專利名稱：利用親和捕獲串聯(lián)質(zhì)譜分析表征分子間作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)和生物化學(xué)分析領(lǐng)域，尤其涉及利用串聯(lián)質(zhì)譜分析對分析物、以及分析物之間的親和作用力進(jìn)行改進(jìn)的鑒定和表征的設(shè)備和方法。
背景技術(shù)：
電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)技術(shù)的出現(xiàn)，加上質(zhì)量分析儀改進(jìn)的性能和更低的成本，在過去的十年里已使質(zhì)譜分析(MS)在與生物有關(guān)的大分子——包括從復(fù)雜生物系統(tǒng)中純化得到的蛋白質(zhì)——的研究所用的標(biāo)準(zhǔn)分析工具中占有一席之地。
例如，在一種稱為肽質(zhì)指紋圖譜的技術(shù)中，質(zhì)譜分析被用于鑒定從生物樣品中純化得到的蛋白質(zhì)。鑒定受到將純化蛋白質(zhì)的蛋白水解碎片的質(zhì)譜與從預(yù)先添加到數(shù)據(jù)庫中的初級序列(primary sequences)預(yù)測的質(zhì)量進(jìn)行對比的影響。Roepstorff，The Analyst 117299-303(1992)；Rappin et al.，Curr.Biol.3(6)327-332(1993)；Mann et al.，Biol.Mass Spectrom.22338-345(1993)；Yates et al.，Anal.Biochem.213397-408(1993)；Henzel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905011-5015(1993)；James et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.19558-64(1993)。
還發(fā)展了類似的采掘數(shù)據(jù)庫的方法，利用碰撞誘導(dǎo)分離(CID)或MALDI源后分離(PSD)所得的碎片質(zhì)譜來鑒定純化蛋白質(zhì)。Enget al.，J.Am.Soc.Mass.Spectrom.5976-989(1994)；Griffin et al.，Rapid Commun.Mass Spectrom.91546-1551(1995)；Yates et al.，U.S.Patent Nos.5,538,897 and 6,017,693；Mann et al.，Anal.Chem.664390-4399(1994)。
還發(fā)展了允許隔離蛋白質(zhì)至少部分重新排序的質(zhì)譜分析技術(shù)。Chait et al.，Science 26289-92(1993)；Keough et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.967131-6(1999)；reviewed in Bergman，EXS 88133-44(2000)。
在因特網(wǎng)上現(xiàn)在已可以容易地獲取蛋白質(zhì)質(zhì)譜和共用的序列數(shù)據(jù)庫采掘之間便捷翻譯的軟件資源來促進(jìn)蛋白質(zhì)鑒定。其中有ProteinProspector(http//prospector.ucsf/edu)、PROWL(http//prowl.rockefeller.edu)，以及Mascot Search Engine(MatrixScience Ltd.，London，UK，www.matrixscience.com)。
盡管高精度的質(zhì)量分配(mass asignment)提供了有用的信息——例如，促進(jìn)了上述技術(shù)所進(jìn)行的純化蛋白質(zhì)的鑒定——盡管如此，這樣的信息依然是有限的。通過將MS分析與目標(biāo)蛋白質(zhì)的酶和/或化學(xué)改性結(jié)合，將能釋放更多的分析能力，可進(jìn)行結(jié)構(gòu)成分的說明、轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)后的改性，并促進(jìn)蛋白質(zhì)鑒定。
此外，復(fù)雜生物材料——例如血液、血清、血漿、淋巴、組織液、尿液、滲出液、完整細(xì)胞、細(xì)胞溶解產(chǎn)物以及細(xì)胞分泌物——通常含有數(shù)以百計的生物細(xì)胞，以及有機鹽和無機鹽，這些阻礙了直接的質(zhì)譜分析。這樣，在MS研究之前，通常必須進(jìn)行樣品預(yù)備和純化步驟。
經(jīng)典的樣品純化方法——例如流體色譜法(離子交換、尺寸排除、親和，以及反相色譜法)、膜透析、離心法、免疫沉淀法，以及電泳法——通常需要大量啟示樣品。即使能夠獲得所需數(shù)量的樣品，在這些純化處理中，微量成分也容易丟失，它們因非特定的結(jié)合和稀釋影響導(dǎo)致的分析物丟失而受損。這些方法還經(jīng)常需要大量的勞動。
因此，很明顯需要便于對異質(zhì)樣品中出現(xiàn)的主要和微量蛋白質(zhì)都進(jìn)行質(zhì)譜探測，而無需事前流體相純化的方法和設(shè)備。進(jìn)一步還需要不僅容易做到樣品純化，還允許質(zhì)譜分析之前的串聯(lián)和并聯(lián)樣品改性方法的MS平臺。
通過發(fā)展親和捕獲激光解吸電離方法部分滿足了這些要求。Hutchens et al.，Rapid Commun.Mass Spectrom.7576-580(1993)；U.S.Patent Nos.5,719,060,5,894,063,6,020,208，and 6,027,942。這種大分子MS分析的新策略利用新穎的、至少在一個表面上具有親和試劑的激光解吸電離探針。親和試劑從異質(zhì)樣品中吸取所需的分析物，將它們以適于隨后的激光解吸電離的形式聚集在探針表面上。分析物的吸取和解吸的結(jié)合避開了脫機純化方法，允許對更小的初始樣品進(jìn)行分析，并進(jìn)一步便于質(zhì)譜分析之前直接在探針表面的樣品改性方法。
親和捕獲激光解吸電離方法允許質(zhì)譜分析適合于許多傳統(tǒng)的生物分析測定形式，包括免疫分析，Nelson et al.，Anal.Chem.671153-1158(1995)，以及親和色譜，Brockman et al.，Anal.Chem.674581-4585(1995)。親和捕獲激光解吸電離方法不僅已應(yīng)用到肽和蛋白質(zhì)的研究，Hutchens et al.，Rapid Commun.Mass Spectrom.7576-580(1993)；Mouradian et al.，J.Amer.Chem.Soc.1188639-8645(1996)；Nelson et al.，rapid Commun.MaSS Spectrom.91380-1385(1995)；Nelson et al.，J.Molec.Recognition 1277-93(1999)；Brockman et al.，J.Mass Spectrom.331141-1147(1998)；Yipet al.，J.Biol.Chem.27132825-33(1996)，還應(yīng)用到低聚核苷酸的研究，Jurinke et al.，Anal.Chem.69904-910(1997)；Tang et al.，Nucl.Acids Res.233126-3131(1995)；Liu et al.，Anal.Chem.673482-90(1995)，細(xì)菌的研究，Bundy et al.，Anal.Chem.711460-1463(1999)，以及小分子的研究，Wei et al.，Nature 399243-246(1999)。在商業(yè)水平上，親和捕獲激光解吸電離包含在Ciphergen的ProteinChipSystems(Ciphergen Biosystems，Inc.Fremont，California，USA)中。
盡管親和捕獲激光解吸電離技術(shù)已解決了現(xiàn)有技術(shù)的許多問題，但困難依然存在。
當(dāng)將此方法用于捕獲來自生物樣品的蛋白質(zhì)時，通常會看到大約捕獲了一皮摩爾的蛋白質(zhì)用于隨后的分析。通常，在色譜儀表面生物芯片上的親和捕獲不會得到完全的純化。另外，與自由溶液或2-D凝膠的變性環(huán)境中進(jìn)行的消化(digest)相比，固相萃取的樣品所見的消化效率更差。因此，如果大約50％為我們所感興趣的蛋白質(zhì)，并且成功地消化了該蛋白質(zhì)中的10％的話，那么至多也只有大約50飛摩爾的一些肽可用于探測。
利用數(shù)據(jù)庫采掘?qū)嶒炛信Ｌデ虻鞍椎奶摂M胰島素消化，已經(jīng)表明，例如，即使具有極高的精度1.0ppm(大多數(shù)MS技術(shù)現(xiàn)在還無法達(dá)到的水平)，當(dāng)檢索這個復(fù)雜的真核狀態(tài)基因組時，用單個肽質(zhì)量只能獲得可信度差的蛋白質(zhì)ID匹配。對于兩個肽，也只能獲得低可信度的結(jié)果。只有在給出三個肽時，才能為質(zhì)量分配返回小于300ppm誤差的可信結(jié)果。在此情形中，大多數(shù)設(shè)備都需要內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)校正。然而，對于五個或更多個肽，無法進(jìn)一步給出質(zhì)量精度好于1000ppm誤差的可信度。
此外，當(dāng)同時消化多個蛋白質(zhì)時，創(chuàng)建了一個異質(zhì)肽池，并且成功的數(shù)據(jù)庫采掘不僅需要極高的精度，而且在很多情況下還需要初級序列信息。串聯(lián)MS/MS方法在給出初級序列信息方面表現(xiàn)出了很大的可用性。Biemann et al.，Acc.Chem.Res.27370-378(1994)；Spengler et al.，Rapid Commun.Mass Spectrom.1991，5198-202(1991)；Spengler et al.，Rapid Commun.Mass Spectrom.6105-108(1992)；Yates et al.，Anal.Chem.671426-1436(1995)；Kaufman et al.，Rapid Commun.Mass.Spectrom.7902-910(1993)；Kaufman et al.，Intern.J.Mass Spectrom.Ion Processes 131355-385(1994)。
然而，直到最近，基于激光解吸的分析所可用的MS/MS方法只有源后衰變分析(PSD)。雖然PSD能夠?qū)ζつ柫考壍碾慕o出合理的序列信息，碎片處理的整個效率也很低；當(dāng)與該方法中常出現(xiàn)的差質(zhì)量精度和靈敏度結(jié)合時，極大地限制了它分析親和捕獲激光解吸電離探針上常出現(xiàn)的低豐度肽的能力。最近，發(fā)展了一種激光解吸電離四極飛行時間質(zhì)譜儀(LDI Qq-TOF)，它能夠進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)分離(CID)MS/MS分析。Krutchinksy et la.，Rapid Commun.MassSpectrom.12508-518(1998)。
因此，需要能夠提高親和捕獲激光解吸質(zhì)譜分析的靈敏度和質(zhì)量精度的設(shè)備和方法。需要能夠提高針上消化效率、并能使蛋白質(zhì)的非同質(zhì)混合物的消化所產(chǎn)生的肽易于分辨的方法和設(shè)備。需要能夠提高親和捕獲激光解吸串聯(lián)質(zhì)譜分析的效率的設(shè)備和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是給出提高現(xiàn)有的親和捕獲激光解吸電離質(zhì)譜儀分析的靈敏度、質(zhì)量精度、質(zhì)量分辨率，并加入ms/ms能力。本發(fā)明的又一個目的是給出使用這些改進(jìn)的分析能力的生物分子分析的方法。
本發(fā)明通過給出——在第一方面——一種分析儀器來滿足這些和其它目的以及技術(shù)中的要求。
本發(fā)明的分析儀器包括激光解吸電離源，親和捕獲探針接口，以及串聯(lián)質(zhì)譜儀，其中親和捕獲探針接口能夠嚙合親和捕獲探針并定位該探針以使它在與串聯(lián)質(zhì)譜儀相聯(lián)系時能接收激光解吸源的查詢(interrogate)，從而使從探針上解吸的離子進(jìn)入質(zhì)譜儀。
通常，激光解吸電離源包括激光激發(fā)源和激光光學(xué)系統(tǒng)；激光光學(xué)系統(tǒng)用于將受激光子從激光激發(fā)源送至探針接口。在這樣的實施方案中，激光光學(xué)系統(tǒng)通常傳遞受查詢探針表面平方毫米上大約20-1000微焦耳的能量。
激光激發(fā)源通常為連續(xù)激光器和脈沖激光器之一，在各種實施方案中，選自下列氮氣激光器、NdYAG激光器、摻鉺YAG激光器，以及CO2激光器。在具體實施方案中，激光激發(fā)源為脈沖氮氣激光器。
在一組實施方案中，激光光學(xué)系統(tǒng)包括選自下面的光學(xué)元件透鏡、反射鏡、棱鏡、衰減器，以及分束器。
在一組替換實施方案中，激光光學(xué)系統(tǒng)包括具有輸入端和輸出端的光纖，激光激發(fā)源與所述光纖輸入端耦合。
在一些光纖激光光學(xué)系統(tǒng)實施方案中，激光光學(xué)系統(tǒng)還包括光學(xué)衰減器。衰減器可置于激光激發(fā)源和光纖輸入端之間，可用來將激光激發(fā)源與光纖輸入端耦合，或可置于光纖輸出端和探針之間。
在某些光纖光學(xué)系統(tǒng)實施方案中，光纖輸出端的直徑在大約200-400μm之間，而輸入端的直徑在大約400至1200μm之間。
分析儀器還可包括探針觀察光學(xué)系統(tǒng)，以在探針接口的嚙合之后可看見探針。
在某些實施方案中，激光光學(xué)系統(tǒng)可包括激光耦合器，用于將激光激發(fā)源與光纖輸入端耦合。正如上面所提到過的，耦合器可用作光學(xué)衰減器。在其它實施方案中，耦合器可用來提高探針在探針接口中的嚙合之后的可視性。
在后面這些實施方案的某些中，耦合器和光纖都是分叉的，分散了一部分來自所述激光激發(fā)源的能量。作為選擇，這樣的分叉可導(dǎo)入可見光來照亮解吸位置。
對于在光學(xué)系統(tǒng)中包括可視化光學(xué)系統(tǒng)的，或者含有光纖的激光光學(xué)系統(tǒng)包括分叉或三分叉的，分析儀器可進(jìn)一步包括探測來自所述探針的反光的CCD相機。
在典型實施方案中，親和捕獲探針接口包括能夠可逆嚙合親和捕獲探針的探針固定器。接口通常還包括探針引入口，其本身能可逆嚙合探針固定器。
在典型實施方案中，探針接口進(jìn)一步包括探針位置傳動組件和接口離子收集系統(tǒng)。當(dāng)探針固定器嚙合在引入口中時，它與探針位置傳動器相接觸；反過來，探針位置傳動器能夠相對于激光電離源(通常，相對于激光光學(xué)系統(tǒng))和離子收集系統(tǒng)移動探針固定器(通常和其所嚙合的探針一起)將其定位。在典型實施方案中，傳動器能夠平移和旋轉(zhuǎn)所述探針固定器將其定位。
探針接口通常還包括與探針引入口耦合的抽真空系統(tǒng)，使探針在次大氣壓下被激光解吸電離源查詢。
本發(fā)明的分析儀器包括串聯(lián)質(zhì)譜儀，在各種實施方案中，它選自下列QqTOF MS、離子陷阱MS、離子陷阱TOP MS，以及傅立葉變換離子回旋共振MS。在本發(fā)明的分析儀器中具體所用的為QqTOFMS。
在具體實施方案中，串聯(lián)質(zhì)譜儀為QqTOF MS而激光激發(fā)源為脈沖氮氣激光器，探針處的激光流量為大約2至4乘以最小解吸閾值，串聯(lián)質(zhì)譜儀的外標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量精度為大約20-50ppm。
本發(fā)明的分析儀器設(shè)計為與親和捕獲激光解吸電離探針嚙合。因此，上述實施方案中的任何一個都可包括嚙合在親和捕獲探針接口中的親和捕獲探針。
在這些實施方案中的親和捕獲探針通常將具有至少一個樣品吸取表面，該表面與激光源處于可查詢關(guān)系，樣品吸取表面選自下列色譜吸取表面和生物分子親和表面。通常，色譜吸取表面選自下列反相、陰離子交換、陽離子交換、固定化金屬親和捕獲以及混合模式表面；而生物分子親和表面的生物分子選自下列抗體、受體、核酸、外源凝集素、酶、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、Staph蛋白A和Staph蛋白G。
親和捕獲激光解吸電離探針可具有許多可分別尋址的樣品吸取表面，它們可與激光源處于可查詢關(guān)系，可包括至少兩個不同的吸取表面。
在其它實施方案中，本發(fā)明的分析儀器包括與串聯(lián)質(zhì)譜儀的探測器相連的數(shù)字計算機。在一些實施方案中，分析儀器還可進(jìn)一步包括可由該數(shù)字計算機執(zhí)行的軟件程序，或者存在計算機中，或者可以被計算機訪問。在這樣的實施方案中的軟件程序能夠控制激光解吸電離源，或能夠控制串聯(lián)質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)采集的至少一個方面，或者能夠?qū)λ龃?lián)質(zhì)譜儀所采集的數(shù)據(jù)執(zhí)行至少一個分析程序，或者這些功能的任何子集。
在另一方面，本發(fā)明給出用于分析至少一個測試蛋白質(zhì)的方法。
該方法包括(a)在親和捕獲蛋白質(zhì)生物芯片上捕獲測試蛋白質(zhì)，(b)利用蛋白水解劑在蛋白質(zhì)生物芯片上產(chǎn)生測試蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物；(c)用串聯(lián)質(zhì)譜儀分析至少一塊蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物。在這個方面的這些實施方案中，分析步驟包括(i)從蛋白質(zhì)生物芯片上將蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物解吸成為氣相，以產(chǎn)生相應(yīng)的母體離子肽，(ii)用第一質(zhì)譜儀選擇用于隨后的碎裂的母體離子肽，(iii)在氣相中將選定的母體離子肽在選定碎裂條件下進(jìn)行碎裂以產(chǎn)生產(chǎn)物離子碎片，以及(iv)生成產(chǎn)物離子碎片的質(zhì)譜。在此方式中，質(zhì)譜提供了測試蛋白質(zhì)的分析。
在本發(fā)明這一方面的某些實施方案中，該方法進(jìn)一步包括一個附加步驟(d)，通過將質(zhì)譜提交給蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫采掘協(xié)議為一個測試蛋白質(zhì)確定至少一個蛋白質(zhì)身份候選，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫采掘協(xié)議根據(jù)質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)理論質(zhì)譜之間的擬合嚴(yán)密度的測量，在數(shù)據(jù)庫中為測試蛋白質(zhì)鑒定至少一個蛋白質(zhì)身份候選。
在這些實施方案的特別實施方案中，步驟(d)進(jìn)一步包括將測試蛋白質(zhì)的質(zhì)量和測試蛋白質(zhì)的原始核素提交給協(xié)議。
在其它實施方案中，該方法進(jìn)一步包括(e)將身份候選與測試蛋白質(zhì)通過如下方式進(jìn)行比較(i)生成(b)的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物的質(zhì)譜；(ii)將蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物的質(zhì)譜提交給計算機協(xié)議，該協(xié)議確定身份候選的被預(yù)測為通過使用蛋白水解劑能生成的分解產(chǎn)物的理論質(zhì)譜與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物的質(zhì)譜之間的擬合嚴(yán)密度的測量，從而該測量指示出蛋白質(zhì)生物芯片上相應(yīng)于測試蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物。
本發(fā)明的其它實施方案進(jìn)一步包括步驟(f)，重復(fù)步驟(c)，其中選定的母體離子肽不相應(yīng)于從身份候選所預(yù)測的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物；然后(g)，對(f)選定的母體離子肽重復(fù)(d)。
在本發(fā)明的這一方面，測試蛋白質(zhì)可以是在第一和第二生物樣品間不同地表達(dá)的蛋白質(zhì)。在這些實施方案的一些中，第一和第二生物樣品來自正常的和病態(tài)的來源。
在第三方面，本發(fā)明給出表征第一和第二分子結(jié)合配偶體(binding partner)之間結(jié)合作用的方法。
在這方面，該方法包括將第二結(jié)合配偶體與第一結(jié)合配偶體結(jié)合在一起，其中所述第一結(jié)合配偶體固定在激光解吸電離探針的表面上；碎裂第二結(jié)合配偶體；然后用串聯(lián)質(zhì)譜儀測量探測至少一塊碎片，由此所探測到的碎片的質(zhì)譜表征了結(jié)合作用。
在本發(fā)明這一方面的某些實施方案中，第一結(jié)合配偶體在第二結(jié)合配偶體結(jié)合到第一結(jié)合配偶體上之前首先固定到親和捕獲探針的表面上。
這樣的固定可通過將第一配偶體直接結(jié)合到親和捕獲探針——例如共價鍵合——來進(jìn)行。典型的共價鍵合實施方案包括第一結(jié)合配偶體的胺與所述探針表面的羰基二咪唑組成部分(carbonyldiimidazole moiety)之間的共價鍵合以及所述第一結(jié)合配偶體的氨基或硫醇基與探針表面的環(huán)氧基之間的共價鍵合。
固定還可通過直接的非共價鍵合來進(jìn)行，例如第一結(jié)合配偶體與探針表面的金屬——例如金或鉑——之間的配位(coordinate)或配價(dative)鍵合。固定還可通過第一結(jié)合配偶體與色譜吸取表面的相互作用來進(jìn)行，色譜吸取表面選自下列反相、陰離子交換、陽離子交換、固定化金屬親和捕獲以及混合模式表面。
作為選擇，固定可以是間接的，雖然是間接的，但也可以是共價的。在后面這些實施方案中的某些中，第一結(jié)合配偶體可由共價鍵合通過銜接物——例如可裂解銜接物——來固定。間接固定也可以是非共價的，例如通過生物素/抗生物素蛋白、生物素/抗生蛋白鏈菌素相互作用固定到探針上。
在本發(fā)明的這一方面，第一分子結(jié)合配偶體可選自下列蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物，以及脂類。通常，第一結(jié)合配偶體是蛋白質(zhì)，可以是有機體上自然存在的蛋白質(zhì)，所述有機體可選自下列多細(xì)胞真核生物、單細(xì)胞真核生物、原核生物，以及病毒；或者是非自然存在的蛋白質(zhì)，例如重組融合蛋白質(zhì)。
在第一結(jié)合配偶體為蛋白質(zhì)的實施方案中，蛋白質(zhì)可選自下列抗體、受體、轉(zhuǎn)錄因子、骨架(cytoskeletal)蛋白質(zhì)、細(xì)胞周期蛋白質(zhì)，以及核糖體蛋白質(zhì)，等等。
第二結(jié)合配偶體與固定化第一結(jié)合配偶體的結(jié)合通過——在典型實施方案中——將第一結(jié)合配偶體與生物樣品接觸來實現(xiàn)；樣品可以是選自下列的液體血液、淋巴、尿液、腦脊髓液、滑液、乳汁、唾液、玻璃體、眼房水、粘液以及精液，或者細(xì)胞溶解產(chǎn)物，或者另一形式的樣品。
在各種實施方案中，包括第一結(jié)合配偶體為蛋白質(zhì)的實施方案，第二結(jié)合配偶體都可以是蛋白質(zhì)。作為選擇，第二結(jié)合配偶體可以是存在于組合庫中的化合物，其中第二結(jié)合配偶體與第一結(jié)合配偶體的結(jié)合通過將第一結(jié)合配偶體與化學(xué)合成組合庫的等分試樣(aliquot)接觸來實現(xiàn)。在其它替換方案中，第二結(jié)合配偶體可以是生物表達(dá)(biologically displayed)組合庫的某一成分，例如噬菌體表達(dá)庫。
在某些典型實施方案中，碎裂通過將第二結(jié)合配偶體與酶接觸來實現(xiàn)；其中第二結(jié)合配偶體為蛋白質(zhì)，酶通常為內(nèi)蛋白酶(endoprotease)，例如胰島素、Glu-C(V8)蛋白酶、內(nèi)蛋白酶Arg-C(絲氨酸蛋白酶)、Asn-N蛋白酶，以及Lys-C蛋白酶。作為選擇，碎裂可通過將所述第二結(jié)合配偶體與液相化學(xué)制品——例如CNBr——接觸來實現(xiàn)。
在一些實施方案中，該方法進(jìn)一步包括在第二結(jié)合配偶體與第一結(jié)合配偶體結(jié)合之后，在碎裂第二結(jié)合配偶體之前，使第二結(jié)合配偶體改變性質(zhì)。
在各種實施方案中，該方法進(jìn)一步包括如下步驟在碎裂第二結(jié)合配偶體之后，用第一洗脫液清洗探針，有時用第二洗脫液，第二洗脫液與第一洗脫液至少有一個洗脫特性不同，例如pH、離子強度、去污強度，以及疏水性。
在典型實施方案中，該方法進(jìn)一步包括在碎裂第二結(jié)合配偶體之后，探測第二結(jié)合配偶體的碎片之前，對探針施用能量吸收分子。在具體實施方案中，探針隨后被嚙合在本發(fā)明的分析儀器的親和捕獲探針接口中，利用儀器的激光源將第二結(jié)合配偶體的碎片電離并從探針上解吸。
在本方法中，該儀器可以用來進(jìn)行若干類有用的測量，包括所有離子質(zhì)量的測量、部分碎片質(zhì)量的測量，以及單離子監(jiān)控測量。
有用地，該方法的實施方案包括在第二結(jié)合配偶體的碎片的質(zhì)譜測量之后，將碎片測量結(jié)果與將碎裂酶的分解規(guī)則用到第二結(jié)合配偶體的初始氨基酸序列上所預(yù)測的結(jié)果相比較，從而，這樣的比較表征了分子間作用。
如果第二結(jié)合配偶體的身份未知，則該方法可進(jìn)一步包括在比較之前，通過ms/ms分析鑒定第二結(jié)合配偶體。這樣的MS/MS分析可包括如下步驟用質(zhì)譜選擇第二結(jié)合配偶體的第一碎片；在氣相中分離第二結(jié)合配偶體的第一碎片；測量第二結(jié)合配偶體第一碎片的碎片譜，然后將該碎片譜與預(yù)先添加在數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列數(shù)據(jù)所預(yù)測的碎片譜相比較。氨基酸序列數(shù)據(jù)可以是經(jīng)驗和預(yù)測數(shù)據(jù)之一，而在典型實施方案中，分離為碰撞誘導(dǎo)分離。
在該方法的一些實施方案中，第一結(jié)合配偶體選自下列抗體、T細(xì)胞受體，以及MHC分子。在其它實施方案中，第一結(jié)合配偶體選自下列受體激動劑、受體部分激動劑、所述受體的拮抗劑，以及所述受體的部分拮抗劑。在其它實施方案中，第一結(jié)合配偶體為糖蛋白受體而第二結(jié)合配偶體為外源凝集素。
在第四方面中，本發(fā)明給出探測分析物的方法，該方法包括將親和捕獲探針嚙合在本發(fā)明的分析儀器的親和捕獲探針接口中，親和捕獲探針上結(jié)合了分析物；利用儀器的激光源解吸并電離來自探針的分析物或其碎片；然后通過用串聯(lián)質(zhì)譜儀測量解吸離子來探測分析物。
在這一方面，該方法可進(jìn)一步包括在解吸和電離步驟之后，探測之前，進(jìn)行所述解吸離子的碰撞誘導(dǎo)分離。在這樣的分離之前，在一些實施方案中，可選擇一部分離子用于碰撞分離。
在其它實施方案中，可在此之前進(jìn)行將分析物吸取到探針上的步驟，而在又一些另外的實施方案中，在吸取分析物之后、將所述探針嚙合到所述探針接口中之前，用能量吸收分子接觸探針和分析物。


在下面的詳細(xì)描述和附圖中將闡明本發(fā)明上述和其它目的與優(yōu)點，在附圖中，相似的符號表示相似的部分，其中圖1粗略示出本發(fā)明分析儀器的一個實施方案；
圖2更詳細(xì)地示出具體用于本發(fā)明分析儀器中的正交QqTOF串聯(lián)質(zhì)譜儀的零件；圖3顯示一個BPH和前列腺癌患者的精液蛋白質(zhì)剖析圖；圖4示出在圖3中可探測的上調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中某個的針上分離結(jié)果；圖5示出利用胰島素對富集生物標(biāo)記候選進(jìn)行在位消化之后由MS分析的單相所探測到的肽；圖6示出本發(fā)明分析設(shè)備上同樣的純化蛋白質(zhì)肽的LDI Qq-TOF MS分析；以及圖7示出濃縮標(biāo)記候選的選定的二價離子由本發(fā)明的分析設(shè)備所得的MS/MS結(jié)果。
具體實施例方式
I.定義在此處，以下面特性提出的術(shù)語具有如下定義。如果沒有另外定義，那么此處所用的所有術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員所通常理解的含義。
“分析物”指要探測的樣品的任何成分。該術(shù)語可指樣品中單個成分或許多成分。
“探針”指一種設(shè)備，當(dāng)與激光解吸電離源以可查詢關(guān)系嚙合，并同時在大氣壓或次大氣壓下與氣相離子譜儀相聯(lián)時，它可用于將來自分析物的離子引入質(zhì)譜儀。此處，“探針”通常都可由探針接口可逆嚙合。
“親和捕獲探針”指一種探針，通過足夠使探針從非同質(zhì)混合物中萃取并濃縮分析物的相互作用來結(jié)合分析物。濃縮為純凈物并無必要。結(jié)合作用通常以探針吸取表面對分析物的吸取來進(jìn)行。術(shù)語ProteinChipArray指可從Ciphergen Biosystems，Inc.，F(xiàn)remont，California購買的親和捕獲探針，用于本發(fā)明中。
“吸取”指分析物在吸取劑上可探測的非共價結(jié)合。
“吸取劑”指任何能夠吸取分析物的材料。術(shù)語“吸取劑”用于此處指單種材料(“單吸取劑”)(例如化合物或功能基)和許多不同材料(“復(fù)合吸取劑”)。復(fù)合吸取劑中的吸取劑材料稱作“吸取物質(zhì)(adsorbent species)”。例如，探針襯底上的激光定位吸取表面可包括特征在于許多不同吸取物質(zhì)(例如，陰離子交換材料、金屬螯合劑或抗體)具有不同結(jié)合特性的復(fù)合吸取劑。
“吸取表面”指具有吸取劑的表面。
“色譜吸取表面”指具有能夠色譜鑒別分析物或分離分析物的吸取劑的表面。這樣該短語包括具有陰離子交換組成部分(moieties)、陽離子交換組成部分、反相組成部分、金屬親和捕獲組成部分，以及混合模式吸取劑的表面，就像在色譜技術(shù)中這些術(shù)語所被理解的那樣。
“生物分子親和表面”指這樣一種表面，它具有包括能夠進(jìn)行特異結(jié)合的生物分子的吸取劑。
“特異結(jié)合”指同時出現(xiàn)在異質(zhì)(非同質(zhì))樣品中的兩類分子的互相鍵合優(yōu)先于和樣品中其它類分子鍵合的能力。通常，特異結(jié)合作用以至少兩倍——更通常地，大于10至100倍——鑒別反應(yīng)中偶然的結(jié)合作用。當(dāng)用于探測分析物時，特異結(jié)合足以進(jìn)行鑒別何時異質(zhì)(非同質(zhì))樣品中的分析物出現(xiàn)的決定性。通常，特異結(jié)合反應(yīng)的親和或親和力為至少大約10-7M，具有更大特定性的特異結(jié)合反應(yīng)通常具有至少10-8M到至少10-9M的親和或親和力。
“能量吸收分子”以及等效縮寫“EAM”指附著到探針上時，能從激光解吸電離源吸收能量，并用于與其相接觸的分析物的解吸和電離的分子。該短語包括在U.S Patent Nos.5,719,060，5,894,063，6,020,208以及6,027,943中所稱的所有分子，這些專利的公開在此處全部引作參考。該短語明確地包括肉桂酸衍生物、sinapinic酸(“SPA”)、氰羥肉桂酸(cyano hydroxyl cinnamic acid)(“CHCA”)以及二羥基苯甲酸(dihydroxybenzoic acid)。
“串聯(lián)質(zhì)譜儀”指任何能夠執(zhí)行離子混合物中離子的基于兩次級m/z的鑒別的氣相離子譜儀。該短語包括具有兩個質(zhì)量分析儀的譜儀，以及那些具有單個質(zhì)量分析儀、能夠在質(zhì)量分析之前進(jìn)行離子的選擇采集和保留的譜儀。這樣該短語明確地包括QqTOF質(zhì)譜儀、離子陷阱質(zhì)譜儀、離子陷阱TOF質(zhì)譜儀、TOF-TOF質(zhì)譜儀，以及傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀。
“洗脫液”指用于影響或改變吸取表面的吸取劑對分析物的吸取的制劑，通常為溶液。洗脫液在這里也指“選擇閾值調(diào)節(jié)劑”。
“洗脫特性”指洗脫液的對其影響或改變吸取表面的吸取劑對分析物的吸取的能力有貢獻(xiàn)的物理或化學(xué)特性。當(dāng)兩種洗脫液與分析物和吸取劑接觸時，如果對吸取劑來說分析物的親和度不同，那么就說這兩種洗脫液具有不同的洗脫特性。洗脫特性包括，例如，pH、離子強度、無序度、去污強度，以及溫度。
“生物樣品”指來自能夠復(fù)制的有機體上至少一部分的樣品。在此處，生物樣品可來自任何已知的分類領(lǐng)域，包括病毒、原核生物、單細(xì)胞真核生物以及多細(xì)胞真核生物。生物樣品可來自整個有機體或其一部分，包括其人工培養(yǎng)的部分。生物樣品可以是任何合乎情況的物理形式，包括均勻混合物、亞細(xì)胞片斷、溶解產(chǎn)物以及流體。
“生物分子”指可以在生物樣品中找到，但并不一定必須來自生物樣品的分子。
“有機生物分子”指可以在生物樣品中找到，但不一定必須來自生物樣品的有機分子，例如類固醇、氨基酸、核苷酸、糖、多肽、多核苷酸、合成碳水化合物以及脂類。
“小型有機分子”指尺寸可與醫(yī)藥品中常用的有機分子相比的有機分子。該術(shù)語不包括有機生物高分子聚合物(例如蛋白質(zhì)、核酸等)。這里所用的小型有機分子在尺寸上通常不超過大約5000Da、不超過大約2500Da、不超過大約2000Da，或不超過大約1000Da。
“生物高分子聚合物”指可以在生物樣品中找到，但不一定必須來自生物樣品的聚合物，例如多肽、多核苷酸、多糖以及聚甘油脂(例如，甘油二酸脂或甘油三酸脂)。
“碎片”脂分析物的化學(xué)產(chǎn)物、酶促產(chǎn)物或物理分解產(chǎn)物。碎片可以是中性狀態(tài)或離子狀態(tài)。
術(shù)語“多肽”、“肽”以及“蛋白質(zhì)”用于此處可互相替換，指包含氨基酸單體(殘基)的可自然獲得的或人工合成的聚合物，其中這里的氨基酸單體包括可自然獲得的氨基酸、可自然獲得的氨基酸結(jié)構(gòu)變體，以及能夠參與肽鍵的人工合成相似物(analog)?？赏ㄟ^，例如加入碳水化合物殘基，改變多肽以形成糖蛋白質(zhì)。術(shù)語“多肽”、“肽”以及“蛋白質(zhì)”包括糖蛋白質(zhì)以及非糖蛋白質(zhì)。
“多核苷酸”和“核酸”等價，指可自然獲得的或人工合成的包含核苷酸單體(基)。多核苷酸包括可自然獲得的核酸，例如脫氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)，以及核酸相似物。核酸相似物包括那些包括非自然獲得的堿基的，還包括那些核苷酸單體不是通過可自然獲得的磷酸二酯酶鍵相連的。核苷酸相似物包括，舉例來說但不局限于此，phosphorothioate、phosphorotriester、磷酰胺化物(phosphoramidate)、硼烷磷酸鹽(boranophosphate)、甲基磷酸鹽(methylphosphonate)、手性甲基磷酸鹽(chiral-methylphosphonate)、2-O-甲基核糖核酸、肽-核酸(PNA)，等等。
在此處，“分子結(jié)合配偶體”——以及等價的“特異結(jié)合配偶體”——指顯示出特異結(jié)合的分子對，通常為有機分子對。非局限實施例有受體和配體、抗體和抗原、生物素和抗生物素蛋白，以及生物素和抗生蛋白鏈菌素。
“受體”指可以在生物樣品中找到，但并不一定必須來自生物樣品，并且能參與和配體的特異結(jié)合的分子，通常為大分子。該術(shù)語進(jìn)一步包括保留與特定配體結(jié)合能力的碎片和衍生物。
“配體”指任何能參與和指定的受體和抗體的特異結(jié)合的化合物。
“抗體”指基本上由至少一種免疫球蛋白基因或至少一種免疫球蛋白基因的碎片編碼、能參與和配體的特異結(jié)合的多肽。該術(shù)語包括可自然獲得的形式，以及碎片和衍生物。此處所用的該術(shù)語范圍內(nèi)的碎片包括那些用各種肽酶——例如Fab、Fab’以及F(ab)’2碎片——消化的、那些由化學(xué)分離、化學(xué)分解以及重組產(chǎn)生的，只要這些碎片保留了與目標(biāo)分子進(jìn)行特異結(jié)合的能力。通過，例如噬菌體表達(dá)，產(chǎn)生的典型重組碎片包括單鏈Fab和scFv(“單鏈可變區(qū)”)碎片。該術(shù)語領(lǐng)域中的衍生物包括按序重組但保留了與靶分子進(jìn)行特異結(jié)合能力的抗體(或其碎片)，包括種間嵌合抗體以及人源抗體。由于此處，抗體可使用任何已知技術(shù)來產(chǎn)生，包括來自天然B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的收獲物、雜種細(xì)胞、重組表達(dá)系統(tǒng)、噬菌體表達(dá)，等等。
“抗原”指可被抗體結(jié)合的配體?？乖瓱o需是可產(chǎn)生免疫性的?？乖吓c抗體接觸的部分稱為“抗原決定簇”。
“流量”指受查詢圖像單位面積通過的能量。
II.親和捕獲探針串聯(lián)質(zhì)譜儀在第一方面，本發(fā)明給出一種分析儀器，結(jié)合了親和捕獲激光解吸電離樣品導(dǎo)引的優(yōu)點和高精度、高質(zhì)量分辨率的串聯(lián)質(zhì)譜儀的優(yōu)點。這一組合給出顯著優(yōu)于現(xiàn)有進(jìn)行已知技術(shù)的設(shè)備的優(yōu)點。此外，新設(shè)備使發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的新方法成為可能，還使鑒定和表征特異結(jié)合配偶體之間分子作用的比現(xiàn)有方法更塊更有效且更靈敏的新方法。下面將首先簡略地整體描述該儀器，然后，將更詳細(xì)地描述親和捕獲探針接口的特點。
簡要地，參看圖1，儀器100包括激光解吸/電離源13；親和捕獲探針接口10，以及串聯(lián)質(zhì)譜儀14。圖1中所示的為具體實施方案，其中激光源12為脈沖氮氣激光器，而串聯(lián)質(zhì)譜儀14是正交四極飛行時間質(zhì)譜儀(QqTOF)串聯(lián)MS。
激光解吸/電離源激光解吸/電離源13產(chǎn)生激發(fā)光子，經(jīng)過適當(dāng)調(diào)節(jié)和對準(zhǔn)，這些光子解吸并電離粘附在親和捕獲探針16上的蛋白質(zhì)和其它分析物。激光解吸/電離源13包括激光源12、激光光學(xué)系統(tǒng)11，以及可選的探針觀察光學(xué)系統(tǒng)18。
激光解吸/電離源13通過使用脈沖激光器12，或者——作為選擇——通過利用機械或電子斬波來自連續(xù)激光器12的光束來產(chǎn)生脈沖激光能量。通常，優(yōu)選脈沖激光器。具體的脈沖激光源包括氮氣激光器、NdYAG激光器、摻鉺YAG激光器，以及CO2激光器。本發(fā)明具體所用的為氮氣激光器，因其簡單的覆蓋區(qū)和相對較低的成本。
從激光器12發(fā)射的光子被激光光學(xué)系統(tǒng)11引導(dǎo)撞擊探針16的表面。光學(xué)系統(tǒng)11可由透鏡、反射鏡、棱鏡、衰減器，和/或分束器排列組成，分束器用于收集、引導(dǎo)、聚焦、細(xì)分并控制每個激光脈沖的強度，從而將解吸能量的聚焦斑點形式的適當(dāng)解吸流量傳給探針16。
作為選擇，光學(xué)系統(tǒng)11也可由用于收集、引導(dǎo)并細(xì)分每個激光脈沖的能量的光纖光學(xué)系統(tǒng)陣組成。
在本實施方案中，利用光學(xué)耦合器將激光器12的輸出耦合進(jìn)光纖的輸入側(cè)；耦合器通常由焦距和直徑適合于光纖的輸入數(shù)值孔徑的透鏡組成。
進(jìn)入光纖的能量總量可通過謹(jǐn)慎調(diào)節(jié)透鏡相對于光纖的位置來控制；在這種情況下，光纖光學(xué)耦合器可兼作光學(xué)衰減器。在另一具體排列中，激光器的所有輸出能量都耦合進(jìn)光纖中，在光纖的輸出側(cè)和光學(xué)系統(tǒng)的解吸點聚焦元件之間放置一個衰減器。在又一具體排列中，在激光器和光纖耦合器之間放置一個光學(xué)衰減器。在所有情況中，都使用光學(xué)衰減來保證向探針16的表面?zhèn)魉秃线m的激光流量，而不依賴于激光器12的輸出能量。典型的激光流量為20-1000微焦/平方毫米量級。
眾所周知，當(dāng)接收來自激光的聚焦能量時，光纖光學(xué)元件常會受到損傷，因此，使光纖輸入側(cè)的接收面積最大化是有利的，這樣，入射激光能量的流量就低于光纖的損傷閾值。后者在調(diào)節(jié)光學(xué)耦合器相對于激光器和光纖的相對位置時，還簡化了激光束和光纖的對準(zhǔn)。然而，為了在探針16上得到適當(dāng)?shù)慕馕髁克剑?dāng)與最大輸出能量大約為200μJ/激光脈沖的氮氣激光器一起使用時，輸出側(cè)光纖直徑不應(yīng)超過400μm(微米)。可以通過引入錐形光纖來解決這一問題，錐形光纖的輸入側(cè)直徑為400至1200微米量級，而輸出側(cè)直徑為200至400微米。
通常，解吸點應(yīng)當(dāng)聚焦至一個使每個脈沖查詢探針16上最大的面積來產(chǎn)生最多的離子同時保持足夠的流量來誘導(dǎo)解吸和電離的尺寸。當(dāng)在與四極-四極飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀耦合的激光解吸/電離源中使用最大輸出能量大約為200μJ/脈沖的典型氮氣激光器時，已確定優(yōu)化激光點的面積在0.4至0.2平方毫米之間。
激光解吸/電離源13可包括——通常作為光學(xué)系統(tǒng)11的一個組成部分——探針觀察光學(xué)系統(tǒng)18。觀察光學(xué)系統(tǒng)18可含有照明源、透鏡、反射鏡、棱鏡、分色鏡、帶通濾波器以及CCD相機，對解吸位置——即探針16上要被激光查詢的區(qū)域——進(jìn)行照明和觀察。
雖然激光光學(xué)系統(tǒng)11包括光纖，觀察光學(xué)系統(tǒng)18可利用來自它自己的光纖的光。
例如，光纖光學(xué)耦合器可分叉以將激光激發(fā)能量分出一小部分用于監(jiān)視施用的激光能量，或者也可以分叉以引入可見光來照亮解吸位置。
在這兩個實施方案中的第一個中，激發(fā)能量的一小部分被引導(dǎo)照射一個光探測器，這個探測器是激光能量電路的組成部分，激光能量電路被校準(zhǔn)以反映送至探針16的真實的總激光能量。在第二實施方案中，通過與CCD相機耦合的一套獨立的照相系統(tǒng)，或在光纖和激光激發(fā)源之間使用將光從光纖的主枝反射至CCD相機上的棱鏡或分色鏡，引入可見光來照亮解吸位置，使得對這一區(qū)域的觀察成為可能。作為選擇，可在光纖的照明枝和照明源之間排列一個棱鏡或分色鏡以使任何耦合進(jìn)這一枝的背反射圖像被引導(dǎo)照射CCD相機。在又一實施方案中，可將激光分叉，一枝傳送解吸/電離激光脈沖，第二枝傳送用于照亮解吸位置的可見光，而第三枝將來自解吸位置的反射光送至CCD相機。對于這些觀察方案中的每一個，都應(yīng)在CCD相機和觀察光學(xué)系統(tǒng)之間配置一個合適的帶通濾波器，以防止可能具有破壞性的高能光子通過，高能光子可以是入射到探針表面上的激光脈沖的直接反射，也可以是受入射激光脈沖激發(fā)而從探針表面上發(fā)射的二次光子。
探針接口親和捕獲探針接口10能夠可逆嚙合親和捕獲探針16，將探針16定位在激光源12可訪問的關(guān)系并與串聯(lián)質(zhì)譜儀14相連；該相連支持大氣壓至次大氣壓。
探針接口10包括探針固定器、探針引入口、探針定位傳動組件、真空和充氣組件，以及接口離子收集系統(tǒng)。
探針固定器為探針接口10的一個元件，其形狀符合探針16的形狀因數(shù)。探針16為ProteinChipArray(Ciphergen Biosystem，Inc.，F(xiàn)remont，CA USA)，故探針固定器符合ProteinChipArray的形狀因數(shù)。
探針固定器可支持單個探針16或許多探針16。固定器定位每個探針16使其相對于接口離子收集系統(tǒng)朝向適當(dāng)?shù)姆轿?，以便被激光解?電離源13訪問。
探針固定器與定位傳動組件緊密接觸。
傳動組件相對于激光解吸/電離源13和接口離子收集系統(tǒng)移動探針16的相對位置，從而探針的不同位置都可被訪問，照射產(chǎn)生的離子被收集以導(dǎo)入串聯(lián)質(zhì)譜儀14。
傳動器由電機械設(shè)備組成，電機械設(shè)備支持探針16的平移和旋轉(zhuǎn)移動同時保持探針相對于激光解吸/電離源和離子收集系統(tǒng)的位置不變。這樣的電機械設(shè)備包括——但不局限于——機械或光學(xué)位置傳感器、螺線管、步進(jìn)電機、直接或間接與直線運動傳動器相連的DC或AC同步電機、直線或環(huán)形運動導(dǎo)軌、萬向固定器、軸承或軸桿。
探針引入口使容納了探針16的探針固定器置于探針位置傳動組件上，而不會使過量大氣壓氣體進(jìn)入探針接口10和串聯(lián)質(zhì)譜儀14。
為了實現(xiàn)后者，探針引入口使用抽真空系統(tǒng)(探針引入口抽空系統(tǒng))來泵出大氣壓氣體，在將芯片移入工作位置之前獲得目標(biāo)入口壓力。在探針交換期間，探針傳動組件將探針從工作位置(與激光解吸源13和離子收集系統(tǒng)對準(zhǔn)的位置)移到交換位置。在這么做時，傳動器可將馬上就要升至大氣壓的交換口和質(zhì)譜儀入口之間密封。在密封質(zhì)譜儀入口之后，由探針引入口加壓系統(tǒng)將大氣壓氣體通入探針引入口。這消除了探針固定器大氣壓表面和引入口之間的壓力差，使探針固定器從探針位置傳動組件中移出。
在移出已分析探針16并裝入新探針16之后，探針固定器重新置入位置傳動器中，并開始樣品載入過程。正如前面所描述的，可利用抽空系統(tǒng)將探針引入口泵至次大氣壓。在獲得靶樣品引入壓力之后，探針傳動系統(tǒng)將探針16從交換位置移至工作位置，同時開啟質(zhì)譜儀入口的密封。
作為選擇，如果離子產(chǎn)生于支持于大氣壓下的解吸室中，并最終被導(dǎo)向?qū)㈦x子引入質(zhì)譜儀入口的離子光學(xué)組件，則無需抽空并加壓探針引入口，因為它被保持在大氣壓下。
探針引入口抽空系統(tǒng)由以下幾部分組成真空泵、壓力傳感器、真空兼容管和連接配件，以及真空兼容閥，當(dāng)它們協(xié)同運作時，這些真空兼容閥使得可以在樣品交換之后，對引入口中所含的大氣壓氣體進(jìn)行受控抽空，從而探針16可移入工作位置。真空泵可以是——但不局限于——單級或多級油機械泵、渦輪泵，或無油膜片泵。在優(yōu)選實施方案中，真空兼容閥為電控制螺管閥。在同一實施方案中，壓力傳感器為能夠在大氣壓至1毫托范圍內(nèi)工作的電子傳感器。這樣的壓力傳感器包括——但不局限于——熱電耦壓力計和熱壓力計(pirani計)。在同一實施方案中，在模擬邏輯電路或數(shù)字微處理器的邏輯控制下獲得了這一系統(tǒng)的協(xié)同工作，模擬邏輯電路或數(shù)字微處理器協(xié)調(diào)來自壓力計和位置傳感器的輸入以使樣品進(jìn)出口的自動抽空作為整個儀器操作的一部分。
探針引入口加壓系統(tǒng)由以下幾部分組成氣源、壓力傳感器、導(dǎo)氣管和配件，以及氣體兼容閥，當(dāng)它們協(xié)同運作時，這些氣體兼容閥對加壓交換口的氣體進(jìn)行受控引入，使探針固定器從傳動組件移開。
在某一實施方案中，氣源為未經(jīng)處理的大氣壓氣體。在另一實施方案中，氣源為首先通過水分吸收劑阱(moisture absorbent trap)然后可選地在進(jìn)入加壓系統(tǒng)之前通過顆粒過濾器的大氣壓氣體。在另一實施方案中，由干燥的不活潑的氣體——例如氮氣或任何節(jié)省成本的惰性氣體——提供加壓氣體，來代替使用大氣壓氣體。
在優(yōu)選實施方案中，導(dǎo)氣管、配件、一些閥門，以及加壓系統(tǒng)的壓力傳感器是抽空系統(tǒng)中所用的那些。在同一實施方案中，在模擬邏輯電路或數(shù)字微處理器的邏輯控制下獲得了這一系統(tǒng)的協(xié)同工作，模擬邏輯電路或數(shù)字微處理器協(xié)調(diào)來自壓力計和位置傳感器的輸入以使樣品進(jìn)出口的自動抽空作為整個儀器操作的一部分。
探針接口壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)用于提供解吸室中存在于探針的樣品當(dāng)前(吸取)表面和離子收集系統(tǒng)之間的選擇背景氣壓?？梢越邮艿慕馕覊毫Ψ秶诖髿鈮褐?.1微托之間。具體壓力范圍在1托至1毫托之間。探針接口壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)由以下幾部分組成氣源、導(dǎo)氣管和配件、氣流調(diào)節(jié)器，以及壓力傳感器。氣源可以是未經(jīng)處理的大氣壓氣體。在另一實施方案中，氣源為首先通過吸水劑阱然后可選地在進(jìn)入加壓系統(tǒng)之前通過顆粒過濾器的大氣壓氣體。在另一實施方案中，由干燥的不活潑的氣體——例如氮氣或任何節(jié)省成本的惰性氣體——純化源來提供調(diào)節(jié)氣體。氣流調(diào)節(jié)器可以是手動控制的限流器。作為選擇，可通過使用電子控制的限流器來進(jìn)行氣流調(diào)節(jié)。在具體實施方案中，在模擬邏輯電路或數(shù)字微處理器的邏輯控制下的自動方式中獲得具體解吸室壓力的閉環(huán)控制，模擬邏輯電路或數(shù)字微處理器主動與自動氣流調(diào)節(jié)器作用以獲得預(yù)建立的從壓力計的讀取。
接口離子收集系統(tǒng)由以下幾部分組成靜電離子收集組件、可選的氣動離子收集組件，以及靜電或RF離子導(dǎo)管(ion guide)。靜電離子收集組件由DC靜電透鏡元件的排列組成，DC靜電透鏡元件用于收集在解吸室中解吸的離子并將它們導(dǎo)向質(zhì)譜儀入口。
在某一實施方案中，該組件由兩個靜電元件組成。第一元件由探針固定器和探針表面組成，而第二元件為引出器透鏡。引出器透鏡安排在離列陣表面0.2至4mm遠(yuǎn)的地方。引出器透鏡包含一個直徑在2mm至20mm之間的小孔，這個小孔的圓心位于從解吸位置中心向質(zhì)譜儀入口中心延伸的垂直軸上。該組件的每個元件都被施以獨立的DC電位。
在優(yōu)選實施方案中，引出器透鏡距離列陣表面1mm，包含一個直徑10mm的小孔。在同一實施方案中，在引出器和列陣之間建立了十伏的電位差。
氣動離子收集組件由以下幾部分組成氣源、導(dǎo)管、管道連接器、氣流調(diào)節(jié)器、氣壓傳感器，以及氣體噴射口，從而可產(chǎn)生預(yù)定流量的氣體來幫助解吸室中的解吸離子向質(zhì)譜儀入口的批量轉(zhuǎn)移。
氣源可以是未經(jīng)處理的大氣壓氣體。在另一實施方案中，氣源為首先通過吸水劑阱然后可選地在進(jìn)入系統(tǒng)之前通過顆粒過濾器的大氣壓氣體。在另一實施方案中，由干燥的不活潑的氣體——例如氮氣或任何節(jié)省成本的惰性氣體——純化源來提離子收集氣體。
氣流調(diào)節(jié)器可以是手動控制的限流器。作為選擇，可通過使用電子控制的限流器來進(jìn)行氣流調(diào)節(jié)。壓力傳感器可以是——但不局限于——熱電耦壓力計和熱壓力計。氣體噴射口位于探針16后面，用于引導(dǎo)氣體環(huán)繞探針并沿位于解吸位置中心和質(zhì)譜儀入口中心的垂直軸向下運動。
在具體實施方案中，氣流處在模擬或數(shù)字控制電路系統(tǒng)的自動閉環(huán)控制之下，從而產(chǎn)生了精確的離子掃出流，而不會使解吸室超壓。
接口離子收集系統(tǒng)的最后一個元件為離子導(dǎo)管。離子導(dǎo)管用于將收集到的離子導(dǎo)入質(zhì)譜儀14。它可以是靜電的或RF的。一個具體實施方案為多極RF離子導(dǎo)管。后者的一個實施例為四極或六極離子導(dǎo)管。在下面將更詳細(xì)描述的具體Qq-TOF儀器中，離子導(dǎo)管為四極RF離子導(dǎo)管。通過分別由靜電和氣動離子收集系統(tǒng)產(chǎn)生的靜電或氣動加速力將離子導(dǎo)入離子導(dǎo)管。在具體實施方案中，離子導(dǎo)管的DC靜電勢通常比引出器透鏡的DC靜電勢低10至20伏。
串聯(lián)質(zhì)譜儀本發(fā)明的分析儀器進(jìn)一步包括串聯(lián)質(zhì)譜儀14。串聯(lián)質(zhì)譜儀14可有用地選自下列正交四極飛行時間(Qq-TOF)、離子陷阱(IT)、離子陷阱飛行時間(IT-TOF)、飛行時間-飛行時間(TOF-TOF)，以及離子回旋共振(ICR)。
本發(fā)明所具體應(yīng)用、并在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的是正交Qq-TOF MS。
QqTOF的主要長處在于顯著的質(zhì)量精度和分辨能力；對肽的高靈敏度和低的mw范圍；以及使用低能碰撞誘導(dǎo)分離(CID)而帶來的優(yōu)良ms/ms性能。從AB/MDS Sciex可購買到帶有電噴射電離源的正交QqTOF(QSTARTM；AB/MDS-Sciex，F(xiàn)oster City，California，USA)。
參考圖2，將粗略勾勒出QqTOF的原理和特征。
離子在第一四極透鏡“q0”之前的解吸室中產(chǎn)生。q0中的壓力通常保持在0.01至1托，但也可以保持在大氣壓。在該方式中，解吸離子在形成之后，通過與背景氣體的碰撞而迅速冷卻。
全體離子的冷卻或衰減提供了三個主要優(yōu)點。
第一，冷卻消除了解吸離子的初始能量分布并將它們的總能量降低到接近其熱能的一個點上。這簡化了正交引出的要求，補償了離子位置和能量的變化，從而提高了最后的分辨能力。分辨率提高的直接后果就是將質(zhì)量精度提高到了低ppm水平。
碰撞冷卻的第二個主要優(yōu)點在于其降低長期離子衰變速率的能力。氣體碰撞釋放了內(nèi)部激發(fā)并提高了肽和蛋白質(zhì)離子的穩(wěn)定性。當(dāng)在1托壓力的背景氣體中產(chǎn)生離子時，穩(wěn)定作用最大。其他人發(fā)表的測量指出，可實際消除小原子團(tuán)的丟失和背景碎片，提高了高mw蛋白質(zhì)和其它不穩(wěn)定生物高分子聚合物(即，糖苷化合物、DNA，等)的傳輸。更快的衰變機制(即時和源內(nèi)型衰變(prompt and in-sourcetype decay))依然會發(fā)生。
q0碰撞冷卻的最后一個優(yōu)點在于進(jìn)入質(zhì)量分析儀的偽連續(xù)離子流的產(chǎn)生。q0中的離子碰撞導(dǎo)致解吸云沿q0的軸鋪開。擴展產(chǎn)生了這樣一種情況，其中來自不同解吸事件的離子開始交迭，產(chǎn)生了離子進(jìn)入分析儀的電噴射類連續(xù)引入。
在穿過q0之后，離子進(jìn)入第二個四極22(“Q1”)。該四極用作離子導(dǎo)管或質(zhì)量過濾器。在這里，為ms/ms或單離子監(jiān)控(SIM)實驗建立離子選擇。
在離開Q1之后，離子進(jìn)入位于碰撞室26中的第三個四極24(“q2”)。在簡單實驗期間，q2作為簡單rf離子導(dǎo)管而工作。對于ms/ms實驗，q2充滿壓力大約為10-2托的碰撞氣體以促進(jìn)低能CID。
在離開q2之后，離子被q2出口和聚焦柵28之間的DC電位差稍稍加速。這一加速使離子的速度在Y軸上偏離了，從而它們的速度現(xiàn)在反比于其m/z的平方根。如果所有不同m/z的離子要在正交引出和自由飛行之后撞擊探測器的話，就必須實現(xiàn)這一偏離。如果這樣的偏離沒有實現(xiàn)，那么不同m/z的離子將以相同的Y軸速度進(jìn)入四極引出區(qū)。
由于總是在飛行時間中，較小m/z的離子將在較大m/z的離子之前撞擊探測器。Y軸的絕對位移量將是離子在Z軸的飛行時間于離子的Y軸速度的乘積。如果探測器處在對于中等mw離子優(yōu)化的位置，那么較輕的離子將“下沖”探測器，到達(dá)圖2中探測器的右側(cè)。反過來，較大m/z的離子將“過沖”探測器，到達(dá)圖2中探測器的左側(cè)。因此，如果所有離子都要撞擊同一探測點，那么必須使所有離子都保持Z和Y軸速度的比值為常數(shù)。前面描述的加?xùn)牌珘旱姆椒▽崿F(xiàn)了這一要求。
在通過聚焦柵28之后，離子到達(dá)四極引出元件的調(diào)制器區(qū)30。調(diào)制器30以接近10000脈沖/秒(10kHz)的速率產(chǎn)生脈沖。離子被推進(jìn)離子光學(xué)系統(tǒng)的加速器列32，并出來進(jìn)入四極飛行時間(O-TOF)的自由飛行區(qū)34。當(dāng)離子進(jìn)入離子反射鏡36時獲得了能量修正。在反射鏡中，離子轉(zhuǎn)向并被引導(dǎo)撞擊快速響應(yīng)的V形排列微溝平板探測器38。
作為替代，可使用原型排列。
例如，上面給出的幾何結(jié)構(gòu)在高加速能量下進(jìn)行O-TOF存在困難。人們已經(jīng)廣為接受，隨著總離子能量的增加，肽和蛋白質(zhì)的離子探測靈敏度提高了。對于人胰島素(MW＝5807.65 Da)，當(dāng)使用典型的微溝平板探測器時，在35keV的離子能量下，獲得了接近100％的探測效率。如果離子要被加速至20或30keV的能量，那么自由飛行管襯套(free flight tube liner)40和其它相應(yīng)的元件必須被加以-20kV或-30kV。眾所周知，在這樣的電位下在簡單離子光源元件上給出穩(wěn)定的電隔離是很困難的。要安全可靠地使許多元件處在這樣的電位下是很困難的。一種解決方法就是使用后加速技術(shù)。
與上述設(shè)備不同，這樣的提到設(shè)備使用探測器后加速器(未示出)。離子在離開正交引出元件之后，被加速至大約4keV的能量，自由飛行區(qū)被加以-4kV的電壓。離子進(jìn)入后加速器探測器組件之后獲得進(jìn)一步的加速。在該組件中，離子穿過保持襯套電位的保場(field-retaining)柵極。然后離子在保場柵極和探測器的一次離子轉(zhuǎn)換表面之間所建立的電場中得到額外的加速度。這樣的加速場大約為4至10nm距離內(nèi)10至20kV的量級。
因為正交設(shè)計使飛行時間測量和離子形成脫鉤，所以實現(xiàn)了許多優(yōu)點。
因為解吸柱(desorption plume)的離子在正交引出并加速進(jìn)入TOF質(zhì)量分析儀之前可以有一段時間(通常為幾個毫秒)來擴展和冷卻，因而消除了與激光流量相關(guān)的問題，例如由于離子屏蔽和離子加速場衰減(collapse)而造成的波峰展寬。另外，正交引出消除了在高激光能量的傳統(tǒng)引出譜(extraction spectra)起始時，由于EAM的過量中性負(fù)荷產(chǎn)生的化學(xué)噪聲而造成的反常的大的凸起和基線。由于中性粒子在調(diào)制器區(qū)中不引出，只有離子向下傳送至探測器，大大減少了化學(xué)噪聲。
這些因素使得可以使用比并聯(lián)連續(xù)或延遲離子引出方法中所用的大2-3倍的激光流量。最終結(jié)果就是，幾乎完全消除了搜尋和查找“最有效點(sweet spot)”的需要，即使在差的樣品——EAM均勻性——情況下也是如此，同時還提高了外標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量精度的確定(典型的誤差為20-50ppm)，提高了定量重復(fù)性，并提高了信噪比。另一個好處是無需進(jìn)行低和高激光能量掃描來分析一個寬m/z范圍的離子?，F(xiàn)在可使用單激光能量來觀察高和低mw離子，極大地簡化了未知混合物的分析。
在與傳統(tǒng)的并行引出方法相比，也許該設(shè)備最令人印象深刻的優(yōu)點之一在于其無需嚴(yán)格定位樣品的能力。因為，實際上從離子形成過程中去掉了TOF測量，離子的初始位置不再重要。而且，由于離子形成在沒有高電壓引出場的高氣壓環(huán)境中完成，故而大大地減小了固態(tài)樣品入口系統(tǒng)的設(shè)計要求。可采用簡單的方法來使用2維樣品控制器，同時保持優(yōu)良的外標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量精度性能。另外，樣品承載表面再也無需用金屬或其它導(dǎo)電介質(zhì)來制作。
總的說來，激光解吸電離(LDI)Qq-TOF MS相對于現(xiàn)有LDI-TOF MS技術(shù)來說具有下列優(yōu)點(1)增大了外標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量精度(典型的20-50ppm)；(2)增強了分辨率；(3)改進(jìn)了ms/ms效率；(4)使用單個高激光能量水平改進(jìn)了信號產(chǎn)生的簡易性，無需高和低能掃描；(5)通過使用TDC技術(shù)和在最小解吸閾值之上2-4倍的激光流量，提高了定量能力；(6)降低了對2維樣品傳動器的需要；(7)使用塑料元件作為樣品承載探針表面(例如，注模成型的二維探針列陣)的潛力；(8)通過使用單離子監(jiān)控降低了化學(xué)噪聲，提高了測量在EAM化學(xué)噪聲領(lǐng)域中的離子的能力。
激光解吸電離(LDI)Qq-TOF MS相對于現(xiàn)有MALDI-PSD方法來說，在蛋白質(zhì)表征和鑒定方面具有如下優(yōu)點。
LDI-QqTOF提供了更高的質(zhì)量分辨能力和質(zhì)量精度；在數(shù)據(jù)庫采掘方法中，這一增強的能力減少了錯誤陽性數(shù)據(jù)庫命中(positivedatabase hits)的數(shù)量，簡化了鑒定。而且，QqTOF還提供了比PSDMS/MS大了不止一個數(shù)量級的靈敏度。
本發(fā)明的分析儀器展示了令人印象深刻的MS/MS能力以及對于單MS分析小于20ppm的質(zhì)量分配誤差。后者使得可以同時鑒定許多保留在單個親和捕獲探針表面上的蛋白質(zhì)。
其它元件親和捕獲探針串聯(lián)MS儀器100通常還包括與串聯(lián)質(zhì)譜儀探測器相連的數(shù)字計算機。數(shù)字計算機通常還與激光解吸源12相連，使其能夠控制離子發(fā)生，還能參與數(shù)據(jù)采集和分析。
分析軟件可安裝在計算機上或不在計算機上但是計算機可以使用。例如，計算機可與因特網(wǎng)相連使其可以使用像Protein Prospector、PROWL或Mascot Search Engine這樣的分析程序包，它們都可從萬維網(wǎng)上獲得。分析軟件也可存在于LAN或WAN服務(wù)器上。
親和捕獲探針為了進(jìn)行像以下部分中詳細(xì)描述的那些分析，至少要在探針接口10中嚙合一個具有吸附了的分析物的親和捕獲探針16，它處在可被激光解吸/電離源13查詢的位置上，將解吸離子送入串聯(lián)質(zhì)譜儀14。
探針16通常具有一個或多個吸取表面18，不同表面之間可互不相同(18a、18b、18c、18d)。通常，如果有許多吸取表面18，那么它們?nèi)勘┞对谔结?6的一個公共面上。
吸取表面18通常為色譜吸取表面或生物分子親和表面。
色譜親和表面具有在分析物中進(jìn)行色譜鑒別或分離分析物的吸附能力。因此這樣的表面可包括陰離子交換組成部分、陽離子交換組成部分、反相組成部分、金屬親和捕獲組成部分，以及混合模式的吸取劑，就像色譜技術(shù)中所理解的術(shù)語那樣。生物分子親和表面具有包括能夠進(jìn)行特異結(jié)合的生物分子的吸取劑。因此這樣的表面可包括抗體、受體、核酸、外源凝集素、酶、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、Staph蛋白質(zhì)A和Staph蛋白質(zhì)G。吸取劑表面將在下面的部分中進(jìn)行進(jìn)一步的描述。
接口10使探針16處于激光解吸/電離源13可查詢的關(guān)系。通常，需要激光查詢探針吸取表面18。因此，接口10使探針16的吸取表面18處于激光解吸/電離源13可查詢的關(guān)系。如果吸取表面18只在探針16的一個面上，那么探針16和/或接口10的探針固定器可以做成不對稱的，這樣承擔(dān)了將探針16沿將吸取表面18朝向激光解吸源13的方向的插入。
如果探針16具有許多吸取表面18，那么就要求激光源12能夠分立地尋址每個吸取表面18。這可以通過在激光源12和接口10之間放置光學(xué)系統(tǒng)并使激光源12和/或接口10可動——或者其組合——來實現(xiàn)。
探針16可以是用于單個MS分析中的那種親和捕獲探針(例如，可從Ciphergen Biosystems，Inc.，F(xiàn)remont，CA USA購買的那些)。
III.親和探針串聯(lián)MS儀器的應(yīng)用本發(fā)明的上述分析儀器在下列方面提供了意義重大的優(yōu)點，并給出了新穎的方法(1)蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)和鑒定，以及(2)特異結(jié)合對之間相互作用的表征，現(xiàn)在將依次對其進(jìn)行描述。
一般而言，上述分析儀器的優(yōu)點包括在與親和捕獲探針技術(shù)——尤其是與特定受體結(jié)合系統(tǒng)——結(jié)合的單個質(zhì)量MS和串聯(lián)MS模式中進(jìn)行高質(zhì)量精度測量的能力。
A.蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)和鑒定1.本發(fā)明的方法的優(yōu)點蛋白質(zhì)生物學(xué)家企圖解決的一組相關(guān)問題是蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)、鑒定和測定開發(fā)(assay development)。蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)是在一個系統(tǒng)中尋找具有生物學(xué)意義的蛋白質(zhì)的過程，因為，例如，它們用作診斷標(biāo)記或執(zhí)行關(guān)鍵的細(xì)胞功能。蛋白質(zhì)鑒定是確定已發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的身份的過程。測定是進(jìn)行可靠的測定來探測蛋白質(zhì)的過程。本發(fā)明的方法為專業(yè)人員提供了進(jìn)行這些過程時相較于早先技術(shù)來說的優(yōu)點。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于它給出了一個單個平臺，在其上可進(jìn)行從蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)到蛋白質(zhì)鑒定到測定開發(fā)的步驟?；赟ELDI技術(shù)的單個平臺的給出大大地減少了發(fā)現(xiàn)和測定確認(rèn)之間的時間使用早先技術(shù)需要數(shù)月時間的過程現(xiàn)在可在幾周或幾天內(nèi)完成。本發(fā)明的方法還大大地降低了進(jìn)行實驗所需的樣品總量。早先技術(shù)需要微摩爾的分析物，而本方法可用皮摩爾的分析物進(jìn)行同樣的實驗。這克服了缺乏樣品或增大樣品比較困難時的一個顯著的障礙。
以前，蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)和分離是通過使用2D凝膠或Western Blots來完成的。然而，將凝膠互相比較以探測不同表達(dá)的蛋白質(zhì)是個困難的過程。
已發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可使用質(zhì)譜分析方法來進(jìn)行鑒定。重要的蛋白質(zhì)可被分離并在凝膠中最終用蛋白酶使其變成碎片，可用質(zhì)譜儀和合適的生物信息學(xué)方法分析肽碎片。然而，凝膠與本質(zhì)譜分析方法并不兼容，肽碎片必須從凝膠中分離出來。因為后一過程必然導(dǎo)致樣品丟失，所以該方法需要大量起始蛋白質(zhì)和材料。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)很稀少時——重要的蛋白質(zhì)可能會這樣——這增加了該過程的難度。
一旦被鑒定了，研究人員需要進(jìn)行可靠的測定來探測蛋白質(zhì)。通常，這包括進(jìn)行ELISA測定。反過來，該技術(shù)需要抗體的產(chǎn)生。這會是一個費時的工作，尤其是如果我們感興趣的蛋白質(zhì)難以大量制造來免疫的話更是如此。
這樣，先前的技術(shù)會需要三種不同的技術(shù)來完成蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)鑒定和蛋白質(zhì)測定。本發(fā)明的方法可用一種技術(shù)來完成這些。
2.蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)、鑒定和測定開發(fā)的方法本發(fā)明用于蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)、鑒定和測定開發(fā)的方法包括準(zhǔn)備差別圖(difference map)來發(fā)現(xiàn)感興趣的一個或多個蛋白質(zhì)，用親和捕獲探針串聯(lián)MS鑒定蛋白質(zhì)，利用親和捕獲探針激光解吸電離色譜表面測定或親和捕獲探針激光解吸電離生物特異表面分析來進(jìn)行確認(rèn)。
這一過程可如下進(jìn)行。通過，例如，使用滯留物研究的差異定位(difference mapping)給出或發(fā)現(xiàn)感興趣的蛋白質(zhì)。這些方法在，例如，WO 98/59362(Hutchens和Yip)中進(jìn)行了描述。簡單地說，用滯留物色譜方法檢驗在某些重要方面有所不同(例如，正常的v.患病的；功能的v.非功能的)的兩個樣品。這些方法包括將樣品置于許多不同色譜親和與洗滌條件下，然后用親和捕獲探針激光解吸電離來進(jìn)行“殘留蛋白質(zhì)”的檢驗。在兩樣品之間不同表達(dá)的蛋白質(zhì)作為進(jìn)一步檢驗的候選者。因為它們在質(zhì)譜儀上進(jìn)行檢驗，所以知道了這些候選蛋白質(zhì)的分子量。
一般地，除了感興趣的蛋白質(zhì)之外，還有其它蛋白質(zhì)的記錄被保留在芯片上。因此，下一可選步驟就是改進(jìn)親和與洗滌條件，在改進(jìn)的條件下，保留了感興趣的一個或多個蛋白質(zhì)，從而為進(jìn)一步的分析簡化了樣品。(這些在Hutchens和Yip申請中也進(jìn)行了描述。)雖然捕獲單個感興趣的蛋白質(zhì)是理想的，但是捕獲不超過大約十個可探測的蛋白質(zhì)也是可以的。改進(jìn)的方法為感興趣的蛋白質(zhì)提供了改良的色譜測定。
然后，在探針上利用特別的蛋白水解劑將殘留蛋白質(zhì)碎裂，產(chǎn)生用于后續(xù)研究的肽池。用像胰島素這樣的特異內(nèi)蛋白酶來進(jìn)行消化是有利的，因為裂解模式是已知的而且與包括存于數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)的硅上(in silico)解離的生物信息學(xué)方法兼容。然后用高分辨率、高精度的MS-MS(例如，質(zhì)量分配誤差小于每百萬20份(part)，并且分辨能力大約為10000)來分析得到的肽。此時，還不清楚特異肽碎片是否就是感興趣的蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，還是其它殘留蛋白質(zhì)中某個的分解產(chǎn)物。盡管如此，通過選擇肽碎片中的一塊(也許隨機地，也許基于其相應(yīng)于感興趣的蛋白質(zhì)的信息)并將其進(jìn)行氣相碎裂，分析繼續(xù)進(jìn)行下去。一種這樣的方法是碰撞誘導(dǎo)分離(CID)。肽無需從芯片上分離下來，因為MS-MS設(shè)備在質(zhì)譜儀中將感興趣的肽從其它肽中分離出來。這將生成選定肽碎片的進(jìn)一步的碎裂模式。
利用技術(shù)中已有的方法——例如數(shù)據(jù)庫采掘協(xié)議，使用來自碎裂模式的信息來查詢蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫以生成一個或多個假定的蛋白質(zhì)身分候選者，肽碎片就來自于該蛋白質(zhì)。該協(xié)議通常進(jìn)行測量蛋白質(zhì)的預(yù)測質(zhì)譜與選定碎片的實際質(zhì)譜有多匹配的擬合嚴(yán)密度分析。然后可將數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)碎片相應(yīng)于數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)的可信度測量進(jìn)行分級。母體蛋白質(zhì)和原始種類的質(zhì)量知識——它們都是已知的——將有助于限制所產(chǎn)生的鑒定候選的數(shù)量。
然后，核實生成肽碎片的蛋白質(zhì)的假定身份。利用來自假定身份候選的主序列的數(shù)據(jù)庫的知識和所用的蛋白水解劑的解離模式，可以預(yù)測身份候選被蛋白水解劑解離所應(yīng)產(chǎn)生的肽碎片以及，特別地，它們的分子量。然后將這組預(yù)測的碎片與殘留在芯片上的蛋白質(zhì)水解分解之后生成的一組實際的碎片根據(jù)它們的質(zhì)量進(jìn)行比較。如果解釋了預(yù)測碎片，那么就可確定假定身份候選確實相應(yīng)于殘留在芯片上的某蛋白質(zhì)之一的鑒定。如果沒有，那么就必須通過一系列排除來測試其它假定身份候選，直到鑒定了生成碎片的蛋白質(zhì)。在此處，生成的相應(yīng)于已鑒定蛋白質(zhì)的碎片可作為已解釋的碎片從所有碎片中去掉。
如果在改進(jìn)親和與洗滌條件之后只有一種蛋白質(zhì)殘留，那么將解釋所有肽碎片，程序結(jié)束。然而，如果殘留的蛋白質(zhì)超過一種，那么情況將更復(fù)雜。例如，分析中所用的碎片可來自感興趣的蛋白質(zhì)，也可以來自殘留在芯片上但并非感興趣的蛋白質(zhì)。在此情形中，用上述MS-MS方法重復(fù)分析未解釋的肽碎片的步驟直到鑒定了感興趣的蛋白質(zhì)或所有殘留蛋白質(zhì)都被鑒定了將是很有用的。
最后，感興趣的蛋白質(zhì)可由親和捕獲探針激光解吸電離方法進(jìn)行測定，該方法使用本身已可保留蛋白質(zhì)的色譜表面或可發(fā)展來用于親和捕獲探針激光解吸電離測定的生物特異表面。生物特異表面的形成包括對已鑒定蛋白質(zhì)——例如抗體或如果受體已知的話則為受體——給出結(jié)合配偶體，使其附在芯片表面。然后，可如上所述那樣用SELDI測定感興趣的蛋白質(zhì)。
B.分子相互作用的表征本發(fā)明的分析儀器使特異結(jié)合配偶體之間的相互作用研究的靈敏、高效、單平臺方法第一次成為可能。
特異結(jié)合配偶體相互作用處于生物過程的寬譜的核心。因此，測量并表征這種相互作用的能力是完全了解這種過程所必須的先決條件；在臨床水平上，測量并表征這種相互作用的能力對于了解那些過程中的病態(tài)畸變是很重要的，對于可用于調(diào)節(jié)甚至消除這種相互作用的試劑的合理設(shè)計也是很重要的。
例如，在有機物的真核組織水平上，哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)系統(tǒng)中的細(xì)胞間信號傳遞以神經(jīng)遞質(zhì)和它們的同源受體之間的相互作用為媒介。對于這種信號傳遞機制的完整理解來說，理解這種結(jié)合相互作用的分子特性是必須的。在臨床水平上，對于信號傳遞反常的機制的完整理解來說需要理解這種結(jié)合相互作用的分子特性，對于合理設(shè)計可減輕這種信號傳遞反常的藥劑以及可用于從Parkinson氏綜合癥到精神分裂癥、從強迫癥到癲癇癥的各種疾病的治療的藥劑來說也需要理解這種結(jié)合相互作用的分子特性。
例如，在循環(huán)水平(circulatory level)上，需要B細(xì)胞受體和循環(huán)抗原之間的相互作用來觸發(fā)B細(xì)胞克隆擴增、分化以及抗原-特異體液免疫反應(yīng)。對于免疫反應(yīng)性的完整理解來說，理解對抗原識別有貢獻(xiàn)的抗原決定簇是很關(guān)鍵的。在臨床水平上，這種理解對于設(shè)計能使體液免疫更強的疫苗來說是很重要的。類似地，T細(xì)胞受體與跟MHC一起顯示在抗原表達(dá)細(xì)胞上的肽之間的相互作用對于細(xì)胞免疫的觸發(fā)是很關(guān)鍵的。對于設(shè)計能使細(xì)胞免疫更強的疫苗來說，理解對抗原識別有貢獻(xiàn)的T細(xì)胞決定簇是很重要的。
在個體細(xì)胞的水平上，對細(xì)胞外信號的表型響應(yīng)以至少一個——最常見的是一串——細(xì)胞間相互作用——從細(xì)胞表面受體和配體之間的初始相互作用，到將信號傳導(dǎo)至細(xì)胞核的胞質(zhì)內(nèi)相互作用，到蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子和DNA之間的相互作用——為媒介，然后基因表達(dá)的變更圖導(dǎo)致觀測到的表型反應(yīng)。
例如，排卵需要雌激素和黃體酮通過卵巢細(xì)胞的可識別結(jié)合。對于理解激素反應(yīng)來說，一方面理解類固醇激素受體和激素配體之間的結(jié)合相互作用的分子特性，另一方面理解配體受體和基因組中的類固醇激素反應(yīng)元素之間的結(jié)合相互作用的分子特性是很重要的。反過來，對于理解不孕和對于合理設(shè)計要消除排卵、胚胎著床和/或胚胎成活力的藥劑來說，這樣的理解是很重要的。
不僅在真核系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了這樣的相互作用，在原核系統(tǒng)和原核生物與真核生物的相互作用中也發(fā)現(xiàn)了這樣的相互作用。例如，某些革蘭氏陰性細(xì)菌具有真核eurethra的入侵所需的纖毛；對于完全理解患病過程以及合理設(shè)計可防止這種入侵的試劑來說，理解這種相互作用是很重要的。
在該技術(shù)中使用了許多技術(shù)來研究和映射特異結(jié)合配偶體之間的這種分子間相互作用。每種都有重大的缺點。
在第一種這樣的方法中，特異結(jié)合對中的一個固定在填塞在色譜柱中的吸取劑上。為了在結(jié)構(gòu)中定位(map)與第一(約束)結(jié)合配偶體接觸的第二(自由)結(jié)合配偶體的位置，將第二(自由)配偶體解離。通常，這樣的分解由特異的蛋白水解酶來進(jìn)行，盡管可以進(jìn)行特異的化學(xué)分解(例如，用CNBr)甚至非特異的化學(xué)水解。之后，對整個柱進(jìn)行消化來結(jié)合第二(自由)配偶體的還與第一(固定)配偶體結(jié)合的那些部分。
然后洗脫第二配偶體的肽——通常利用鹽或pH梯度，并對其進(jìn)行鑒定——通常通過將肽送入使用MALDI或電噴射電離的質(zhì)譜儀來進(jìn)行。
該方法具有一些眾所周知的重大問題。首先，需要大量純化的第一結(jié)合配偶體來產(chǎn)生特異吸取劑。第二，需要大量第二結(jié)合配偶體——通常是純化的——用于消化、吸取和洗脫，因為這其中的每一步都會產(chǎn)生稀釋作用和分析物丟失。此外，盡管隨后的質(zhì)譜分析可以是高靈敏度的，將液相分析引入MS也會引起分析物丟失。
也許更基本的缺點在于，通過在結(jié)合到第一配偶體之前解離第二結(jié)合配偶體，只有第二結(jié)合配偶體上完全留在肽碎片中的分子結(jié)構(gòu)會結(jié)合并在之后被探測。如果，例如，抗體和抗原在不連續(xù)的——而不是線性的——抗原決定簇處結(jié)合，那么這樣的不連續(xù)抗原決定簇將會受到碎裂的破壞；無法支持與固定抗體的結(jié)合，這樣的抗原決定簇不能被探測到。
技術(shù)中第二個典型的方法是利用點突變在蛋白質(zhì)結(jié)合配偶體中定位(map)對分子間結(jié)合有貢獻(xiàn)的那些殘余物。
后面的這種方法需要克隆蛋白質(zhì)結(jié)合配偶體，產(chǎn)生所需的點突變，重組轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)的表達(dá)，并將其純化。之后，測量轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)與其它配偶體的結(jié)合動力學(xué)來確定突變殘余物對分子間相互作用的影響。
結(jié)合配偶體之間的接觸的特性可用已結(jié)合配偶體的X射線晶體學(xué)來闡明，這種方法更為少用。該技術(shù)非常有效，而且提供了原子水平的分辨率，但是需要每個結(jié)合配偶體高度純化并需要形成合適的晶體。
本發(fā)明的親和捕獲串聯(lián)質(zhì)譜儀器給出一種改進(jìn)的方法，只需極少的起始材料，消除了點突變分析、結(jié)晶，充分降低了純度要求。
第一步是將結(jié)合配偶體之一固定到親和捕獲探針上。
可固定任何一個配偶體；然而，所能獲得的是自由配偶體關(guān)于結(jié)合接觸的結(jié)構(gòu)信息。利用作為本方法例子的受體/配體相互作用，將配體固定在探針上可進(jìn)行受體參與結(jié)合配體的區(qū)域的鑒定；將受體固定在探針上可進(jìn)行配體參與結(jié)合受體的區(qū)域的鑒定。在配體是蛋白質(zhì)——例如蛋白質(zhì)激素、細(xì)胞因子或化學(xué)增活劑(chemokine)——的情況下，依次使用每個配偶體的分離實驗將得出分子間接觸的雙邊理解。
探針結(jié)合的配偶體可用共價或強的非共價作用來固定。選擇取決于要固定的配偶體上合適反應(yīng)基的可用性以及探針表面的化學(xué)特性。在分析技術(shù)中，合適的化學(xué)處理是眾所周知的。
例如，在要固定的結(jié)合配偶體具有自由氨基時，可在結(jié)合配偶體的自由氨基和探針表面的羰基二咪唑根之間形成共價鍵合。類似地，結(jié)合配偶體的自由氨基或硫醇基可用來將該配偶體共價結(jié)合到具有環(huán)氧基的探針表面上。在結(jié)合配偶體的自由氫硫基和探針表面上的金或鉑之間可形成強的配位或配價(dative)鍵。
可選地，隨后可填塞探針表面上剩余的活性位置以減少與活化的探針表面的非特異結(jié)合。
然后將第二(自由)結(jié)合配偶體與親和捕獲芯片接觸并與第一(固定)結(jié)合配偶體結(jié)合。
第二(自由)結(jié)合配偶體可以是融化狀態(tài)的純凈物——如果已知并且可以獲得的話，或者更通常地，從異質(zhì)混合物——例如懷疑含有第二結(jié)合配偶體的生物樣品——中獲取。像前述生物標(biāo)記發(fā)現(xiàn)方法中的生物樣品可以是生物液體，例如血液、血清、血漿、淋巴、組織液、尿液、滲出液，可以是細(xì)胞溶解產(chǎn)物、細(xì)胞分泌物，或者它們的部分分餾和純化部分。
然后用一種或多種具有規(guī)定的洗脫特征的洗脫液洗滌探針。洗滌是用來減少非特異結(jié)合到探針上的種類的數(shù)量。
然后應(yīng)用通常處于液相的能量吸收分子，并干燥。能量吸收分子的應(yīng)用受到親和捕獲探針的現(xiàn)有使用的同樣方式的影響；在使用ProteinChipArray(Ciphergen Biosystems，Inc.，F(xiàn)remont，CA，USA)的情況下，根據(jù)廠商的說明來應(yīng)用能量吸收分子。
然后，非共價結(jié)合到親和捕獲探針上的種類——例如，特異結(jié)合到第一(固定)結(jié)合配偶體上的第二結(jié)合配偶體、非特異結(jié)合到探針表面上的分子、非特異結(jié)合到第一結(jié)合配偶體上的分子——在激光解吸電離質(zhì)譜分析的第一相中進(jìn)行探測。
質(zhì)譜儀可以是單級親和捕獲LDI-MS設(shè)備，例如CiphergenBiosystems，Inc.(Fremont，CA USA)的PBS II。然而，優(yōu)選提供了更高質(zhì)量精度和更高質(zhì)量分辨率的本發(fā)明的親和捕獲串聯(lián)MS。
通常，從先前的研究將可已知第二(自由)結(jié)合配偶體，用質(zhì)譜分析可以容易地確的它是否存在。如果第二(自由)結(jié)合配偶體未知，則可依次探查結(jié)合到探針上的每個種類。如果可探測種類的數(shù)量太大，那么可使用具有不同洗脫特征(通常，增大的嚴(yán)格度(increasedstringency))的洗脫液來洗滌親和捕獲探針，以減少要分析的種類的數(shù)量。
一旦確認(rèn)了第二(“自由”)結(jié)合配偶體與第一(固定)結(jié)合配偶體的結(jié)合，則使第二結(jié)合配偶體碎裂。這通常通過將第二結(jié)合配偶體(此時它非共價但特異地結(jié)合在第一結(jié)合配偶體上，而后者反過來固定在探針表面上)與特定內(nèi)蛋白酶——例如胰島素、Glu-C(V8)蛋白酶、蛋白酶Arg-C(絲氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶Arg-C酶)、Asn-N蛋白酶，或Lys-C蛋白酶——接觸來完成。
在消化之后，用質(zhì)譜分析來探測肽。
如果要鑒定第二結(jié)合配偶體的所有碎片——例如用肽質(zhì)指紋圖譜分析來確認(rèn)第二結(jié)合配偶體的身份，那么可應(yīng)用能量吸收分子，和用以通過激光解吸電離將肽送入質(zhì)譜分析的探針。為此，可使用Ciphergen PBS II單加速級線性TOF MS；優(yōu)選提供更佳質(zhì)量精度和質(zhì)量分辨率的本發(fā)明的串聯(lián)MS，因為增大的分辨率和精度降低了在任何給定數(shù)據(jù)庫查詢中任何給定置信度下返回的假定“命中”的數(shù)量。
然而，更通常地，需要分析和固定的第一結(jié)合配偶體結(jié)合最緊密的第二結(jié)合配偶體的碎片。在這樣的情形中，在加入能量吸收分子之前用一種和多種洗脫液來洗滌探針。
此時，探針插入本發(fā)明的串聯(lián)MS的接口，第二結(jié)合配偶體的碎片(通常是肽)被探測。
如果第二(自由)結(jié)合配偶體的身份已知，可將已探測碎片的質(zhì)量與將碎裂酶的已知分解規(guī)則用于第二結(jié)合配偶體的初級氨基酸序列所預(yù)測的質(zhì)量進(jìn)行比較。照這樣，可鑒定每個碎片，從而在第二結(jié)合配偶體的結(jié)構(gòu)中定位了那些擔(dān)負(fù)與第一結(jié)合配偶體的結(jié)合的部分。
盡管在理論上可使用單級MS設(shè)備，但是實際上，除了來自第二結(jié)合配偶體的碎片之外，還會出現(xiàn)其它碎片，混淆了這樣的分析。這樣，本發(fā)明的儀器的高質(zhì)量分辨率和質(zhì)量精度將給普通情況中的最后鑒定帶來好處，而且ms/ms分析也常給普通情況中的最后鑒定帶來好處。
如果第二(自由)結(jié)合配偶體未知，可使用ms/ms分析來鑒定該配偶體。
通常，這樣的分析采取如下形式在MS的第一級中選擇第一母體肽，碎裂選定的肽，然后在MS分析的第二級中產(chǎn)生碎片質(zhì)譜。碎裂在氣相中進(jìn)行，優(yōu)選地采用碰撞誘導(dǎo)分離。在本發(fā)明的親和捕獲串聯(lián)質(zhì)譜儀的具體實施方案中，CID在q2中通過與氮氣在大約10-2托下碰撞而起作用。
然后利用已知的算法——例如在Yates et al.，U.S.Patent Nos.5,538,897 and 6,017,693中公開的以及Protein Prospector MS-TAG(http∥prospector.ucsf/edu)模塊中所用的——將碎片譜用于查詢序列數(shù)據(jù)庫。
通過選擇第二母體肽并重復(fù)該方法，可進(jìn)一步檢驗假定鑒定，要確認(rèn)所有肽來自可鑒定母體，這是必須的。
之后，一旦鑒定了第二結(jié)合配偶體，則可如上面所提出的那樣對分子間相互作用的特性進(jìn)行研究。將碎裂酶(或化學(xué)制劑，例如CNBr)已知的分解規(guī)則用于現(xiàn)在鑒定的第二結(jié)合配偶體的初級序列，將經(jīng)驗測得的肽定位到理論消化上，從而鑒定了結(jié)合到固定的第一結(jié)合配偶體上、并且處在對結(jié)合有貢獻(xiàn)的本地分子中的肽。同上，可以提高洗滌嚴(yán)格度來重復(fù)實驗以鑒定那些結(jié)合最緊密的肽。
可進(jìn)行其它干擾以進(jìn)一步闡明分子間相互作用的特性。
可改變在第二結(jié)合配偶體碎裂后用于洗滌探針的洗脫液的洗脫特征來鑒定對相互作用貢獻(xiàn)最大的碎片，或鑒定對結(jié)合有貢獻(xiàn)的與pH相關(guān)或與鹽相關(guān)的接觸。
在色譜和分子生物技術(shù)中，原理當(dāng)然是眾所周知的隨著洗滌嚴(yán)格度的提高(例如，提高鹽的濃度、升高溫度)，那些與固定的第一結(jié)合配偶體結(jié)合更不緊密的碎片將被從第一結(jié)合配偶體上洗脫掉。在本幾何結(jié)構(gòu)中，如此差結(jié)合的碎片將被從探針上洗脫掉，不參與隨后的質(zhì)譜分析。這樣可進(jìn)行一系列實驗，其中在增加嚴(yán)格度下洗滌探針和同樣的對應(yīng)探針，從而產(chǎn)生了一系列逐漸變化的第二結(jié)合配偶體的碎片子集，其中每個相繼子集都具有由更緊密結(jié)合的碎片組成的更小的子集。
正如上面所指出的，第一(固定)和第二(自由)結(jié)合配偶體是可以互換的，使得可以闡明其它配偶體的結(jié)合接觸。
又一有用的干擾是在某一或兩個結(jié)合配偶體上移除或平移后改性的改變。例如，如果第一結(jié)合配偶體是糖蛋白質(zhì)，在與第二結(jié)合配偶體結(jié)合之前和/或之后用一種或多種特異或非特異糖苷酶對其進(jìn)行處理將有助于闡明糖殘余物對結(jié)合的貢獻(xiàn)。
類似地，在某一結(jié)合配偶體是核酸的情況下，在與另一結(jié)合配偶體結(jié)合之前用核酸酶對核酸結(jié)合配偶體進(jìn)行處理將有助于鑒定關(guān)鍵性的結(jié)合殘余物。
上述表征分子間相互作用的方法用單平臺、流水線化、靈敏的方法取代了現(xiàn)有技術(shù)中多平臺、大勞動密度、不靈敏的技術(shù)。該方法適用于很多種不同的生物系統(tǒng)和問題。
如上所建議的，本發(fā)明的方法可用于抗原決定簇定位(mapping)——也就是，在抗原中鑒定對與抗體、T細(xì)胞受體或MHC的結(jié)合有貢獻(xiàn)的接觸。該方法可用于闡明多蛋白質(zhì)復(fù)合體中生物配體與其受體、轉(zhuǎn)錄因子與核酸、轉(zhuǎn)錄因子與其它的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合的特性。
盡管在上面關(guān)于蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行了特別討論，本發(fā)明的方法可實際用于闡明外源凝集素與糖蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸、以及小分子與受體之間的結(jié)合相互作用。
特別地關(guān)于小分子配體，該方法也可用于已知受體的激動劑和拮抗劑的設(shè)計。
在過去的幾十年里，發(fā)展了用于組合地產(chǎn)生大量小分子和用于在各種同質(zhì)和活細(xì)胞測定中篩選(screen)這種分子(因為它們能夠影響一種或多種生物過程)的技術(shù)。例如，同質(zhì)閃爍鄰近測定(homogeneous scintillation proximity assay)可用來聯(lián)篩選組合庫用于和已知受體的結(jié)合；基于數(shù)字圖像的分子測定可用來篩選來自組合庫的化合物用于下游效應(yīng)(downstream efiect)，例如受體的細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核輸送、細(xì)胞內(nèi)鈣分布的改變、細(xì)胞活動性的改變。
然而，一旦鑒定了這樣一個前導(dǎo)物，對小分子和其受體之間相互作用的詳細(xì)理解將促進(jìn)具有改進(jìn)藥物動力學(xué)和治療指數(shù)的分子的巧妙設(shè)計。本發(fā)明的技術(shù)很適合于這樣的應(yīng)用。
如果小分子給出了靠近能量吸收分子的信號，則MS進(jìn)行單離子監(jiān)控，僅為組合庫成分尋找已知質(zhì)量。
實例1前列腺癌生物標(biāo)記的鑒定傳統(tǒng)上，在發(fā)現(xiàn)前列腺特異抗原(PSA)在血液中的含量升高之后，通過活體組織切片檢查來診斷前列腺癌。在正常男性的身體中，PSA的含量小于1ng/ml。對于BPH和前列腺癌，PSA的含量會提高到4-10ng/ml。Chen et al.，J.Urology 1572166-2170(1997)；Qian etal.，Clin.Chem.43352-359(1997)。PSA已知具有胰島素活性，在酪氨酸和亮氨酸的C端處裂解。Qian et al.，Clin.Chem.43352-359(1997)。
用ProteinChip差別顯示技術(shù)來分析來自診斷為BPH的病人和診斷為前列腺癌的病人的精漿。圖3顯示了一個BPH和前列腺癌患者的精液蛋白質(zhì)圖。利用虛擬的凝膠顯示來提高樣品之間的可視化比較。在凝膠視圖的下方顯示了前列腺癌的蛋白質(zhì)圖減去BPH的蛋白質(zhì)圖的差別曲線。差別曲線正向顯示的信號表示在前列腺癌中上調(diào)整(upregulated)的蛋白質(zhì)，而負(fù)的峰代表前列腺癌向下的蛋白質(zhì)調(diào)整。探測到了一些獨特地上調(diào)整的信號，它們表示可能的前列腺癌生物標(biāo)記。
通過使用混合模式表面和中性pH緩沖洗滌得到了這些上調(diào)整蛋白質(zhì)中的某種的片上分離(見圖4)。在此情形中，蛋白質(zhì)被富集成接近于同質(zhì)(homogeneity)。然后利用胰島素對富集的生物標(biāo)記候選進(jìn)行在位消化。在培育(incubation)之后，加入CHCA(matrix)的飽和溶液，并用SELDI-TOF對隨后的消化產(chǎn)物進(jìn)行分析。
探測了一些肽(見圖5)。對合成的肽信號進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分析并進(jìn)行人類semenogellin I的初步鑒定。這一鑒定稍微有點復(fù)雜，因為生物標(biāo)記的分子量為大約5751 Da，遠(yuǎn)小于semenogellin I的分子量(MW 52，131 Da)。
對同一純化蛋白質(zhì)進(jìn)行ProteinChip LDI Qq-TOF MS探測(見圖6)。因為5751 Da處的母體離子超過了LDI Qq-TOF MS/MS分析的現(xiàn)有質(zhì)量限制(3000M/z)，因此為CID MS/MS定序使用帶兩個電荷的離子(見圖7)。利用CID MS/MS結(jié)果來進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫采掘。26ms/ms離子中的15個被映射(mapped)回人類精液堿性蛋白質(zhì)(SBP)，semenogelin I的蛋白水解導(dǎo)出碎片，給出了該候選生物標(biāo)記的最后鑒定。
盡管像這些初始研究很快揭示了潛在的生物標(biāo)記，任何生物標(biāo)記的完全確認(rèn)需要分析數(shù)十甚至數(shù)百個相關(guān)樣品來獲得表達(dá)和發(fā)病率的統(tǒng)計意義上的信息。
這里提到的所有專利、專利發(fā)表以及其它已出版的參考都在此引入其所有內(nèi)容作為參考，并假定它們中的每一份都單獨并特定地在此引入作為參考。雖然在此文件中引入各種參考，申請者并不承認(rèn)任何特別的參考為其發(fā)明的“現(xiàn)有技術(shù)”。
雖然給出了特定的實施例，上面的描述都是說明性的而非限制性的。前述實施方案中的任何一個或多個特點都可以任何方式與本發(fā)明中任何其它實施方案的一個或多個特點相結(jié)合。而且，在復(fù)查了本說明書之后，對于熟練的技術(shù)人員來說，本發(fā)明的許多變化都是顯而易見的。因此，本發(fā)明的范圍并不能比照上面的描述來確定，而應(yīng)比照所附的權(quán)利要求連同其等效的完整范圍來進(jìn)行確定。
權(quán)利要求
1.表征第一和第二分子結(jié)合配偶體之間結(jié)合相互作用的方法，該方法包括將第二結(jié)合配偶體與第一結(jié)合配偶體結(jié)合，所述第一結(jié)合配偶體固定在一個激光解吸電離探針的表面上；碎裂所述第二結(jié)合配偶體；以及然后用串聯(lián)質(zhì)譜儀測量來探測所述碎片中至少一個，探測到的碎片的質(zhì)譜表征了所述結(jié)合相互作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，在將所述第二結(jié)合配偶體結(jié)合到第一結(jié)合配偶體上之前，進(jìn)一步包括以下步驟將第一結(jié)合配偶體固定到一個親和捕獲探針的表面。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述第一配偶體通過直接結(jié)合而固定到親和捕獲探針表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中與所述探針表面的直接結(jié)合為共價鍵合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述共價鍵合存在于第一結(jié)合配偶體的胺和所述探針表面的羰基二咪唑組成部分之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述共價鍵合存在于第一結(jié)合配偶體的氨基或硫醇基和探針表面的環(huán)氧基之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中與所述探針表面的直接結(jié)合為非共價鍵合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中與所述探針表面的直接結(jié)合為配位或配價鍵合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述配位或配價鍵合為與探針表面的金屬的鍵合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述金屬為金或鉑。
11.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中親和捕獲探針固定表面為色譜吸取表面。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述色譜吸取表面選自下列組中反相、陰離子交換、陽離子交換、固定化金屬親和捕獲以及混合模式表面。
13.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述第一配偶體通過非直接結(jié)合而固定到親和捕獲探針的表面；
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述非直接結(jié)合將第一結(jié)合配偶體共價結(jié)合到親和捕獲探針表面。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中與所述親和捕獲探針表面的非直接共價結(jié)合包括可裂解銜接物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述銜接物可由選自下列的作用劑裂解化學(xué)制劑、酶，以及輻射。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述非直接結(jié)合將第一結(jié)合配偶體非共價結(jié)合到親和捕獲探針表面。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中與所述親和捕獲探針表面的非共價非直接鍵合包括生物素分子。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中與所述親和捕獲探針表面的非共價非直接鍵合包括抗生物素蛋白分子。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中與所述親和捕獲探針表面的非共價非直接鍵合包括抗生蛋白鏈菌素分子。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一分子結(jié)合配偶體選自下列組中蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物，以及脂類。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述第一分子結(jié)合配偶體為蛋白質(zhì)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述蛋白質(zhì)為自然存在的。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述蛋白質(zhì)自然存在于選自下列的有機物中多細(xì)胞真核生物、單細(xì)胞真核生物、原核生物，以及病毒。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述蛋白質(zhì)自然存在于多細(xì)胞真核生物中。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述多細(xì)胞真核生物選自下列組中哺乳動物、昆蟲、線蟲、魚，以及導(dǎo)管植物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述多細(xì)胞真核生物為哺乳動物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述哺乳動物為智人。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述哺乳動物為嚙齒動物。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述嚙齒動物為鼠、家鼠，或天竺鼠。
31.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述蛋白質(zhì)為非自然存在的。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述蛋白質(zhì)為重組融合蛋白質(zhì)。
33.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自下列組中抗體、受體、轉(zhuǎn)錄因子、骨架蛋白質(zhì)、細(xì)胞周期蛋白質(zhì)，以及核糖體蛋白質(zhì)。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述蛋白質(zhì)為抗體。
35.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述蛋白質(zhì)為受體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述受體選自下列組中細(xì)胞表面受體、橫跨膜受體，以及細(xì)胞核受體。
37.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二結(jié)合配偶體與第一結(jié)合配偶體的結(jié)合通過以生物樣品接觸第一結(jié)合配偶體來實現(xiàn)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述生物樣品為選自下列的流體血液、淋巴、尿液、腦脊髓液、滑液、乳汁、唾液、玻璃體液、眼房水、粘液以及精液。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述生物流體為血液。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述流體為尿液。
41.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述生物流體為CSF。
42.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述生物樣品為細(xì)胞溶解產(chǎn)物。
43.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二結(jié)合配偶體為蛋白質(zhì)。
44.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二結(jié)合配偶體與第一結(jié)合配偶體的結(jié)合通過將第一結(jié)合配偶體與化學(xué)合成組合庫的等分試樣接觸來實現(xiàn)。
45.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二結(jié)合配偶體與第一結(jié)合配偶體的結(jié)合通過將第一結(jié)合配偶體與生物表達(dá)組合庫的等分試樣接觸來實現(xiàn)。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述庫為噬菌體表達(dá)庫。
47.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述碎裂通過將第二結(jié)合配偶體與酶接觸來實現(xiàn)。
48.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述碎裂通過將第二結(jié)合配偶體與酶接觸來實現(xiàn)。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述酶為特異內(nèi)蛋白酶。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述內(nèi)蛋白酶選自下列組中胰島素、Glu-C(V8)蛋白酶、內(nèi)蛋白酶Arg-C(絲氨酸蛋白酶)、內(nèi)蛋白酶Arg-C(半胱氨酸蛋白酶)、Asn-N蛋白酶，以及Lys-C蛋白酶。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述蛋白酶為胰島素。
52.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述碎裂通過將第二結(jié)合配偶體與液相化學(xué)制劑接觸來實現(xiàn)。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述化學(xué)制劑為CNBr。
54.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，在所述第二結(jié)合配偶體與第一結(jié)合配偶體結(jié)合之后，第二結(jié)合配偶體碎裂之前，進(jìn)一步包括以下步驟使所述第二結(jié)合配偶體改變性質(zhì)。
55.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，在碎裂所述第二結(jié)合配偶體之后，進(jìn)一步包括以下步驟用第一洗脫液洗滌所述探針。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，在用第一洗脫液洗滌所述探針之后，用串聯(lián)質(zhì)譜儀測量來探測碎片之前，進(jìn)一步包括以下步驟用第二洗脫液洗滌所述探針，第二洗脫液至少在某一洗脫特征方面與第一洗脫液有所不同。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中洗脫特征選自下列組中pH、離子強度、去污強度，以及疏水性。
58.根據(jù)權(quán)利要求1或55的方法，在碎裂之后，探測所述碎片之前，進(jìn)一步包括以下步驟對所述探針應(yīng)用能量吸收分子。
59.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，在碎裂之后，探測所述碎片之前，進(jìn)一步包括以下步驟將探針嚙合到分析儀器的親和捕獲探針接口中，所述分析儀器包括激光解吸電離源；親和捕獲探針接口；以及串聯(lián)質(zhì)譜儀，其中所述親和捕獲探針接口能夠嚙合一個親和捕獲探針并將其定位在與激光源處于可查詢的關(guān)系且同時與串聯(lián)質(zhì)譜儀相聯(lián)；以及然后利用所述激光源將第二結(jié)合配偶體的碎片從探針上解吸并電離。
60.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述串聯(lián)質(zhì)譜儀測量為對所有離子質(zhì)量的測量。
61.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述串聯(lián)質(zhì)譜儀測量為對碎片的一個子集的質(zhì)量的測量。
62.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述串聯(lián)質(zhì)譜儀測量為單離子監(jiān)控測量。
63.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，在所述探測之后，進(jìn)一步包括以下步驟將所述碎片測量結(jié)果與將碎裂酶的裂解規(guī)則應(yīng)用到第二結(jié)合配偶體的初級氨基酸序列上所預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行比較。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，在所述探測之后和所述比較之前，進(jìn)一步包括以下步驟通過ms/ms分析鑒定所述第二結(jié)合配偶體。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中所述通過ms/ms分析的鑒定包括以下步驟利用質(zhì)譜分析選擇所述第二結(jié)合配偶體的第一碎片；在氣相中分離所述第二結(jié)合配偶體第一碎片；測量所述第二結(jié)合配偶體第一碎片的碎片譜，以及然后將所述碎片譜與預(yù)先添加在數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列數(shù)據(jù)所預(yù)測的碎片譜進(jìn)行比較。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中所述氨基酸序列數(shù)據(jù)選自經(jīng)驗數(shù)據(jù)或預(yù)測數(shù)據(jù)。
67.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中所述分離為碰撞誘導(dǎo)分離。
68.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一結(jié)合配偶體為抗體。
69.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一結(jié)合配偶體為T細(xì)胞受體。
70.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一結(jié)合配偶體為MHC分子。
71.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一結(jié)合配偶體為受體而第二結(jié)合配偶體為該受體的激動劑。
72.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一結(jié)合配偶體為受體而第二結(jié)合配偶體為該受體的部分激動劑。
73.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一結(jié)合配偶體為受體而第二結(jié)合配偶體為該受體的拮抗劑。
74.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一結(jié)合配偶體為受體而第二結(jié)合配偶體為該受體的部分拮抗劑。
75.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一結(jié)合配偶體為糖蛋白受體而第二結(jié)合配偶體為外源凝集素。
全文摘要
本發(fā)明給出了包括親和捕獲探針接口、激光解吸電離源以及串聯(lián)質(zhì)譜儀的分析儀器。還給出了用于蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)及識別和利用本發(fā)明的儀器來表征分子間相互作用的新方法。
文檔編號G01N33/483GK1474944SQ00819963
公開日2004年2月11日 申請日期2000年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月12日
發(fā)明者斯科特·維恩伯格, 蒂娜·莫里斯, 斯科特 維恩伯格, 莫里斯 申請人:塞弗根生物系統(tǒng)股份有限公司, 人類基因組科學(xué)公司