專利名稱：細胞學組合檢測及操作方法
技術領域：
本發(fā)明屬細胞學檢測技術，具體地說是細胞學多項指標的組合檢測技術及相應的操作方法。
在細胞免疫學、細胞遺傳學、細胞增殖動力學的研究中，淋巴細胞轉化率(LTR)、微核率(MNR)、姊妹染色單體互換頻率(SCE)、有絲分裂指數(shù)(MI)、細胞周期比率(CCR)、增殖率指數(shù)(PRI)是常用和首選的指標。目前國內外多數(shù)實驗室測定這6項指標，采用的是采一次血來培養(yǎng)72小時后，收集細胞制片，觀測一項指標，要觀測另一項指標得再采一次血來培養(yǎng)72小時后，收集細胞制片觀測。這種單項實驗單項測定方法，儀器復雜、操作繁瑣、費時耗資，用單項實驗單項測定6項指標要耗資一千多元，需連續(xù)工作35天才能獲得全部結果。單項測定法，測定結果只能反映某一方面的問題，不利于綜合分析評價。因此，國內外均有人試圖探索簡便易行的方法。1986年Kunihiko等在研究溫度對化學物質誘發(fā)人體淋巴細胞SCE的影響時，把SCE和CCR組合觀測，1988年顧祖維等在16種化學物體外微核檢測中把SCE與MNR同時觀測，提高了檢測效率和可靠性，但未見三項以上指標組合檢測的報道。經國際聯(lián)機檢索國內外科技文獻和國內外專利文獻均未見與本發(fā)明相同技術報道。
本發(fā)明的目的鑒于傳統(tǒng)的細胞學檢測方法存在儀器復雜、操作繁瑣、費時耗資等缺點，建立快速、簡便，省力節(jié)資的組合檢測法就顯得勢在必行。為此，我們發(fā)明了細胞學組合檢測及相應的操作方法。
主要技術內容一、細胞學組合檢測隨著當代生物科學的發(fā)展，細胞檢測技術已成了推動細胞生物學、基礎醫(yī)學、臨床醫(yī)學、預防醫(yī)學進步和發(fā)展的有力武器。細胞生物學和醫(yī)藥衛(wèi)生科研及實際應用都離不開細胞學檢測技術，例如我們可通過測定LTR來了解細胞的免疫功能；測定MNR和SCE來了解染色體和DNA的損傷程度；測定MI、CCR和PRI來判斷細胞的分裂和增殖活力?？茖W技術的不斷進步和邊緣學科的興起，使細胞學檢測技術在醫(yī)藥衛(wèi)生及有關部門的應用日益廣泛，研究和應用好新方法是科技人員的當務之急。
為此，我們在細胞學單項實驗單項檢測法基礎上，發(fā)明了細胞學組合檢測法，它的特征是在觀測姊妹染色單體互換頻率(SCE)的玻片上同時觀測淋巴細胞轉化率(LTR)、微核率(MNR)、有絲分裂指數(shù)(MI)、細胞周期比率(CCR)和增殖率指數(shù)(PRI)6項指標的細胞學組合檢測。
研究細胞學組合檢測法要考慮的主要問題是試劑和操作方法對實驗結果的影響，用組合方法與傳統(tǒng)法檢測LTR、MNR、MI的差別在于主要是前者在細胞培養(yǎng)液中加入了胸腺嘧啶核苷的類似物5-溴脫氧尿嘧碇核苷和紡錘體抑制劑秋水仙堿，其次是前者用UPG分化染色，這些因素對檢測結果是否有影響？我們作了30例自身對比研究。用組合法測定的LTR為67.30±12.27％，MNR為1.07±0.77‰，MI為4.93±1.34％；用傳統(tǒng)法測定的LTR為68.77±10.01％，MNR為1.20±0.65‰，MI為2.25±1.85％。經統(tǒng)計學處理，LTR和MNR均無顯著性差異(P＞0.05)，MI有顯著性差異(P＜0.001)，表明可用組合法代替?zhèn)鹘y(tǒng)法來測定LTR和MNR，而測定MI最好是用組合法。加之測定CCR和PRI一直是和SCE的方法相同。所以，組合法是測定LTR、MNR、SCE、MI、CCR、PRI的可靠方法。
根據優(yōu)選組合細胞免疫學、細胞遺傳學和細胞增殖動力學等邊緣交叉學科里常用和首選的觀測指標而建立的細胞學組合檢測及操作方法，在同一張玻片上，同時觀測人體淋巴細胞轉化率(LTR)、微核率(MNR)、姊妹染色單體互換頻率(SCE)，有絲分裂指數(shù)(MI)、細胞周期比率(CCR)、增殖率指數(shù)(PRI)6項指標，具有靈敏、簡便、快速、經濟、準確可靠，一次同時測試多個終點，各項指標之間優(yōu)勢互補，有利于綜合評價的優(yōu)點。6項檢測指標，也可視使用目的單項或多項組合應用，在細胞生物學、基礎醫(yī)學、臨床醫(yī)學、預防醫(yī)學等學科領域里應用。
二、操作方法在單項實驗，單項檢測的操作方法的基礎上，我們發(fā)明了細胞學組合檢測的操作方法，其特征是進行組合檢測時在觀測姊妹染色單體互換頻率等操作中，配制培養(yǎng)液時加入了自制小牛血清和自制植物血凝集素，該自制小牛血清是抽取初生牛犢全血分離其血清而成，該自制植物血凝集素是從大白蕓豆中提取而成。進行細胞培養(yǎng)時加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)25μg，收獲前6小時加入秋水仙堿0.3μg。分化染色采用30W紫外燈距離8cm垂直照射25分鐘，4％Giemsa37℃染色7分鐘。
細胞學組合檢測具體操作方法如下1、標本制作1.1配制培養(yǎng)液 在無菌室內配制，以5ml/份計算，其中含RPMI 1640培養(yǎng)液3.8ml、自制小牛血清1ml、自制植物血凝集素(PHA)0.2ml、雙抗(青霉素500U和鏈霉素500μg)或卡那霉素250μg、肝素12.5μg，用5％NaHCO3調PH至7.2，可按此比例批量配制，用10ml滅菌培養(yǎng)瓶分裝，放4℃?zhèn)溆?。也可用市售成品細胞培養(yǎng)試劑盒。
1.2細胞培養(yǎng) 在無菌條件下，每份細胞培養(yǎng)液中加入新鮮全血0.3ml、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)25μg、受檢物適量，搖勺，37℃避光培養(yǎng)72小時。收獲前6小時加入秋水仙堿0.3μg。
1.3收集細胞 將細胞培養(yǎng)物吸入10ml離心管，以1000轉/分離心10分鐘，吸棄上清液；在沉淀物中加入37℃預溫的0.075mol·L-1KCl低滲液5ml，用吸管吹打勻，放37℃水浴12分鐘，最后2分鐘加入3∶1(無水乙醇∶冰乙酸)固定液1ml預固定，以1000轉/分離心10分鐘，吸棄上清液；在沉淀物中加入3∶1固定液5ml，用吸管輕吹打散細胞團塊，室溫靜置30分鐘，以1000轉/分離心10分鐘，吸棄上清液；重復前述操作，即在沉淀物中加入3∶1固定液5ml，用吸管輕吹打散細胞團塊，室溫靜置30分鐘，以1000轉/分離心10分鐘，吸棄上清液；在白色沉淀物中加入0.5ml固定液，放4℃冰箱靜置30分鐘，滴冰片2-3張。
1.4分化染色 玻片編號，放37℃孵箱老化12-24小時后，在60℃恒溫水浴箱上置一金屬板，玻片置于其上，滴加預溫50℃的2×SSC液，30W紫外燈距離8cm垂直照射25分鐘。取出玻片在自來水中漂洗，即用4％Gimsa磷酸緩沖液(PH6.8)37℃染色7分鐘，自來水沖片，涼干。
2.結果觀測2.1 LTR 每例在高倍或油鏡下計數(shù)200個淋巴細胞中所含的轉化細胞和未轉化細胞數(shù)。轉化淋巴細胞體積大，核疏松，染色偏紅；未轉化淋巴細胞體積小，核致密，染色偏藍；過渡型細胞體積大小、核致密度、著色度、介于轉化和未轉化細胞之間，其特征是在高倍鏡下細胞膜呈戒指狀環(huán)形亮圈，調動焦距，圈的亮度隨細胞核清晰度的變化而變化；過渡型細胞記入轉化細胞。
LTR(％)＝轉化細胞數(shù)/觀測細胞總數(shù)(轉化細胞數(shù)+未轉化細胞數(shù))×100，樣本間比較用卡方(X2)檢驗。我室觀測60例正常值為74.67％。
2.2 MNR 每例在高倍鏡或油鏡下計數(shù)2000個轉化淋巴細胞中的微核細胞和非微核細胞數(shù)。微核的特征是(1)在轉化細胞的胞漿內，完全與主核分離；(2)染色與主核一致；(3)小于主核的1/3。
MNR(‰)＝微核細胞數(shù)/觀測的轉化細胞總數(shù)(微核細胞+非微核細胞)×1000，樣本間比較用X2檢驗。我室觀測60例正常值為1.19‰。
2.3 SCE 每例在油鏡下計數(shù)25個分散良好，色差分明的第二中期分裂細胞的SCE數(shù)。染色單體未端發(fā)生的互換記為1次SCE；在染色單體中間發(fā)生的互換記為2次SCE；在著絲點處發(fā)生的交換，并判明不是染色單體扭轉者也記為1次SCE。
SCE/細胞＝SCE總數(shù)/觀測細胞數(shù)，用兩樣本均數(shù)t檢驗統(tǒng)計分析。我室觀測60例正常值為5.07/細胞。
2.4 CCR 每例在油鏡下計數(shù)200個中期分裂相中的第一周期(M1)細胞、第二周期(M2)細胞、第三周期(M3)細胞數(shù)。它們的特征是M1為不顯色差的紅色染色體；M2全部染色體均為一條單體顯深色，一條顯淺色；M3部分染色體為一條單體顯深色，一條單體顯淺色，另一部分染色體的兩條單體均顯淺色。
Mx(％)＝Mx/觀測細胞總數(shù)(M1+M2+M3)×100，樣本間比較用X2檢驗。我室觀測60例正常值為M119.46％，M227.19％，M353.35％。
2.5 PRI 代入公式求出。PRI＝(1M1+2M2+3M3)/100，樣本間比較用X2檢驗。我室觀測60例正常值為2.34。
2.6 M1 每例在油鏡下計數(shù)1000個細胞中所含的分裂細胞數(shù)。分裂細胞的特征是M1、M2、M3均為典型的分裂細胞；此外，細胞核呈絲網狀或毛線團狀的細胞也記為分裂細胞數(shù)。
MI(％)＝分裂細胞數(shù)/觀測細胞總數(shù)(分裂細胞數(shù)+未分裂細胞數(shù))×100，樣本間比較用X2檢驗。我室觀測60例正常值為4.69％。
儀器設備及試劑配制
1、實驗室應具備細胞培養(yǎng)的基本條件主要儀器有電光源雙目顯微鏡、電冰箱、電熱干燥箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴箱、電爐、離心機、高壓蒸汽消毒器、凈化工作臺、30W紫外光燈、無菌過濾器、蒸餾器、注射器、試劑瓶、細胞培養(yǎng)瓶、刻度吸管、毛細吸管、離心管、玻片、量筒、燒杯、容量瓶、分析天平等。
2、成品試劑配制2.1培養(yǎng)基配制 稱取RPMI 1640培養(yǎng)基10.4g于容量瓶中，加入三蒸水溶解，加NaHCO32g，用力振搖，使其徹底溶解，加三蒸水定容至1000ml，調PH至7.0。用滅菌G6玻砂濾器過濾除菌，在無菌室內分裝，貯4℃?zhèn)溆谩?br> 2.2 0.85％生理鹽水 稱取NaCl4.25g于輸液瓶中，加三蒸水500ml溶解。
2.3 500μg/ml肝素液 稱取肝素鈉50mg于注射瓶內，用0.85％生理鹽水溶解至100ml，瓶塞上扎一注射針頭排氣減壓，0.069Mpa15min滅菌，4℃貯存?zhèn)溆?。也可取注射用肝?125萬u/ml)2ml，加無菌生理鹽水至25ml，貯4℃?zhèn)溆谩?br> 2.4 5％NaHCO3溶液 稱取分析純NaHCO35g于注射瓶中，加三蒸水100ml溶解，瓶塞上扎一注射針頭排氣減壓，0.069Mpa15min滅菌，貯4℃?zhèn)溆谩?br> 2.5 250μg/ml Brdu液 稱取5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)1mg于無菌小瓶中，加滅菌生理鹽水4ml，搖勺，避光保存于4℃，最好是現(xiàn)配現(xiàn)用。
2.6 1μg/ml秋水仙堿液 稱取秋水仙堿10mg于注射瓶中，用0.85％生理鹽水溶解至100ml，取此液1ml加0.85％生理鹽水99ml，瓶塞上扎一注射針頭排氣減壓，0.069Mpa 15min滅菌，貯4℃?zhèn)溆谩?br> 2.7 0.075mol·L-1KCL低滲液 稱取KCl2.79g于容量瓶中，加蒸餾水溶解，定容至500ml。
2.8 3∶1固定液配制 量取3份無水乙醇與1份冰乙酸混勻，須現(xiàn)配現(xiàn)用。
2.9 2×SSC液 稱取NaCl 17.54g、檸檬酸三鈉8.82g，溶于1000ml蒸餾水中。
2.10磷酸緩沖液(1)1/15mol·L-1Na2HPO4溶液 稱取Na2HPO4.12H2O 23.87g，加蒸餾水溶解，定容至1000ml；(2)1/15mol.L-1KH2PO4溶液稱取KH2PO49.08g，加蒸餾水溶解，定容至1000ml。
2.11 Giemsa原液配制 稱量0.5g Giemsa粉，甘油33ml，在研缽內先用少量甘油和Giemsa粉混合，研磨直至無顆粒為止，再將剩余甘油倒入，56℃保溫2h后，加入33ml純甲醇，保存于棕色瓶內。
2.12 Giemsa應用液配制 量取磷酸緩沖液(1)和(2)各48ml，加Giemsa原液4ml，混勻，即為4％Giemsa染色液。
3.注意事項3.1配制試劑除特殊要求外，一律用滅菌三蒸水；
3.2細胞培養(yǎng)所用的一切器皿必須嚴格清洗和滅菌；3.3所用的試劑生產廠和批號不要隨意變換；3.4化學污染、細菌污染、酸堿度和溫度變化是影響細胞培養(yǎng)的致命因素，時刻都要高度重視。
優(yōu)點和積極效果細胞學組合檢測法豐富和發(fā)展了細胞學檢測技術，其應用范圍廣，實用價值高，我們已將該方法用于細胞生物學、勞動衛(wèi)生職業(yè)病損傷、衛(wèi)生毒理學、中藥和食品資源保健作用研究及慢性病防冶研究，取得了顯著的社會效益和經濟效益。細胞學組合檢測法作為邊緣交叉學科里的一項新技術，還可用于環(huán)保監(jiān)測及傳染病、地方病、遺傳性疾病、免疫性疾病和腫瘤防治研究。為促進科學進步和學術交流，為保護人體健康和經濟建設做出了重要貢獻。經組合法與傳統(tǒng)法直接經濟效益比較，用組合法同時測定6項指標耗資為385元，只需連續(xù)工作9天就能獲得全部結果，而單項實驗單項測定6項指標，則要耗資1383.20元，需連續(xù)工作35天才能獲得全部結果。
實施例用番石榴成熟果對人體細胞免疫遺傳及增殖作用的組合檢測番石榴(Psidium gurajava L.)分布于熱帶、亞熱帶國家和地區(qū)，攀西地區(qū)野生資源豐富。因富含多種營養(yǎng)成份及其獨特的風味和藥效作用，有較大的開發(fā)利用價值。鑒于以往研究結果提示，野生番石榴半成熟果有抑制淋巴細胞轉化和增殖及誘發(fā)SCE和微核的作用，本文用細胞學組合檢測法進一步探討種植和野生番石榴成熟果對人體細胞免疫、遺傳和增殖作用，為其開發(fā)利用提供依據。
1.材料和方法1.1樣品制備 采摘市林科所種植和荒山野生番石榴成熟鮮果，加水搗碎，過濾取汁，滅菌備用，以固形物干重計算含量，種植果受試劑量為20μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、2500μg/ml，野生果受試劑量為15μg/ml、80μg/ml、400μg/ml、2000μg/ml。
1.2細胞培養(yǎng)及觀測 按細胞學組合檢測及操作方法配制細胞培養(yǎng)液，每份細胞培養(yǎng)液含RPMI 1640培養(yǎng)液3.8ml、自制小牛血清1ml、自制植物血凝集素(PHA)0.2ml、卡那霉素250μg、肝素12.5μg、用5％NaHCO3調PH至7.2，以5ml/瓶分裝。每份標本中加入不同含量的番石榴溶液，新鮮全血0.3ml，Brdu終濃度5μg/ml。重蒸餾水為對照組。37℃避光培養(yǎng)72小時，收獲細胞前6小時加入秋水仙堿0.3μg。按細胞學組合檢測及操作方法收集細胞、制片、分化染色、觀測計數(shù)和統(tǒng)計淋巴細胞轉化率(LTR)、姊妹染色單體互換(SCE)、微核率(MNR)、有絲分裂指數(shù)(MI)、細胞周期比率(CCR)和增殖率指數(shù)(PRI)6項指標。
2.結果2.1對人體細胞免疫的影響 種植番石榴4個劑量組的LTR為76.4％、82.2％、77.0％、82.4％，與對照組80.0％比無顯著差異(P＞0.05)。野生番石榴4個劑量組的LTR為78.0％、78.0％、76.0％、63.4％，最高劑量63.4％，顯著低于對照組80.0％(P＜0.005)。
2.2對人體細胞遺傳的影響 種植番石榴4個劑量組的SCE為6.0±2.3/細胞、5.2±1.9/細胞、5.6±1.8/細胞、5.3±1.9/細胞，與對照組4.5±2.1/細胞比較差異不顯著(P＞0.05)；MNR為2.0‰、1.8‰、1.8‰、2.6‰，與對照組1.4‰比較無顯著差異(P＞0.05)。野生番石榴4個劑量組的SCE為4.6±2.3/細胞、4.4±1.9/細胞、4.4±1.8/細胞、5.0±2.1/細胞，與對照組4.5±2.1/細胞比無顯著性差異(P＞0.05)；MNR為0.6‰、0.6‰、0.6‰、0.4‰，與對照組1.4‰比差異不顯著(P＞0.05)。
2.3對人體細胞增殖的影響 種植番石榴4個劑量組的MI為5.9％、5.8％、6.6％、5.3％，與對照組5.0％比較差異不顯著(P＞0.05)；CCR為M17.4％、6.0％、12.6％、7.0％，M222.8％、12.4％、16.2％、20.4％，M369.8％、81.6％、71.2％、72.6％，與對照組(MI15.0％、M221.2％、M363.8％)比有顯著差異(P＜0.05)；PRI 2.6、2.8、2.6、2.7與對照組2.5比有高度顯著性差異(P＜0.005)。野生番石榴4個劑量組的MI為5.0％、6.0％、6.5％、6.0％，與對照組5.0％比較無顯著性差異(P＞0.05)；CCR為M111.6％、7.6％、16.4％、25.8％，M218.8％、23.6％、26.2％、29.6％，M369.6％、68.8％、59.4％、44.60％，與對照組(M115.0％、M221.2％、M363.8％)比較，最高劑量組有顯著差異(P＜0.05)；PRI 2.6、2.6、2.5、2.2與對照組2.5比較，最高劑量有高度顯著性差異(P＜0.005)。
3.討論番石榴已有數(shù)百年食用歷史，在國外有果王，果后之稱。中西醫(yī)認為，番石榴性平無毒，有收斂、止瀉、止血、止癢、消炎解毒和抗誘變作用，對糖尿病療效明顯。
本文用細胞學組合檢測法探討種植和野生番石榴成熟果對人體淋巴細胞免疫、遺傳和增殖效應。野生番石榴最高劑量組LTR顯著低于對照組(P＜0.005)，這與我們先前的研究結果一致，有輕微抑制淋巴細胞轉化，降低細胞免疫力的作用。種植和野生番石榴誘發(fā)的SCE和MNR與對照組比無明顯差異，未見致人體細胞DNA和染色體損傷作用；種植番石榴M3和PRI顯著高于對照組(P＜0.05)和(P＜0.005)，有激活細胞增殖的作用；野生番石榴M3和PRI高劑量組顯著低于對照組(P＜0.05)和(P＜0.005)，此與先前結果一致，有抑制細胞增殖的作用。
權利要求
1.一種細胞學組合檢測法其特征是在觀測姊妹染色單體互換頻率(SCE)的玻片上，同時觀測淋巴細胞轉化率(LTR)、微核率(MNR)、有絲分裂指數(shù)(MI)、細胞周期比率(CCR)和增殖率指數(shù)(PRI)6項指標的細胞學組合檢測方法。
2.一種細胞學組合檢測的操作方法其特征是在進行細胞學組合檢測時，在觀測姊妹染色單體互換頻率等操作中a配制培養(yǎng)液加入自制小牛血清和自制植物血凝集素(PHA)；b細胞培養(yǎng)加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)25μg，收獲前6小時加入秋水仙堿0.3μg；c收集細胞加入無水乙醇∶冰乙酸(3∶1)為固定液；d分化染色用30W紫外燈距離8cm垂直照射25分鐘，4％Giemsa37℃染色7分鐘。
3.按權利要求2所說的操作方法其特征是自制小牛血清是抽取初生牛犢全血分離其血清而成。
4.按權利要求2所說的操作方法其特征是自制植物血凝集素(PHA)是從大白蕓豆中提取而成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種細胞學組合檢測及操作方法,在同一玻片上,同時觀測人體淋巴細胞轉化率(LTR)、微核率(MNR)、姊妹染色單體互換頻率(SCE)、有絲分裂指數(shù)(MI)、細胞周期比率(CCR)和增殖率指數(shù)(PRI)6項指標。具有靈敏、簡便、快速、經濟、準確可靠,各項指標之間優(yōu)勢互補,有利于綜合評價的優(yōu)點,可在細胞生物學、基礎醫(yī)學、臨床醫(yī)學、預防醫(yī)學等學科領域里應用。同時,本發(fā)明還提出了相應和可靠的操作方法。
文檔編號G01N33/50GK1375698SQ0110727
公開日2002年10月23日 申請日期2001年3月21日 優(yōu)先權日2001年3月21日
發(fā)明者張家華 申請人:攀枝花市衛(wèi)生防疫站