專利名稱：采用生物化學標記物診斷纖維化疾病的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過采用可容易地檢測的生物學標記物的血清濃度來檢測患者，特別是肝纖維化，特別是感染丙型肝炎病毒的患者，炎癥、纖維化或癌性疾病程度的一種新診斷方法。本發(fā)明還涉及實現本方法的診斷試劑盒。
為了改善患者的治療和隨訪疾病，能夠在肝臟病理進展過程中檢測這些早期階段仍然是重要的。由于肝活檢仍然是侵入性的方法，具有一種快速和易于進行的、可對患者的纖維化水平給出較好預測值的檢測是有利的。
在感染丙型肝炎病毒后，疾病的進展可導致纖維化，以后成為肝硬化。肝活檢可以確定纖維化的階段，以及肝臟壞死性炎性病變的存在。這些病灶的密度和活動度，補充了纖維化的程度，被醫(yī)生們確認為是疾病診斷和進展預后的重要因素，并為了確定要給與的治療類型。
因此，需要開發(fā)一種診斷方法，可以對患者中纖維化和/或病變的存在(或不存在)給予很好的預測值，它應是可靠的，足以減少肝活檢的需要。
圖2根據纖維化分期，六個標記物纖維化計分值(從0.00至1.00)的散點圖。
圖3包含了5個(α2-巨球蛋白、觸珠蛋白、總膽紅素、Apo A1和GGT)、六個(α2-巨球蛋白、α2-微球蛋白、總膽紅素、γ球蛋白、apo A1和GGT)或十個生物化學因子(上述加上白蛋白、α1-微球蛋白、β球蛋白和ALT)和年齡和性別的纖維化標記物函數的ROC曲線。曲線下面積沒有顯著差異分別為0.837±0.02、0.847±0.02和0.851±0.02。
圖4根據纖維化分期的纖維化計分值圖4a6個標記物函數F0 n＝56中位數＝0.10；F1 n＝145中位數＝0.22；F2 n＝68中位數＝0.41；F3 n＝28中位數＝0.66；F4 n＝42中位數＝0.89。
圖4b5個標記物函數F0 n＝55中位數＝0.14；F1 n＝139中位數＝0.21；F2 n＝64中位數＝0.43；F3 n＝26中位數＝0.73；F4 n＝41中位數＝0.85。
框的頂端和底端是第25和第75百分點。因此，框的長度是四分位數之間的范圍。也就是，該框代表中間50％的數據。一條直線在中間點(第50百分點)的位置劃過框的中央。上面毗鄰的數值是最大觀察值，即小于或等于第75百分點加上1.5倍四分位數間的范圍。下面毗鄰的數值是最小觀察值，即大于或等于第25百分點減去1.5倍四分位數間的范圍。方差分析顯示在所有分期間具有顯著差異。(Bonferroni全部配對多重比較檢驗；p＜0.001)。
圖5根據纖維化分期的α2球蛋白、α2巨球蛋白和觸珠蛋白。
圖5a對于α2球蛋白值，僅在4期對比1和3期之間有顯著差異。(Bonferroni全部配對多重比較檢驗；p＝0.01)。
圖5b對于α2巨球蛋白，0和1期值顯著低于2、3和4期。(Bonferroni全部配對多重比較檢驗；p＜0.001)。2期值低于3和4期值。(Bonferroni全部配對多重比較檢驗；p＜0.001)。在0和1期之間和3和4期之間沒有顯著差異。
圖5c對于觸珠蛋白，1期數值顯著高于2、3和4期。(Bonferroni全部配對多重比較檢驗；p＜0.001)。4期數值低于0、1和2期的數值。(Bonferroni全部配對多重比較檢驗；p＜0.001)。在0和1期之間和3和4期之間沒有顯著差異。
優(yōu)選實施例的描述本發(fā)明因此涉及一種診斷患者炎癥性、纖維化或癌性疾病的方法，包括以下步驟a)測定所述患者血清中生物化學標記物的數值，b)通過包含所述標記物的邏輯(logistic)函數結合所述的數值，c)分析所述邏輯函數的最終數值以確定所述患者中存在肝纖維化和/或肝壞死性炎性病變。
生物化學標記物也可在患者的血漿中測定，當不使用任選的第一個步驟(收集患者的血清或血漿)時，該方法可認為是體外的方法。
特別的是，本發(fā)明的方法完全適合診斷所述患者中存在肝纖維化和/或肝壞死性炎性病變。也可用來在患者的肺或腎臟中診斷炎癥性和/或纖維化疾病。也適合在例如肺、乳腺、膀胱、結腸中進行癌性病變的診斷。
邏輯函數可通過下面的方法獲得i)根據患者的疾病程度將其分成不同組；ii)通過線性分析確定在這些組間顯著不同的因子；iii)邏輯回歸分析標記物的獨立判別值以診斷纖維化和/或肝壞死性炎性病變；
iv)合并這些已確定的獨立因子，構建邏輯函數(一種指數的構建)。
從定義上，根據判別得到的最佳指數(“纖維化計分值”)是合并獨立因子的邏輯回歸函數。
邏輯函數是通過結合每個參數的相對權重和負號而獲得的，前者如在邏輯回歸中單獨確定的那樣，后者是當標記物與纖維化分期呈負相關時。對于數值范圍非常大的標記物使用對數。
邏輯函數的品質在ROC曲線的輔助下進行分析，后者是根據診斷需要的閾值來獲得的。獲得ROC曲線的方法在實施例中進行描述。在本發(fā)明中，患者的分類是纖維化的出現，起始于很少纖維間隔，但如果準備僅以大量纖維間隔或肝硬化來診斷患者，也是可以改變的。如在實施例中所描述的那樣，這樣產生了另一個ROC曲線。
在患者中診斷肝纖維化和/或肝壞死性炎性病變的存在可進一步通過人群中肝纖維化預期發(fā)病率的數據進行精確化。
優(yōu)選地，在根據本發(fā)明方法的步驟a)中定量的生物化學標記物是“簡單的”生物化學標記物，意味著它們容易地用本領域中已知的方法被定量(色譜、電泳、ELISA測定…)。
因此，優(yōu)選地適合本發(fā)明方法的標記物包括α2-巨球蛋白、丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、γ谷氨酰轉肽酶(GGT)、γ-球蛋白、總膽紅素、白蛋白、α1-球蛋白，α2-球蛋白、觸珠蛋白、β-球蛋白、載脂蛋白A1(apoA1)、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB。根據所研究的疾病，還可以使用其他細胞因子，或本領域專業(yè)技術人員已知的特殊標記物。對于腎臟或膀胱疾病的分析，可在患者的尿液標本上很容易地進行一些測定。
在本發(fā)明方法中的一個特殊實施例中，可研究至少4個，更優(yōu)選地5或6個、7或10個生物化學標記物，并在本方法的步驟a)中進行測定。
優(yōu)選地，當打算診斷肝纖維化時，這些標記物是α2-巨球蛋白、GGT、γ-球蛋白、總膽紅素、(α2-球蛋白或觸珠蛋白)和apoA1。觸珠蛋白可用來代替α2-球蛋白，因為α2-球蛋白是α2-巨球蛋白和α2-微球蛋白的總和，后者主要由觸珠蛋白組成。因而α2-微球蛋白和觸珠蛋白的相對權重可能在邏輯函數中被調整。
當要診斷肝壞死性炎性病變的存在時，當測定的標記物包括α2-巨球蛋白、GGT、γ-球蛋白、(ALT或AST)和apoA1時是最佳的。由于本申請中所報告的數據顯示這些標記物是相關的，AST或ALT的應用不太重要。因此，考慮到相關因子，用另一個標記物代替一個標記物僅引起邏輯函數中系數的平衡。
邏輯函數也可使用其他的標記物如患者的年齡和性別。在邏輯函數中對不同標記物獲得的數值使用的不同系數可通過統(tǒng)計學分析來計算，如在實施例中所描述的。
特別的是，可用來實現本發(fā)明方法的合適的邏輯函數如下采用6個標記物f1＝a1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-a2×[α2-球蛋白(g/l)]+a3×Log[GGT(IU/l)]+a4×[γ-球蛋白(g/l)]+a5×[年齡(歲)]+a6×Log[膽紅素(umol/l)]-a7×[ApoA1(g/l)]+a8×[性別(女性＝0，男性＝1)]-a9，其中a1包含在6.5和6.9之間，a2包含在0.450和0.485之間，a3包含在1.100和1.300之間，a4包含在0.0700和0.0750之間，a5包含在0.0265和0.0300之間，a6包含在1.400和1.700之間，a7包含在0.900和1之間，a8包含在0.300和0.450之間，和a9包含在4.200和4.700之間，特異的可用函數特別是f1-a＝6.826×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.479×[α2-球蛋白(g/l)]+1.252×Log[GGT(IU/l)]+0.0707×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0273×[年齡(歲)]+1.628×Log[膽紅素(umol/l)]-0.925×[ApoA1(g/l)]+0.344×[性別(女性＝0，男性＝1)]-4.544；或
f1-b＝6.552×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.458×[α2-球蛋白(g/l)]+1.113×Log[GGT(IU/l)]+0.0740×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0295×[年齡(歲)]+1.473×Log[膽紅素(umol/l)]-0.979×[ApoA1(g/l)]+0.414×[Sex(女性＝0，男性＝1)]-4.305；采用10個標記物f2＝b1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-b2×[α2-球蛋白(g/l)]+b3×Log[GGT(IU/l)]+b4×[γ-球蛋白(g/l)]+b5×[年齡(歲)]+b6×Log[膽紅素(umol/l)]-b7×[ApoA1(g/l)]+b8×[性別(女性＝0，男性＝1)]+b9[白蛋白(g/l)]+b10[α1-球蛋白(g/l)]-b11[β2-球蛋白(g/l)]2.189-b12×Log[ALT(IU/l)]-b13，其中b1包括在9.9和10.2之間，b2包括在0.7和0.77之間，b3包括在2和2.4之間，b4包括在0.1和0.2之間，b5包括在0.04和0.07之間，b6包括在4和4.6之間，b7包括在2和2.5之間，b8包括在0.28和0.32之間，b9包括在0.025和0.04之間，b10包括在2和2.2之間，b11包括在0.1和0.16之間，b12包括在0.7和0.9之間，和b13包括在12和14之間，一個特異的可用函數特別是f2＝10.088×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.735×[α2-球蛋白(g/l)]+2.189×Log[GGT(IU/l)]+0.137×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0546×[年齡(歲)]+4.301×Log[膽紅素(umol/l)]-2.284×[ApoA1(g/l)]+0.294×[性別(女性＝0，男性＝1)]+0.0312[白蛋白(g/l)]+2.109[α1-球蛋白(g/l)]-0.136[β2-球蛋白(g/l)]-0.813×Log[ALT(IU/l)]-13.165。
采用6個標記物來確定顯著活動度f3＝c1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-c2×[β2-球蛋白(g/l)]+c3×Log[GGT(IU/l)]+c4×[γ-球蛋白(g/l)]-c5×[年齡(歲)]+c6×Log[ALT(IU/l)]-c7×[ApoA1(g/l)]-c8×[性別(女性＝0，男性＝1)]-c9，其中c1包括在3.45和3.65之間，c2包括在0.3和0.4之間，c3包括在0.8和1之間，c4包括在0.075和0.09之間，c5包括在0.0015和0.003之間，c6包括在2.1和2.5之間，c7包括在1.55和1.75之間，c8包括在0.35和0.45之間，和c9包括在4和4.6之間，一個特異的可用函數特別是f3＝3.513×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.354×[β2-球蛋白(g/l)]+0.889×Log[GGT(IU/l)]+0.0827×[γ-球蛋白(g/l)]-0.0022×[年齡(歲)]+2.295×Log[ALT(IU/l)]-1.670×[ApoA1(g/l)]-0.415×[性別(女性＝0，男性＝1)]-4.311。
采用7個標記物，以診斷顯著的纖維化或顯著的活動度f4＝d1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-d2×[α2-球蛋白(g/l)]+d3×Log[GGT(IU/l)]+d4×[γ-球蛋白(g/l)]+d5×[年齡(歲)]+d6×Log[膽紅素(umol/l)]-d7×[ApoA1(g/l)]+d8×[性別(女性＝0，男性＝1)]+d9Log[ALT(IU/L)]-d10，其中d1包括在5.3和6.7之間，d2包括在0.45和0.5之間，d3包括在0.8和1.2之間，d4包括在0.06和0.08之間，d5包括在0.0015和0.0025之間，d6包括在1和1.2之間，
d7包括在1和1.2之間，d8包括在0.09和1.1之間，d9包括在1.2和1.5之間，和d10包括在4和5之間。
一個特異的可用函數是f4＝5.981×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.481×[α2-球蛋白(g/l)]+0.965×Log[GGT(IU/l)]+0.0679×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0190×[年齡(歲)]+1.143×Log[膽紅素(umol/l)-1.097×[ApoA1(g/l)]+0.092×[性別(女性＝0，男性＝1)]-1.355Log[ALT(IU/L)]-4.498。
采用5個標記物，以診斷明顯的纖維化f5＝z1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)-z2×Log[觸珠蛋白(g/l)]+z3×Log[GGT(IU/l)]+z4×[年齡(歲)]+z5×Log[膽紅素(umol/l)]-z6×[ApoA1(g/l)]+z7×[性別(女性＝0，男性＝1)]-z8，其中z1包括在4和5之間，z2包括在1.2和1.5之間，z3包括在0.9和1.1之間，z4包括在0.0026和0.03之間，z5包括在1.6和1.9之間，z6包括在1和1.3之間，z7包括在0.25和0.35之間，和z8包括在5和6之間。
一個特異的可用函數是f5＝4.467×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-1.357×Log[觸珠蛋白(g/l)]+1.017×Log[GGT(IU/l)]+0.0281×[年齡(歲)]+1.737×Log[膽紅素(umol/l)]-1.184×[ApoA1(g/l)]+0.301×[性別(女性＝0，男性＝1)]-5.540。
實際上，不同函數中系數的數字精確度依所研究的患者的數量和特征，可以略有變化(大約10-15％)。因此，不同標記物系數給定的數值必須被解釋為能夠輕微的不同，而并不減少本發(fā)明的范圍。
根據分析生物學標記物測定值的邏輯函數所獲得的最終數值，能夠得出患者存在肝纖維化的結論。也可能通過將肝硬化作為ROC曲線圖中的閾值而得出肝硬化存在的結論。
本發(fā)明的方法也可用作疾病進展的預測手段。特別是，當患者被丙型肝炎病毒感染時，確定感染的日期(通常經過輸血)常常是可能的。因此，應用本方明的方法通過診斷的日期來確定疾病進展的程度也可對疾病的未來進展進行預測。
根據本發(fā)明診斷方法獲得的數據對醫(yī)生根據疾病的分期為患者選擇適合的治療方法也是非常有價值的。
依靠就診的患者人群中肝纖維化的發(fā)病率，本發(fā)明方法獲得的數據可用來確定對患者進行肝活檢的必要性。希望本發(fā)明的方法將減少大約50％的肝活檢需要。
本發(fā)明的方法打算用于患有涉及可進展為肝硬化的肝纖維化的任何疾病的患者。特別的是，本發(fā)明的方法有利地在患有以下疾病的患者中進行以檢測肝纖維化乙型肝炎和丙型肝炎、酗酒者、血色素沉著病、代謝性疾病、糖尿病、肥胖癥、自家免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥、威爾遜病。
本發(fā)明的方法最好用于肝炎病毒感染的患者，特別是丙型肝炎病毒。
本發(fā)明也涉及一種診斷患者炎癥性、纖維化或癌性疾病的試劑盒，包括說明書，使得在測定生物化學標記物后，可在所述患者中確定存在所述的炎癥、纖維化或癌性疾病。
本發(fā)明也涉及一種診斷患者肝纖維化和/或肝壞死性炎性病變的試劑盒，包括說明書，使得在測定生物化學標記物后，可在所述患者中確定存在肝纖維化和/或肝壞死性炎性病變。
說明書可包括在測定生物化學標記物劑量后必須要使用的邏輯函數。它可以打印的載體形式出現，以及計算機可用的載體，如軟件。說明書也可包含依賴所尋找的閾值的ROC曲線，可以分析從邏輯函數中獲得的最終數據。它們也可包含不同的圖表，以便依靠患者人群中的預期纖維化發(fā)病率獲得預測值。
根據本發(fā)明的診斷試劑盒也可含有能夠測定目標生物學標記物的成分。
本發(fā)明的方法可很容易的自動操作，標記物的測定自動地進行，數據被發(fā)送至計算機或計算器，它們將計算邏輯函數的數值并在ROC曲線的輔助下進行分析，最終分析患者人群中肝纖維化的發(fā)病率。因此醫(yī)生獲得的數據可更容易地判斷，將可以改進決定活檢需要或預知適當治療的過程。
下面的實施例是要描述發(fā)明的一個方面，給出方法學以便重復本發(fā)明的方法，但并不限制本發(fā)明。
實施例實施例1患者和方法1.1患者入組研究的患者屬于一個單中心人群(DOSVIRC)。此人群包括法國巴黎Pitié-Salpêtrière醫(yī)院肝和胃腸中心追蹤的所有丙型肝炎患者(定義為至少通過改進型ELISA檢測的血清學陽性)，1993年以前的為回顧性，之后為前瞻性(16)。一份特殊的問卷由每個患者填寫，該問卷包含129個項目，包括社會-人口統(tǒng)計學管理數據、風險因子、和每次回訪的臨床、生物學、病毒學和治療的項目，以及進行肝活檢時的組織學數據。HCV感染的時間通過輸血的日期或暴露于其他胃腸外來源的開始時間來估計，對偶爾發(fā)生感染的患者或那些感染源未知的患者無法計算。排除的標準是存在HBsAg或HIV陽性抗體。從1997年八月至2000年3月，預先納入所有知情同意的通過PCR檢測到HCV的患者，他們接受肝活檢，在活檢的當天取血樣。排除標準是同時感染HIV，HBV，其他肝臟疾病，和無法解釋的肝活檢。
在第一個階段(首年訓練期206個患者)內進行分析并在第二階段(驗證期156個患者)進行確證(表1)。
在訓練期排除1個患者和驗證期排除22個患者后(表4)進行另一項分析。
1.2血清標記物下面11項檢測在兩個階段均檢測α2-巨球蛋白、AST、ALT、GGT、總膽紅素、白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白(主要由α2-巨球蛋白和觸珠蛋白組成)，在兩個階段內對觸珠蛋白進行回顧性檢測。
IL10、TGF-β1、apoA2和apoB僅在第二階段進行檢測。
AST、ALT、GGT、總膽紅素采用Roche診斷試劑(Mannheim Germany)通過日立917自動儀進行測定。
白蛋白用溴甲酚綠法(17)檢測，不依靠血清蛋白電泳，(α1、α2、β和γ球蛋白餾分)，在Hydrasys和Hyrys自動系統(tǒng)(Sebia，Issy-Les-Moulineaux，法國)上進行。
通過采用自動比濁計BNII(Dade Behring Marburg，德國)在血清樣品中(在-80℃保存至測定)測定載脂蛋白A1、-A2、-B和α2巨球蛋白。
采用Quantikine人TGFβ1免疫測定法(R和D系統(tǒng)，Inc.Minneapolis，MN，美國)測定血漿TGFβ1的濃度。為了激活潛在的TGFβ1成為免疫活性形式，樣品用酸活化，之后中和。
采用免疫測定試劑盒(Beckman Coulter Company Immunotech，Marseille，法國)測定血漿白介素10。
血漿樣品保存在-80℃直至測定(不超過1年)。
1.3組織學分期和分級肝臟標本的組織學特征根據METAVIR評分系統(tǒng)進行分析(18，19)。肝活檢，長度超過10毫米，固定，石蠟包埋，至少用蘇木精伊紅藏花紅染色，Masson’s三色或picrosirius紅染膠原。
對每個肝活檢，根據下列的標準建立纖維化的分期和活動度的級別。肝活檢的分期為0至4期0＝無纖維化，1＝門脈區(qū)纖維化無纖維間隔，2＝少數纖維間隔，3＝大量的纖維間隔無肝硬化，和4＝肝硬化。這種特征在病理學家之間是高度重現性的。
活動度的分級可評價壞死性炎性病變的強度，其含義如下A0＝無組織學活動度，A1＝輕微活動度，A2＝中等活動度，A3＝嚴重活動度。METAVIR評分系統(tǒng)通過一個不知道患者特征的病理學家(FC)來進行評價。
實施例2統(tǒng)計學分析統(tǒng)計學分析采用邏輯回歸和ROC曲線(20)。分析在第一階段(首年訓練期)進行，驗證在第二階段(驗證期)進行，患者的組別見表1和4。
然后結合兩階段對總體的人群進行最后的分析(見表2和5)。
根據METAVIR評分系統(tǒng)，患者分為幾個組。
主要的終點是確定具有顯著的纖維化(F2，F3或F4)的患者和無顯著纖維化的患者(F0和F1)。
在第二次分析中，患者也根據活動度的分級分組無顯著活性的患者(A0或A1)和有組織學活性的患者(A2，或A3)。
確定無顯著組織學特征的一組(A＜2和F＜2)和顯著病變的一組(A≥2和F≥2)。
最后也確定具有廣泛纖維化或肝硬化(F3或F4)的一組。
第一階段包括在這些組中采用卡方，Student t檢驗或Mann-Whitney檢驗通過線性分析鑒定明顯變化的因子。
第二階段包括邏輯回歸分析測定標記物診斷纖維化的獨立判別值。
第三步是構建一個合并這些已鑒定因子的指數。從定義上，根據判別得到的最佳指數(“纖維化計分值”)是合并獨立因子的邏輯回歸函數。
這些指數和分離因子的診斷價值通過敏感性、特異性、陽性和陰性預測值以及接受者表現特征來評價。預測值可對觀察到的顯著纖維化發(fā)病率(本研究中為40％)進行評價，也可更低(10％)或更高的發(fā)病率(90％)。
通過接受者表現特征的曲線下面積比較各自的總體診斷價值。在對患者分類后，根據邏輯函數獲得的數值相對不同的閾值(從0至1)，ROC曲線通過繪制敏感性對比值(1-特異性)而制成。應該知道，ROC曲線下面積的值超過0.7是診斷的良好預測曲線。ROC曲線可被認為是一種可預測診斷方法質量的曲線。
這些統(tǒng)計學分析如以前所定義的，可分別對不同的組進行。
為了降低因子的數量，進行的分析僅合并6個最顯著的標記物(f1-a，或f1-b)。
因為在分析中觀察到，當考慮α2巨球蛋白時，α2球蛋白具有獨立的診斷價值，因此觸珠蛋白，α2球蛋白的第二個主要成分的診斷價值被回顧性的進行評價。
最終構建了具有5個標記物的指數，除了蛋白電泳成分，結合了觸珠蛋白和4個其他的已鑒定標記物(邏輯函數f5)。
實施例3確定邏輯函數預先納入422個患有慢性丙型肝炎的患者。
根據排除下列原因(HIV共同感染，HBV共同感染和移植)后的數目，在其他人中不能進行纖維化的分期，或在11個標記物中至少1個不能測定的數量，總共362(第一個研究)或339(第二個研究)個患有慢性丙型肝炎的患者納入研究中，在表1和4分別顯示。
在患者特征之間，第一次和第二次的樣品之間的生物化學標記物沒有差異(表1和4)。由組織學確定的顯著纖維化的總體發(fā)病率為40％(F017-18％，F1 42-43％，F2 19-20％，F3 8％，F4 12-13％)。
3.1明顯纖維化的診斷11個生物化學標記物的每一個診斷數值(ROC曲線下面積)見表2和5，以及它們與纖維化的獨立相關性(邏輯回歸)。
結合10個或6個最提供信息的標記物(α2巨球蛋白、α2微球蛋白、總膽紅素、γ球蛋白、apoA1和GGT)或5個標記物(除去α2-微球蛋白、γ球蛋白后，加進觸珠蛋白)、年齡和性別在訓練期樣品以及驗證樣品和總體的人群中(表2和5)具有很高的診斷價值。
因為轉氨酶ALT和AST是高度相關的(相關系數＝0.88)，當需要此標記物時僅使用ALT。
6個標記物和年齡和性別的邏輯函數被確定為如下f1-a＝6.826×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.479×[α2-球蛋白(g/l)]+1.252×Log[GGT(IU/l)]+0.0707×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0273×[年齡(歲)]+1.628×Log[膽紅素(umol/l)]-0.925×[ApoA1(g/l)]+0.344×[性別(女性＝0，男性＝1)]-4.544。
或f1-b＝6.552×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.458×[α2-球蛋白(g/l)]+1.113×Log[GGT(IU/l)]+0.0740×[γ-球蛋白(g/l)]+0.02950×[年齡(歲)]+1.473×Log[膽紅素(umol/l)]-0.979×[ApoA1(g/l)]+0.414×[性別(女性＝0，男性＝1)]-4.305。
6個標記物和年齡和性別的邏輯函數被確定為如下f5＝4.467×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-1.357×Log[觸珠蛋白(g/l)]+1.017×Log[GGT(IU/l)]+0.0281×[年齡(歲)]+1.737×Log[膽紅素(umol/l)]-1.184×[ApoA1(g/l)]+0.301×[性別(女性＝0，男性＝1)]-5.540。
邏輯函數是通過結合每個參數的相對權重和負號而獲得的，前者如在邏輯回歸中單獨確定的那樣，后者是當標記物與纖維化分期呈負相關時。對于數值范圍非常大的標記物使用對數。
當使用10個標記物來計算確定纖維化的邏輯函數時，該函數如下f2＝10.088×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.735×[α2-球蛋白(g/l)]+2.189×Log[GGT(IU/l)]+0.137×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0546×[年齡(歲)]+4.301×Log[膽紅素(umol/l)]-2.284×[ApoA1(g/l)]+0.294×[性別(女性＝0，男性＝1)]+0.0312[白蛋白(g/l)]+2.109[α1球蛋白(g/l)]-0.136[β2-球蛋白(g/l)]-0.813×Log[ALT(IU/L)]-13.165。
采用10個或6個最提供信息的標記物(

圖1)，或10個、6個或5個最提供信息的標記物(圖3)的ROC曲線，對纖維化計分值是相同的。曲線下面積沒有不同。
6個標記物纖維化計分值(范圍從0.00至1.00)的散點圖，根據纖維化的分期在圖2中顯示。
5或6個標記物纖維化計分值的框圖(范圍從0.00至1.00)，根據纖維化的分期在圖4中顯示。
采用6個標記物的纖維化計分值，對于0至0.20范圍的計分值(125例患者(第一個研究)，或119例患者(第二個研究))得到高度陰性的預測值(＞90％缺少F2 F3 F4)，即大約患者的35％，其中13個假陰性，年齡從34至59歲4個F2A0、6個F2A1、3個F2A2)。對于0.80至1的計分值(分別為53個患者(第一個研究)，50個患者(第二個研究)，即患者的15％，其中分別有4和5個假陽性，年齡從47至68歲分別為1、2個F1A1，3個F1A2)(表3和6)，獲得高度陽性的預測值(＞90％存在F2 F3 F4)。
這些數值為纖維化(F＞1)發(fā)病率40％的被檢測人群而計算。如果檢測人群的纖維化發(fā)病率是90％或10％，要考慮的預測值也在表3和6中顯示。
神經連接法給出了相似的結果訓練期、驗證和檢測樣品的被正確分類的患者百分比分別為77％、74％和79％(未顯示)。
在第二個樣品中，IL10、TGFβ1、apoA2和apoB的加入可輕微增加曲線面積至0.889±0.030，與6個標記物纖維化計分值無差別。
3.2.在低ALT患者中診斷顯著的纖維化(第二個研究)ALT低于35IU/l的總共43例患者，其中10例患者具顯著的纖維化。6個標記物纖維化函數的診斷值還是高的，其ROC曲線下面積為0.758±0.090。兩個計分值超過0.80的患者有肝硬化。在計分值低于0.20的29例患者中，25例沒顯著的纖維化。
3.3.診斷肝硬化或彌漫性纖維化(第一個研究)對于診斷肝硬化或彌漫性纖維化，用相同6個標記物(R2＝0.345P＜0.001)的纖維化計分值達到非常高的ROC曲線下面積0.929±0.020。
用此函數，獲得了計分值在0至0.80的高度陰性預測值(＞90％沒有F3 F4)(309例患者中，即85％的患者，有32例年齡從27至74歲的假陰性13例肝硬化和19例F3)。對于計分值＞0.80者有較高的陽性預測值(＞85％存在F3 F4)，53例患者，即15％的患者中，有8例年齡從47至68歲的假陽性4例F2和2例F1。
3.4.診斷肝硬化或彌漫性纖維化(第二個研究)對于診斷肝硬化或彌漫性纖維化，用相同6個標記物(R2＝0.347P＜0.001)的纖維化計分值達到非常高的ROC曲線下面積0.923±0.020。
用此函數，獲得了計分值在0至0.80的高度陰性預測值(＞90％沒有F3 F4)。在這289例患者中，即總數的85％，有30例假陰性11例肝硬化和19例F3。對于計分值＞0.80者有較高的陽性預測值(＞85％存在F3 F4)。在這50例患者中，即總數的15％，有10例假陽性5例F2和5例F1。
3.5.診斷顯著的活動度或纖維化或活動(第一和第二個研究)對于診斷顯著的活動度(A2A3)，最好的終極邏輯回歸結合了ALT、α2-巨球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、apo A1、和GGT(R2＝0.243P＜0.001)。
所使用的邏輯函數是f3＝3.513×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.354×[β2-球蛋白(g/l)(g/l)]+0.889×Log[GGT(IU/l)]+0.0827×[γ-球蛋白(g/l)]-0.0022×[年齡(歲)]+2.295×Log[ALT(IU/l)]-1.670×[ApoA1(g/l)]-0.415×[性別(女性＝0，男性＝1)]-4.311。
就單獨的有實際意義纖維化加上ALT而言，(R2＝0.290 P＜0.001)對于診斷顯著的纖維化(F2F3F4)或顯著的活動度(A2A3)，最好的終極邏輯回歸結合了同樣的6個標記物。
應當用于此診斷讀數的邏輯函數是f4＝5.981×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.481×[α2-球蛋白(g/l)]+0.965×Log[GGT(IU/l)]+0.0679×[γ-球蛋白(g/l)]-0.0190×[年齡(歲)]+1.143×Log[膽紅素(umol/l)]-1.097×[ApoA1(g/l)]+0.092×[性別(女性＝0，男性＝1)]+1.355 Log[ALT(IU/l)]-4.498。
3.6.細胞因子和生物化學標記物間的聯系(第二個研究)TGF-β1與觸珠蛋白正性相關(R＝0.39；p＜0.001)，與α2巨球蛋白(R＝-0.20；p＝0.02)、膽紅素(R＝-0.32；p＜0.001)和GGT(R＝-0.20；p＝0.01)負性相關。HGF與α2巨球蛋白(R＝0.45；p＝0.006)和GGT(R＝0.54；p＜0.001)相關。IL10僅與γ-球蛋白(R＝0.20；p＝0.01)相關。
實施例4數據分析獲得的結果顯示，5個或6個簡單生化標記物的聯合與纖維化發(fā)生不直接相關，但可以達到診斷有實際意義纖維化的高度陽性或陰性的預測值，甚至在很少纖維間隔的早期階段。
如果研究樣本是偏倚的，不代表多數患者，那么診斷方法的結論通常是不充分的。本研究中預定人群的臨床、組織學和生物化學特征在研究的33個月期間是穩(wěn)定的，在最近的大型隨機試驗(22)中的入組人群與之相似。有明顯的失代償性肝硬化的患者不入組。包括嚴重肝病的患者可人工地改善邏輯函數的預測值。另一方面，還有值得注意數量的患者有極小的組織學特征(13-18％沒有纖維化)，9％的患者ALT低于30IU/ml，13％者ALT低于35IU/ml，他們通常不入組隨機化試驗。
纖維化計分的診斷值在2個分期間是重現性的(表2和5)。這些結果的分析得到這樣的結論，在慢性丙型肝炎的管理中，活檢的數量可以減少50％。
實際上，患者是根據纖維化的分期和等級治療的(1-4)。根據纖維化計分值＜0.20，如果未活檢就作出不治療的決定，在125至119例患者中僅有13例是假陰性。其中沒有一個是肝硬化或彌漫性纖維化(F3-F4)，且僅有2例是中度活動度。根據纖維化計分值＞0.80，如果未活檢就作出治療的決定，在53例中僅有4例患者或50例中僅有5例患者是假陽性。其中3例患者有中度活動度，證明治療是合理的，盡管按照共同聲明(2)只有肝門纖維化。
這3例患者中的2例接受了經靜脈的肝活體組織檢查，顯示門—腔梯度的升高，分別是19和13mmHg。因此很可能這些患者事實上有顯著的纖維化。
在此情況下，僅有1或2例患者(4％)可能被過度治療。因此，此計分值也可以探測大多數具有中重度組織學活動度但沒有顯著纖維化的患者。最后，纖維化計分值還可以用于未活檢的肝硬化的管理。
非常重要的是注意到，本發(fā)明的方法不引起患者大量不適當的治療，或排除需要治療的患者。此申請中提供的數據確實強化了根據本發(fā)明的診斷方法的可靠性。
纖維化計分值也可以用于未活檢的肝硬化的管理。因此，對纖維化計分值＞0.80的患者可以推薦篩選脈管曲張和肝細胞腫瘤。
最提供信息的標記物以降序是α2-巨球蛋白、α2-球蛋白、GGT、γ球蛋白、總膽紅素和apoA1。
α2-球蛋白(正常范圍4-6g/l)是由α2-巨球蛋白(1.4-4.0g/l)和α2-微球蛋白組成的觸珠蛋白(0.4-2g/l)、天蘭色胞漿素(0.2-0.4)、抗凝血酶III(0.2-0.3)和維生素A結合蛋白(0.03-0.07)(23)。由于纖維化伴有α2-巨球蛋白增加和α2-微球蛋白下降，在單變量分析中沒有觀察到α2-球蛋白的診斷值(圖5)。
報告的數據提示，α2-微球蛋白的主要成分觸珠蛋白在纖維化增加時下降，并成為預測因素。的確，α2-球蛋白和α2-巨球蛋白之間主要由觸珠蛋白構成的差異與纖維化強烈地負相關(R＝-0.33，p＜0.001)。α2-巨球蛋白的其它成分(天蘭色胞漿素、抗凝血酶III和維生素A結合蛋白)在血清中濃度很低，其獨立的診斷值尚未評定。
纖維化和α2-巨球蛋白之間(正性相關R＝0.46p＜0.001)與纖維化和α2-微球蛋白(富有觸珠蛋白，負性相關R＝-0.40)之間相比，可以觀察到相反的相關關系。
有5個標記物的邏輯函數強化了此假設。
α2-巨球蛋白升高對纖維化分期的顯著診斷價值已經在酒精性肝病患者中觀察到。α2-巨球蛋白屬于急性期蛋白，由肝細胞、星形細胞和肉芽瘤細胞在炎癥和肝纖維化的部位局部產生。此外，α2-巨球蛋白作為星形細胞活化的特征與纖維化特異地相關。α2-巨球蛋白還是一個蛋白酶抑制劑，其合成增加可以抑制基質蛋白的分解代謝并增進肝的纖維化過程。
纖維化增加時觸珠蛋白下降，因此解釋了α2-球蛋白與α2-巨球蛋白結合時的預測值。正如已經觀察到的，觸珠蛋白與纖維化強烈地負性關聯。此關聯與溶血、脾功能亢進、或肝功能不全不相關。相似地，在此研究中(數據未顯示)發(fā)現與非結合膽紅素沒有顯著關聯。
纖維化與α2-巨球蛋白(正性)和觸珠蛋白(負性)之間相反的相關關系可以通過HGF和TGF-β1在纖維化發(fā)生和急性期反應過程中的不同作用來解釋。對于α2-巨球蛋白，觀察到與HGF的強正性關聯，以及與TGF-β1血清濃度的負性相關。
相反，觀察到觸珠蛋白與TGF-β1的強正性相關。在實驗性纖維化中已經觀察到，用HGF基因轉導抑制了TGF-β1的增加，且HGF刺激α2-巨球蛋白的合成和減少觸珠蛋白的合成。因此，看起來這兩個蛋白提供了很多的信息，成為兩個主要的纖維化發(fā)生細胞因子的代表α2-巨球蛋白是HGF的代表，觸珠蛋白是TGF-β1的代表。
GGT已經數次觀察到與纖維化有關，并與凝血酶原和載脂蛋白A1PGA指數一起應用(7-8，13-14，34)。在此研究中，GGT的診斷值不依賴于其它因子，特別是轉氨酶和膽紅素。目前，不能解釋總血清膽紅素在非肝硬化患者中的獨立診斷值。GGT和膽紅素均與HGF相關。除早期膽汁淤積外，表皮生長因子增加可能是GGT升高的一個解釋。
γ球蛋白血清濃度已經與肝硬化和門—體分流相關聯多年(36)。在此研究中顯示，盡管比肝硬化患者低，但非肝硬化性纖維化的患者與F1或F0的患者相比，γ-球蛋白濃度已經升高了。
ApoA1血清濃度已經數次觀察到與纖維化有關，并與凝血酶原和GGT一起應用PGA指數(參見上面)。在此研究中發(fā)現，apo-AII或apoB與apoA1單獨相比，沒有顯著的輔助診斷價值。
在此研究中，觀察到隨纖維化分期意外的血清TGF-β1下降，盡管這沒有為6個標記物的聯合增加顯著的診斷價值。在TGF-β1和α2-巨球蛋白之間觀察到最強的相關(R＝0.42 p＜0.001)，提示觸珠蛋白可能是慢性丙型肝炎中TGF-β1活化的一個簡單標記物。
最后，血清細胞因子的評估不增加生物化學標記物的顯著診斷價值，而后者的檢測是容易且廉價的。檢測電泳化合物(α2-球蛋白和γ-球蛋白)可以看作是半定量測定的老方法。在5個標記物函數中用觸珠蛋白代替它們給出了相似的預測值。
總之，本發(fā)明提出了一個用于檢測肝纖維化和/或存在炎性病變的5個、6個或更多生物化學標記物的聯合。在本發(fā)明中使用的標記物還從未用這樣的方法與患者的年齡和性別結合在一起以得到這樣好的預測值，正如以ROC曲線下面積所說明的。
本發(fā)明的診斷方法可以在自動測量標記物的數值后被自動分析，并能夠有利地應用于慢性丙型肝炎的患者以降低肝活檢的指征。
表1確定函數f1-a、f2、f3、f4的入組患者的特征特征訓練期 驗證期 總計患者數 206156362活檢時年齡(歲)均值95％CI 47(45-49) 48(46-50) 47(46-49)男性(％) 108(52％) 103(66％) 211(58％)女性(％) 99(48％) 53(％34) 152(42％)無纖維化(F0) 36(17％) 28(18％) 64(18％)肝門纖維化(F1) 91(44％) 61(39％) 152(42％)很少纖維間隔(F2) 41(20％) 29(19％) 70(19％)許多纖維間隔(F3) 18(9％)11(7％)29(8％)肝硬化(F4) 21(10％) 27(17％) 48(13％)無(A0) 52(25％) 27(17％) 79(22％)輕度(A1) 87(42％) 87(56％) 174(48％)中度(A2) 63(30％) 38(24％) 101(28％)重度(A3) 5(2％) 4(3％) 9(2％)鐵計分 1.2(0.8-1.6) 1.4(0.9-1.7) 1.3(1.0-1.6)脂肪變性(％) 12％(9-26％) 15％(10-19％) 13％(10-16％)標記物(正常范圍)AST U/L(17-27女性)(20-32男性)71(63-80) 79(65-92) 74(67-82)ALT U/L(11-26女性)(16-35男性)108(95-121)113(92-133)110(99-122)總膽紅素umoles/L(2-17) 11(10-12) 13(9-18) 12(10-14)白蛋白g/L(35-44) 44(43-44) 44(43-45) 44(43-44)GGT U/L(7-32女性)(11-49男性) 81(64-98) 99(72-126) 89(74-104)α2巨球蛋白g/L(女性1.6-4.0男 2.6(2.5-2.7) 2.5(2.3-2.6) 2.6(2.5-2.7)性1.4-3.3)α1球蛋白g/L(1-3)1.9(1.9-2.0) 1.8(1.8-1.9) 1.9(1.9-1.9)α2球蛋白g/L(4-9)7.6(7.4-7.8) 6.8(6.6-7.1) 7.3(7.1-7.4)β球蛋白g/L(4-10)6.8(6.7-7.0) 7.0(6.8-7.2) 6.9(6.8-7.0)γ球蛋白g/L(5-12)14.9(14.3-15.6)14.6(13.8-15.5)14.8(14.3-15.3)ApoA1 g/L(1.2-1.7) 1.5(1.5-1.6) 1.4(1.4-1.5) 1.5(1.4-1.5)ApoB g/L(0.5-1.4)ND 0.9(0.8-0.9) NDApoA2 g/L(0.3-0.5) ND 0.3(0.3-0.3) NDIL 10 pg/ml(＜16)ND 73(41-105) NDTGF B1 ng/l(35-64) ND 32(29-33) NDND未定。表2對表1中患者的f1-a、f2，顯著性纖維化(很少F2、許多纖維間隔F3、肝硬化F4)的生物化學標記物的診斷值(ROC曲線下面積±sd)。標記物訓練期驗證期 兩個周期ROC曲線 顯著性 ROC曲線 顯著性ROC曲線顯著性下面積 邏輯回歸下面積邏輯回歸 下面積 邏輯回歸AST 0.774±0.040.13 0.706±0.04 0.35 0.743±0.030.35α2巨球蛋白 0.753±0.04＜0.001 0.750±0.04 ＜0.0010.751±0.03＜0.001ALT 0.724±0.040.09 0.583±0.05 0.11 0.662±0.030.41GGT 0.680±0.040.03 0.722±0.04 0.01 0.700±0.030.003γ球蛋白 0.680±0.040.16 0.680±0.04 0.59 0.676±0.030.04總膽紅素 0.611±0.040.69 0.751±0.04 0.008 0.673±0.030.06白蛋白 0.485±0.040.12 0.326±0.04 0.53 0.415±0.030.68α1球蛋白0.512±0.040.30 0.571±0.05 0.80 0.534±0.030.26α2球蛋白0.488±0.040.0070.482±0.05 0.03 0.480±0.03＜0.001β球蛋白 0.477±0.040.75 0.578±0.05 0.45 0.522±0.030.97ApoA10.449±0.040.14 0.372±0.04 0.12 0.413±0.030.0510個標記物 0.856±0.03＜0.001 0.885±0.03 ＜0.0010.853±0.02＜0.001和年齡、性別R2＝0.314R2＝0.363R2＝0.310的邏輯函數6個標記物 0.839±0.03 ＜0.001 0.868±0.03 ＜0.0010.851±0.02＜0.001和年齡、R2＝0.288R2＝0.347R2＝0.298性別的邏輯函數**6個標記物和年齡、性別的邏輯函數6.826×Logα2巨球蛋白(g/l)-0.479×α2球蛋白(g/l)+1.252×LogGGT(IU/l)+0.0707×γ球蛋白(g/l)+0.0273×年齡(歲)+1.628×Log膽紅素(umol/l)-0.925×ApoA1(g/l)+0.344×性別(女性＝0，男性＝1)-4.544。
ND未定 R2＝R的平方表36個標記物纖維化函數f1-a的靈敏度、特異性和預測值纖維化函數 靈敏度 特異性 似然比 Prev＝0.40Prev＝0.10 Prev＝0.90截止點PPVNPVPPVNPV PPVNPV0.100.990.301.41 0.49 0.97 0.14 0.995 0.93 0.710.200.910.521.89 0.56 0.90 0.17 0.980.94 0.390.300.830.652.35 0.61 0.85 0.21 0.970.96 0.300.400.740.742.85 0.66 0.81 0.24 0.960.96 0.240.500.670.813.62 0.71 0.79 0.29 0.960.97 0.220.600.590.938.48 0.85 0.77 0.49 0.950.99 0.200.700.510.9612.160.89 0.74 0.57 0.950.99 0.180.800.320.9813.900.90 0.68 0.61 0.930.99 0.140.900.160.995 35.500.96 0.64 0.80 0.910.997 0.12
表4確定邏輯函數f1-b和f5的入組患者的特征特征 訓練期 驗證期 總計患者數205 134 339活檢時年齡(歲)均值95％CI 47(45-49) 48(46-50) 47(46-49)男性(％) 108(53％) 88(66％)196(58％)女性(％) 97(47％)46(34％)143(42％)無纖維化(F0) 36(17％)20(15％)56(17％)肝門纖維化(F1)91(44％)54(40％)145(43％)很少纖維間隔(F2) 40(20％)28(21％)68(20％)許多纖維間隔(F3) 18(9％) 10(7％) 28(8％)肝硬化(F4)20(10％)22(17％)42(12％)無(A0)52(25％)17(12％)69(20％)輕度(A1) 85(41％)80(60％)165(49％)中度(A2) 63(31％)33(25％)96(28％)重度(A3) 5(2％) 4(3％) 9(3％)鐵計分1.2(0.8-1.6)1.4(0.9-1.7)1.3(1.0-1.6)脂肪變性(％) 12％(9-26％)15％(10-19％) 13％(10-16％)標記物(正常范圍)ASr U/L(17-27女性)(20-32男性) 71(63-80) 79(65-92) 77(67-82)ALT U/L(11-26女性)(16-35男性) 108(95-121) 113(92-133) 114(99-122)總膽紅素umoles/L(2-17)11(10-12) 13(9-18)12(10-14)白蛋白g/L(35-44) 44(43-44) 44(43-45) 44(43-44)GGT U/L(7-32女性)(11-49男性) 81(64-98) 99(72-126) 88(74-104)α2巨球蛋白g/L(女性1.6-4.0男性2.6(2.5-2.7)2.5(2.3-2.6)2.6(2.5-2.7)1.4-3.3)α1球蛋白g/L(1-3) 1.9(1.9-2.0)1.8(1.8-1.9)1.9(1.9-1.9)α2球蛋白g/L(4-9) 7.6(7.4-7.8)6.8(6.6-7.1)7.3(7.1-7.4)β球蛋白g/L(4-10) 6.8(6.7-7.0)7.0(6.8-7.2)6.9(6.8-7.0)γ球蛋白g/L(5-12) 14.9(14.3-15.6) 14.6(13.8-15.5) 14.8(14.3-15.3)ApoA1 g/L(1.2-1.7)1.5(1.5-1.6)1.4(1.4-1.5)1.5(1.4-1.5)ApoB g/L(0.5-1.4) ND 0.9(0.8-0.9)NDApoA2 g/L(0.3-0.5)ND 0.3(0.3-0.3)NDIL 10 pg/ml(＜16) ND 78(41-105) NDTGF B1 ng/l(35-64)ND 31(29-33) ND觸珠蛋白g/l(0.35-2.00)* 0.97(0.89-1.05) 0.89(0.80-0.99) 0.94(0.88-1.00)HGF ng/l(-) ND 1181(976-1386) NDND未定 *對于觸珠蛋白，在第一周期有8個患者，第二周期有一個患者未測定。表5對表4中患者的f1-b、f2、f5、顯著性纖維化(很少F2、許多纖維間隔F3、肝硬化F4)的生物化學標記物的診斷值(ROC曲線下面積±sd)。標記物 訓練期 驗證期 兩個周期ROC曲線 顯著性 ROC曲線 顯著性 ROC曲線 邏輯回歸下面積 邏輯回歸 下面積邏輯回歸 下面積顯著性AST 0.773±0.04 0.13 0.679±0.05 0.35 0.739±0.03 0.35α2巨球蛋白 0.749±0.04 ＜0.0010.740±0.04 ＜0.0010.746±0.03 ＜0.001ALT 0.725±0.04 0.09 0.564±0.05 0.11 0.664±0.03 0.41觸珠蛋白(下降)§0.704±0.04 0.02 0.654±0.05 0.006 0.685±0.03 0.02γ球蛋白 0.680±0.04 0.16 0.670±0.04 0.59 0.672±0.03 0.04GGT 0.672±0.04 0.03 0.705±0.04 0.01 0.697±0.03 0.003總膽紅素 0.611±0.04 0.69 0.726±0.04 0.008 0.669±0.03 0.06ApoA1(下降) 0.554±0.04 0.14 0.647±0.05 0.12 0.597±0.03 0.05白蛋白(下降) 0.514±0.04 0.12 0.662±0.04 0.53 0.574±0.03 0.68α1球蛋白0.518±0.04 0.30 0.577±0.05 0.80 0.538±0.03 0.26α2球蛋白(下降) 0.508±0.04 0.007 0.518±0.05 0.03 0.518±0.03 ＜0.001β球蛋白 0.475±0.04 0.75 0.601±0.05 0.45 0.527±0.03 0.9710個標記物 0.856±0.03 ＜0.0010.885±0.03 ＜0.0010.851±0.02 ＜0.001和年齡、性別的邏輯函數R2＝0.314 R2＝0.363 R2＝0.3056個標記物0.836±0.03 ＜0.0010.870±0.03 ＜0.0010.847±0.02 ＜0.001和年齡、性別的邏輯函數* R2＝0.284 R2＝0.338 R2＝0.2975個標記物0.827±0.03 ＜0.0010.851±0.03 ＜0.0010.837±0.02 ＜0.001和年齡、性別的邏輯函數** R2＝0.265 R2＝0.323 R2＝0.297§回顧性評估觸珠蛋白。在第一周期有8個患者，第二周期有一個患者未測定。當觸珠蛋白代替α2球蛋白時，有邏輯回歸顯著性。*6個標記物和年齡、性別的邏輯函數6.552×Logα2巨球蛋白(g/l)-0.458×α2球蛋白(g/l)+1.113×LogGGT(IU/l)+0.0740×γ球蛋白(g/l)+0.0295×年齡(歲)+1.473×Log膽紅素(umol/l)-0.979×ApoA1(g/l)+0.414×性別(女性＝0，男性＝1)-4.305。**5個標記物和年齡、性別的邏輯函數4.467×Logα2巨球蛋白(g/l)-1.357×Log觸珠蛋白(g/l)+1.017×LogGGT(IU/l)+0.0281×年齡(歲)+1.737×Log膽紅素(umol/l)-1.184×ApoA1(g/l)+0.301×性別(女性＝0，男性＝1)-5.540。
ND未定 R2＝R的平方表66個標記物纖維化函數f1-b的靈敏度、特異性和預測值纖維化函數靈敏度 特異性 似然比 觀察的 模擬的 模擬的截止點普遍性＝0普遍性＝0.10普遍性＝0.90PPV NPVPPV NPV PPV NPV0.10 0.980.331.460.50 0.96 0.140.990.930.630.20 0.910.531.940.57 0.90 0.180.980.950.390.30 0.810.652.330.62 0.83 0.210.970.950.280.40 0.730.742.780.66 0.80 0.240.960.960.230.50 0.680.854.420.75 0.79 0.330.960.980.230.60 0.600.938.640.86 0.77 0.490.950.990.210.70 0.500.9510.05 0.87 0.73 0.530.940.990.170.80 0.330.9813.11 0.90 0.68 0.590.930.990.120.90 0.170.9917.48 0.92 0.64 0.660.920.997 0.12
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權利要求
1.在患者中診斷炎癥、纖維性或癌性疾病的方法，包括下列步驟a)測定所述患者血清或血漿中生物化學標記物的數值，b)通過包含所述標記物的邏輯函數合并所述的數值和，c)分析所述邏輯函數的最終值以確定所述患者中肝纖維化和/或肝壞死性炎性病變的存在。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的疾病是肝纖維化和/或存在肝壞死性炎性病變。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述的邏輯函數是通過以下方法獲得的i)根據患者的疾病程度將其分成不同組；ii)通過線性分析確定在這些組間顯著不同的因子；iii)邏輯回歸分析評價標記物的獨立判別值用于診斷纖維化和/或肝壞死性炎性病變；iv)通過結合這些確定的獨立因子，構建邏輯函數。
4.根據權利要求1所述的方法，其中至少4個生物化學標記物在步驟a)中被研究。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述的標記物選自α2-巨球蛋白、AST、ALT、GGT、γ-球蛋白、總膽紅素、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、觸珠蛋白、β-球蛋白、apoA1、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述的邏輯函數進一步考慮了患者的年齡和性別。
7.根據權利要求2所述的方法，其中所述檢測的用于診斷纖維化的生物化學標記物包括α2-巨球蛋白、GGT、γ-球蛋白、總膽紅素、(α2-球蛋白或觸珠蛋白)和apoA1。
8.根據權利要求2所述的方法，其中所述檢測的用于診斷存在壞死性炎性病變的生物化學標記物包括α2-巨球蛋白、GGT、γ-球蛋白、(ALT或AST)和apoA1。
9.根據權利要求2所述的方法，其中所述的邏輯函數包括-f1＝a1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-a2×[α2-球蛋白(g/l)]+a3×Log[GGT(IU/l)]+a4×[γ-球蛋白(g/l)]+a5×[年齡(歲)]+a6×Log[膽紅素(umol/l)]-a7×[ApoA1(g/l)]+a8×[性別(女性＝0，男性＝1)]-a9，其中-a1包含在6.5和6.9之間，-a2包含在0.450和0.485之間，-a3包含在1.100和1.300之間，-a4包含在0.0700和0.0750之間，-a5包含在0.0265和0.0300之間，-a6包含在1.400和1.700之間，-a7包含在0.900和1之間，-a8包含在0.300和0.450之間，和-a9包含在4.200和4.700之間；-f2＝b1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-b2×[α2-球蛋白(g/l)]+b3×Log[GGT(IU/l)]+b4×[γ-球蛋白(g/l)]+b5×[年齡(歲)]+b6×Log[膽紅素(umol/l)]-b7×[ApoA1(g/l)]+b8×[性別(女性＝0，男性＝1)]+b9[白蛋白(g/l)]+b10[α1-球蛋白(g/l)]-b11[β2-球蛋白(g/l)]2.189-b12×Log[ALT(IU/l)]-b13，其中-b1包括在9.9和10.2之間，-b2包括在0.7和0.77之間，-b3包括在2和2.4之間，-b4包括在0.1和0.2之間，-b5包括在0.04和0.07之間，-b6包括在4和4.6之間，-b7包括在2和2.5之間，-b8包括在0.28和0.32之間，-b9包括在0.025和0.04之間，-b10包括在2和2.2之間，-b11包括在0.1和0.16之間，-b12包括在0.7和0.9之間，-b13包括在12和14之間；-f3＝c1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-c2×[β2-球蛋白(g/l)]+c3×Log[GGT(IU/l)]+c4×[γ-球蛋白(g/l)]-c5×[年齡(歲)]+c6×Log[ALT(IU/l)]-c7×[ApoA1(g/l)]-c8×[性別(女性＝0，男性＝1)]-c9，其中-c1包括在3.45和3.65之間，-c2包括在0.3和0.4之間，-c3包括在0.8和1之間，-c4包括在0.075和0.09之間，-c5包括在0.0015和0.003之間，-c6包括在2.1和2.5之間，-c7包括在1.55和1.75之間，-c8包括在0.35和0.45之間，和-c9包括在4和4.6之間；-f4＝d1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-d2×[α2-球蛋白(g/l)]+d3×Log[GGT(IU/l)]+d4×[γ-球蛋白(g/l)]+d5×[年齡(歲)]+d6×Log[膽紅素(umol/l)]-d7×[ApoA1(g/l)]+d8×[性別(女性＝0，男性＝1)]+d9Log[ALT(IU/l)]-d10，其中-d1包括在5.3和6.7之間，-d2包括在0.45和0.5之間，-d3包括在0.8和1.2之間，-d4包括在0.06和0.08之間，-d5包括在0.0015和0.0025之間，-d6包括在1和1.2之間，-d7包括在1和1.2之間，-d8包括在0.09和1.1之間，-d9包括在1.2和1.5之間，和-d10包括在4和5之間。-f5＝z1×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-z2×Log[觸珠蛋白(g/l)]+z3×Log[GGT(IU/l)]+z4×[年齡(歲)]+z5×Log[膽紅素(umol/l)]-z6×[ApoA1(g/l)]+z7×[性別(女性＝0，男性＝1)]-z8，其中-z1包括在4和5之間，-z2包括在1.2和1.5之間，-z3包括在0.9和1.1之間，-z4包括在0.0026和0.03之間，-z5包括在1.6和1.9之間，-z6包括在1和1.3之間，-z7包括在0.25和0.35之間，和-z8包括在5和6之間。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述的邏輯函數選自-f1-a＝6.826×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.479×[α2-球蛋白(g/l)]+1.252×Log[GGT(IU/l)]+0.0707×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0273×[年齡(歲)]+1.628×Log[膽紅素(umol/l)]-0.925×[ApoA1(g/l)]+0.344×[性別(女性＝0，男性＝1)]-4.544；-f1-b＝6.552×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.458×[α2-球蛋白(g/l)]+1.113×Log[GGT(IU/l)]+0.0740×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0295×[年齡(歲)]+1.473×Log[膽紅素(umol/l)]-0.979×[ApoA1(g/l)]+0.414×[性別(女性＝0，男性＝1)]-4.305；-f2＝10.088×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.735×[α2-球蛋白(g/l)]+2.189×Log[GGT(IU/l)]+0.137×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0546×[年齡(歲)]+4.301×Log[膽紅素(umol/l)]-2.284×[ApoA1(g/l)]+0.294×[性別(女性＝0，男性＝1)]+0.0312[白蛋白(g/l)]+2.109[α1-球蛋白(g/l)]-0.136[β2-球蛋白(g/l)]-0.813×Log[ALT(IU/l)]-13.165；-f3＝3.513×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.354×[β2-球蛋白(g/l)]+0.889×Log[GGT(IU/l)]+0.0827×[γ-球蛋白(g/l)]-0.0022×[年齡(歲)]+2.295×Log[ALT(IU/l)]-1.670×[ApoA1(g/l)]-0.415×[性別(女性＝0，男性＝1)]-4.311；-f4＝5.981×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-0.481×[α2-球蛋白(g/l)]+0.965×Log[GGT(IU/l)]+0.0679×[γ-球蛋白(g/l)]+0.0190×[年齡(歲)]+1.143×Log[膽紅素(umol/l)]-1.097×[ApoA1(g/l)]+0.092×[性別(女性＝0，男性＝1)]+1.355Log[ALT(IU/l)]-4.498；-f5＝4.467×Log[α2-巨球蛋白(g/l)]-1.357×Log[觸珠蛋白(g/l)]+1.017×Log[GGT(IU/l)]+0.0281×[年齡(歲)]+1.737×Log[膽紅素(umol/l)]-1.184×[ApoA1(g/l)]+0.301×[性別(女性＝0，男性＝1)]-5.540。
11.根據權利要求2所述的方法，其中所述的邏輯函數最終值被用于診斷肝硬化。
12.根據權利要求1所述的方法，其中所述的邏輯函數最終值被用于預測疾病的進展。
13.根據權利要求1所述的方法，其中所述的邏輯函數最終值被用于選擇對患者合適的治療。
14.根據權利要求1所述的方法，其中所述的邏輯函數最終值被用于決定對所述患者進行肝活檢。
15.根據權利要求2所述的方法，其中所述的患者患有涉及肝纖維化的疾病，可選擇地是正在形成的肝硬化。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述的疾病包括乙和丙型肝炎、酒精中毒、血色沉著病、代謝性疾病、糖尿病、肥胖癥、自身免疫性肝病、原發(fā)膽汁性肝硬化、α1-抗胰蛋白酶缺陷、Wilson病。
17.根據權利要求15所述的方法，其中所述的疾病是丙型肝炎病毒感染。
18.在患者中診斷炎癥、纖維性或癌性疾病的試劑盒，包括在使用生物化學標記物后可以確定所述患者中存在所述的炎癥、纖維性或癌性疾病的說明書。
19.在患者中診斷肝纖維化和/或肝壞死性炎性病變的試劑盒，包括在使用生物化學標記物后可以確定所述患者中存在肝纖維化、和/或肝壞死性炎性病變的說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過采用可容易地檢測的生物學標記物的血清濃度來檢測患者，特別是肝纖維化，特別是感染丙型肝炎病毒的患者，炎癥、纖維化或癌性疾病程度的一種新診斷方法。本發(fā)明也涉及實現本方法的診斷試劑盒。
文檔編號G01N33/576GK1468375SQ00819912
公開日2004年1月14日 申請日期2000年10月24日 優(yōu)先權日2000年8月21日
發(fā)明者T·波伊納德, T 波伊納德 申請人:法國公立援助醫(yī)院