專利名稱：對(duì)艾滋病與丙型肝炎病毒抗體的聯(lián)合快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是可用于對(duì)Ⅰ型和Ⅱ型艾滋病病毒抗體和丙型肝炎病毒抗體進(jìn)行聯(lián)合快速檢測(cè)的方法。
艾滋病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)在人群中的一個(gè)重要傳播和感染途徑是血液或血液制品。目前對(duì)這兩種病毒的血清學(xué)診測(cè)方法可有兩種(1)檢測(cè)病毒抗原或人體內(nèi)相應(yīng)抗體的免疫學(xué)方法，如常用的酶聯(lián)免疫法和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)；(2)以聚合酶鏈?zhǔn)椒糯蠓磻?yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的檢測(cè)病毒基因組的核酸檢測(cè)技術(shù)和方法。上述的免疫學(xué)方法現(xiàn)在對(duì)這兩類病毒還尚難直接對(duì)該相應(yīng)的抗原進(jìn)行檢測(cè)，在臨床和血站等醫(yī)療、防疫單位均采用的是對(duì)機(jī)體內(nèi)的相應(yīng)抗體進(jìn)行檢測(cè)的方式。其中的酶聯(lián)免疫法因費(fèi)用較低、一次可檢測(cè)多達(dá)近百個(gè)樣本和可進(jìn)行機(jī)械化操作，以及其靈敏度和特異性較好，已成為目前最廣為使用的一種方法，但其檢測(cè)所需時(shí)間為4-8小時(shí)，不能滿足如海關(guān)、防疫部門(mén)和血站等對(duì)受染者或獻(xiàn)血員等進(jìn)行快速鑒別檢測(cè)的特殊要求。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)的檢測(cè)費(fèi)用昂貴，且檢測(cè)所用時(shí)間更長(zhǎng)，要超過(guò)一天。上述的核酸檢測(cè)技術(shù)和方法，是目前對(duì)艾滋病病毒和丙型肝炎病病毒最常用的確認(rèn)手段，但也還存在有檢測(cè)費(fèi)用高和檢測(cè)耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，且進(jìn)行檢測(cè)時(shí)常需有大規(guī)模樣本時(shí)才能開(kāi)機(jī)進(jìn)行一次，同樣也無(wú)法滿足海關(guān)、防疫和血站等單位或部門(mén)對(duì)快速鑒別檢測(cè)的特殊要求，以及中、小醫(yī)療單位對(duì)檢測(cè)工作的開(kāi)展，而且其結(jié)果還會(huì)因?qū)嶒?yàn)室器械的污染而造成假陽(yáng)性。此外，這些方法共同的一點(diǎn)是還均要求有較大型的儀器設(shè)備的支持，使缺乏成套檢驗(yàn)設(shè)備和能力的醫(yī)療單位及時(shí)做出診斷感到困難。除一次檢測(cè)周期需耗時(shí)數(shù)小時(shí)甚至更長(zhǎng)外，其一次檢測(cè)也只能對(duì)艾滋病毒或丙型肝炎病毒進(jìn)行分開(kāi)的單項(xiàng)檢測(cè)，也是不能滿足中、小型醫(yī)院、血站、海關(guān)等對(duì)待檢測(cè)對(duì)象必須做出迅速檢測(cè)判斷需要一個(gè)重要方面。
在公開(kāi)號(hào)為CN 1140090A的中國(guó)專利文獻(xiàn)中曾提出了一種“人類免疫缺陷病毒丙肝病毒抗體聯(lián)合診斷試劑的制備方法”，該方法是將艾滋病毒和丙肝病毒的抗原用pH9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋制成診斷試劑包被液，然后將其包被于聚苯乙烯、聚乙烯、纖維素、硝酸纖維素、醋酸纖維素、玻璃材料及細(xì)胞等載體之上。按該文獻(xiàn)方法制備的檢測(cè)載體及其所適用的檢測(cè)方法，實(shí)際上仍是一種基于或等同于目前以孔板或類似方式進(jìn)行的上述酶聯(lián)免疫法。該方法除檢測(cè)的全程操作時(shí)間仍超過(guò)6小時(shí)外，由于其檢測(cè)方式是在同一檢測(cè)孔中同時(shí)檢測(cè)HIV和HCV兩種抗體，因此對(duì)檢測(cè)中所顯示出的陽(yáng)性結(jié)果尚無(wú)法直接判斷究竟是屬于HIV陽(yáng)性還是HCV陽(yáng)性，抑或是這二者兼而有之，因而還必須要求作第二次的HIV或HCV單項(xiàng)檢測(cè)，以區(qū)別和確定該陽(yáng)性結(jié)果的歸屬，使檢測(cè)的時(shí)間至少又要延長(zhǎng)2天。
鑒于此，本發(fā)明首先的一個(gè)目的是提供一種能對(duì)Ⅰ型和Ⅱ型艾滋病病毒抗體及丙型肝炎病毒抗體進(jìn)行聯(lián)合快速檢測(cè)的方法。在此基礎(chǔ)上本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能對(duì)被檢測(cè)樣品在Ⅰ型和Ⅱ型艾滋病病毒抗體及丙型肝炎病毒抗體中是否存在有單項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性情況進(jìn)行聯(lián)合快速檢測(cè)的方法。
本發(fā)明對(duì)艾滋病與丙型肝炎病毒抗體的聯(lián)合快速檢測(cè)方法是，在包被于同一支持物上的載體表面設(shè)置有含艾滋病毒(HIV)抗原、丙型肝炎病毒(HCV)抗原以及高、低兩種濃度的二硝基酚(DNP)內(nèi)部對(duì)照成分在內(nèi)的包被檢測(cè)區(qū)，將被檢測(cè)樣品點(diǎn)加于所說(shuō)的包被檢測(cè)區(qū)所在部位一端外的載體表面處并使其向包被檢測(cè)區(qū)的另一端作正向的第一次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散，至全部覆蓋包被檢測(cè)區(qū)后，自上述包被檢測(cè)區(qū)所在部位的另一端用由緩沖液溶解的已與抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的示蹤標(biāo)記物質(zhì)向上述被檢測(cè)樣品點(diǎn)加端作逆向的第二次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散，至再次全部覆蓋上述包被檢測(cè)區(qū)后，檢測(cè)和比較示蹤標(biāo)記物質(zhì)對(duì)包被檢測(cè)區(qū)中各病毒抗原和對(duì)照檢測(cè)成分的沉積量，得到檢測(cè)判別結(jié)果。
對(duì)于上述所說(shuō)的包被于支持物上的載體，可以為在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的硝基纖維素膜、聚苯乙烯膜、聚乙烯膜、尼龍膜、纖維素膜、醋酸纖維素膜、玻璃纖維膜等固體形式的載體。
上述方法中所說(shuō)的用緩沖液溶解的已與抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的示蹤標(biāo)記物質(zhì)可以包括生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中常用的能用肉眼進(jìn)行觀察和判別，或者是不能由肉眼直接觀察而須以相應(yīng)儀器進(jìn)行分析判讀的各類示蹤標(biāo)記物質(zhì)或顯色性物質(zhì)。這些可供使用的示蹤標(biāo)記物質(zhì)或顯色性物質(zhì)，可以包括目前已有報(bào)導(dǎo)和使用的顆粒顯色劑、發(fā)光標(biāo)記物、比色標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、化學(xué)標(biāo)記物、酶、放射性標(biāo)記物、或射頻標(biāo)記物、金屬膠體、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物等多種類型。進(jìn)一步以其中的顆粒顯色劑為例，其又可以有膠體金顆粒(如顆粒度為16-30納米的三羥四氯金精酸膠體金材料)、銀顆粒、有機(jī)分子、脂質(zhì)體或有機(jī)聚合物膠體顆粒等多種形式。使用時(shí)可以根據(jù)檢測(cè)的實(shí)際需要和/或與相關(guān)的檢測(cè)判讀儀器設(shè)備相互適配選用。對(duì)上述使所說(shuō)的示蹤標(biāo)記物質(zhì)或顯色物質(zhì)在各包被檢測(cè)區(qū)中由其顯色情況和/或程度所表明的沉積量進(jìn)行檢測(cè)和分析判斷，是本發(fā)明上述檢測(cè)方法的關(guān)鍵。雖然對(duì)在各包被檢測(cè)區(qū)中示蹤標(biāo)記或顯色性物質(zhì)的沉積量可以采用以肉眼直接觀察的方式進(jìn)行檢測(cè)判別，但通過(guò)儀器或設(shè)備進(jìn)行的檢測(cè)和判別一般情況下顯然更為客觀和準(zhǔn)確可靠。
在本發(fā)明的上述檢測(cè)方法中，根據(jù)所使用的示蹤標(biāo)記物質(zhì)或顯色物質(zhì)的種類和/或示蹤顯示特性的不同，在包被于支持物上的載體表面設(shè)置的含艾滋病毒(HIV)抗原、丙型肝炎病毒(HCV)抗原以及高、低兩種濃度的二硝基酚(DNP)內(nèi)部對(duì)照成分的包被檢測(cè)區(qū)的方式也可以相應(yīng)有所不同。例如，若將HIV、HCV及高、低兩濃度DNP內(nèi)部對(duì)照成分分別以不同種類或不同示蹤顯示特性的示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)相偶合時(shí)，所說(shuō)的該四種檢測(cè)用的抗原和內(nèi)部對(duì)照成分即可以以共同混合物的形式包被于所說(shuō)載體表面的同一檢測(cè)區(qū)域中；使用時(shí)只需根據(jù)其各自所偶合的示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)再行或特性對(duì)這四種檢測(cè)用成分分別進(jìn)行各自的檢測(cè)和判讀，即能準(zhǔn)確得到相應(yīng)的示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)分別在該四種檢測(cè)用成分中的沉積量數(shù)據(jù)，用于檢測(cè)結(jié)果的判斷。若所說(shuō)的該四種檢測(cè)用成分中有兩種或兩種以上的成分使用的是同一種示蹤標(biāo)記物質(zhì)或顯色物質(zhì)，則使用該同一示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)的檢測(cè)用成分顯然只能通過(guò)將其分別包被在所說(shuō)載體表面的不同區(qū)域，才能使其各自的沉積量能相互區(qū)別和被分別地檢測(cè)和判讀。其中，采用后者的示蹤標(biāo)記方式在實(shí)際使用中有時(shí)會(huì)顯示出如有利于用肉眼直接進(jìn)行觀察判別操作等一定的簡(jiǎn)便性。例如，使所說(shuō)的艾滋病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原以及高、低兩種濃度的二硝基酚內(nèi)部對(duì)照成分的包被檢測(cè)區(qū)在包被于支持物上的載體表面為沿同一排布方向以保持有間隔距離的方式單獨(dú)分別設(shè)置，就是在采用上述后者方式時(shí)可供選擇的具體設(shè)置方式之一。
本發(fā)明上述檢測(cè)方法的工作過(guò)程和原理是將血清、血漿、全血或其它體液形式的被檢測(cè)樣品標(biāo)本點(diǎn)加在所說(shuō)的各包被檢測(cè)區(qū)所在部位排布方向一端外的載體表面處，并使其在通常的毛細(xì)管層析作用和水平側(cè)流擴(kuò)散作用，或是以其它適當(dāng)方式的作用下向各包被檢測(cè)區(qū)排布方向的另一端作正向的第一次的浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散，至全部覆蓋各包被檢測(cè)區(qū)的過(guò)程中，若被檢測(cè)樣品標(biāo)本中含有HIV和/或HCV抗體，則其將與已在載體表面的各相應(yīng)包被檢測(cè)區(qū)中相應(yīng)的HIV和/或HCV抗原反應(yīng)，形成抗原一抗體第一免疫復(fù)合物。此時(shí)自上述各包被檢測(cè)區(qū)所在部位的另一端用由適當(dāng)緩沖液溶解的已與抗DNP抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的示蹤標(biāo)記物質(zhì)向上述被檢測(cè)樣品點(diǎn)加端作逆向的第二次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散時(shí)，并同時(shí)也推動(dòng)經(jīng)第一次遷移擴(kuò)散至此的被檢測(cè)樣品標(biāo)本液體也向其原點(diǎn)加端作逆向的第二次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散，直至再次全部覆蓋上述各包被檢測(cè)區(qū)。在此第二次的逆向浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散過(guò)程中將發(fā)生的反應(yīng)有(1)被檢測(cè)樣品標(biāo)本中尚未與相應(yīng)包被區(qū)中的相應(yīng)抗原結(jié)合的剩余抗HIV和/或抗HCV抗體再次相遇，繼續(xù)抗原-抗體反應(yīng)并再次形成上述的第一免疫復(fù)合物。
(2)溶解于適當(dāng)緩沖液中與顯色性物質(zhì)相偶合的抗DNP抗體將與已包被于支持物上的載體表面的高、低兩濃度DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)中的DNP相遇而反應(yīng)，形成供內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)用的另一種抗原-抗體復(fù)合物，并使示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)被沉積在這兩個(gè)內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)中。實(shí)驗(yàn)表明在此兩個(gè)內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)中示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)的沉積量與被包被在載體上的DNP的量之間存在有線性相關(guān)關(guān)系。
(3)溶解于適當(dāng)緩沖液中與示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)相偶合的抗人丙種球蛋白抗體將與已在載體上包被的相應(yīng)檢測(cè)區(qū)中形成的HIV-抗HIV和/或HCV-抗HCV第一免疫復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)，并在該第一免疫復(fù)合物上形成最終的抗原-抗體-抗人丙種球蛋白抗體-示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)的第二免疫復(fù)合物，使示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)也分別沉積在已結(jié)合有HIV抗體和/或HCV抗體的相應(yīng)檢測(cè)區(qū)中而顯色或以其它相應(yīng)方式顯示，從而能被相應(yīng)的掃描和判讀儀器或是其它適當(dāng)?shù)挠^察或判別方式以定性和/或定量地得出檢測(cè)結(jié)果。
上述對(duì)被檢測(cè)樣品標(biāo)本中抗HIV和/或抗HCV抗體的檢測(cè)反應(yīng)和全過(guò)程可表示為被檢樣品中的抗HIV和/或抗HCV抗體(正向第一次遷移擴(kuò)散)-→與已包被的HIV和/或HCV抗原結(jié)合生成第一免疫復(fù)合物-→(逆向第二次遷移擴(kuò)散)再同已與示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)相偶合的抗人丙種球蛋白抗體結(jié)合生成第二免疫復(fù)合物-→示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)在相應(yīng)包被檢測(cè)區(qū)中沉積和顯色或顯示-→對(duì)示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)的沉積量進(jìn)行檢測(cè)和分析并作出檢測(cè)結(jié)果判斷。
在本發(fā)明的上述檢測(cè)方法中，各包被檢測(cè)區(qū)中的高、低兩種濃度的DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)的設(shè)置是必要的。由于被檢測(cè)樣品點(diǎn)加后進(jìn)行的第一次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散，以及用溶解緩沖液進(jìn)行的第二次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散過(guò)程，有可能會(huì)受某些因素影響而產(chǎn)生足以對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾或影響的異常，因此設(shè)置低濃度DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)并通過(guò)對(duì)其中示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)的沉積量進(jìn)行檢測(cè)，可以用于判斷該次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散過(guò)程是否正常，以判斷該次檢驗(yàn)是否有效。在證明了此次檢測(cè)過(guò)程正常有效的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)高濃度DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)中示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)的沉積量的檢測(cè)，即可被用于對(duì)HIV和/或HCV檢測(cè)區(qū)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行定量性的分析和判斷。例如，可通過(guò)相應(yīng)的掃描或判讀儀器對(duì)高濃度DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)中由示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)的沉積量所決定的如光密度值等檢測(cè)值，與在HIV和/或HCV抗原檢測(cè)區(qū)中同樣由示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)沉積量所表現(xiàn)出的該檢測(cè)值間的比值或其它形式的相關(guān)關(guān)系，與預(yù)設(shè)的檢測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行對(duì)照，從而即可對(duì)被檢測(cè)樣品標(biāo)本中的抗HIV和/或抗HCV抗體在該次檢測(cè)中的結(jié)果做出陰性或陽(yáng)性的準(zhǔn)確判別。
上述方法中所說(shuō)的在載體表面各包被檢測(cè)區(qū)的包被形式，可以分別有點(diǎn)狀、片狀、條帶狀等多種形式，為有利于使所點(diǎn)加的被檢測(cè)樣品和用緩沖液溶解的已與抗DNP抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的顯色性物質(zhì)在相應(yīng)的浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散過(guò)程中能與所包被的抗原等檢測(cè)用成分充分接觸和反應(yīng)生成抗原-抗體復(fù)合物，以采用使各包被檢測(cè)區(qū)分別為與試劑進(jìn)行浸潤(rùn)及遷移擴(kuò)散的方向，或是單獨(dú)分散排布的方向相垂直的條狀包被帶的形式為佳。
上述所說(shuō)的在載體表面包被的各檢測(cè)區(qū)采用在同一方向上以保持有間隔距離的方式排布的基礎(chǔ)上，所說(shuō)的包被于支持物上的載體或連同其所包被的支持物，雖然不排除可以采用各種形式，但尤以采用與各包被檢測(cè)區(qū)所設(shè)置的排布方式相適應(yīng)的平面條狀的形式，例如，目前在生物學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)中常用的條形試紙或類似的平面條狀結(jié)構(gòu)就是可供選擇的較理想形式之一。
上述包被于支持物上的載體表面的各包被檢測(cè)區(qū)采用單獨(dú)分別設(shè)置時(shí)，所說(shuō)的HIV抗原包被檢測(cè)區(qū)、HCV抗原包被檢測(cè)區(qū)和高、低兩種濃度DNP內(nèi)部對(duì)照包被檢測(cè)區(qū)在其所在設(shè)置區(qū)域中的排布順序無(wú)需有特別的限定和要求。例如，各包被檢測(cè)區(qū)的排布方式，可以采取將高、低兩種濃度DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)排布在檢測(cè)區(qū)所在區(qū)域兩端位置的形式，也可以采取以一種或兩種濃度的DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)位于HIV和HCV兩抗原檢測(cè)區(qū)之間的方式排布。
由上述內(nèi)容可以理解，使被檢測(cè)樣品和適當(dāng)?shù)脑噭┤芤涸谒f(shuō)的包被于支持物上的載體表面的各包被檢測(cè)區(qū)所在部位進(jìn)行正向和逆向的兩次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散操作，是本發(fā)明檢測(cè)方法中必不可少的。進(jìn)行所說(shuō)的各浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散操作時(shí)，包被于支持物上的載體所處的狀態(tài)一般情況下無(wú)需有特別的限定和要求。例如，所說(shuō)的各次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散過(guò)程的操作可以在處于垂直或斜置狀態(tài)的載體表面進(jìn)行，必要時(shí)還可以在進(jìn)行正向和逆向的兩次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散時(shí)根據(jù)需要對(duì)載體所處的狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整或調(diào)換；也可以使所說(shuō)的浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散過(guò)程的操作為在呈水平狀態(tài)的包被于支持物上的載體上進(jìn)行的方式，并且以采用后者的水平方式較好而方便，更有利于檢測(cè)中載體表面上的試劑以通常的毛細(xì)管層析作用和水平側(cè)流擴(kuò)散過(guò)程的進(jìn)行。檢測(cè)時(shí)，包被有載體及在其上已包被有各檢測(cè)區(qū)的支持物可以被置放于相應(yīng)的試紙盒或其它適當(dāng)形式的置放或承托定位容器中進(jìn)行操作。
在上述所說(shuō)的載體上對(duì)艾滋病毒抗原檢測(cè)區(qū)、丙型肝炎病毒抗原檢測(cè)區(qū)、以及高、低兩種濃度的DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)包被時(shí)所用的緩沖液，可以為目前生物學(xué)試驗(yàn)中常用的pH7.0-7.5含有10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽和1m MEDTA的Tris緩沖液，也可以為pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.02％氯化鉀、0.8％氯化鈉、0.02％磷酸氫二鉀和0.215％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液中的一種。對(duì)HIV抗原檢測(cè)區(qū)和HCV抗原檢測(cè)區(qū)進(jìn)行包被時(shí)所用的抗原濃度和/或包被量，可以根據(jù)檢測(cè)反應(yīng)、檢測(cè)儀器和設(shè)備的需要及其它具體情況，由相應(yīng)的適用性篩選試驗(yàn)確定。例如，包被HIV抗原檢測(cè)區(qū)和HCV抗原檢測(cè)區(qū)時(shí)，可以由已溶解于上述兩種緩沖液之一的HIV和HCV抗原溶液，用上述緩沖液將相應(yīng)抗原分別稀釋成0.1-1毫克/毫升的濃度后，按0.5-1微升/厘米的量進(jìn)行包被。包被高、低兩種濃度的DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)時(shí)，可以用上述的緩沖液將DNP稀釋成濃度分別為3-4毫克/毫升和1-2毫克/毫升后，再按0.5-1微升/厘米的量進(jìn)行包被。
上述方法中所說(shuō)的作逆向第二次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散所用的溶解緩沖液，一般也可根據(jù)需要和實(shí)際情況，按照本領(lǐng)域中的常規(guī)方式經(jīng)適當(dāng)?shù)倪m用性試驗(yàn)篩選確定。例如，在pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.2％氯化鉀、8％氯化鈉、0.2％磷酸氫二鉀和2.15％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液中還含有重量/體積比為0.1％酪蛋白、1％小牛血清白蛋白、0.1％疊氮鈉及體積比為1％的吐溫-20和2毫摩爾EDTA組成的磷酸鹽緩沖液，是可供選擇使用的溶解緩沖液方案之一。
在本發(fā)明的上述檢測(cè)方法中，點(diǎn)加被檢測(cè)樣品的操作，雖無(wú)必要將直接把被檢測(cè)樣品標(biāo)本點(diǎn)加在所說(shuō)的樣品點(diǎn)加部位處的載體表面的方式排除在外，但建議采用的方式是在已覆蓋于該被檢測(cè)樣品點(diǎn)加部位處并用封閉緩沖液作過(guò)封閉處理的醋酸纖維素膜等具有較強(qiáng)吸水性能的纖維素膜材料的樣品吸收墊片上進(jìn)行。這里所說(shuō)的封閉緩沖液可以為在pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.02％氯化鉀、0.8％氯化鈉、0.02％磷酸氫二鉀和0.215％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液中，還含有重量/體積比為1％小牛血清白蛋白、1％Triton X-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1-2％蔗糖和2毫克/毫升兔丙種球蛋白組成的封閉緩沖液。
同樣，用由緩沖液溶解的已與抗DNP抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)向被檢測(cè)樣品點(diǎn)加端作逆向的第二次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散的操作，雖可以采取將所說(shuō)的試劑溶液直接施加在所說(shuō)的各包被檢測(cè)區(qū)所在部位另一端部位處的載體表面的方式，但更好的是建議以采用在設(shè)置于所說(shuō)的各包被檢測(cè)區(qū)所在部位另一端部位處并用已與抗DNP抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)在玻璃纖維膜介質(zhì)材料體表面進(jìn)行包被的化學(xué)偶合物墊片上加入用于溶解和釋放已包被于其上的與抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的示蹤標(biāo)記或顯色物質(zhì)的溶解緩沖液的方式。例如，采用將分別已用三羥四氯金精酸膠體金材料顯色物質(zhì)偶合標(biāo)記的顆粒度為16-30納米的抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體分別均用在pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.11％氯化鉀、4.4％氯化鈉、0.11％磷酸氫二鉀和1.18％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液中還含有重量/體積比為0.05％酪蛋白、1％小牛血清白蛋白、0.1％疊氮鈉及體積比為0.5％的吐溫-20和2mM EDTA所組成的緩沖液溶解并稀釋成濃度為0.5-2毫克/毫升后，按5-10微升/厘米的量進(jìn)行包被，是可供選擇的方式之一。
在上述所說(shuō)的用于偶合標(biāo)記抗人丙種球蛋白抗體顯色物質(zhì)的抗人丙種球蛋白抗體中，一般可采用常用的兔抗人丙種球蛋白抗體，也可以采用鼠抗人丙種球蛋白抗體或羊抗人丙種球蛋白抗體，以及其它生物種或細(xì)胞株所產(chǎn)生的其它形式的抗人丙種球蛋白抗體。根據(jù)其不同的活性指標(biāo)，使用時(shí)包被用的抗人丙種球蛋白抗體的終濃度一般可控制在1-50微克/毫升范圍內(nèi)。
以制備包被用的膠體金抗體偶合物為例，其中所用三羥四氯金精酸膠體金材料的制備，可以將三羥四氯金精酸顆粒用超純水配制成100微克/毫升的溶液并加熱至沸騰后，再加入1％枸櫞酸三鈉至枸櫞酸三鈉的終濃度為130微克/毫升繼續(xù)加熱并保持沸騰5分鐘，在室溫下攪拌冷卻至45℃后經(jīng)濾孔孔徑為0.2微米的介質(zhì)過(guò)濾，再將所得到的膠體金顆粒用200毫摩爾的常用碳酸鹽調(diào)至pH7.0。然后再取濃度分別均為1毫克/毫升的兔抗DNP及兔(或鼠、羊等其它種類)抗人抗體，分別用濾孔孔徑為0.2微米(μm)的介質(zhì)過(guò)濾后，在室溫?cái)嚢柘录尤肷鲜龅哪z體金溶液，使兔抗DNP終濃度為2.5微克/毫升，兔(或鼠、羊等其它種類)抗人抗體的終濃度為1-50微克/毫升，并以充分?jǐn)嚢璧确绞绞鼓z體金與抗體蛋白充分吸附后，在攪拌下加入用濾孔孔徑為0.2微米的介質(zhì)過(guò)濾的小牛血清白蛋白至終濃度為2微克/毫升，超速離心后的沉淀物用含有分子量為20,000、重量/體積比為1％聚乙二醇(PEG)的pH9.0和濃度為2mM的硼酸鹽緩沖液至少洗滌一次，洗滌后的離心沉淀物以1％濃度(w/v)懸浮于其原體積量的硼酸鹽緩沖液中，用濾孔孔徑為0.2微米的介質(zhì)過(guò)濾，用測(cè)定其520納米波長(zhǎng)的光密度值OD520的方法或其它的適當(dāng)方式計(jì)算溶液中抗體-膠體金標(biāo)記物的量。
這里所說(shuō)的化學(xué)偶合物墊片所用的玻璃纖維膜介質(zhì)材料體，最好在包被已與抗DNP抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的顯色物質(zhì)前已用pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.02％氯化鉀、0.8％氯化鈉、0.02％磷酸氫二鉀和0.215％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液中還含有重量/體積比為1％小牛血清白蛋白、1％Triton X-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1-2％蔗糖和2毫克/毫升兔丙種球蛋白組成的封閉緩沖液進(jìn)行過(guò)封閉處理，以避免可能存在的雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生不必要的干擾。
上述所說(shuō)對(duì)化學(xué)偶合物墊片所用的玻璃纖維膜介質(zhì)材料體用封閉緩沖液作封閉處理時(shí)，將被處理的玻璃纖維膜介質(zhì)材料體用封閉緩沖液浸透后，平鋪在網(wǎng)格型支持物上37℃烘干，是可以供選擇采用的處理方式之一。當(dāng)然這并不意味著排除也可以采用現(xiàn)在生物學(xué)試驗(yàn)中對(duì)載體材料進(jìn)行封閉處理中常用的其它適當(dāng)方式進(jìn)行封閉處理。
在所說(shuō)的采用上述在覆蓋于該化學(xué)偶合物墊片上加入溶解緩沖液形式的基礎(chǔ)上，還可以進(jìn)一步采取在已覆蓋于該化學(xué)偶合物墊片上并也已用封閉緩沖液作過(guò)封閉處理的如醋酸纖維素膜或其它具有較強(qiáng)吸水性能的常用纖維素膜材料形式的緩沖液吸收墊片上的方式進(jìn)行。以在pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.02％氯化鉀、0.8％氯化鈉、0.02％磷酸氫二鉀和0.215％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液中還含有重量/體積比為1％小牛血清白蛋白、1％Triton X-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1-2％蔗糖和2毫克/毫升兔丙種球蛋白組成的封閉緩沖液，是在作封閉處理時(shí)可供選則的封閉緩沖液形式之一。
在本發(fā)明上述方法的操作過(guò)程中，被檢測(cè)樣品標(biāo)本點(diǎn)加后，以及在包被于支持物上的載體表面進(jìn)行正向和逆向的兩次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散后，含有被檢測(cè)樣品成分的液體有不同程度的溢出是難以避免的。為避免其外溢對(duì)檢測(cè)環(huán)境及有關(guān)的儀器設(shè)備等的污染，可以在所說(shuō)的與各包被檢測(cè)區(qū)所在部位相反的被檢測(cè)樣品點(diǎn)加部位另一方向的載體部位處，設(shè)置有用于吸收在浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散過(guò)程中溢出液體的液體吸收材料，如常用的具有液體吸收作用的試紙或其它具有液體吸收能力的適當(dāng)材料即可。
大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明的上述方法對(duì)于血清、血漿、全血或其它體液形式的常用被檢測(cè)樣品的標(biāo)本進(jìn)行HIV和HCV兩種病毒抗體的同步聯(lián)合檢測(cè)，一般在15分鐘以內(nèi)，最快僅需幾分鐘即可分別得到相應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果，不僅對(duì)于同時(shí)含有HIV和HCV兩種病毒抗體的樣品可以同時(shí)得到相應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果外，對(duì)于只含有HIV或HCV中的一種病毒的被檢測(cè)樣品同樣可以準(zhǔn)確地區(qū)分并對(duì)所含的該病毒抗體給出相應(yīng)的單項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果。
以下結(jié)合適當(dāng)?shù)母綀D，通過(guò)具體的操作和檢測(cè)實(shí)例對(duì)本發(fā)明上述方法的內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述主題所實(shí)現(xiàn)的同樣技術(shù)均應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。


圖1是可在本發(fā)明方法使用的一種試紙條形式的包被有載體的支持物的結(jié)構(gòu)示意。
圖2是顯示有設(shè)置在圖1試紙條的載體表面各包被檢測(cè)區(qū)可采用的一種排布形式的示意圖。
如圖所示的試紙條中，在平面條狀支持物1的一側(cè)表面包被有硝基纖維素膜6形式的載體，在該硝基纖維素膜6表面的一端以與其呈T形狀態(tài)設(shè)置的由具有液體吸收功能的新華48號(hào)濾紙材料制成的液體吸收墊片2；在與之相對(duì)的硝基纖維素膜6表面的另一端設(shè)置有在已作過(guò)預(yù)封閉處理的玻璃纖維膜表面用與抗DNP抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的膠體金顆粒進(jìn)行包被所制成的化學(xué)偶合物墊片9，其上還覆蓋有也已用封閉緩沖液作過(guò)封閉處理的醋酸纖維素膜緩沖液吸收墊片10。在液體吸收墊片2和化學(xué)偶合物墊片9之間靠近液體吸收墊片2的部位處，以與其保持有間隔距離的方式設(shè)置有也已用封閉緩沖液作過(guò)封閉處理的醋酸纖維素膜樣品吸收墊片3。在該樣品吸收墊片3與化學(xué)偶合物墊片9之間的硝基纖維素膜6表面區(qū)域中，沿該條狀支持物1的長(zhǎng)度方向以保持有間隔距離和垂直橫貫硝基纖維素膜6寬度的方式依次設(shè)置有條狀的高濃度DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)包被帶4、HIV抗原檢測(cè)區(qū)包被帶5、低濃度DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)包被帶7和HCV抗原檢測(cè)區(qū)包被帶8。
上述對(duì)HIV抗原檢測(cè)區(qū)包被帶5和HCV抗原檢測(cè)區(qū)包被帶8的包被，采用將已溶于pH7.0-7.5的含有10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽和1mM EDTA的Tris緩沖液中供檢測(cè)用的HIV和HCV兩種標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液，分別用由重量/體積比組成為0.02％氯化鉀、0.8％氯化鈉、0.02％磷酸氫二鉀和0.215％磷酸氫二鈉的pH7.0磷酸鹽(PBS)緩沖液稀釋成HIV抗原濃度為0.5毫克/毫升和HCV抗原濃度為0.25毫克/毫升的抗原溶液后，分別按0.75微升/厘米的量進(jìn)行包被；對(duì)高濃度的DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)包被帶4和低濃度的DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)包被帶7的包被，采用將已溶于pH7.0-7.5的PBS緩沖液的DNP溶液，用與稀釋HIV/HCV相同的PBS緩沖液分別稀釋成3.0毫克/毫升(高濃度)和1.0毫克/毫升(低濃度)溶液后，同樣分別按0.75微升/厘米的量進(jìn)行包被。
制備所用的與抗DNP抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的膠體金顆粒在玻璃纖維膜介質(zhì)材料體表面進(jìn)行包被所成的化學(xué)偶合物墊片9的方式是(1)預(yù)封閉化學(xué)偶合物墊片將玻璃纖維膜介質(zhì)材料體用在pH7.0且重量/體積比組成為0.02％氯化鉀、0.8％氯化鈉、0.02％磷酸氫二鉀和0.215％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液中還含有重量/體積比為1％小牛血清白蛋白、1％TritonX-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1.5％蔗糖和2毫克/毫升兔丙種球蛋白所組成的封閉緩沖液浸透后，平鋪在網(wǎng)格型支持物上37℃烘干。
(2)制備膠體金顆粒將三羥四氯金精酸膠體金顆粒用超純水配制成100微克/毫升的溶液并加熱至沸騰后，再加入1％枸櫞酸三鈉至枸櫞酸三鈉的終濃度為130微克/毫升，繼續(xù)加熱并保持沸騰5分鐘，在室溫下攪拌冷卻至45℃后經(jīng)濾孔孔徑為0.2微米的濾器過(guò)濾，并將已制備的30納米的膠體金顆粒用200毫摩爾的常用碳酸鹽調(diào)至pH7.0。再取濃度分別均為1毫克/毫升的兔抗DNP及兔抗人抗體，分別用濾孔孔徑為0.2微米的濾器過(guò)濾。在室溫?cái)嚢柘录尤肽z體金溶液，使兔抗DNP終濃度為2.5微克/毫升，兔抗人抗體的濃度為10微克/毫升。室溫?cái)嚢?0分鐘，使膠體金與抗體蛋白充分吸附。然后攪拌下加入用孔徑為0.2微米的濾膜過(guò)濾的小牛血清白蛋白至終濃度為2微克/毫升，并于室溫?cái)嚢?0分鐘。然后于15℃用13,000轉(zhuǎn)/分超速離心30分鐘。沉淀物加入與其離心處理前原體積量相等的pH9.0，濃度為2mM的硼酸鹽緩沖液(含1％(w/v)聚乙二醇(PEG)，分子量20,000)懸浮，然后用同樣方法再作離心處理，進(jìn)行洗滌后，再以上述1/2體積量的同樣硼酸鹽緩沖液用同樣的方法作一次洗滌。最后離心得到的沉淀物以1％濃度(w/v)懸浮于其原體積量的硼酸鹽緩沖液，用孔徑為0.2微米(μm)的濾器過(guò)濾，然后用測(cè)定其520納米波長(zhǎng)處的光密度值OD520的方式計(jì)算溶液中抗體-膠體金標(biāo)記物的量，于4℃保存。
(3)制備膠體金抗體包被的化學(xué)偶合物墊片用于偶合標(biāo)記抗DNP抗體和抗人丙種球蛋白抗體的顆粒度分別均為16納米(或30納米)。將均已溶解于重量/體積比濃度為上述包被各檢測(cè)區(qū)帶所用PBS緩沖液5.5倍的PBS緩沖液的抗DNP抗體和抗人丙種球蛋白抗體，以在該溶解用的緩沖液中還含有重量/體積比例為0.05％酪蛋白、1％小牛血清白蛋白、0.1％疊氮鈉及體積比為0.5％的吐溫-20和2mM EDTA組成的混合形式的包被緩沖液稀釋成抗DNP抗體和抗人丙種球蛋白抗體的量分別均為1毫克/毫升的抗原溶液后，按0.75微升/厘米的量進(jìn)行包被后，于37℃干燥1小時(shí)，密閉備用。
上述緩沖液吸收墊片10和樣品吸收墊片3的制備，均為將醋酸纖維膜用與上述對(duì)化學(xué)偶合物墊片9作預(yù)封閉處理所用的相同封閉緩沖液浸濕后，37℃干燥2小時(shí)。
將上述試紙條置于在與其樣品吸收墊片3、緩沖液吸收墊片10及各包被檢測(cè)帶所在區(qū)域位置相對(duì)應(yīng)的部位開(kāi)設(shè)有適當(dāng)形式和大小的加樣口和檢測(cè)觀察口等操作窗口且呈水平狀放置的相應(yīng)試紙盒中使用。
檢測(cè)時(shí)，先將被檢測(cè)樣品的標(biāo)本點(diǎn)加在樣品吸收墊片3上，使其向各包被檢測(cè)區(qū)排布方向的另一端作正向的第一次毛細(xì)管層析作用浸潤(rùn)擴(kuò)散，至全部覆蓋各包被檢測(cè)區(qū)后，再向緩沖液吸收墊片10上加入由在pH7.0且重量/體積比組成為0.2％氯化鉀、8％氯化鈉、0.2％磷酸氫二鉀和2.15％磷酸氫二鈉的10倍濃縮形式的磷酸磷酸鹽緩沖液中還含有重量/體積比為0.1％酪蛋白、1％小牛血清白蛋白、0.1％疊氮鈉及體積比為1％的吐溫-20和2毫摩爾EDTA組成的磷酸鹽緩沖液，使其溶解和釋放包被在化學(xué)偶合物墊片9上的已與抗DNP抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的膠體金顆粒，并使其向樣品吸收墊片3端作逆向的第二次毛細(xì)管層析作用浸潤(rùn)擴(kuò)散，至再次全部覆蓋上述各包被檢測(cè)區(qū)。然后用相應(yīng)的檢測(cè)儀器對(duì)在各包被檢測(cè)區(qū)中由膠體金的顯色所表明的其沉積量進(jìn)行自動(dòng)掃描讀取檢測(cè)。由低濃度DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)帶7的檢測(cè)結(jié)果與保證實(shí)驗(yàn)有效性的最低預(yù)置值進(jìn)行比較，以確定本次檢測(cè)過(guò)程及其結(jié)果是否有效。然后用由同一儀器讀取的HIV抗原和HCV抗原包被檢測(cè)區(qū)帶的光密度值(Dr)與對(duì)高濃度DNP內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)帶4讀取的光密度值(Dr)之比值作為相對(duì)光密度的信號(hào)值，并將其與預(yù)設(shè)背景噪聲值間的信/噪比，參考或?qū)φ战?jīng)實(shí)驗(yàn)設(shè)定的判斷標(biāo)準(zhǔn)得出被檢測(cè)樣品標(biāo)本在該次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中為陰性或陽(yáng)性的檢測(cè)判斷結(jié)果。
以上述的試紙和操作方法，分別進(jìn)行了以下各項(xiàng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證明本發(fā)明檢測(cè)方法對(duì)HIV和HCV兩種病毒檢測(cè)的特異性、靈敏性和精密性。
檢測(cè)實(shí)例1由中國(guó)藥品與生物制品檢定所提供國(guó)家醫(yī)藥管理局判斷酶聯(lián)免疫法(EIA)HIV診斷試劑的質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)品。用該所提供的參比血清進(jìn)行檢定應(yīng)復(fù)合以下標(biāo)準(zhǔn)(1)特異性對(duì)20份陰性參比血清檢測(cè)，假陽(yáng)性結(jié)果不得超出1份；(2)靈敏度對(duì)20份陽(yáng)性強(qiáng)度不等的Ⅰ型或Ⅱ型HIV抗體參比血清進(jìn)行檢測(cè)，不得出現(xiàn)假陰性；(3)精密性用精確度測(cè)參比血清是(n=10)，其測(cè)定的信/噪比(S/CO)值之百分變異系數(shù)(％CV)應(yīng)＜15％。
用上述本發(fā)明的方法對(duì)批號(hào)為9911的上述參比血清進(jìn)行的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下對(duì)20份HIV陽(yáng)性參比血清的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。此結(jié)果顯示本發(fā)明方法的檢測(cè)結(jié)果也陽(yáng)性，表明符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)靈敏度的檢定要求。
對(duì)20份HIV陰性參比血清的檢測(cè)結(jié)果如表2所示。此結(jié)果中，除第3號(hào)外其余全部為陰性，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)特異性的檢定要求。其中第3號(hào)呈現(xiàn)可疑陽(yáng)性。
第18號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品為精密性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品，連續(xù)用10份上述的試紙條檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。此結(jié)果顯示信/噪比值之百分變異系數(shù)為6.5％，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)精密性的要求。
表1 對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品HIV陽(yáng)性參比血清的靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表2 對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品HIV陰性參比血清的特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表3 對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品HIV第18號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性參比血清精密度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
檢測(cè)實(shí)例2由中國(guó)藥品與生物制品檢定所提供國(guó)家醫(yī)藥管理局判斷酶聯(lián)免疫法(EIA)HCV診斷試劑的質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)品。用該所提供的參比血清進(jìn)行檢定應(yīng)復(fù)合以下標(biāo)準(zhǔn)(1)特異性對(duì)40份陰性參比血清檢測(cè)，假陽(yáng)性結(jié)果不得超出1份；(2)靈敏度對(duì)40份陽(yáng)性參比血清進(jìn)行檢測(cè)，假陰性不得超出2份。
用上述本發(fā)明的方法對(duì)參比血清進(jìn)行的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。此結(jié)果中除第38號(hào)和第40號(hào)陽(yáng)性參比血清外，38/40份陽(yáng)性血清經(jīng)本發(fā)明方法檢出陽(yáng)性，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)靈敏度的要求。
特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。此結(jié)果中除第18號(hào)陰性參比血清外，39/40份陽(yáng)性血清經(jīng)本發(fā)明方法檢出陰性，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)特異性的要求。
表4 對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品HCV陽(yáng)性參比血清的靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表5 對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品HCV陰性參比血清的特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
檢測(cè)實(shí)例3將三份已知HIV單項(xiàng)陽(yáng)性血清(實(shí)驗(yàn)標(biāo)本號(hào)分別為106-1,106-3,106-8)各40微升，分別均自上述試紙盒的被檢樣品加樣口點(diǎn)加在樣品吸收墊片3上，待其正向第一次遷移擴(kuò)散完成后，再自緩沖液加樣口在緩沖液吸收墊片10上加入150微升用于溶解和釋放已包被于化學(xué)偶合物墊片9上已與抗DNP抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的膠體金顆粒的溶解緩沖液，使其完成逆向的第二次遷移擴(kuò)散。作第二次遷移擴(kuò)散的同時(shí)，室溫下孵育15分鐘，然后用相應(yīng)的儀器對(duì)試紙條中相應(yīng)包被檢測(cè)帶中的由膠體金顯色狀況所表明的沉積量進(jìn)行自動(dòng)掃描讀取和分析，給出檢測(cè)結(jié)果。對(duì)此三份已知HIV單項(xiàng)陽(yáng)性血清的檢測(cè)，同時(shí)還用Abbott兩種酶聯(lián)免疫法及其它三種快速HIV檢測(cè)法的結(jié)果進(jìn)行比較，并以蛋白印跡法(Western Blot)作為權(quán)威方法進(jìn)行驗(yàn)證。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明上述三份已知HIV單項(xiàng)陽(yáng)性血清經(jīng)本發(fā)明方法檢測(cè)均為陽(yáng)性，且其靈敏度與Abbott酶聯(lián)免疫法相等，可檢出HIV-Ⅰ型及HIV-Ⅱ型，優(yōu)于其它三種快速HIV檢測(cè)試紙(分別為Orgenics,Murex SUDS和Trinity)，與Ortho的蛋白印跡法(Western Blot)結(jié)果相符。
表6 已知HIV單項(xiàng)陽(yáng)性血清檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
檢測(cè)實(shí)例4取HCV單項(xiàng)陽(yáng)性血清(實(shí)驗(yàn)標(biāo)本號(hào)分別為B1l和B40)各40微升，用上述檢測(cè)實(shí)例3的同樣方法操作，并分別與Ortho的HCV3.O酶聯(lián)免疫法及RIBA檢測(cè)法的結(jié)果進(jìn)行比較。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。表7結(jié)果顯示本發(fā)明檢測(cè)方法可檢出HCV單項(xiàng)陽(yáng)性的標(biāo)本，與Ortho的HCV3.O酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果一致；甚至對(duì)RIBA顯示僅單項(xiàng)C22強(qiáng)陽(yáng)性的B11號(hào)標(biāo)本，在本發(fā)明的上述檢測(cè)試紙中也顯示了強(qiáng)陽(yáng)性的結(jié)果。
表7 HCV單項(xiàng)陽(yáng)性血清檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1．對(duì)艾滋病與丙型肝炎病毒抗體的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于在同一包被于支持物上的載體表面設(shè)置有含艾滋病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原以及高、低兩種濃度的二硝基酚內(nèi)部對(duì)照成分在內(nèi)的包被檢測(cè)區(qū)，將被檢測(cè)樣品點(diǎn)加于所說(shuō)的包被檢測(cè)區(qū)所在部位一端外的載體表面處并使其向包被檢測(cè)區(qū)的另一端作正向的第一次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散，至全部覆蓋包被檢測(cè)區(qū)后，自上述包被檢測(cè)區(qū)所在部位的另一端用由緩沖液溶解的已與抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的示蹤標(biāo)記物質(zhì)向上述被檢測(cè)樣品點(diǎn)加端作逆向的第二次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散，至再次全部覆蓋上述包被檢測(cè)區(qū)后，檢測(cè)和比較示蹤標(biāo)記物質(zhì)對(duì)包被檢測(cè)區(qū)中各檢測(cè)成分的沉積量，得到檢測(cè)判別結(jié)果。
2．如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的包被于支持物上的載體為硝基纖維素膜。
3．如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的用緩沖液溶解的已與抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的示蹤標(biāo)記物質(zhì)為顯色性物質(zhì)。
4．如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的艾滋病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原以及高、低兩種濃度的二硝基酚內(nèi)部對(duì)照成分的包被檢測(cè)區(qū)為在包被于支持物上的載體表面沿同一排布方向以保持有間隔距離的方式單獨(dú)分別設(shè)置的形式。
5．如權(quán)利要求4所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的包被有載體的支持物為與其上設(shè)置的各包被檢測(cè)區(qū)排布方向一致的平面條狀形式。
6．如權(quán)利要求4所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的各包被檢測(cè)區(qū)分別為與其排布方向相垂直的條狀包被帶形式。
7．如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的各浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散過(guò)程均在呈水平置放狀態(tài)的包被于支持物上的載體上進(jìn)行。
8．如權(quán)利要求1至7之一所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于在所說(shuō)的載體上對(duì)艾滋病毒抗原檢測(cè)區(qū)、丙型肝炎病毒抗原檢測(cè)區(qū)的包被為以pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.02％氯化鉀、0.8％氯化鈉、0.02％磷酸氫二鉀和0.215％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液將相應(yīng)抗原分別稀釋成抗原濃度為0.1-1毫克/毫升后，按0.5-1微升/厘米的量進(jìn)行包被。
9．如權(quán)利要求1至7之一所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于在所說(shuō)的載體上對(duì)高、低兩種濃度的二硝基酚內(nèi)部對(duì)照檢測(cè)區(qū)的包被為以pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.02％氯化鉀、0.8％氯化鈉、0.02％磷酸氫二鉀和0.215％磷酸氫二鈉的的磷酸鹽緩沖液將二硝基酚分別稀釋成3-4毫克/毫升和1-2毫克/毫升濃度后，按0.5-1微升/厘米的量進(jìn)行包被。
10．如權(quán)利要求1至7之一所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的用由緩沖液溶解的已與抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的顯色性物質(zhì)向被檢測(cè)樣品點(diǎn)加端作逆向的第二次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散時(shí)，采用向設(shè)置于所說(shuō)的各包被檢測(cè)區(qū)所在部位的另一端部位處并用已與抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的顯色物質(zhì)在玻璃纖維膜介質(zhì)材料體表面進(jìn)行包被所成的化學(xué)偶合物墊片上加入用于溶解和釋放已包被于其上的與抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的顯色物質(zhì)的溶解緩沖液的方式。
11．如權(quán)利要求10所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的化學(xué)偶合物墊片所用的玻璃纖維膜介質(zhì)材料體在包被已與抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的顯色物質(zhì)前已用在pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.02％氯化鉀、0.8％氯化鈉、0.02％磷酸氫二鉀和0.215％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液中還含有重量/體積比為1％小牛血清白蛋白、1％Triton X-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1-2％蔗糖和2毫克/毫升兔丙種球蛋白所組成的封閉緩沖液進(jìn)行過(guò)封閉處理。
12．如權(quán)利要求11所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于對(duì)所說(shuō)的化學(xué)偶合物墊片所用的玻璃纖維膜介質(zhì)材料體用封閉緩沖液作封閉處理的方法是將被處理的玻璃纖維膜介質(zhì)材料體用所說(shuō)的封閉緩沖液浸透后，平鋪在網(wǎng)格形式的支持物上37℃烘干。
13．如權(quán)利要求10所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的向化學(xué)偶合物墊片上加入溶解緩沖液的操作采用在覆蓋于該化學(xué)偶合物墊片上并已用封閉緩沖液作過(guò)封閉處理的吸水性纖維素膜材料的緩沖液吸收墊片上進(jìn)行，所用的封閉緩沖液為在pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.02％氯化鉀、0.8％氯化鈉、0.02％磷酸氫二鉀和0.215％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液中還含有重量/體積比為1％小牛血清白蛋白、1％Triton X-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1-2％蔗糖和2毫克/毫升兔丙種球蛋白所組成的封閉緩沖液。
14．如權(quán)利要求13所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的覆蓋于化學(xué)偶合物墊片上的吸水性纖維素膜材料緩沖液吸收墊片為醋酸纖維素膜。
15．如權(quán)利要求1至7之一所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的作逆向第二次浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散所用的溶解緩沖液為在pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.2％氯化鉀、8％氯化鈉、0.2％磷酸氫二鉀和2.15％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液中還含有重量/體積比為0.1％酪蛋白、1％小牛血清白蛋白、0.1％疊氮鈉及體積比為1％的吐溫-20和2毫摩爾EDTA所組成的磷酸鹽緩沖液。
16．如權(quán)利要求1至7之一所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的用于偶合標(biāo)記抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體的顯色物質(zhì)為顆粒度為16-30納米的三羥四氯金精酸膠體金材料。
17．如權(quán)利要求1至7之一所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的用于偶合標(biāo)記抗人丙種球蛋白抗體顯色物質(zhì)的抗人丙種球蛋白抗體為兔抗人丙種球蛋白抗體。
18．如權(quán)利要求10所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的化學(xué)偶合物墊片的包被采用將分別已用三羥四氯金精酸膠體金材料顯色物質(zhì)偶合標(biāo)記的顆粒度為16-30納米的抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體分別均用在pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.11％氯化鉀、4.4％氯化鈉、0.11％磷酸氫二鉀和1.18％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液中還含有重量/體積比為0.05％酪蛋白、1％小牛血清白蛋白、0.1％疊氮鈉及體積比為0.5％的吐溫-20和2mM EDTA所組成的緩沖液溶解并稀釋成濃度為0.5-2毫克/毫升后，按5-10微升/厘米的量進(jìn)行包被。
19．如權(quán)利要求18所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的在偶合物墊片上包被的膠體金抗體偶合物，所用的三羥四氯金精酸膠體金材料為先將三羥四氯金精酸顆粒用超純水配制成100微克/毫升的溶液并加熱至沸騰后，再加入1％枸櫞酸三鈉至枸櫞酸三鈉終濃度為130微克/毫升，繼續(xù)加熱并保持沸騰5分鐘，在室溫下攪拌冷卻至低于45℃，經(jīng)濾孔孔徑為0.2微米的介質(zhì)過(guò)濾后，再將得到的膠體金顆粒用200毫摩爾的碳酸鹽調(diào)至pH7.0，再取分別經(jīng)濾孔孔徑為0.2微米的介質(zhì)過(guò)濾且濃度分別均為1毫克/毫升的兔抗DNP及兔抗人抗體，在室溫?cái)嚢柘录尤朐撃z體金溶液，使兔抗DNP的終濃度為2.5微克/毫升，兔抗人抗體的終濃度為1-50微克/毫升，使膠體金與抗體蛋白充分吸附后的溶液在攪拌下再加入經(jīng)孔徑為0.2微米的介質(zhì)過(guò)濾的小牛血清白蛋白至其終濃度為2微克/毫升，經(jīng)超速離心分離后對(duì)沉淀物用含有分子量為20,000及重量/體積比為1％聚乙二醇的pH9.0且濃度為2mM的硼酸鹽緩沖液至少洗滌一次，洗滌后的離心沉淀物以1％重量/體積濃度懸浮于其原體積量的硼酸鹽緩沖液后，再用孔徑為0.2微米的介質(zhì)過(guò)濾，測(cè)定并計(jì)算其抗體-膠體金標(biāo)記物的含量。
20．如權(quán)利要求1至7之一所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的點(diǎn)加被檢測(cè)樣品的操作采用在已覆蓋于該被檢測(cè)樣品點(diǎn)加部位處并用封閉緩沖液作過(guò)封閉處理的吸水性纖維素膜材料的樣品吸收墊片上進(jìn)行，所用的封閉緩沖液為在pH7.0-7.5且重量/體積比組成為0.02％氯化鉀、0.8％氯化鈉、0.02％磷酸氫二鉀和0.215％磷酸氫二鈉的磷酸鹽緩沖液中還含有重量/體積比為1％小牛血清白蛋白、1％Triton X-100、0.3％聚乙烯基吡咯烷酮、1-2％蔗糖和2毫克/毫升兔丙種球蛋白組成的封閉緩沖液。
21．如權(quán)利要求1至7之一所述的聯(lián)合快速檢測(cè)方法，其特征在于在所說(shuō)的與各包被檢測(cè)區(qū)所在部位相反的被檢測(cè)樣品點(diǎn)加部位另一方向的載體部位處設(shè)置有用于吸收在浸潤(rùn)或遷移擴(kuò)散過(guò)程中溢出液體的液體吸收材料。
全文摘要
對(duì)艾滋病與丙型肝炎病毒抗體的聯(lián)合快速檢測(cè)方法,是在同一包被于支持物上的載體表面設(shè)置有含HIV和HCV病毒抗原以及高、低兩種濃度二硝基酚內(nèi)部對(duì)照成分在內(nèi)的包被檢測(cè)區(qū),被檢測(cè)樣品點(diǎn)加于包被檢測(cè)區(qū)所在部位一端的載體表面處并使其向包被檢測(cè)區(qū)的另一端作正向的第一次浸潤(rùn)遷移擴(kuò)散,至全部覆蓋包被檢測(cè)區(qū)后,自上述包被檢測(cè)區(qū)所在部位的另一端用由緩沖液溶解的已與抗二硝基酚抗體和抗人丙種球蛋白抗體相偶合的示蹤標(biāo)記物質(zhì)向上述被檢測(cè)樣品點(diǎn)加端作逆向的第二次浸潤(rùn)遷移擴(kuò)散,至再次全部覆蓋上述包被檢測(cè)區(qū)。檢測(cè)和比較示蹤標(biāo)記物質(zhì)與包被檢測(cè)區(qū)中各檢測(cè)成分的沉積量,得到檢測(cè)判別結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1305109SQ0110719
公開(kāi)日2001年7月25日 申請(qǐng)日期2001年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月27日
發(fā)明者周思亮 申請(qǐng)人:周思亮