由于運(yùn)載液的體積及其后的試驗(yàn)樣品都小到毫微升級(jí),水分的蒸發(fā)便成為一問(wèn)題了。因此取決于具體體積的大小,液體在基底上的操縱處理最好要在高濕度的氛圍下進(jìn)行。
      在試驗(yàn)域是密閉隔室的情況下,只有通過(guò)一通道系統(tǒng),亦即一微量液體操作系統(tǒng),才能接近試驗(yàn)域。當(dāng)將一如圖2C所示的第二結(jié)構(gòu)17放置到任何一基底上時(shí),不管該基底上是否具有試驗(yàn)域,都屬于密閉試驗(yàn)域的情況。這種情況下,運(yùn)載液及細(xì)胞的供應(yīng)必須通過(guò)通常界定在第二結(jié)構(gòu)17上的進(jìn)口通道來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種第二結(jié)構(gòu)可以用例如硅來(lái)制造,其中的液流通道可以用標(biāo)準(zhǔn)的光刻及蝕刻技術(shù)來(lái)形成。這種第二結(jié)構(gòu)可以放置到任何一實(shí)施例的頂上。
      按照另一方面,是將細(xì)胞直接培養(yǎng)在基底上并同時(shí)浸沒在培養(yǎng)介質(zhì)中。在最好的情況下,細(xì)胞會(huì)在整個(gè)表面上形成一均勻的單層(取決于將要生長(zhǎng)的細(xì)胞類型),除非在故意制成不適于細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域?;咨霞?xì)胞培養(yǎng)能否成功強(qiáng)烈地取決于基底的材料。
      按照又一方面,為用一種帶有離子通道的人造膜來(lái)替代細(xì)胞。這種人造膜可以由一種脂質(zhì)飽和溶液來(lái)制作。Christopher Miller的“IonChannel Reconstitution”,Plenum 1986,p.577中完整地?cái)⑹隽嗽擁?xiàng)技術(shù),其方法為將一小塊類脂體放在一小孔上,如果小孔的尺寸合適并且在小孔兩端存在諸如水那樣的極性液體,小孔上便可形成一脂雙層。然后將一蛋白質(zhì)離子通道并入該雙層中,其方法為將帶有所并入的離子通道的類脂體小泡放置到該脂雙層的一側(cè)上,該小泡便會(huì)由于例如滲透梯度的原因受到拉曳而與該雙層相溶,于是離子通道便并入到該雙層中。
      現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)很好的描述了在細(xì)胞和玻璃細(xì)導(dǎo)管之間獲得良好接觸從而在二者之間產(chǎn)生千兆絕緣帶的方法。為了將細(xì)胞拉曳到細(xì)導(dǎo)管的頂端并使二者之間具有必要的良好接觸以獲得千兆絕緣帶,通常要對(duì)細(xì)導(dǎo)管進(jìn)行抽吸。
      在圖2A至2C所示基底的情況下是不提供抽吸的,而且細(xì)胞是通過(guò)其它手段來(lái)定位的。另外已經(jīng)顯示出,對(duì)于通常用超純硅制造的基底來(lái)說(shuō)僅僅依靠細(xì)胞膜和和基底之間的一般接觸便足以使二者之間產(chǎn)生某種連接而產(chǎn)生千兆絕緣帶。
      可以利用電泳來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的定位,電極所造成的電場(chǎng)可以把帶電荷的細(xì)胞拉向自己,帶負(fù)電荷的細(xì)胞被拉向正極,反之亦然。對(duì)于一群電極來(lái)說(shuō),靜電拉力也可作為一種導(dǎo)引手段。備選的是,在一試驗(yàn)域中,可以將一種疏水性材料26覆蓋在基底上除了緊靠電極周圍區(qū)域以外的表面上。如圖5所示。于是細(xì)胞便僅在電極位點(diǎn)14上相連接。還可以同時(shí)采用上述兩種方法或任選為與另一手段聯(lián)合使用,即將基底上圍繞電極的區(qū)域設(shè)計(jì)成具有合適的幾何形狀以將下沉中的細(xì)胞引向電極。
      在另一實(shí)施例中,位點(diǎn)及測(cè)量電極的分布密度及圖形接近或超過(guò)將細(xì)胞在基底表面上作最緊密排列時(shí)密度的細(xì)胞分布最大密度。這就使得只要細(xì)胞數(shù)目供應(yīng)充分就可保證每個(gè)細(xì)胞都將覆蓋至少一個(gè)電極而不需另外的導(dǎo)引手段。
      在圖4A所示的實(shí)施例中,運(yùn)載液中的一或多個(gè)細(xì)胞2被施加到所述漏斗中并向底部下沉,這就是一利用幾何形狀來(lái)定位的例子。在進(jìn)行抽吸時(shí),將把細(xì)胞拉到小孔30上并在細(xì)胞和小孔之間建立起一將小孔內(nèi)部空間和溶液隔離開來(lái)的千兆絕緣帶。該千兆絕緣帶可以取任何形狀,例如園形或矩形。運(yùn)載液使得細(xì)胞和參考電極之間產(chǎn)生電接觸。抽吸作用可能使細(xì)胞變形并延伸進(jìn)入小孔內(nèi)部,如果此變形延伸是受到控制的話則可能是所希望的情況。
      每個(gè)試驗(yàn)域最好包括幾個(gè)電極位點(diǎn)。為了檢測(cè)電極是否被細(xì)胞覆蓋并被千兆絕緣帶所隔離,可以測(cè)量諸電極之間或諸電極和測(cè)量電極之間的漏電電流。即使一試驗(yàn)域中包括許多電極,檢測(cè)千兆絕緣帶的任務(wù)也是一項(xiàng)很適于用計(jì)算機(jī)來(lái)完成的簡(jiǎn)單工作。
      圖6及7所示為進(jìn)行此項(xiàng)工作的原理圖,其中電極16在試驗(yàn)域中形成一n×m(圖中為3×3)的矩陣。每個(gè)測(cè)量電極通過(guò)連線18連到基底上的一觸點(diǎn)20(No.1到9),因此可以被一臺(tái)帶有電流測(cè)量手段的計(jì)算機(jī)單獨(dú)尋址。用一如圖7程序框圖所示的簡(jiǎn)單方法便可建立起一已被千兆絕緣帶隔離的電極的目錄。首先(1)用兩個(gè)循環(huán)語(yǔ)句(twoloops)將電極矩陣中的每個(gè)引入線(entry)都考慮進(jìn)去。在(2)中將矩陣的n×m陣列展開,以給各個(gè)電極觸點(diǎn)提供一單獨(dú)的地址(3)即電極觸點(diǎn)號(hào)N(No.1到9)。然后,在觸點(diǎn)N和參考電極8(觸點(diǎn)No.0)之間施加一電壓的情況下測(cè)量所產(chǎn)生的電流IN0(4),并且將該電流值和某個(gè)閾值電流I閾值進(jìn)行比較(5)以確定該電極是否已被千兆絕緣帶所隔離。如果一千兆絕緣帶檢測(cè)合格,該觸點(diǎn)號(hào)便寫入合格電極目錄中(6),并根據(jù)此目錄來(lái)選擇測(cè)量電極(7)。該框圖攜帶了關(guān)于合格電極相關(guān)位置n,m的某些信息。在(7)中可以利用這些信息從這些電極中選出最佳的測(cè)量電極,但是也可以將這一部分程序簡(jiǎn)化而只簡(jiǎn)單地給出合格電極的觸點(diǎn)號(hào)N。通常每個(gè)試驗(yàn)域中僅選擇一電極。
      這些通道的活性可以是單獨(dú)地進(jìn)行測(cè)量(單通道記錄)或交替地測(cè)量,還可以將膜片弄破以測(cè)量整個(gè)細(xì)胞膜的通道活性(全細(xì)胞記錄)??梢杂弥辽偃N不同的方法(所有方法都可行,但不同方法對(duì)不同的細(xì)胞可能工作得更好些)來(lái)以高的電導(dǎo)率訪問(wèn)細(xì)胞內(nèi)部以實(shí)施全細(xì)胞測(cè)量a)在圖4A所示實(shí)施例中,可以從小孔一側(cè)進(jìn)行抽吸來(lái)弄破膜。負(fù)壓可以以短暫脈沖的形式或以鋸齒形或階躍形式來(lái)增加其負(fù)壓強(qiáng)度。核查方法為加上一試驗(yàn)電壓脈沖,如果膜已破裂則會(huì)產(chǎn)生一明顯增大的電容性的響應(yīng)電流尖峰信號(hào)(反映整個(gè)細(xì)胞膜的電容)。
      b)通過(guò)施加電壓脈沖擊破細(xì)胞膜。在兩個(gè)電極之間施加電壓脈沖,脈沖可以或是以短暫脈沖的形式或是以鋸齒形或階躍形式來(lái)增加其強(qiáng)度(從毫伏到伏)和持續(xù)時(shí)間(從微秒到毫秒)。一般的細(xì)胞膜是由脂質(zhì)形成的,他們會(huì)被電壓脈沖所導(dǎo)致的巨大電場(chǎng)所感應(yīng),從而會(huì)在電極附近破裂。核查方法為加上一試驗(yàn)電壓脈沖,如果膜已破裂則會(huì)產(chǎn)生一明顯增大的電容性的響應(yīng)電流尖峰信號(hào)。
      c)使膜成為可透過(guò)的。將微孔形成物質(zhì)(例如諸如制霉菌素或兩性霉素B等抗菌素)預(yù)先沉積在位點(diǎn)上。這種以加入促進(jìn)滲透性的分子來(lái)有選擇地降低膜電阻的方法其效果優(yōu)于將膜弄破,這使得可以通過(guò)正負(fù)電極來(lái)有效地控制細(xì)胞電壓(cell voltage)。加入微孔形成物質(zhì)后膜的總電阻會(huì)逐漸下降而電容會(huì)逐漸上聲。
      至此便得到了一帶有若干電極的基底,其中每個(gè)電極都持有一細(xì)胞,所選擇出來(lái)的細(xì)胞其電極周圍都已形成千兆絕緣帶,因此允許用來(lái)測(cè)量細(xì)胞膜中的離子通道的電生理學(xué)性能。本發(fā)明的主要內(nèi)容便是大量地提供這種制備好的可供電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)用的樣本細(xì)胞。此外,其中的每個(gè)細(xì)胞都是限制在一定邊界內(nèi)的以便可以單獨(dú)對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。
      剩下的內(nèi)容就是如何使用這種已制備好的基底了。
      每個(gè)試驗(yàn)域上必須單獨(dú)地加上試驗(yàn)樣品,每個(gè)試驗(yàn)域上的試驗(yàn)樣品可以不同。試驗(yàn)樣品可以用上述各種施加運(yùn)載液的方法來(lái)施加,除了在整個(gè)基底上全面施加運(yùn)載液的方法以外。
      細(xì)胞定位在測(cè)量構(gòu)形中后,便可以測(cè)量其若干電生理學(xué)性能,諸如經(jīng)過(guò)離子通道的電流(電壓箝位)或含離子通道膜的電容。在作任何測(cè)量時(shí),都還需要一適用的電子測(cè)量電路。本專業(yè)的技術(shù)人員都有能力選擇適用的測(cè)量電路。前面已經(jīng)敘述過(guò)一適于作電壓箝位測(cè)量的可能的電路如圖1所示。
      在電壓箝位測(cè)量的情況下,由離子通道攜帶的電流所導(dǎo)致的從溶液(參考電極)流到測(cè)量電極的電荷傳輸量級(jí)通常為從微微安級(jí)到毫安級(jí)。用一低噪聲放大器來(lái)測(cè)量此電流。電子電路可以歸并到獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)裝置中,該裝置上具有通向兩個(gè)電極的接點(diǎn)及可能的用來(lái)施加藥物的液流通道。
      權(quán)利要求
      1.一種平面的基底,其具有一第一表面部分及一和第一表面部分相反的第二表面部分,該第一表面部分具有許多位點(diǎn),其中每個(gè)位點(diǎn)都適于固定一含離子通道的組織,并具有一與該位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極;該基底還帶有一或多個(gè)參考電極;測(cè)量電極及對(duì)應(yīng)的一或多個(gè)參考電極當(dāng)他們通過(guò)電解質(zhì)相互接觸并在其間施加一電位差時(shí),通過(guò)一種電極發(fā)出離子而另一種電極接受離子便會(huì)在兩種電極之間產(chǎn)生電流;每個(gè)所述位點(diǎn)都適于在被固定在該位點(diǎn)的含離子通道的組織和該位點(diǎn)的一表面部分之間提供一高電阻值的絕緣帶;該絕緣帶提供后,便將下述兩個(gè)區(qū)域隔離開,一個(gè)區(qū)域由含離子通道的組織的一側(cè)所界定并通過(guò)電解質(zhì)與測(cè)量電極接觸,另一個(gè)區(qū)域由含離子通道的組織的另一側(cè)所界定并通過(guò)電解質(zhì)與對(duì)應(yīng)的參考電極電接觸,由此可以測(cè)定和/或監(jiān)視流過(guò)兩種電極之間的含離子通道的組織中的離子通道的電流;該電極通過(guò)晶片加工工藝與基底集成在一起。
      2.如權(quán)利要求1的基底,其中該基底是一硅基底,其中所述位點(diǎn)的待提供高電阻值絕緣帶的表面部分是一硅石表面部分,而且所述電極是用一種工藝來(lái)形成的,該工藝包括淀積/光刻/蝕刻工藝。
      3.如權(quán)利要求1或2的基底,其中該基底的第一表面部分上布置有排成陣列的許多位點(diǎn)。
      4.如權(quán)利要求3的基底,其中所述位點(diǎn)的陣列包括至少9個(gè)位點(diǎn)。
      5.如以上任一權(quán)利要求的基底,其中的測(cè)量電極及參考電極是銀/銀鹵化物電極。
      6.如權(quán)利要求5的基底,其中的測(cè)量電極及參考電極是銀/銀氯化物電極。
      7.如以上任一權(quán)利要求的基底,該基底的表面上或表面之上包括一由疏水性材料組成的第一層,所述第一層僅覆蓋在該基底的一部分表面上。
      8.如權(quán)利要求7的基底,其中一或多個(gè)位點(diǎn)位于該基底沒有被所述第一層覆蓋的另一部分表面內(nèi)。
      9.如以上任一權(quán)利要求的基底,該基底包括一或多個(gè)向內(nèi)延伸進(jìn)入該基底的井,每個(gè)井具有一界定在所述第一表面部分中的井口及一底部和一側(cè)面部分,第一表面部分的至少幾個(gè)位點(diǎn)位于井的底部?jī)?nèi)。
      10.如權(quán)利要求9的基底,其中井的形成工藝包括光刻/蝕刻工藝。
      11.如權(quán)利要求10的基底,其中該基底是硅基底,其中井的形狀為截尾錐體,錐體的大端就是井口,錐體側(cè)面部分的斜度為54.7°。
      12.如權(quán)利要求9至11中任一的基底,其中每個(gè)井的側(cè)面部分上有一參考電極。
      13.如以上任一權(quán)利要求的基底,其中和每個(gè)位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極位于相應(yīng)的每一位點(diǎn)上。
      14.如權(quán)利要求13的基底,其中位點(diǎn)上的測(cè)量電極位于該位點(diǎn)的待提供高電阻絕緣帶的表面部分內(nèi)。
      15.如權(quán)利要求14的基底,其中位點(diǎn)上的測(cè)量電極被埋入基底之中,并且具有一與該位點(diǎn)的待提供高電阻絕緣帶的第一表面部分基本齊平的表面部分。
      16.如權(quán)利要求14的基底,其中位點(diǎn)上的測(cè)量電極被埋入基底之中,并且具有一退縮到該位點(diǎn)的待提供高電阻絕緣帶的第一表面部分以下的表面部分。
      17.如權(quán)利要求16的基底,其中該測(cè)量電極的退縮表面部分和該位點(diǎn)的待提供高電阻絕緣帶的第一表面部分將限定一容積,該容積至少部分地充填一種微孔形成物質(zhì)。
      18.如權(quán)利要求1至13任一的基底,每個(gè)位點(diǎn)上還限定一連接第一及第二表面部分的通道,該通道位于該位點(diǎn)的待提供高電阻絕緣帶的表面部分內(nèi)。
      19.如權(quán)利要求18的基底,其中所述通道的橫向尺寸為1至5微米。
      20.如權(quán)利要求18或19的基底,其中與每個(gè)位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極位于該基底相反的第二表面部分上。
      21.如權(quán)利要求20的基底,其中與每個(gè)位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極位于對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上限定的所述通道的一開口附近。
      22.如以上任一權(quán)利要求的基底,還包括用于每個(gè)位點(diǎn)的電子電路,該電子電路和對(duì)應(yīng)的測(cè)量電極和參考電極或幾個(gè)參考電極中的一相關(guān)聯(lián),用于產(chǎn)生一放大信號(hào),該放大信號(hào)是流經(jīng)所述電極之間的離子通道的電流的唯一函數(shù)。
      23.一種建立全細(xì)胞測(cè)量構(gòu)形的方法,用于測(cè)定和/或監(jiān)視一或多個(gè)含離子通道的組織的一或多個(gè)離子通道的電生理學(xué)性能,所述方法包括下列步驟提供一如權(quán)利要求1所述的基底;向一或多個(gè)位點(diǎn)供應(yīng)運(yùn)載液體,所述運(yùn)載液體包含一或多個(gè)含離子通道的組織;將至少一個(gè)含離子通道的組織定位到相應(yīng)數(shù)目的位點(diǎn)上;檢驗(yàn)固定在位點(diǎn)上的含離子通道的組織和該位點(diǎn)的待提供高電阻絕緣帶的表面部分之間的高電阻絕緣帶,其方法為在與該位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極和一參考電極之間連貫地施加一第一電位差,隨后監(jiān)測(cè)流經(jīng)該測(cè)量電極和該參考電極之間的第一電流并將該第一電流值與一預(yù)定的閾值電流值相比較,如果該第一電流值至多也不超過(guò)該預(yù)定的閾值則驗(yàn)證該位點(diǎn)在含離子通道的組織和該位點(diǎn)表面部分之間存在一合格的絕緣帶,并且在已被驗(yàn)證的位點(diǎn)上建立一全細(xì)胞構(gòu)形,由此便可對(duì)流過(guò)測(cè)量電極和參考電極之間的含離子通道的組織的離子通道的第三電流進(jìn)行測(cè)定和/或監(jiān)視。
      24.如權(quán)利要求23的方法,其中所述在已被驗(yàn)證的位點(diǎn)上建立一全細(xì)胞測(cè)量構(gòu)形的步驟,包括在和每個(gè)已被驗(yàn)證位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極和參考電極之間施加一第二電位差脈沖串并監(jiān)視在測(cè)量電極和參考電極之間流過(guò)的第二電流,當(dāng)該第二電流超過(guò)預(yù)定的閾值時(shí)便中斷該第二電位差脈沖串,借此將含離子通道的組織的最靠近測(cè)量電極的部分弄破。
      25.如權(quán)利要求23的方法,其中在已被驗(yàn)證的位點(diǎn)上建立一全細(xì)胞測(cè)量構(gòu)形的步驟,包括使含離子通道的組織的最靠近測(cè)量電極的部分與一微孔形成物質(zhì)相互作用。
      26.如權(quán)利要求23至25中任一的方法,其中與每個(gè)位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極位于每個(gè)對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上,并且其中將至少一個(gè)含離子通道的組織定位到一或多個(gè)位點(diǎn)上的步驟,包括在一或多個(gè)測(cè)量電極和一或多個(gè)參考電極之間施加一第三電位差,以產(chǎn)生一電場(chǎng)來(lái)使一或多個(gè)含離子通道的組織朝至少一個(gè)測(cè)量電極運(yùn)動(dòng),以將含離子通道的組織定位在該位點(diǎn)上。
      27.如權(quán)利要求23至25中任一的方法,其中該基底的每個(gè)位點(diǎn)上都有一連接第一及第二表面部分的通道,該通道基本上位于該位點(diǎn)的待提供高電阻絕緣帶的表面部分的中央,以及其中將一或多個(gè)含離子通道的組織定位到一或多個(gè)位點(diǎn)上的步驟,包括一為被選定位點(diǎn)的所述通道的內(nèi)部空間進(jìn)行抽吸的步驟,從而產(chǎn)生一通過(guò)該通道的運(yùn)載液體的流動(dòng),以將含離子通道的組織導(dǎo)向該通道。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種用于獲得電生理學(xué)測(cè)量構(gòu)形的基底及方法,在該測(cè)量構(gòu)形中,一細(xì)胞在一測(cè)量電極周圍形成一高電阻的絕緣帶(千兆絕緣帶),這使它適于用來(lái)測(cè)定和監(jiān)視流經(jīng)細(xì)胞膜的電流。該基底通常是一用來(lái)研究細(xì)胞膜中電事件的儀器的一部分,例如一用來(lái)進(jìn)行膜片箝術(shù)研究生物膜中的離子傳輸通道的儀器的一部分。該基底具有許多測(cè)量位點(diǎn)或測(cè)量位點(diǎn)陣列,其帶有由晶片加工工藝形成的集成的測(cè)量電極和參考電極。該集成的電極通常是銀/銀鹵化物電極,其中的一電極發(fā)出離子另一電極接受離子,因而適于在它們之間傳導(dǎo)電流。該測(cè)量構(gòu)形中的測(cè)量電極和細(xì)胞內(nèi)部之間存在直接的電接觸,這允許對(duì)該測(cè)量構(gòu)形中的細(xì)胞進(jìn)行快速而有效的測(cè)量,因此是一種全細(xì)胞測(cè)量構(gòu)形。
      文檔編號(hào)G01N27/416GK1377464SQ00813615
      公開日2002年10月30日 申請(qǐng)日期2000年10月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月1日
      發(fā)明者約翰·W·彼德森, 皮特·泰勒曼, 奧利·漢森, 帕利·克里斯托弗遜, 摩坦·比徹, 索倫·P·奧爾森, 喬根·杜, 拉爾斯·托姆遜 申請(qǐng)人:索菲昂生物科學(xué)有限公司
      網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1