專利名稱：一種用醋酸纖維絲制備金屬螯合親和色譜介質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親和色譜，具體地說是一種用醋酸纖維絲制備金屬螯合親和色譜介質(zhì)的方法。
在現(xiàn)有技術(shù)中，在基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)中，分離純化的費用常常占生產(chǎn)成本中的主要部分，采用親和色譜，可以大大降低基因工程產(chǎn)品的費用，提高產(chǎn)品的純度和收率。親和色譜是進行蛋白質(zhì)及多肽、糖類、抗原抗體、生化藥物、基因工程產(chǎn)品純化分離的最有效的手段，作為金屬螯合親和色譜的介質(zhì)，目前主要有瓊脂糖，顆粒狀的纖維素，交聯(lián)瓊脂糖，聚丙烯或聚丙烯酰胺，玻璃中空纖維微孔濾膜，分析濾紙等，文獻1喬·利西恩·等，固定化金屬離子親和色譜中配體密度對分離人生長激素的影響，《色譜雜志A》，76427-33，1997(J.Liesieneet al.，Immobilized metal affinity chromatography of human growth hormone-Effect ofligand density.J.Chromatogr，A，76427-33，1997)公開報道了一種利用瓊脂糖(Sepharose FF)固定化金屬親和介質(zhì)，螯合銅離子，純化重組人生長激素(Somatotropin)的方法。文獻2魏琪，姚汝華，鮑時祥，固定化金屬螯合親和膜色譜柱制備及純化銅鋅超氧化物酶的研究，《色譜》18(4)361-363，2000，公開報道了一種纖維素分析濾紙為介質(zhì)，螯合銅離子，親和純化溶菌酶的技術(shù)路線。文獻3奧·維·帕特沃德汗和馬·墨·阿特艾，固定化金屬離子親和色譜中結(jié)合位點和pH對牛血清白蛋白親和容量的影響，《色譜雜志A》，76711-23，1997(A.V.Patwardhan M.M.Ataai.，Site accessibility and the pH dependence of thesaturation capacity of a highly cross-linked matrix immobilized metal affinitychromatography of bovine serum albumin on chelating superose..J.Chromtogr.A，76711-23，1997)，公開報道了一種用Sepharose FF固定化金屬親和介質(zhì)，螯合銅離子，研究該介質(zhì)對牛血清白蛋白的親和能力。根據(jù)西格馬《生化試劑與一般試劑》2000-2001(Sigma，“Biochemicals and Reagents”，2000-2001)報道，采用Pharmacia公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B為基質(zhì)材料，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化、偶聯(lián)亞氨基二乙酸，螯合金屬銅離子，其銅離子負載量為50～100微摩爾/克介質(zhì)；A.V.Patwardhan等利用Sepharose FF固定化金屬親和介質(zhì)，螯合銅離子，研究了該介質(zhì)對牛血清白蛋白的親和能力，在pH5～7范圍內(nèi)，飽和吸附量為140毫克/克介質(zhì)。然而，目前一般使用的介質(zhì)或是價格昂貴，或是負載量低。
本發(fā)明的目的是提供一種價格低、負載量高、生物相容性好、可反復(fù)利用的用醋酸纖維絲制備金屬螯合親和色譜介質(zhì)的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是按如下步驟操作(1)取醋酸纖維絲基材，對其進行活化將醋酸纖維絲基材，浸入濃度為0.5～1M的堿溶液中，加入環(huán)氧氯丙烷或1，4-丁二醇二縮水甘油醚、再加入硼氫化鈉，制成活化液，室溫下反應(yīng)18～30小時，或55～65℃情況下反應(yīng)1～4小時，來活化醋酸纖維絲上的羥基，洗滌至pH值為中性；其中醋酸纖維絲基材與加入的活化液重量比例為0.1～10∶10～50；(2)制備醋酸纖維絲金屬螯合介質(zhì)加入偶聯(lián)金屬螯合劑，用濃度1.0～12M的碳酸鹽，加配亞氨基二乙酸或亞氨基三乙酸制成偶聯(lián)液，55～65℃下反應(yīng)10～24小時，洗滌至pH值為中性；其中醋酸纖維絲基材與偶聯(lián)液重量比例為0.1～10∶10～50；(3)制備醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)將上述中間產(chǎn)品醋酸纖維絲金屬螯合介質(zhì)，加入40～60mM硫酸銅溶液或氯化銅溶液，室溫下吸附30min～20小時，洗滌4～6次即可，其中醋酸纖維絲金屬螯合介質(zhì)與硫酸銅溶液或氯化銅溶液的重量比例為0.1～10∶10～50；所述醋酸纖維絲基材為醋酸纖維絲本身、醋酸纖維絲的填充物、醋酸纖維絲經(jīng)物理加工制成的濾棒、濾餅、濾紙、濾膜；所述活化液中堿溶液與環(huán)氧氯丙烷或1，4-丁二醇二縮水甘油醚的體積百分比為10～30％環(huán)氧氯丙烷或1，4-丁二醇二縮水甘油醚，余量為堿溶液，再加入活化液重量的0.1～0.3％硼氫化鈉；所述堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀；所述偶聯(lián)液中碳酸鹽與亞氨基二乙酸或亞氨基三乙酸的摩爾比例為20～30∶1～3；所述碳酸鹽為碳酸鉀、碳酸鈉或碳酸氫鈉。
本發(fā)明原理如下本發(fā)明所述環(huán)氧氯丙烷或1，4-丁二醇二縮水甘油醚首先與醋酸纖維絲上的羥基共價連接，形成含有單環(huán)氧環(huán)的介質(zhì)，然后再與亞氨基二乙酸或亞氨基三乙酸上的亞氨基共價反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價交聯(lián)介質(zhì)；本發(fā)明所述醋酸纖維絲濾棒醋酸纖維素制成，成型時加固化劑以使粘附，并提高吸附力，易潤濕于水溶液中。長100毫米，直徑7.7毫米，重0.615克，吸阻2100～2300帕。橫斷剪開，纖維不松散，無毛刺，相互纏繞，但經(jīng)5M NaOH浸泡3天，產(chǎn)生大量小纖維，松散。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.生物相容性好。采用本發(fā)明方法，以醋酸纖維絲為基材制成的金屬螯合親和色譜介質(zhì)，對銅離子的負載量高達92.1微摩爾/克介質(zhì)，與現(xiàn)有技術(shù)中的負載量相當(dāng)；對牛血清白蛋白進行了親和能力的考察，親和吸附量可達59毫克/克介質(zhì)。
2.采用本發(fā)明方法制成的金屬螯合親和色譜介質(zhì)成本低，每克成本低于1元，而每克瓊脂糖凝膠大于需20元，可反復(fù)利用。
3.應(yīng)用范圍廣。采用本發(fā)明方法所得的金屬螯合親和色譜介質(zhì)，是一種帶通用型配基的親和色譜介質(zhì)，它利用銅、鋅、鈷、鎳等金屬離子與蛋白質(zhì)或多肽表面上的組氨酸、半胱氨酸或色氨酸的配位螯合作用，達到親和純化的效果，因此可用來純化蛋白質(zhì)，它不僅可應(yīng)用于牛血清白蛋白、天然蛋白質(zhì)、天然多肽、天然含組氨酸、半胱氨酸或色氨酸的生物物質(zhì)的親和純化，還可應(yīng)用于親和色譜操作，其對象是基因工程蛋白質(zhì)、基因工程多肽、含組氨酸、半胱氨酸或色氨酸的基因工程小肽，或含組氨酸、半胱氨酸或色氨酸的基因工程生物物質(zhì)。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
實施例1取醋酸纖維絲基材，對其進行活化取四份香煙過濾嘴的醋酸纖維絲濾棒，每份重0.126克，加入15毫升活化液(含0.6M氫氧化鈉13毫升，1，4-丁二醇二縮水甘油醚2毫升，活化液重量的0.2％硼氫化鈉)的錐形瓶中，室溫下振蕩10小時，來活化醋酸纖維絲上的羥基；濾棒用大量蒸餾水洗滌至pH中性；制備醋酸纖維絲金屬螯合介質(zhì)加入15毫升偶聯(lián)金屬螯合液，具體為用2M碳酸鉀15毫升，加入0.20克亞氨基二乙酸，60℃反應(yīng)24小時，濾棒用大量蒸餾水洗滌至pH中性；制備醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)將上述中間產(chǎn)品醋酸纖維絲金屬螯合介質(zhì)，加入50mM硫酸銅溶液20毫升，室溫下振蕩過夜，吸附10小時；濾棒經(jīng)蒸餾水洗滌5次后，即得到醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)。
將上述方法所得的醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)1份，經(jīng)0.2M pH5.0檸檬酸緩沖液洗脫銅離子，采用2-[(5-溴-2-吡啶)偶氮]-5-二乙氨基苯酚顯色、560nm吸光度法測定銅離子的含量，結(jié)果表明醋酸纖維絲上螯合的銅離子的量為66.7微摩爾/克介質(zhì)；用上述方法所得的醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)1份進行親和純化經(jīng)0.02M pH7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(含0.5M氯化鈉)洗滌一次，加入5毫升2毫克/毫升的牛血清白蛋白溶液，室溫下放置過夜，用0.02M pH7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(含0.5M氯化鈉)洗滌六次，以6毫升50mM乙二胺四乙酸鈉(0.02M pH7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液，0.5M氯化鈉)洗脫，采用考馬斯亮蘭染色法、在595nm測定洗脫液中牛血清白蛋白的含量。經(jīng)計算，所述醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)對牛血清白蛋白的親和吸附量為54.4毫克/克介質(zhì)。
其操作方式為間歇式，所采用的親和色譜裝置為填充柱。
實施例2取醋酸纖維絲基材，對其進行活化取四份香煙過濾嘴的醋酸纖維絲濾棒，每份重0.120克，加入含14毫升活化液(含0.5M氫氧化鉀12.5毫升，環(huán)氧氯丙烷1.5毫升，活化液重量的0.1％硼氫化鉀)的錐形瓶中，室溫下振蕩20小時，來活化醋酸纖維上的羥基；濾餅用大量蒸餾水洗滌至pH中性；制備醋酸纖維絲金屬螯合介質(zhì)，加入15毫升偶聯(lián)金屬螯合液用濃度5M的碳酸鈉15毫升，加入0.20克亞氨基三乙酸，60℃反應(yīng)24小時，濾棒用大量蒸餾水洗滌至pH中性；制備醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)將上述中間產(chǎn)品醋酸纖維金屬螯合介質(zhì)，加入50mM硫酸銅溶液20毫升，室溫下振蕩過夜，濾棒經(jīng)蒸餾水洗滌5次后，即得到醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)。
將上述方法所得的醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)1份，經(jīng)0.2M pH5.0檸檬酸緩沖液洗脫銅離子，采用2-[(5-溴-2-吡啶)偶氮]-5-二乙氨基苯酚顯色、560nm吸光度法測定銅離子的含量，結(jié)果表明醋酸纖維絲上螯合的銅離子的量為92.1微摩爾/克介質(zhì)；
用上述方法所得的醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)1份進行親和純化經(jīng)0.02M pH7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(含0.5M氯化鈉)洗滌一次，加入5毫升2毫克/毫升的天然蛋白質(zhì)溶液，室溫下放置過夜，用0.02M pH7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(含0.5M氯化鈉)洗滌六次，以6毫升50mM乙二胺四乙酸鈉(0.02M pH7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液，0.5M氯化鈉)洗脫，采用考馬斯亮蘭染色法、在595nm測定洗脫液中牛血清白蛋白的含量。經(jīng)計算，所述醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)對牛血清白蛋白的親和吸附量為59毫克/克介質(zhì)。
其操作方式為連續(xù)式，所采用的親和色譜裝置為過濾器。
實施例3與實施例1不同之處在于取醋酸纖維絲基材，對其進行活化取香煙過濾嘴的醋酸纖維絲濾棒，重5克，加入含50毫升活化液(含1.0M氫氧化鉀45毫升，環(huán)氧氯丙烷5毫升，活化液重量的0.1％硼氫化鉀)的錐形瓶中，55℃下反應(yīng)1小時，來活化醋酸纖維上的羥基；濾餅用大量蒸餾水洗滌至pH中性；制備醋酸纖維金屬螯合介質(zhì)，加入50毫升偶聯(lián)金屬螯合液用濃度5M的碳酸鈉50毫升，加入5克亞氨基三乙酸，65℃反應(yīng)20小時，濾棒用大量蒸餾水洗滌至pH中性；制備醋酸纖維金屬螯合親和色譜介質(zhì)將上述中間產(chǎn)品醋酸纖維金屬螯合介質(zhì)，加入40mM硫酸銅溶液50毫升，室溫下吸附20小時，濾棒經(jīng)蒸餾水洗滌6次后，即得到醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)。
實施例4與實施例1不同之處在于
(1)取醋酸纖維絲為基材，對其進行活化取香煙過濾嘴的醋酸纖維絲濾餅，重10克，加入含50毫升活化液(含0.6M氫氧化鉀35毫升，1，4-丁二醇二縮水甘油醚15毫升，活化液重量的0.3％硼氫化鉀)的錐形瓶中，50℃反應(yīng)4小時，來活化醋酸纖維上的羥基；濾膜用大量蒸餾水洗滌至pH中性；(2)制備醋酸纖維金屬螯合介質(zhì)加入50毫升偶聯(lián)金屬螯合液，具體為用濃度12M的碳酸鉀50毫升，加入8克亞氨基二乙酸，55℃反應(yīng)11小時，濾棒用大量蒸餾水洗滌至pH中性；(3)制備醋酸纖維金屬螯合親和色譜介質(zhì)將上述中間產(chǎn)品醋酸纖維金屬螯合介質(zhì)，加入60mM氯化銅溶液50毫升，室溫下，吸附30分鐘，濾棒經(jīng)蒸餾水洗滌4次后，即得到醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)。
另外，本發(fā)明所述醋酸纖維絲基材還可以是醋酸纖維絲本身或其他醋酸纖維絲的填充物、醋酸纖維絲經(jīng)物理加工制成的濾紙、濾膜；本發(fā)明制備醋酸纖維金屬螯合介質(zhì)時也可在加入偶聯(lián)金屬螯合劑使用碳酸氫鈉；本發(fā)明還可用于天然蛋白質(zhì)、天然多肽、天然含組氨酸、半胱氨酸或色氨酸的生物物質(zhì)的親和純化；采用所述的醋酸纖維絲金屬螯合介質(zhì)進行親和色譜操作，其對象還可以是基因工程蛋白質(zhì)、基因工程多肽、含組氨酸、半胱氨酸或色氨酸的基因工程小肽，或含組氨酸、半胱氨酸或色氨酸的基因工程生物物質(zhì)；其操作方式還可以為半連續(xù)式，所采用的親和色譜裝置還可以為過濾板或含有上述介質(zhì)的其它容器。
權(quán)利要求
1.一種用醋酸纖維絲制備金屬螯合親和色譜介質(zhì)的方法，其特征在于按如下步驟操作(1)取醋酸纖維絲基材，對其進行活化將醋酸纖維絲基材，浸入濃度為0.5～1M的堿溶液中，加入環(huán)氧氯丙烷或1，4-丁二醇二縮水甘油醚、再加入硼氫化鈉，制成活化液，室溫下反應(yīng)18～30小時，或55～65℃情況下反應(yīng)1～4小時，來活化醋酸纖維絲上的羥基，洗滌至pH值為中性；其中醋酸纖維絲基材與加入的活化液重量比例為0.1～10∶10～50；(2)制備醋酸纖維絲金屬螯合介質(zhì)偶聯(lián)金屬螯合劑，用濃度1.0～12M的碳酸鹽，加配亞氨基二乙酸或亞氨基三乙酸制成偶聯(lián)液，55～65℃下反應(yīng)10～24小時，洗滌至pH值為中性；其中醋酸纖維絲基材與偶聯(lián)液重量比例為0.1～10∶10～50；(3)制備醋酸纖維絲金屬螯合親和色譜介質(zhì)將上述中間產(chǎn)品醋酸纖維絲金屬螯合介質(zhì)，加入40～60mM硫酸銅溶液或氯化銅溶液，室溫下吸附30min～20小時，洗滌4～6次即可，其中醋酸纖維絲金屬螯合介質(zhì)與硫酸銅溶液或氯化銅溶液的重量比例為0.1～10∶10～50。
2.按照權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于所述醋酸纖維絲基材為醋酸纖維絲本身、醋酸纖維絲的填充物、醋酸纖維絲經(jīng)物理加工制成的濾棒、濾餅、濾紙、濾膜。
3.按照權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于所述活化液中堿溶液與環(huán)氧氯丙烷或1，4-丁二醇二縮水甘油醚的體積百分比為10～30％環(huán)氧氯丙烷或1，4-丁二醇二縮水甘油醚，余量為堿溶液，再加入活化液重量的0.1～0.3％硼氫化鈉。
4.按照權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于所述偶聯(lián)液中碳酸鹽與亞氨基二乙酸或亞氨基三乙酸的摩爾比例為20～30∶1～3。
5.按照權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于所述碳酸鹽為碳酸鉀、碳酸鈉或碳酸氫鈉。
6.按照權(quán)利要求1或3所述制備方法，其特征在于所述堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀。
全文摘要
一種用醋酸纖維絲制備金屬螯合親和色譜介質(zhì)的方法。將醋酸纖維絲基材浸入濃度為0.5～1M的堿溶液中,加環(huán)氧氯丙烷或1,4－丁二醇二縮水甘油醚、再加硼氫化鈉,制成活化液,室溫反應(yīng)18～30小時,洗滌至pH值為中性;加濃度1.0～12M的碳酸鹽,加配亞氨基二乙酸制成偶聯(lián)液,55～65℃下反應(yīng)10～24小時,洗滌至pH值為中性;再加入40～60mM硫酸銅溶液或氯化銅溶液,室溫下吸附30min～20小時,洗滌4～6次。它價格低、負載量高、生物相容性好、可反復(fù)利用。
文檔編號G01N30/02GK1376919SQ0110634
公開日2002年10月30日 申請日期2001年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月23日
發(fā)明者李京華, 商振華, 魏桂林, 于億年, 劉學(xué)良 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所