專利名稱：核酸的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸的檢測。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明涉及采用支持物-固定的寡核苷酸并且提供與所述支持物或支持物-固定的寡核苷酸相關(guān)性可檢測信號以及與其雜交的靶核酸相關(guān)性可檢測信號的方法來檢測靶核酸。
背景技術(shù)：
核酸的檢測廣泛用來測定特定基因、已知序列的存在和拷貝數(shù)，以及用來鑒定和定量臨床樣品和環(huán)境樣品中的病毒、原核病原體和真核病原體。核酸的一個重要特征是其與具有互補核苷酸序列的核酸形成序列特異性氫鍵的能力。核酸與核酸的互補鏈雜交的這種能力已經(jīng)有利地用于被稱為雜交分析和DNA純化技術(shù)中。
在雜交分析中，使用具有已知序列的核酸作為與具有互補核酸序列的靶核酸雜交的探針。標(biāo)記所述探針使得可以檢測雜交體，相應(yīng)地檢測所述靶核酸。
分析測定取決于產(chǎn)生理想為均相形式的可檢測信號分析物相關(guān)性變化?？删嗤瑫r測定多種靶核酸(多重性)的分析系統(tǒng)是最理想的。沒有這類系統(tǒng)用于核酸分析。
采用芯片上的DNA陣列檢測靶核酸的方法代表本領(lǐng)域一個顯著進步。這種方法在美國專利5,856,101、5,837,832、5,658,802和5,571,639中有介紹。
流式細(xì)胞儀已經(jīng)作為微粒分析儀用于基于多種顆粒的測定中(Fulwyler等，Methods Cell Biology，第二版，Academic Press，第33卷，613(1990)，McHugh，Methods Cell Biology，第二版，Academic Press，第42卷，575(1994)，McHugh等，Cytometry 29，106(1997))。一般而言，應(yīng)用微米大小的球形顆粒(微珠)作為固相，該固相用作熒光信號源，所述熒光信號的強度隨分析物的濃度而變化。當(dāng)顆粒通過多參數(shù)檢測器送到單儲存器，通過流式細(xì)胞儀逐一分析所述顆粒時，所述熒光信號被檢測出來。當(dāng)對大小或熒光強度(或兩者的組合)彼此不同的粒進行差別測定時，每種熒光強度或大小代表一種不同的測定。微球體的熒光標(biāo)記允許多容量高達512種同時不同的測定(Chandler等，ISAC XIX International Congress；Colorado Springs，Colorado USA，1998年2月28日至3月5日)。流式細(xì)胞計量顆粒測定是潛在的均相測定，因為信號連同觸發(fā)顆粒事件一起被記錄下來。所述儀器會略去與觸發(fā)顆粒事件無關(guān)的信號，否則會干擾所述測定。
采用流式細(xì)胞術(shù)對DNA片段按大小進行分辨的方法在以下文獻中有介紹Castro等，Anal Chem 65，849(1993)，Goodwin等，NucleicAcids Res 21，803(1993)，Petty等，Anal Chem 67，1755(1995)和美國專利第5,558,998號。能夠發(fā)熒光的化合物(熒光團或熒光劑)以及能夠與DNA片段化學(xué)計量性結(jié)合的化合物隨著所述DNA片段逐一流經(jīng)流式細(xì)胞儀的檢測器時產(chǎn)生可檢測信號。激光束在特定波長激發(fā)熒光團，然后測量所發(fā)射的熒光，由于脈沖強度與結(jié)合DNA片段的熒光團分子的數(shù)目成正比，因此，也與所述片段的長度成正比。然而，該方法需要檢測和記錄所有的信號事件，而不是檢測和記錄恰好與觸發(fā)事件相關(guān)的信號事件。此外，該方法不提供序列信息或基因身份，僅僅提供所述片段的相對大小。另外，該方法也不能作為一種均相方法。
根據(jù)標(biāo)記探針和靶與寡核苷酸微珠組(bead-set)竟?fàn)幗Y(jié)合，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測DNA序列的方法在以下文獻中有介紹Fulton的美國專利5,736,330(′330專利)，還有Spain，IVD Technology Magazine(1998)，和McDade等，Medical Device & Diagnostic Industry Magazine(1997)。
根據(jù)雙鏈DNA與連接微珠的嵌入劑的結(jié)合，通過流式細(xì)胞計量熒光檢測測定雙鏈DNA的方法在Bieniarx等的美國5,582,984(′984專利)中有介紹。
′330專利介紹了本領(lǐng)域一個有用的進步；然而，對于不同的DNA靶，它需要應(yīng)用不同的標(biāo)記探針，并且采用間接競爭性結(jié)合方法來檢測靶，而不是采用更為先進的直接結(jié)合方法來檢測靶。
′984專利介紹的方法可用來檢測雙鏈DNA的存在，但是不能檢測具體的靶核酸。嵌入染料不存在于溶液中，而是與微珠連接；信號強度有限，由于多個染料分子不能自由與一個雙鏈DNA分子結(jié)合所致。
用于測定靶核酸的這些現(xiàn)有技術(shù)和其它現(xiàn)有技術(shù)的方法已得到廣泛認(rèn)可和利用。然而，仍需要特異性、定量、均相、快速、能夠自動化的方法，使得可以測定多種靶核酸并對其進行鑒定。理想的是，這樣的方法也足夠靈敏，使得當(dāng)靶以多拷貝存在時，不需要擴增靶或者僅需要次數(shù)較少的擴增循環(huán)。
發(fā)明概述本發(fā)明滿足了上述需求。
一方面，本發(fā)明涉及測定一種靶核酸存在或含量的方法，所述方法包括以下步驟A)生成包含以下成分的混合物i)所述靶核酸，和ii)一種寡核苷酸固定在其上的支持物，所述寡核苷酸包含與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列；B)測定與所述支持物或支持物-固定寡核苷酸相關(guān)的參數(shù)值；和C)測定與所述支持物-固定寡核苷酸雜交的靶核酸相關(guān)的信號，作為所述靶核酸存在或含量的度量。
另一方面，本發(fā)明涉及測定多種不同的靶核酸存在或含量的方法，所述方法包括A)生成包含以下成分的混合物i)所述多種靶核酸，和ii)一種或多種靶特異性寡核苷酸固定的其上的支持物，其中一種靶特異性寡核苷酸包含與一種不同的靶核酸的至少一部分互補的核酸序列；B)測定與所述支持物或支持物-固定的靶特異性寡核苷酸相關(guān)的參數(shù)值；和C)測定與所述支持物-固定的靶特異性寡核苷酸雜交的不同靶核酸相關(guān)的信號，作為所述靶核酸存在或含量的度量。
另一方面，本發(fā)明涉及測定一種靶核酸存在或含量的方法，所述方法包括以下步驟A)生成包含以下成分的混合物i)所述靶核酸，和ii)一種寡核苷酸固定在其上的顆粒，所述寡核苷酸包含與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列，其中所述顆粒a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的一種第一化合物或多種化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的一種第一化合物或多種化合物。
可以將所述混合物任選加熱至使雙鏈核酸變性，然后冷卻至讓所述靶核酸與所述固定寡核苷酸雜交，或者，如有需要，可以在與固定寡核苷酸混合之前使靶核酸變性。
所述方法包括產(chǎn)生與雜交靶和固定寡核苷酸探針相關(guān)的可檢測信號、最好是諸如熒光的光學(xué)信號的步驟。在一個實施方案中，將能夠與雙鏈核酸結(jié)合并且當(dāng)與其結(jié)合時產(chǎn)生可檢測熒光信號的第二化合物與所述混合物混合。在一個不同的實施方案中，所述寡核苷酸可以(但不是必須)與能夠發(fā)熒光的第二化合物連接，然后將所述混合物與一種單鏈特異性內(nèi)切核酸酶接觸。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸或所述支持物包含能夠發(fā)熒光的第二化合物。另外，所述支持物或寡核苷酸包含足夠接近所述第二化合物的一種熒光猝滅化合物，以在靶核酸與所述固定寡核苷酸雜交之前猝滅所述第二化合物的熒光。在另一個實施方案中，與微珠連接的寡核苷酸包含或能夠包含代表已知的限制性內(nèi)切核酸酶靶位點的一個互補序列的序列。讓樣品或擴增核酸序列在能夠切割所述位點的一種限制性內(nèi)切核酸酶存在下與結(jié)合在顆粒上的寡核苷酸雜交。任選的是，可以稍后加入所述限制性內(nèi)切核酸酶。如果存在合適的靶核酸，則由于異源雙鏈體的形成而形成完整限制位點，并且所述限制性酶切割所述核酸，從所述顆粒釋放全部或部分標(biāo)記雙鏈序列。這減少或消除了與該特定觸發(fā)事件相關(guān)的核酸特異性熒光信號。
采用用來產(chǎn)生可檢測信號或與固定寡核苷酸探針雜交的靶相關(guān)的信號變化的任一上述實施方案，在顆粒支持物的情況下，將所述混合物暴露于或送進能夠檢測來自所述顆粒的散射電磁輻射或來自第一化合物或多種其它化合物的熒光、或者檢測散射和熒光兩者的裝置或儀器中，從而將顆粒與背景區(qū)分開來。也檢測來自第二化合物的熒光信號，即靶相關(guān)熒光，反映所述靶核酸的存在或含量。
在實施本發(fā)明時可以使用能夠通過檢測顆粒相關(guān)散射和/或熒光，將顆粒與背景區(qū)分開來以及將一種靶特異性顆粒與其它顆粒區(qū)分開來的任何顆粒分析方法或裝置，并且所述方法或裝置能夠檢測靶相關(guān)信號。優(yōu)選激光流式細(xì)胞計量方法?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的激光流式細(xì)胞儀是Ortho-Clinical Diagnostics，Inc.，Raritan，NJ的ORTHOCYTORONABSOLUTE流式細(xì)胞儀。也可以使用熒光顯微鏡檢方法和裝置。也可以使用激光掃描方法和裝置，例如Compucyte Corporation，Cambridge，MA的Compucyte激光掃描細(xì)胞儀?？梢允褂迷试S空間分辨支持物-固定寡核苷酸的多種方法；激光掃描方法是特別適合的方法。如上所述，也可以使用能夠?qū)㈩w粒與背景區(qū)分開來并且能夠辨別來自靶特異性顆粒的散射或熒光信號、并且能夠檢測靶相關(guān)信號的方法和裝置，所述方法和裝置不依賴于各種顆粒的物理分離。
另一方面，本發(fā)明涉及測定多種不同的靶核酸存在或含量的方法，所述方法包括A)生成包含以下組分的混合物i)所述靶核酸，和ii)多種靶特異性顆粒，其中一種靶特異性顆粒上固定有包含與一種不同的靶核酸的至少一部分互補的核酸序列的寡核苷酸，其中每種顆粒獨立地a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的不同熒光信號的一種不同的第一化合物或多種其它化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述不同顆粒的不同熒光信號的一種不同的第一化合物或多種其它化合物。
如上所討論，可以將所述混合物任選加熱至使雙鏈核酸變性，然后冷卻至讓所述靶核酸與固定寡核苷酸雜交，或者，如有需要，可以在與固定寡核苷酸混合之前將所述靶核酸加熱。
用于測定多種靶核酸的方法包括產(chǎn)生與固定寡核苷酸雜交的靶相關(guān)的可檢測信號、優(yōu)選光學(xué)信號、最優(yōu)選熒光的步驟。將能夠與雙鏈核酸結(jié)合并且當(dāng)與其結(jié)合時產(chǎn)生可檢測熒光信號的第二化合物與所述混合物混合，或者將所述寡核苷酸與能夠發(fā)熒光的第二化合物連接，然后將所述混合物與單鏈特異性內(nèi)切核酸酶接觸，或者所述寡核苷酸或支持物包含能夠發(fā)熒光的第二化合物，并且所述支持物或寡核苷酸包含足夠接近第二化合物的熒光猝滅化合物，以在靶核酸與固定寡核苷酸雜交之前猝滅所述第二化合物的熒光。
采用用來產(chǎn)生與固定探針雜交的靶相關(guān)的可檢測信號的上述實施方案，在顆粒性支持物的情況下，將所述混合物暴露于或送進如上所述的裝置或儀器中，所述裝置或儀器能夠檢測來自顆粒的散射電磁輻射或來自顆粒的第一化合物或多種其它化合物的熒光、或者能夠檢測兩者、以及檢測來自所述第二化合物的熒光信號，作為各種不同的靶核酸存在或含量的度量。因為所述靶特異性顆?？梢愿鶕?jù)其特異性光散射和/熒光來區(qū)分，所以可以完成所述方法。因此，對于每種靶，提供靶相關(guān)熒光信號的第二化合物可以相同。然而，對于每種靶，如有需要，可以使用不同的第二化合物。
所產(chǎn)生的熒光信號與固定寡核苷酸雜交的靶含量成正比?？赡芘c溶液中游離的不與固定探針雜交的靶核酸和非靶核酸相關(guān)的熒光基本上(如果有的話)不對測量的靶相關(guān)信號產(chǎn)生影響。
采用長寡核苷酸探針序列，可以獲得高度的特異性和靈敏度，所述探針序列也允許應(yīng)用嚴(yán)格性雜交條件。
另一方面，本發(fā)明涉及檢測一種靶核酸的試劑盒，所述試劑盒在同一容器或不同容器中包含1)一種顆粒a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物；2)一種寡核苷酸，所述寡核苷酸包含與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列；和3)一種化合物，所述化合物能夠與雙鏈核酸結(jié)合并且結(jié)合時或結(jié)合在其上時能夠產(chǎn)生一種可檢測信號。
另一方面，本發(fā)明涉及檢測一種靶核酸的試劑盒，所述試劑盒在相同或不同容器中包含1)一種顆粒a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物；2)一種寡核苷酸，所述寡核苷酸包含與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列，所述寡核苷酸包含一種配體；3)一種單鏈特異性內(nèi)切核酸酶；和4)一種化合物，所述化合物能夠發(fā)熒光并且能夠與所述配體結(jié)合。
另一方面，本發(fā)明涉及檢測一種靶核酸的試劑盒，所述試劑盒在相同或不同容器中包含1)一種顆粒a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物；2)一種寡核苷酸，所述寡核苷酸包含
a)與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列；b)能夠發(fā)熒光的第一化合物，和c)能夠猝滅所述第一化合物的熒光的第二化合物。
另一方面，本發(fā)明涉及檢測一種靶核酸的試劑盒，所述試劑盒在相同或不同容器中包含1)一種顆粒a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物；2)一種寡核苷酸，所述寡核苷酸包含與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列，所述寡核苷酸包含一種配體；3)一種雙鏈序列特異性限制性內(nèi)切核酸酶；和4)一種化合物，所述化合物能夠發(fā)熒光并且能夠與所述配體結(jié)合。
在本發(fā)明的又一實施方案中，公開了檢測生物樣品中擴增核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟將含有所述核酸序列的生物樣品與微粒、熱穩(wěn)定性熒光團和熱穩(wěn)定聚合酶混合；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增所述核酸的選定區(qū)段；和檢測所述核酸序列。
所述熱穩(wěn)定性熒光團選自SYBR green I、溴化乙錠和碘化丙錠，所述熱穩(wěn)定性熒光團最好是SYBR green I。
在本發(fā)明的再一實施方案中，公開了檢測生物樣品中擴增核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟將含有所述核酸序列的生物樣品與微粒和熱穩(wěn)定聚合酶混合；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增所述核酸的選定區(qū)段；將步驟(b)的擴增產(chǎn)物與熒光團混合；和檢測所述核酸序列。
所述熒光團選自濃縮picogreen、SYBR green I、溴化乙錠和碘化丙錠，并且所述熒光團最好是濃縮picogreen。
在本發(fā)明的再一實施方案中，公開了檢測生物樣品中擴增核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟在熱穩(wěn)定聚合酶存在下通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增所述核酸序列；將步驟(a)的擴增產(chǎn)物與熒光團和微?；旌?；和檢測所述核酸序列。
所述熒光團選自濃縮picogreen、SYBR green I、溴化乙錠和碘化丙錠，并且所述熒光團最好是濃縮picogreen。
在本發(fā)明的再一實施方案中，公開了包含寡核苷酸陣列的DNA芯片，所述寡核苷酸陣列包含靶特異性點陣(locus)和重復(fù)點陣。所述芯片或玻片可用于測定一種或多種特異性靶序列的存在或含量。對于每種靶，所述芯片包含約5個至約20個靶特異性點陣和約5個至約20個重復(fù)點陣，更優(yōu)選約100個至約1000個靶特異性點陣和約10個至約100個重復(fù)點陣。
還公開了采用DNA芯片檢測一種或多種靶DNA序列的方法，所述方法包括將已經(jīng)錨定有對應(yīng)于一種或多種待測靶序列的一種或多種寡核苷酸的DNA芯片與含有所述一種或多種靶序列的樣品接觸，一般而言，所述靶序列為約30pg至約200ng或更高含量的熒光標(biāo)記DNA；和檢測所述一種或多種特異性靶序列的存在或含量。
所述熒光團選自吖啶橙、碘化丙錠、溴化乙錠、光神霉素、色霉素、橄欖霉素，另見美國專利第5,049,490號和第5,563,037號。優(yōu)選的化合物包括Hoechst H33258、Hoechst H33342、DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)，和Molecular Probes的TOPRO、TOTO、YOPRO、YOYO、SYBR GREEN I和Picogreen，以及本領(lǐng)域常用的其它化合物；所述熒光團最好是濃縮Picogreen。
所有的上述方法或試劑盒可以具體用以測定一種或多種靶核酸。
附圖簡述

圖1為一示意圖，描繪了與顆粒-固定寡核苷酸雜交的靶核酸的雜交和檢測。
圖2A為前方位角光散射與直角光散射(顆粒大小選擇)的曲線圖，噻唑橙作為靶DNA指示劑，存在CTDNA、不存在靶DNA。
圖2B為前方位角光散射與直角光散射(顆粒大小選擇)的曲線圖，噻唑橙作為靶DNA指示劑，1000費摩爾靶DNA，過量的CTDNA。
圖2C為前方位角光散射與綠色熒光的曲線圖，噻唑橙作為靶DNA指示劑，存在CTDNA、不存在靶DNA。
圖2D為前方位角光散射與綠色熒光的曲線圖，噻唑橙作為靶DNA指示劑，1000費摩爾靶DNA，過量的CTDNA。
圖2E為事件分布與綠色熒光的曲線圖，噻唑橙作為靶DNA指示劑，存在CTDNA、不存在靶DNA。
圖2F為事件分布與綠色熒光的曲線圖，1000費摩爾靶DNA，過量的CTDNA。
圖3為平均綠色熒光與雙鏈靶DNA拷貝數(shù)的曲線圖。
圖4顯示核酸酶保護和檢測顆粒結(jié)合靶核酸的示意圖。
圖5為平均信道橙色熒光(用鏈霉抗生物素蛋白綴合的R-藻紅蛋白染色，捕獲在微珠上的核酸酶保護性dsDNA)與雙鏈靶DNA拷貝數(shù)的曲線圖。
圖6為平均信道熒光與PCR擴增循環(huán)次數(shù)的曲線圖。
發(fā)明詳述一般性討論對于本發(fā)明而言，術(shù)語“支持物”表示任何顆粒物質(zhì)或非顆粒物質(zhì)，寡核苷酸可以固定至所述物質(zhì)或寡核苷酸固定在所述物質(zhì)上。
廣義上說，用于檢測靶核酸的本發(fā)明方法依賴于對一個第一參數(shù)或多個其它參數(shù)的一系列測量，以便鑒定一種測定。對一個第二參數(shù)或多個其它參數(shù)的相應(yīng)一系列測量用來測定一種靶核酸的存在或?qū)ζ溥M行定量。用所述分析鑒定和靶測定參數(shù)制出相關(guān)的數(shù)據(jù)表。可以連續(xù)進行這些參數(shù)的測量。每組測量值被稱為一個事件。因此，數(shù)據(jù)表可以如下
通常采用激光掃描細(xì)胞術(shù)或流式顯微熒光測定法獲得這樣的數(shù)據(jù)表。它們統(tǒng)稱為“表式數(shù)據(jù)”。
可以用一個參數(shù)X值的一個范圍(“A”)來確定對第一靶核酸的一種測定。可以用X值的另一范圍(“B”)來確定對第二靶核酸的一種測定。用這種方法，可以同時進行兩種測定。每當(dāng)一個事件與范圍A內(nèi)的X值有關(guān)時，則對參數(shù)Z的測量總是針對所述第一靶核酸。每當(dāng)一個事件與范圍B內(nèi)的X值有關(guān)時，則對參數(shù)Z的測量總是針對所述第二靶核酸?？梢酝瑫r進行的測定的數(shù)目僅受參數(shù)X范圍內(nèi)可被檢測的不同范圍的數(shù)目限制，所述參數(shù)X用來對各種靶核酸確定一種測定。通過對A、B等設(shè)定大范圍，可以獲得屬于特殊測定類別的事件的高度可靠性。
如果用一個以上的參數(shù)來確定一種測定，則可以增加可以同時進行測定的數(shù)目?？梢杂脜?shù)X值的一個范圍(“A”)連同參數(shù)Y值的一個范圍(“Q”)一起確定針對第一靶核酸的一種測定?？梢杂肵值的另一范圍(“B”)連同參數(shù)Y值的另一范圍(“R”)一起確定針對第二靶核酸的一種測定。用這種方法，可以同時進行兩種測定。每當(dāng)一個事件與范圍A內(nèi)的X值和范圍Q內(nèi)的Y值有關(guān)時，則對參數(shù)Z的測量總是針對所述第一靶核酸。同樣，每當(dāng)一個事件與范圍B內(nèi)的X值、和范圍R內(nèi)的Y值有關(guān)時，則對參數(shù)Z的測量總是針對所述第二靶核酸。當(dāng)采用多參數(shù)來鑒定一種測定時，可以同時進行測定的數(shù)目不再受單個參數(shù)的不同范圍數(shù)目限制，這是由于可以用參數(shù)的特定組合來確定對每種靶核酸的一種測定所致。另外，通過對A、B、Q、R等設(shè)定大范圍，可以獲得屬于特殊測定類別的事件的更高可靠性。
在激光掃描細(xì)胞術(shù)或流式細(xì)胞術(shù)中，對多種同時測定分類的優(yōu)選參數(shù)是前向光散射、側(cè)向散射，或者與用來檢測來自雜交核酸的信號不同的熒光參數(shù)。對于DNA芯片，對多種測定分類的優(yōu)選參數(shù)是空間維度，即芯片表面上的x和y坐標(biāo)或位置。
除可供用于同時進行多項測定外，本發(fā)明的一個主要優(yōu)點是運用所述列表方式數(shù)據(jù)獲得相同測定重復(fù)測量的能力。例如，基于參數(shù)X值的一個范圍(“A”)的測量連同參數(shù)Y值的一個范圍(“Q”)的測量一起，把事件1到事件n分成屬于對第一靶核酸的一項測定?；赬值的一個范圍(“B”)的測量連同參數(shù)Y值的一個范圍(“R”)的測量一起，把事件n+1到事件p分成屬于對第二靶核酸的一項測定。
可以進行統(tǒng)計學(xué)分析，以通過分析事件1到事件n來確定第一項測定的Z均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差。同樣，可以對第二項測定進行統(tǒng)計學(xué)分析，以通過分析事件n+1到事件p來確定Z的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差。因此，靶和對照之間的信號差異以及靶不同水平之間的差異可以以重復(fù)測量的均數(shù)之間的差異來表示，從而提高所進行的所有測定的靈敏度。屬于特殊測定類別的事件不必連續(xù)測量。僅為了說明本發(fā)明，進行了連續(xù)性測定說明。
另一個優(yōu)點是可以使用單參數(shù)來同時檢測多種靶核酸的信號。因而，無論待測靶核酸的數(shù)目多少，僅需要一個報告因素。異硫氰酸熒光素(FITC)的綴合物可用來產(chǎn)生信號。在優(yōu)選實施方案中，使用一種嵌入染料。
采用結(jié)合雙鏈核酸時或當(dāng)與雙鏈核酸結(jié)合后產(chǎn)生在諸如吸收或熒光的光學(xué)特性方面的可檢測變化的化合物，可以完成在單鏈核酸存在下測定雙鏈核酸的存在或含量(Ririe等，Anal Biochem 245，154(1997)，Wittwer等，BioTechniques 22，130(1997)，Yamamoto等，歐洲專利公布0 643 140 A1和Sutherland等的美國專利第5,049,490號和第5,563,037號)。
采用以下文獻中介紹的“核酸酶保護測定”，可以對核酸進行測定Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，第1-3卷，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)和Thompson等，Biol.Chem.267，5921(1991)。該方法包括標(biāo)記的單鏈DNA探針與靶DNA或RNA分子的雜交并且隨后用一種單鏈特異性內(nèi)切核酸酶(例如S1核酸酶)水解單鏈核酸。雜交雙鏈核酸仍保持完整，保護所述標(biāo)記探針不被所述內(nèi)切核酸酶水解。所述標(biāo)記物可以是本領(lǐng)域已知并且適合檢測的染料、熒光劑、放射性標(biāo)記分子、酶等等。所述測定可以對所速靶核酸進行定量。
諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的核酸擴增方法，通常采用標(biāo)記探針或者延伸至捕獲在固定互補寡核苷酸探針上的可檢測產(chǎn)物中的標(biāo)記引物達到對靶核酸的檢測，已經(jīng)開發(fā)出各種各樣的標(biāo)記物，Vlieger等，Anal Biochem 205，1(1992)，Yang等，Blood 81，1083(1993)。熒光素化引物已經(jīng)用于bcl-2/MBR和IgH基因重排的流式細(xì)胞計量檢測中，Barker等，Blood 83，1079(1994)。
測定靶核酸的另一種方法包括線性增強熒光劑標(biāo)記的靶特異性寡核苷酸探針的信號。所述標(biāo)記探針當(dāng)與靶雜交時，被一種雙鏈核酸特異性外切核酸酶(例如從3′端水解雙鏈DNA(dsDNA)的外切核酸酶III)水解。在水解期間產(chǎn)生的截短的異源雙鏈雜交體是不穩(wěn)定的。標(biāo)記探針的縮短片段會解離。然后，新的完整標(biāo)記探針可以與所述靶雜交，發(fā)生新一輪水解后，又是縮短的標(biāo)記探針的解離，如此循環(huán)。然后，將所產(chǎn)生的探針片段通過電泳進行分離，并用測序儀對其進行測定。(Okano等，Anal Biochem 228，101(1995))。
最近，Tyagi等，Nature Biotechnolgy 14，303(1996)介紹了應(yīng)用所謂的分子信標(biāo)(beacon)檢測核酸。分子信標(biāo)是包含一種熒光劑和緊靠著所述熒光劑的猝滅劑的靶特異性寡核苷酸。在結(jié)合靶核酸時，所述熒光劑和猝滅劑分離，然后檢測所產(chǎn)生的熒光。
在多種不同的靶核酸的情況下，靶特異性支持物/顆粒因為在其上固定有與僅一種不同的靶核酸的至少一部分互補寡核苷酸，而對不同的靶核酸有特異性。
靶DNA可以為單鏈(ssDNA)或雙鏈形式。如果為雙鏈形式，則通常通過加熱對其進行處理，以在與支持物-固定寡核苷酸混合之前、期間或之后使所述dsDNA變性。然后，讓所述ssDNA靶與支持物-固定寡核苷酸雜交。
在實施本發(fā)明時可以使用任何光學(xué)信號和產(chǎn)生所述光學(xué)信號的方法，所述信號來源于與支持物-固定寡核苷酸雜交的靶核酸或與所述靶核酸相關(guān)。如上所述，在一個實施方案中，通過利用與dsDNA結(jié)合并且當(dāng)如此結(jié)合時產(chǎn)生可檢測熒光信號的熒光劑，獲得靶相關(guān)信號。這在圖1中用示意圖說明。另一方面，通過利用與支持物-固定的寡核苷酸連接的熒光團，可以產(chǎn)生與所述寡核苷酸雜交的靶相關(guān)的熒光信號。當(dāng)支持物-固定寡核苷酸探針與靶核酸雜交形成雙鏈核酸時，單鏈特異性內(nèi)切核酸酶不能水解或基本上不能水解所述寡核苷酸，因此不能水解或基本上不能水解具有與其連接的熒光劑的寡核苷酸部分。因而，與寡核苷酸連接的熒光劑仍然與所述支持物結(jié)合；檢測與雜交靶結(jié)合的熒光劑的靶相關(guān)信號。通過單鏈內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)的水解釋放的熒光劑產(chǎn)生的信號基本上不對所測量的熒光產(chǎn)生影響。在一個相關(guān)實施方案中，當(dāng)靶與支持物-固定寡核苷酸雜交時產(chǎn)生含有一個限制位點的雙鏈DNA序列后，限制性內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)的水解作用可用來釋放與所述寡核苷酸結(jié)合的熒光團。在另一個實施方案中，將熒光團與所述寡核苷酸或所述支持物結(jié)合，使得足夠接近能夠基本上猝滅(大于或等于約50％)其熒光的化合物。如果所述熒光劑與所述支持物連接，則所述猝滅劑與所述寡核苷酸連接。如果所述猝滅劑與所述支持物連接，則所述熒光劑與所述寡核苷酸連接?；蛘邿晒鈩┖外鐒﹥烧叨伎梢耘c所述寡核苷酸連接。
盡管優(yōu)選熒光劑僅當(dāng)與dsDNA結(jié)合時才產(chǎn)生可檢測信號的能力，但是并不要求熒光劑具有這種能力，以便其可用于實施本發(fā)明。顆粒和顆粒-固定的寡核苷酸本發(fā)明的顆粒支持物可以由能夠共價或非共價連接寡核苷酸和/或其它化合物(例如熒光團)的任何材料構(gòu)成或多種材料組合構(gòu)成。它們可以具有允許化合物(例如熒光團)被包囊的結(jié)構(gòu)，只要所述熒光是可檢測的即可。它們可以具有散射電磁輻射的大小和組成。所述顆粒最好由一種或多種包含配體或官能團的聚合物構(gòu)成，所述配體或官能團使得能夠直接或通過合適的結(jié)合配偶體或接頭基團來非共價或共價結(jié)合寡核苷酸和/或其它化合物。它們最好大致為球形，其直徑范圍約0.3微米至約50微米，更優(yōu)選0.9微米至約15微米，和/或它們能夠散射的電磁輻射大于或等于約200納米。用于實施本發(fā)明的聚合顆?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備。參見例如美國專利4,997,772、5,149,737、5,210,289和5,278,267和其中引用的參考文獻?；蛘?，合適的顆?？梢缘米岳鏐angs Labs，F(xiàn)ishers，IN和Spherotech，Libertyville，IL和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它來源。
采用眾所周知的方法，例如在美國專利5,177,023、4,713,326、5,147,777、5149,737、EP-B-0 070 687、WO-A-88/01302和其中引用的參考文獻中描述的方法，可以進行寡核苷酸與顆粒性支持物或非顆粒性支持物的連接。寡核苷酸可以與其任何所需的一種或多種化合物連接，只要所述一種或多種化合物基本上不干擾所述靶核酸的雜交即可。例如，也可以如此連接諸如生物素的配體、熒光劑、熒光猝滅化合物或其它合物。寡核苷酸可以在其3′端或5′端與顆粒連接。
寡核苷酸探針可以包含任何所需數(shù)目的堿基。一般而言，它可以包含的堿基長度在約5個至約105個核苷酸堿基之間。優(yōu)選它包含的堿基長度在約15個至約40,000個堿基之間，更優(yōu)選在約30個至約10,000個堿基之間，甚至更優(yōu)選在約30個至約1000個堿基之間，最優(yōu)選在約30個至約500個堿基之間。檢測用顆粒性支持物的本發(fā)明的一個重要方面是應(yīng)用基于顆粒的光散射和/熒光特性，將所述顆粒和靶相關(guān)信號與本底和靶特異性顆粒相互區(qū)分開來的方法和儀器。通過靶特異性顆粒的光散射特性和/或來源于與各種靶特異性顆粒相關(guān)的一種或多種熒光團的熒光信號方面的不同差異，將所述靶特異性顆粒相互區(qū)分開來，所述熒光信號與靶相關(guān)熒光不同。
顆粒的散射光取決于所述顆粒的大小和/或折射率，兩者均可以采用熟知的方法按需進行改變。顆粒不一定能夠散射光。顆粒的鑒別可以通過將一種或多種能夠產(chǎn)生不同熒光的化合物摻入、包囊、非共價或共價與顆粒鍵合來實現(xiàn)。
激光掃描細(xì)胞術(shù)已用來鑒別顆粒，例如血細(xì)胞。當(dāng)用激光光束對細(xì)胞或細(xì)胞團(聚集體)進行掃描時，照射光被所述細(xì)胞或細(xì)胞團散射；散射的強度隨細(xì)胞(或聚集體)的大小或形狀而異。例如單個紅細(xì)胞散射的光小于小聚集體，進而小聚集體散射的光小于大聚集體。
同樣，當(dāng)用激光光束對細(xì)胞或細(xì)胞團(聚集體)進行掃描時，照射光可以誘導(dǎo)與一個或多個細(xì)胞結(jié)合的熒光劑的熒光。如果熒光劑與細(xì)胞相對均勻地結(jié)合，則熒光強度與聚集體大小有關(guān)。例如單個紅細(xì)胞發(fā)射的熒光小于小聚集體，進而小聚集體發(fā)射的熒光小于大聚集體。
采用散射光并結(jié)合熒光比采用單獨的散射光或熒光來鑒別不同類別的聚集體更為可靠。
在流式細(xì)胞術(shù)中，諸如血細(xì)胞的顆粒被送進快速流動的液體流的中心，并且迫使其排成單行以勻速流出直徑小的小孔。由于流體動力學(xué)作用，所述顆粒被鞘流液的周圍層流匯聚到流體中心。流體中的顆粒進入檢測區(qū)，在檢測區(qū)用外加的光源對其進行照射，在紅細(xì)胞的情況下，以速率為2.5×102至106細(xì)胞/分鐘進行測量。在測量顆粒時使用激光光源；所用的典型激光光源包括氬離子激光(UV，藍綠光)、氪激光(黃紅光)、氦-鎘激光(UV和藍光)和氦-氖激光(紅光)。
在熒光顯微鏡檢術(shù)中，可以在顯微鏡載玻片或等同物上對顆粒進行檢測。通常，用白色光源或基本為單色光源對其進行照射。在此，也可以使用激光光源作為單色光的光源。可以用白光評價顆粒的存在，并且用單色光和適當(dāng)?shù)臑V光片評價相關(guān)的熒光。對于這些讀數(shù)中的一種或兩種讀數(shù)，使用可以目測或自動化手段。
優(yōu)選的流式細(xì)胞儀能夠選擇性檢測與顆粒相關(guān)的靶相關(guān)信號，所述顆粒具有已知范圍的前方位角和直角散射的信號強度或特殊的熒光(Yang等，Blood 81，1083(1993)，Barker等，Blood 83，1709-1085(1994)，Chandler等，ISAC XIX International Congress；Colorado Springs，Colorado USA，F(xiàn)ulton等，Clinical Chem 43，1749(1997)，F(xiàn)ulwyler等，Methods Cell Biology，第二版，Academic Press，第33卷，613(1990)和McHugh，Methods Cell Biology，第二版，Academic Press，第42卷，575(1994))。用光散射和/或與顆粒相關(guān)的熒光主控數(shù)據(jù)獲取。選擇與顆粒相關(guān)的信號使得可以檢測靶相關(guān)信號，而不受源自所述顆粒浸漬的混合溶液相的熒光的干擾。因而，信噪比大。靶相關(guān)信號與靶含量成正比，采用優(yōu)選的流式細(xì)胞計量方法測定多種靶核酸也是可能的。采用流式細(xì)胞術(shù)對溶液中游離存在的核酸進行多重分析在以下文獻中有描述Chandler等，ISAC XIX International Congress；ColoradoSprings，Colorado(1998)，F(xiàn)ulton等，Clin Chem 43，1749(1997)，F(xiàn)ulwyler等，Methods Cell Biology，第二版，613(1990)和McHugh，Methods Cell Biology，第二版，575(1990)。DNA結(jié)合的熒光團能夠與dsDNA結(jié)合并且當(dāng)與其結(jié)合時能夠產(chǎn)生一種可檢測信號或可對其進行化學(xué)修飾以產(chǎn)生一種可檢測信號的許多化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且可獲得的。其中包括染料、抗生素和化學(xué)治療劑。它們可以嵌入性的或非嵌入性的；但是，它們必須基本上不與固定寡核苷酸的支持物結(jié)合。具體的實施包括但不限于吖啶橙、碘化丙錠、溴化乙錠、光神霉素、色霉素、橄欖霉素，另見美國專利第5,049,490號和第5,563,037號。優(yōu)選的化合物包括Hoechst H33258、Hoechst H33342、DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)，和Molecular Probes的TOPRO、TOTO、YOPRO、YOYO、SYBR GREEN I和PicogreendsDNA定量試劑和噻唑橙。某些化合物(例如YOYO)在它們結(jié)合dsDNA前實際上不發(fā)熒光。吖啶橙具有異染色特性，使得可以鑒別是與ssDNA結(jié)合還是與dsDNA結(jié)合。對于本發(fā)明而言，化合物必須基本上不與單鏈固定寡核苷酸結(jié)合，但如果確已結(jié)合，任何所產(chǎn)生的信號必須能夠不同于當(dāng)所述化合物與dsDNA結(jié)合時所產(chǎn)生的信號。單鏈特異性內(nèi)切核酸酶、限制性內(nèi)切核酸酶在實施本發(fā)明時可以使用的單鏈特異性內(nèi)切核酸酶包括但不限于S1內(nèi)切核酸酶和綠豆內(nèi)切核酸酶?？梢允褂玫南拗菩詢?nèi)切核酸酶包括但不限于Acc65 I、Acc I、Aci I、Alu I、Apa I、Apa L、Ava I、AvaII、Bae I、BamH I、Bcg I、Bcl I、Bfa I、Bgl I、Bgl II、Bsa I、BsaJ I、Bsl I、BspH I、BsrG I、Bst4C I、BssS I、BstE II、BstU I、BstX I、BstYI、Cla I、Dde I、Dpn I、Dpn II、Dra I、Dra III、EcoOl09 I、EcoR I、EcoR V、Fau I、Fok I、Hae II、Hae III、Hha I、Hinc II、Hind III、Hinf I、Hpa I、Hpa II、Kpn I、Mbo I、Mlu I、Mnl I、Mse I、Msp I、Nae I、Nco I、Nde I、Nhe I、Nla III、Nru I、Pst I、Pvu I、Pvu II、RsaI、Sac I、Sac II、Sal I、Sau3A I、Sca I、Sfi I、Sma I、SnaB I、，Spe I、Sph I、Ssp I、Stu I、Sty I、Taq I、Xba I、Xcm I、Xho I、Xma I和XmnI。熒光劑和猝滅劑在其中一起提供熒光團和猝滅劑的一個實施方案中，可以將熒光團連接在寡核苷酸的末端或附近，而將猝滅劑連接在另一末端或附近，正如Tyagi等，Nature Biotechnolgy 14，303(1996)，Tyagi等，Nature Biotechnolgy 16，49(1998)，Giesendorf等，Clin Chem 44，482(1998)和Estrada等，Mol Cell Probes 12，219(1998)描述的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(分子信標(biāo))。在莖-環(huán)結(jié)構(gòu)中，所述寡核苷酸在兩個末端都包含互補核苷酸堿基對。互補堿基對的雜交導(dǎo)致形式具有與熒光團和猝滅劑足夠接近的閉合環(huán)，使得熒光被猝滅。在靶核酸與所述寡核苷酸雜交后，所述環(huán)被打開，熒光團和猝滅劑變得足夠分離，以允許發(fā)熒光。
在所有情況下，檢測之前不需要支持物-固定寡核苷酸與其浸漬的溶液分離。然而，如有需要，采用眾所周知的方法，例如過濾、離心或磁分離，可以進行這樣的分離。
在本發(fā)明的另一方面，靶核酸分子可以在嚴(yán)格性條件下與微球體結(jié)合的互補序列的寡核苷酸探針雜交，并且雜交用dsDNA特異性熒光染料通過染色來檢測?？梢允褂米阋允顾鑫⑶蝮w飽和的靶濃度和孵育時間，達到在飽和結(jié)合之前和之后的不同時間點對信號進行測量。對于無關(guān)的靶序列沒有觀察高于本底的信號。當(dāng)所述靶序列與所述微球體結(jié)合的寡核苷酸在每一核苷酸位置都互補時，觀察到與所述微球體相關(guān)的最大熒光信號，并且完全互補性也產(chǎn)生隨分析物濃度上升而上升的最快速信號上升。當(dāng)一個堿基在所述靶序列中被錯配時，熒光信號低于完全互補的靶序列。相應(yīng)的是，熒光信號隨時間上升比完全互補靶序列慢。另外，最大熒光和信號的上升速率是錯配3種可能性的核苷酸的函數(shù)。因此，通過測量飽和結(jié)合時的最大熒光，或通過測量隨分析物濃度的信號升高，所述方法提供對SNP檢測的精巧手段。推測通過該方法也可以對錯配位置作圖，因此，在DNA測序應(yīng)用方面，應(yīng)該可以利用該方法。
同時本說明書描述了對PCR產(chǎn)物的檢測，即通過將這些PCR產(chǎn)物與微球體和嵌入染料混合來檢測所述PCR產(chǎn)物，還公開了在熱循環(huán)之前，或者之后，將微球體-固定寡核苷酸探針和嵌入染料加到PCR反應(yīng)中。在本發(fā)明的這個實施方案中，單獨的染料(在所述實施方案中，最好是熱穩(wěn)定性染料)或微球體可以在熱循環(huán)之前存在于所述混合物中，或者，兩者可以同時存在于所述混合物中。因此，當(dāng)以本文上述的以及其后實施例6中描述的均相形式或以本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用或研制的其它形式測量PCR產(chǎn)物時，甚至可以進一步減少樣品處理。用于實施例的材料和方法除非另有說明，實施例中所用的顆粒是按照美國專利第5,149,737號、第5,210,289號和第5,278,267號中所述方法制備的(聚[苯乙烯-共(對乙烯基芐硫基)丙酸]97.6∶2.4摩爾比)的共聚物。所述顆粒為直徑約1.7微米的大致球形。寡核苷酸與所述顆粒的偶聯(lián)基本上按照美國專利第5,147,777號所述方法進行。除非另有說明，采用本領(lǐng)域熟知的方法合成寡核苷酸。下文鑒定了實施例中使用的兩種寡核苷酸SEQ ID NO.15′-TTTCCAAGTA AGCAATAACG TCAGCTCTTT CTTGTGGCTT CTTCATACCAGCGAAAGACA TCTTAGTACC TGGCATGAAC TTCTTTGGGT-3′.
如下所示，與顆粒連接的3′端有和沒有氨基二醇(ADL)接頭、通過兩個四甘醇(TEG-TEG)間隔區(qū)將生物素與5′端連接，對上述寡核苷酸進行修飾Oligo-1A生物素-TEG-TEG-5′-TTTCCAAGTA AGCAATAACG TCAGCTCTTT CTTGTGGCTTCTTCATACCAG CGAAAGACAT CTTAGTACCT GGCATGAACT TCTTTGGGT-3′-TEG-TEG-ADL-顆粒和Oligo-1B生物素-TEG-TEG-5′-TTTCCAAGTA AGCAATAACG TCAGCTCTTT CTTGTGGCTTCTTCATACCAG CGAAAGACAT CTTAGTACCT GGCATGAACT TCTTTGGGT-3′.SEQ ID NO25′-ACCCAAAGAA GTTCATGCCA GGTACTAAGA TGTCTTTCG-C TG-GTATGAAGAAGCCACAAG AAAGAGCTGA CGTTATTGCT TTGGAAA-3′.雜交條件通過將含100費摩爾探針的10μl 0.15M氯化鉀、0.01M三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、pH8.3在1μg小牛胸腺DNA存在下孵育，進行生物素化寡核苷酸探針(SEQ ID NO1)與靶DNA(SEQ ID NO2)的雜交。通過于96℃加熱3分鐘使DNA變性，然后將混合物于65℃孵育10分鐘，讓靶和寡核苷酸探針雜交。在終體積15μl中通過給反應(yīng)混合物補充5×104微珠，并且將所述混合物在室溫下孵育10分鐘，進行使所述生物素化寡核苷酸與鏈霉抗生物素蛋白包被的微珠(Bangs Laboratories)結(jié)合。熒光團的結(jié)合向500μl等份熒光團的工作儲備液加入10μl經(jīng)雜交的靶-探針微珠懸浮液，然后將所述混合物在室溫下最少孵育5分鐘。用生產(chǎn)商供應(yīng)的原始制劑如下制備熒光團的工作儲備液用TE緩沖液以1∶10,000稀釋picogreen，用TE緩沖液以1∶200稀釋SYBR GREEN，噻唑橙(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)1μg/ml的TE緩沖液，TOPRO-1、TOTO-1、YOPRO-1和YOYO-1，所有都為0.5μM的TE緩沖液。核酸酶保護微珠-固定寡核苷酸探針(SEQ ID NO1)與靶DNA(SEQ ID NO2)雜交后，將8μl等份懸浮液與8μl 2x S1核酸酶緩沖液或2x綠豆核酸酶緩沖液(Promega，Madison，WI)混合，以1單位S1核酸酶或綠豆核酸酶消化，于30℃孵育30分鐘。向反應(yīng)混合物加入1∶10稀釋的鏈霉抗生物素蛋白綴合的藻紅蛋白熒光團的TE緩沖液，至終體積為24μl。流式細(xì)胞術(shù)采用裝有Immunocount 2.2軟件的Ortho CYTORONABSOLUTE流式細(xì)胞儀，進行流式細(xì)胞計量分析。對于每批微珠-固定寡核苷酸，測定顆粒分析的參數(shù)。設(shè)置前方位角散射和直角散射的倍增放大器，使得各種大小的微珠都可以通過該儀器進行檢測和分辨。將CYTORONABSOLUTE流式細(xì)胞儀中設(shè)置的熒光倍增放大器調(diào)至使雜交介導(dǎo)的熒光檢測最優(yōu)化。用簇分析測定平均峰信道熒光，由于它允許既存在熒光又存在另一參數(shù)(例如，向前散射或90°散射)的閾值，因此允許對不同的待分析樣品使用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。這種方法消除了由存在高散射熒光信道值的顆粒產(chǎn)生的本底噪聲。
下文所述的實施例利用DNA作為靶核酸。這僅僅為了說明本發(fā)明。只要有必要，本發(fā)明的方法可容易地修改用于RNA靶，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
表1MCF MCF熒光團無靶1000費摩爾靶噻唑橙22.587.4Picogreen 27.1103.7Svbrgreen 15.851.5TO-PRO-1 19.3101.6TOTO-113 49.1YO-PRO-1 20.659.8YOYO-136 63.6不需要將與雜交靶和寡核苷酸結(jié)合的顆粒與溶液中的游離DNA分開，因為通過圖象分析軟件，光散射門控的顆粒允許對內(nèi)聚性(cohesive)窄范圍的前方位角散射x直角散射值的選定組顆粒進行分析；僅限于分析目的顆粒。
將8微升在TE緩沖液中以1∶10稀釋的等份鏈霉抗生物素蛋白連接的熒光劑(Molecular Probes的鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白)加到16微升經(jīng)核酸酶處理的樣品中，在室溫下孵育10分鐘。結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白連接的熒光劑用作完整的微珠連接寡核苷酸的報道物。采用流式細(xì)胞術(shù)分析所述混合物。不含靶的藻紅蛋白的平均信道熒光為21.5，含有1000費摩爾靶的藻紅蛋白的平均信道熒光為34.7。
與微珠-固定寡核苷酸相關(guān)的熒光信號單一性取決于所述濃度，證明在濃度范圍數(shù)值約為6個數(shù)量級范圍內(nèi)可以定量測定所述靶DNA含量。在0.8μg非特異性小牛胸腺DNA的本底中，清晰地檢測到低至相當(dāng)于440阿摩爾(attomoles)或約2.5×108拷貝90-mer靶的25.7皮克靶dsDNA。因此所述靶DNA在約3.11×104倍過量的非特異性DNA存在下是容易檢測的。結(jié)果也表明，所述方法在所述濃度范圍內(nèi)是非常靈敏的；約1.25×108至1.09×1012拷貝靶濃度范圍在體積為8微升時，靶DNA濃度增加兩倍是容易檢測的。用噻唑橙、TOPRO-1、TOTO-1、YOPRO-1、YOYO-1和picogreen獲得的平均熒光，在所有情況下，也與靶DNA的濃度成正比(數(shù)據(jù)未顯示)。
保護寡核苷酸探針免被核酸酶S1消化與所述靶DNA含量成正比。圖5顯示平均熒光信號隨單鏈靶DNA濃度的增加而增加。在約100倍過量的非靶CTDNA中檢測到少至40.96費摩爾(約2.5×1010拷貝)90個堿基對DNA靶(SEQ ID NO2)。
在本實施例中，采用PCR，從質(zhì)?？寺〉腄NA插入片段(SEQ IDNO.3)擴增10拷貝靶DNA。在體積為100微升含有以下組分的混合物中擴增靶DNA(10拷貝，SEQ ID NO3)CT(小牛胸腺)DNA、5微摩爾NaOH、4毫摩爾MgCl2、18mM Tris緩沖液、54mM KCl、0.4mM各種引物(SEQ ID NO4和SEQ ID NO5)、0.3mM各種dNTP、0.108微克/微升明膠、0.725mM EDTA、40微摩爾DTT、9.5％甘油、0.02％Tween 20、0.02％Nonidet P40。靶DNA具有以下序列的靶DNA由在pUC18中克隆的DNA片段組成SEQ ID NO35′-CTGCAGGCGCCAGCGTGGAC CATCAAGTAG TAATGAACGC ACGGACGAGGACATCATAGA GATTACACCT TTATCCACAG TTCTCGGTCT AACGCAGCAGTCAGTGTATC AGCACCAGCA TCCGTAGTGA GTCTTCAGTG TCTGCTCCAGGATCGTGGCG CTGCAG-3′下劃線序列對應(yīng)于采用下述PCR引物(SEQ ID NO4和SEQ IDNO5)從所述靶DNA擴增的區(qū)域。PCR引物用按照以下序列的寡核苷酸，合成方法制備用于靶DNA擴增的引物SEQ ID NO4(正向引物)5′-CGCCAGCGTG GACCATCAAG TAGTAA-3′SEQ ID NO5(反向引物)5′-CACGATCCTG GAGCAGACAC TGAAGA-3′在Perkin Elmer 9600 PCR系統(tǒng)熱循環(huán)儀中，采用標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)方案(循環(huán)1-596℃30秒、68℃60秒；循環(huán)6-4096℃15秒、68℃60秒)進行PCR，分別在5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個和40個循環(huán)后終止所述反應(yīng)。雜交擴增后，將10μl PCR混合物與10微升含有約105個直徑3.5微米、先前已與懸浮于2x雜交緩沖液(0.3M氯化鉀、0.02M Tris和2mMEDTA，pH8.3)中的所述寡核苷酸探針(SEQ ID NO6)偶聯(lián)的顆粒(Bangs Labs，F(xiàn)ishers，IN)的懸浮液混合，然后將所述混合物于96℃加熱3分鐘，然后讓其冷卻至65℃，然后孵育10分鐘。微粒-固定的DNA探針固定在顆粒上的寡核苷酸探針具有以下序列SEQ ID NO65′-CTGCGTTAGA CCGAGAACTG TGGATAAAGG-3′通過將生物素與3′端共價連接來修飾SEQ ID NO.6。采用標(biāo)準(zhǔn)方案，讓所述探針與鏈霉抗生物素蛋白包被的、直徑3.5微米的顆粒(Bangs Laboratories)結(jié)合。DNA染色DNA染色如下進行將500μl 1∶200稀釋的濃縮picogreen熒光染料與20μl包含雜交的靶微珠懸浮液混合，于室溫下將所述懸浮液最少孵育2分鐘。接下來，用CYTORONABSOLUTE流式細(xì)胞儀對樣品進行分析。結(jié)果根據(jù)得自與雜交的靶和顆粒固定寡核苷酸dsDNA結(jié)合的picogreen的平均信道熒光，測量PCR產(chǎn)物。在圖6中，可以觀察到所述平均信道熒光在30個循環(huán)后隨PCR循環(huán)次數(shù)的增加而增加，證明對PCR擴增產(chǎn)物的定量檢測。
包含靶特異性寡核苷酸探針的顆粒必須大至足以被激光掃描細(xì)胞儀中所用的檢測系統(tǒng)分辨。顆粒優(yōu)選大于或等于約0.3微米，更優(yōu)選在約1微米至約5微米之間。將顆粒、包含靶核酸的樣品和當(dāng)與dsDNA結(jié)合時產(chǎn)生可檢測熒光的化合物進行混合，生成一種混合物。稀釋所述混合物，讓所述顆粒足以在顯微鏡載玻片上均勻分散。所述激光掃描儀在所述載玻片上移動，用顆粒的光散射和/或熒光觸發(fā)測量與雜交的靶和顆粒-固定寡核苷酸結(jié)合的化合物的可檢測熒光。所述激光掃描細(xì)胞儀通過靶特異性顆粒的特異性光散射和/或熒光特征來鑒別多種不同的靶特異性顆粒。
包含寡核苷酸陣列的DNA芯片代表二維分離裝置。用于制備這種陣列的方法在WO9818961和背景部分指出的美國專利中有描述。
在操作中，在一個方向即x方向獲得一系列測量測量值x1，在與x的垂直方向即y方向獲得一系列測量值y1。已知檢測的x1y1事件與特定靶特異性探針有關(guān)。同樣，已知x2y2測量結(jié)果與相同靶或不同靶的探針有關(guān)，如此類推。
寡核苷酸直接或間接通過化學(xué)接頭或其它固定化試劑而沉積或錨定至表面，可以制備包含寡核苷酸陣列的DNA芯片或載玻片，全部采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，并且在WO 9818961以及本文前面引用的美國專利中可以找到。它們在芯片或載玻片的一個表面上以不同的xy位置固定。每個xy點陣或點對任何所需靶核酸有特異性。在所述芯片或載玻片上可以有一個靶特異性的多個點，以實現(xiàn)重復(fù)測定(重復(fù)點)?？梢允褂萌魏嗡钄?shù)目的靶特異性核酸點和重復(fù)點。對于每種靶而言，優(yōu)選所述芯片或載玻片包含約5個至約20個靶特異性點和約相同數(shù)目的重復(fù)點，更優(yōu)選所述芯片或載玻片包含約100個至約1000個靶特異性點和約10個至100個重復(fù)點，使所述DNA芯片或載玻片與樣品和當(dāng)與dsDNA結(jié)合時產(chǎn)生可檢測熒光信號的化合物接觸。例如，采用激光掃描裝置，測量所述芯片或載玻片上各點即各種具體xy位置的靶相關(guān)性熒光。所述熒光信號與所述特異性靶核酸的存在或含量有關(guān)。
具體地說，具有SEQ ID NO.1的約100個靶特異性點陣和約10個重復(fù)點陣的DNA芯片，所述寡核苷酸序列印制在硅烷基化載玻片(CEL Associates)上。印制點直徑約125μm，中心之間的空間間隔為300μm。將約10個復(fù)份無關(guān)序列的探針(例如，檢測哺乳動物序列的情況下針對植物基因的探針)也印制在所述載玻片上。印制的玻璃載玻片用硼氫化鈉溶液(0.066M NaBH4、0.06M NaAC)處理，確保探針與所述載玻片形成氨基鍵。然后將所述載玻片在水中煮沸2分鐘，使所述cDNA變性。將含有約30個至約30,000個靶核酸分子的生物樣品于99℃加熱5分鐘，然后在雜交前進行預(yù)冷卻，在這種情況下，在室溫下保持5分鐘，然后加樣到所述載玻片上。所述載玻片用玻璃蓋玻片蓋上，用DPX(Fluka)密封，于60℃雜交4-6小時。雜交結(jié)束時，讓載玻片冷卻至室溫。所述載玻片在1X SSC、0.2％SDS中于55℃洗滌5分鐘，在0.1X SSC、0.2％SDS中于55℃洗滌5分鐘。所述載玻片的染色如下進行將全部表面與1∶200稀釋的濃縮picogreen熒光染料接觸，在室溫下最少孵育2分鐘。在0.1X SSC、0.2％SDS中快速沖洗后，將所述載玻片風(fēng)干，待用于掃描。采用ScanArray 3000(General Scanning，Inc.)，對陣列的picogreen染料發(fā)出的熒光進行掃描。隨后用ImaGene軟件(Biodiscovery，Inc.)對其進行定量。通過減去即時周圍本底，校正每個點的強度。
熒光信號與特異性靶核酸的存在或含量有關(guān)，對所述載玻片進行10個復(fù)份的所述測定，采用統(tǒng)計學(xué)方法將復(fù)份試驗點平均熒光值與無關(guān)序列的復(fù)份探針的平均熒光值進行比較。
采用對SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6具有約100個靶特異性點陣和約10個重復(fù)點陣的DNA芯片，重復(fù)上述方法和步驟。
采用以下鑒定的條件、引物和探針，利用實施例6的材料和方法。采用合適的PCR方案，將靶DNA(10拷貝)SEQ ID NO.3在包含以下組分的100微升體積中擴增PCR混合物、0.25微升105寡核苷酸結(jié)合的1.7微米微珠。使用的微珠是按照美國專利第5,149,737號、第5,210,289號和第5,278,267號中所述方法制備的聚[苯乙烯-共(對乙烯基芐硫基)丙酸]95∶5摩爾比的微珠，而合適濃度的DNA結(jié)合熒光團，在這種情況下，是500微升1∶200稀釋的濃縮picogreen，在所述熱循環(huán)之后加入所述熒光團。擴增反應(yīng)依照實施例6的PCR條件設(shè)置，只是在所述混合物中包括105寡核苷酸結(jié)合的微粒，并且PCR循環(huán)的增加允許雜交的溫度循環(huán)。
然后采用例如CYTORONABSOLUTE流式細(xì)胞儀，通過流式細(xì)胞術(shù)測定所得混合物中擴增靶DNA的存在。靶DNA將具有以下序列的靶DNA克隆到pUC18中SEQ ID NO.35′-CTGCAGGCGC CAGCGTGGAC CATCAAGTAG TAATGAACGCACGGACGAGG ACATCATAGA GATTACACCT TTATCCACAG TTCTCGGTCTAACGCAGCAG TCAGTGTATC AGCACCAGCA TCCGTAGTGA GTCTTCAGTGTCTGCTCCAG GATCGTGGCG CTGCAG-3′擴增和雜交反應(yīng)采用以下鑒定的PCR條件和引物，采用改進的擴增方案(循環(huán)1-596℃30秒、68℃60秒；循環(huán)6-4096℃15秒、68℃60秒；循環(huán)4172℃5分鐘；循環(huán)42∶96℃3分鐘；循環(huán)4350℃60秒)，在PE9600熱循環(huán)儀中擴增SEQ ID NO.3中的下劃線序列。SEQ ID NO.4(正向引物)5′-CGCCAGCGT GGACCATCA AGTAGTAA-3′SEQ ID NO.5(反向引物)5′-CACGATCCT GGAGCAGAC ACTGAAGA-3′固定在顆粒上的寡核苷酸探針具有以下序列SEQ ID NO.65′-CTGCGTTAG ACCGAGAAC TGTGGATAA AGG-3′采用標(biāo)準(zhǔn)方案，通過與聚苯乙烯顆粒(直徑1微米)表面共價連接對SEQ ID NO.6進行修飾。DNA染色DNA的染色如下進行通過將500μl 1∶200稀釋的濃縮picogreen與20μl包含雜交擴增靶以上鑒定的PCR微珠懸浮液混合，于室溫下將所述懸浮液最少孵育2分鐘，。結(jié)果根據(jù)得自與雜交的靶和顆粒-固定寡核苷酸dsDNA結(jié)合的picogreen的平均信道熒光，測定PCR產(chǎn)物。
采用實施例9的材料和方法，只是在熱循環(huán)之前，將2.5微升濃縮熱穩(wěn)定染料(例如SYBR Green I染料，Molecular Probes，Eugene，Oregon)加入到含有靶的PCR懸浮液中?？梢允褂玫钠渌鼰岱€(wěn)定染料包括溴化乙錠和碘化丙錠。結(jié)果根據(jù)得自與雜交的靶和顆粒-固定寡核苷酸dsDNA結(jié)合的SYBRGreen的平均信道熒光，測定PCR產(chǎn)物。
采用實施例9的材料和方法，以及在熱循環(huán)之前，將2.5微升濃縮熱穩(wěn)定SYBR Green染料加入到所述PCR靶懸浮液中?？梢允褂玫钠渌鼰岱€(wěn)定染料包括溴化乙錠和碘化丙錠。DNA雜交熱循環(huán)之前，將10微升懸浮于2x雜交緩沖液(0.3M氯化鉀、0.02MTris和2mM EDTA，pH8.3)中105寡核苷酸結(jié)合的微粒(規(guī)格為1-10微米)加到10微升擴增產(chǎn)物-染料混合物中，于96℃加熱3分鐘，然后讓其冷卻至65℃，以允許雜交。分析所述雜交樣品補充500μl 1mM Tris、10mM EDTA緩沖液，并用例如CYTORONABSOLUTE流式細(xì)胞儀進行分析。結(jié)果根據(jù)得自與雜交的靶和顆粒-固定寡核苷酸dsDNA結(jié)合的SYBRGreen的平均信道熒光，測定PCR產(chǎn)物。
參考具體的優(yōu)選實施方案詳細(xì)描述了本發(fā)明。不用說，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以進行各種變化和修改。所有引用的專利、專利申請和非專利公開文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
序列表(1)一般資料(i)序列數(shù)6(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度90個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型探針(iii)假說無(iv)反義結(jié)構(gòu)無(v)原始來源合成制備(vi)直接來源合成制備(vii)公布信息無(viii)序列描述SEQ ID15-TTTCCAAGTA AGCAATAACG TCAGCTCTTT CTTGTGGCTT CTTCATACCAGCGAAGACAT CTTGTCCT GGCATGAACT TCTTTGGGT-3′(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度87個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型探針(iii)假說無(iv)反義結(jié)構(gòu)無(v)原始來源合成制備(vi)直接來源合成制備(vii)公布信息無(viii)序列描述SEQ ID25′-ACCCAAAGAA GTTCATGCCA GGTACTAAGA TGTCTTTCGC TGGTATGAAGAAGCCACAAG AAAGAGCTGA CGTTATTGCT TTGGAAA-3′(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度166個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型靶(iii)假說無(iv)反義結(jié)構(gòu)無(v)原始來源合成制備(vi)直接來源合成制備(vii)公布信息無(viii)序列描述SEQ ID35′-CTGCAGGCGC CAGCGTGGAC CATCAAGTAG TAATGAACGC ACGGACGAGGACATCATAGA GATTACACCT TTATCCACAG TTCTCGGTCT AACGCAGCAGTCAGTGTATC AGCACCAGCA TCCGTAGTG4 GTCTTCAGTG TCTGCTCCAGGATCGTGGCG CTGCAG-3′(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度26個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型引物(iii)假說無(iv)反義結(jié)構(gòu)無(v)原始來源合成制備(vi)直接來源合成制備(vii)公布信息無(viii)序列描述SEQ ID45′-CGCCAGCGTG GACCATCAAG TAGTAA-3′(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度26個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型引物(iii)假說無(iv)反義結(jié)構(gòu)無(v)原始來源合成制備(vi)直接來源合成制備(vii)公布信息無(viii)序列描述SEQ ID55′-CACGATCCTG GAGCAGACAC TGAAGA-3′(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度30個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型探針(iii)假說無(iv)反義結(jié)構(gòu)無(v)原始來源合成制備(vi)直接來源合成制備(vii)公布信息無(viii)序列描述SEQ ID65′-CTGCGTTAGA CCGAGAACTG TGGATAAAGG-3′
權(quán)利要求
1.一種測定一種靶核酸的存在或含量的方法，該方法包括以下步驟A)形成包含以下組分的混合物i)靶核酸，和ii)一種寡核苷酸固定在其上的支持物，所述寡核苷酸包含與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列；B)測定與所述支持物或支持物-固定的寡核苷酸相關(guān)性參數(shù)值；C)測定與所述支持物-固定的寡核苷酸雜交的靶核酸相關(guān)性信號，從而測得所述靶核酸的存在或含量。
2.一種測定多種不同靶核酸的存在或含量的方法，該方法包括A)形成包含以下組分的混合物i)靶核酸，和ii)一種或多種靶特異性寡核苷酸固定在其上的支持物，其中一種靶特異性寡核苷酸包含與一種不同靶核酸的至少一部分互補的核酸序列；B)測定與所述支持物或支持物-固定的靶特異性寡核苷酸相關(guān)性參數(shù)值；C)測定與所述支持物-固定的靶特異性寡核苷酸雜交的不同靶核酸相關(guān)性信號，從而測得所述靶核酸的存在或含量。
3.一種測定一種靶核酸的存在或含量的方法，該方法包括A)形成包含以下組分的混合物i)靶核酸，和ii)一種寡核苷酸固定在其上的顆粒，所述寡核苷酸包含與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列，其中所述顆粒a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的不同熒光信號的一種第一化合物或多種其它化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的不同熒光信號的一種第一化合物或多種其它化合物，iii)一種能夠與雙鏈核酸結(jié)合并且當(dāng)與其結(jié)合時產(chǎn)生可檢測熒光信號的第二化合物；任選的是，B)將所述混合物加熱至使雙鏈核酸變性，然后冷卻所述混合物，使所述靶核酸與所述固定寡核苷酸雜交；C)將所述混合物暴露于能夠檢測熒光并且任選檢測散射電磁輻射的檢測器；D)檢測所述顆粒的散射電磁輻射或所述第一化合物或多種其它化合物的熒光，或者同時檢測散射電磁輻射和熒光；E)檢測與雜交的靶核酸和固定寡核苷酸結(jié)合的所述第二化合物的熒光信號，從而測得所述靶核酸的存在或含量。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述檢測器是流式細(xì)胞儀、掃描細(xì)胞儀或熒光顯微鏡。
5.一種測定多種不同靶核酸的存在或含量的方法，所述方法包括A)形成包含以下組分的混合物i)靶核酸，和ii)多種靶特異性顆粒，其中一種靶特異性顆粒其上固定有一種包含與一種不同靶核酸的至少一部分互補的核酸序列的寡核苷酸，并且其中每種顆粒獨立地a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的不同熒光信號的一種不同的第一化合物或多種其它化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述不同顆粒的不同熒光信號的一種不同的第一化合物或多種其它化合物，iii)一種化合物，所述化合物能夠與雙鏈核酸結(jié)合并且當(dāng)與其結(jié)合時產(chǎn)生一種可檢測光學(xué)信號；任選的是，B)將所述混合物加熱至使雙鏈核酸變性，然后冷卻所述混合物，使靶核酸與固定寡核苷酸雜交；C)將所述混合物暴露于能夠檢測熒光并且任選檢測散射電磁輻射的檢測器；D)檢測各種顆粒的散射電磁輻射或各種顆粒的所述第一化合物或多種其它化合物的熒光，或者同時檢測散射電磁輻射和熒光；E)檢測與雜交的靶核酸和固定寡核苷酸結(jié)合的所述第二化合物的熒光信號，從而測得所述靶核酸的存在或含量。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述檢測器是流式細(xì)胞儀、掃描細(xì)胞儀或熒光顯微鏡。
7.一種測定一種靶核酸的存在或含量的方法，所述方法包括A)形成包含以下組分的混合物i)靶核酸，和ii)一種寡核苷酸固定在其上的顆粒，所述寡核苷酸包含與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列，所述寡核苷酸包含一種配體，并且其中所述顆粒a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的不同熒光信號的一種第一化合物或多種其它化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的不同熒光信號的一種第一化合物或多種其它化合物；任選的是B)將所述混合物加熱至使雙鏈核酸變性，然后冷卻所述混合物，使所述靶核酸與所述固定寡核苷酸雜交；C)將所述混合物與一種單鏈或雙鏈特異性內(nèi)切核酸酶接觸；D)將步驟C)的混合物與一種能夠發(fā)熒光并且能夠與所述配體結(jié)合的第二化合物接觸；E)將所述混合物暴露于能夠檢測熒光并且任選檢測散射電磁輻射的檢測器；F)檢測所述顆粒的散射電磁輻射或所述第一化合物或多種其它化合物的熒光，或者兩種檢測散射電磁輻射和熒光；G)測定與所述配體結(jié)合的所述第二化合物的熒光信號，從而測得所述靶核酸的存在或含量。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述檢測器是流式細(xì)胞儀、掃描細(xì)胞儀或熒光顯微鏡。
9.一種測定多種不同靶核酸的存在或含量的方法，所述方法包括A)形成包含以下組分的混合物i)靶核酸，和ii)多種靶特異性顆粒，其中一種靶特異性顆粒其上固定有一種包含與一種不同靶核酸的至少一部分互補的核酸序列的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含一種配體，并且其中每種顆粒獨立地a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的不同熒光信號的一種不同的第一化合物或多種其它化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的不同熒光信號的一種不同的第一化合物或多種其它化合物，iii)一種化合物，所述化合物能夠與雙鏈核酸結(jié)合并且當(dāng)與其結(jié)合時產(chǎn)生一種可檢測光學(xué)信號；任選的是，B)將所述混合物加熱至使雙鏈核酸變性，然后冷卻所述混合物，使靶核酸與固定寡核苷酸雜交；C)將所述混合物與一種單鏈或雙鏈特異性內(nèi)切核酸酶接觸；D)將步驟C)的混合物與一種能夠發(fā)熒光并且能夠與所述配體結(jié)合的第二化合物接觸；E)將步驟D)混合物暴露于能夠檢測熒光并且任選檢測散射電磁輻射的檢測器；F)檢測各種顆粒的散射電磁輻射或各種顆粒的所述第一化合物或多種其它化合物的熒光，或者同時檢測散射電磁輻射和熒光；G)測定與所述配體結(jié)合的所述第二化合物的熒光信號，從而測得所述靶核酸的存在或含量。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述檢測器是流式細(xì)胞儀、掃描細(xì)胞儀或熒光顯微鏡。
11.一種測定一種靶核酸的存在或含量的方法，所述方法包括A)形成包含以下組分的混合物i)靶核酸，和ii)一種寡核苷酸固定在其上的顆粒，所述寡核苷酸包含與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列，其中所述寡核苷酸包含一種能夠發(fā)熒光的第二化合物，所述顆粒或所述寡核苷酸包含足夠接近所述第二化合物的熒光猝滅化合物，以在所述寡核苷酸與所述靶核酸雜交之前猝滅所述第二化合物的熒光，并且其中所述顆粒a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的不同熒光信號的一種第一化合物或多種其它化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的不同熒光信號的一種第一化合物或多種其它化合物；任選的是B)將所述混合物加熱至使雙鏈核酸變性，然后冷卻所述混合物，使所述靶核酸與所述固定寡核苷酸雜交；C)將所述混合物暴露于能夠檢測熒光并且任選檢測散射電磁輻射的檢測器；D)檢測所述顆粒的散射電磁輻射或所述第一化合物或多種其它化合物的熒光，或者同時檢測散射電磁輻射和熒光；E)測定所述第二化合物的熒光信號，從而測得所述靶核酸的存在或含量。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述檢測器是流式細(xì)胞儀、掃描細(xì)胞儀或熒光顯微鏡。
13.一種測定多種不同靶核酸的存在或含量的方法，所述方法包括A)形成包含以下組分的混合物i)靶核酸，和ii)多種靶特異性顆粒，其中一種靶特異性顆粒其上固定有一種包含與一種不同靶核酸的至少一部分互補的核酸序列的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含一種能夠發(fā)熒光的第二化合物，所述顆粒或所述寡核苷酸包含足夠接近所述第二化合物的熒光猝滅化合物，以在所述寡核苷酸與所述靶核酸雜交之前猝滅所述第二化合物的熒光，并且其中所述顆粒獨立地a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的不同熒光信號的一種不同的第一化合物或多種其它化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述不同顆粒的不同熒光信號的一種不同的第一化合物或多種其它化合物，iii)一種化合物，所述化合物能夠與雙鏈核酸結(jié)合并且當(dāng)與其結(jié)合時產(chǎn)生一種可檢測光學(xué)信號；任選的是B)將所述混合物加熱至使雙鏈核酸變性，然后冷卻所述混合物，使靶核酸與固定寡核苷酸雜交；C)將所述混合物暴露于能夠檢測熒光并且任選檢測散射電磁輻射的檢測器；D)檢測一種顆粒的散射電磁輻射或一種顆粒的所述第一化合物或多種其它化合物的熒光，或者同時檢測散射電磁輻射和熒光；E)檢測所述第二化合物的熒光信號，從而測得各種不同靶核酸的存在或含量。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述檢測器是流式細(xì)胞儀、掃描細(xì)胞儀或熒光顯微鏡。
15.一種用于檢測靶核酸的試劑盒，所述試劑盒在同一或不同容器中包含1)一種顆粒，它a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物；2)一種寡核苷酸，所述寡核苷酸包含與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列；和3)一種化合物，所述化合物能夠與雙鏈核酸結(jié)合并且在與其結(jié)合時或結(jié)合后能夠產(chǎn)生一種可檢測信號。
16.一種用于檢測靶核酸的試劑盒，所述試劑盒在同一或不同容器中包含1)一種顆粒，它a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物；2)一種寡核苷酸，所述寡核苷酸包含與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列；所述寡核苷酸包含一種配體；3)一種單鏈特異性內(nèi)切核酸酶；和4)一種化合物，所述化合物能夠發(fā)熒光并且能夠與所述配體結(jié)合。
17.一種用于檢測靶核酸的試劑盒，所述試劑盒在同一或不同容器中包含1)一種顆粒，它a)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射，或b)包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物，或c)能夠散射波長大于或等于約200nm的電磁輻射并且包含一種或多種能夠產(chǎn)生對應(yīng)于所述顆粒的熒光信號的化合物；3)一種寡核苷酸，所述寡核苷酸包含a)與所述靶核酸的至少一部分互補的核酸序列；b)能夠發(fā)熒光的第一化合物，和c)能夠猝滅所述第一化合物的熒光的第二化合物。
18.一種檢測生物樣品中的擴增核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟將含有所述核酸序列的生物樣品與微粒、一種熱穩(wěn)定熒光團和一種熱穩(wěn)定聚合酶混合；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增所述核酸的選定區(qū)段；檢測所述核酸序列。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述熱穩(wěn)定熒光團選自SYBR greenI、溴化乙錠和碘化丙錠。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述熱穩(wěn)定熒光團是SYBR greenI。
21.一種檢測生物樣品中的擴增核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟將含有所述核酸序列的生物樣品與微粒和一種熱穩(wěn)定聚合酶混合；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增所述核酸的選定區(qū)段；將步驟(b)的擴增產(chǎn)物與一種熒光團混合；檢測所述核酸序列。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述熒光團選自濃縮picogreen、SYBR green I、溴化乙錠和碘化丙錠。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述熒光團是濃縮picogreen。
24.一種檢測生物樣品中的擴增核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟在熱穩(wěn)定聚合酶存在下通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增所述核酸序列；將步驟(a)的擴增產(chǎn)物與一種熒光團和微粒混合；檢測所述核酸序列。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述熒光團選自濃縮picogreen、SYBR green I、溴化乙錠和碘化丙錠。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述熒光團是濃縮picogreen。
27.一種包含寡核苷酸陣列的DNA芯片，所述寡核苷酸陣列包含靶特異性點陣和重復(fù)點陣，所述芯片可用于測定一種或多種特異性靶序列的存在或含量。
28.權(quán)利要求27的DNA芯片，所述芯片包含約5個至約20個靶特異性點陣和約5個至約20個重復(fù)點陣。
29.權(quán)利要求27的DNA芯片，所述芯片對于每種靶包含約100個至約1000個靶特異性點陣和約10個至約100個重復(fù)點陣。
30.采用DNA芯片檢測一種或多種靶DNA序列的方法，所述方法包括(a)將一種DNA芯片與含有所述一種或多種靶序列的樣品和一種熒光團接觸，其中所述DNA芯片已經(jīng)錨定了對應(yīng)于所述一種或多種待測靶序列的一種或多種寡核苷酸；(b)檢測所述一種或多種靶序列的存在或含量。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述熒光團選自吖啶橙、碘化丙錠、溴化乙錠、光神霉素、色霉素、橄欖霉素、Hoechst H33258、HoechstH33342、DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)、TOPRO、TOTO、YOPRO、YOYO、SYBR GREEN I和Picogreen。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述熒光團最好是Picogreen。
全文摘要
本發(fā)明描述了與固定在顆粒性支持物和非顆粒性支持物上的寡核苷酸探針雜交的靶核酸的均相多重測定。采用根據(jù)所述顆粒的光散射或熒光特性能夠辨別顆粒的檢測方法如流式細(xì)胞計量方法，或者通過空間分辨固定在支持物特定點陣上的寡核苷酸，從而測定靶核酸。測定源自與所述支持物－固定的寡核苷酸雜交的靶核酸的靶相關(guān)性熒光信號，從而測量所述靶核酸的存在或含量。
文檔編號G01N33/542GK1434874SQ00818981
公開日2003年8月6日 申請日期2000年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月21日
發(fā)明者M·C·康內(nèi)利, G·塞里諾, T·J·梅爾科利諾 申請人:奧索臨床診斷有限公司