專利名稱：檢測(cè)外周血抗原特異性細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及體外檢測(cè)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的新方法，利用該方法的試劑盒及其應(yīng)用。
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTLs)通過(guò)識(shí)別細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)I類分子及其結(jié)合的抗原肽而殺傷靶細(xì)胞，是機(jī)體抗腫瘤、抗移植物及有效控制各種感染的重要免疫防御反應(yīng)之一?？乖禺愋訡TLs所能識(shí)別的抗原主要是來(lái)源于內(nèi)源性蛋白抗原降解后結(jié)合于MHC I類分子上的肽段。MHC I類分子是由具有高度多態(tài)性的重鏈及保守的輕鏈即β2微球蛋白組成的異源二聚體，在所有有核的細(xì)胞中表達(dá)，在人中MHC I類分子的重鏈由稱為人白細(xì)胞抗原(HLA)的分子組成。與MHC I類分子結(jié)合的抗原短肽在抗原遞呈細(xì)胞(APC)內(nèi)被加工(內(nèi)源性抗原)，在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中結(jié)合于MHCI類分子重鏈的α1和α2功能區(qū)構(gòu)成的肽結(jié)合槽(groove)內(nèi)，β2微球蛋白與重鏈通過(guò)非共價(jià)結(jié)合并起穩(wěn)定MHC I類分子-肽復(fù)合物的作用，然后定位于細(xì)胞表面，抗原特異性CTLs通過(guò)其表面的αβ型T細(xì)胞受體(TCR)和MHC I類分子-肽復(fù)合物的相互作用來(lái)識(shí)別被感染的細(xì)胞，進(jìn)而殺傷感染細(xì)胞。近年來(lái)對(duì)特異性CTL反應(yīng)在防治愛(ài)滋病、瘧疾以及抗腫瘤中的重要作用有大量報(bào)道。
生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展使得癌癥、自身免疫性疾病和感染性疾病的新的免疫治療方法得到了迅速的發(fā)展。疫苗免疫或免疫治療后進(jìn)行定量或定性CTL反應(yīng)檢測(cè)抗原及時(shí)對(duì)治療效果進(jìn)行評(píng)估，從而為臨床治療提供有力的依據(jù)。由此，迫切需要簡(jiǎn)便、易行、靈敏的方法對(duì)CTL的數(shù)量和功能進(jìn)行評(píng)估。目前檢測(cè)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法主要有以下幾種①細(xì)胞毒性分析方法，即經(jīng)典的51Cr釋放分析法、LDA；②細(xì)胞因子檢測(cè)法，例如酶聯(lián)免疫印記分析方法、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法；③特異T淋巴細(xì)胞受體(TCR)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)；以及④可溶性MHC-肽四聚體方法。由于對(duì)某一MHC-肽復(fù)合體具有特異識(shí)別作用的CTLs在外周血淋巴細(xì)胞中的比率很低，因此檢測(cè)這些低頻率的特異性CTLs需要有高敏感度的方法。細(xì)胞毒性分析方法和細(xì)胞因子檢測(cè)法是間接檢測(cè)抗原特異性CTLs的方法，要求有大量的特異性CTLs作為效應(yīng)細(xì)胞，因此需要首先在體外進(jìn)行擴(kuò)增，致使這兩種方法周期長(zhǎng)、敏感性低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以廣泛應(yīng)用。TCR的聚合酶鏈反應(yīng)是一種基于PCR技術(shù)的方法，其敏感性高，但是只能應(yīng)用于已知TCR基因型的特異CTLs檢測(cè)，因此在很大程度上限制了該方法的應(yīng)用。可溶性MHC-肽四聚體法(Altman，J.D.et al.Science 274，94-6.(1996))是目前最新的直接檢測(cè)抗原特異性CTLs的方法，然而，盡管四聚體可以同時(shí)與四個(gè)TCR結(jié)合，雖然減慢了它們的解離率，卻沒(méi)有從根本上解決解離率快的問(wèn)題。因?yàn)榭扇苄訫HC-肽復(fù)合物單體與TCR的解離率很快，也就是說(shuō)它一旦與TCR結(jié)合后在幾秒鐘內(nèi)就又與TCR解離。在四聚體與特異性CTLs孵育后，不可避免地要進(jìn)行沖洗，從而減低流式細(xì)胞儀檢測(cè)背景，提高陽(yáng)性檢出率。沖洗本身打破了結(jié)合在細(xì)胞表面的四聚體和游離的四聚體之間的平衡，使結(jié)合在細(xì)胞表面的四聚體與TCR解離速度增加?？梢栽O(shè)想，沖洗后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)合在特異性CTL表面的四聚體將越來(lái)越少，使得流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果靈敏度降低，陽(yáng)性檢出率下降。另外，此方法的操作過(guò)程仍然很復(fù)雜，構(gòu)建四聚體要經(jīng)過(guò)三次蛋白純化，大大增加了蛋白的損失量，因此必須提高原核細(xì)胞的蛋白表達(dá)量以滿足需求，造成實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，消耗大量人力物力，影響了此法在臨床檢測(cè)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的簡(jiǎn)便性和實(shí)用性。
本發(fā)明人針對(duì)四聚體的這些缺點(diǎn)進(jìn)行了創(chuàng)新，利用一種苯甲酮類光交聯(lián)劑的化學(xué)試劑，使MHC-肽復(fù)合物不可逆地與TCR結(jié)合，從而不需可溶性MHC-肽四聚體，僅用MHC-肽單體即實(shí)現(xiàn)了抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的簡(jiǎn)便、靈敏、結(jié)果可靠的檢測(cè)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供檢測(cè)外周血抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的一種新方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測(cè)外周血抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒利用本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的再一目的在于提供本發(fā)明方法在診斷或輔助診斷及預(yù)后感染性疾病、腫瘤、同種異體移植排斥反應(yīng)中的應(yīng)用及在評(píng)價(jià)疫苗中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)外周血抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法，所述方法包括如下步驟a)構(gòu)建和制備MHC I類分子的突變體蛋白，以使之能與苯甲酮類光交聯(lián)劑結(jié)合而同時(shí)不改變其空間構(gòu)象和與TCR結(jié)合的功能；b)將突變體蛋白與抗原特異性肽保溫形成復(fù)合物；c)將所述復(fù)合物與苯甲酮類光交聯(lián)劑在4℃避光保溫過(guò)夜；d)將步驟c)的復(fù)合物與可能含有抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的外周血淋巴細(xì)胞樣品4℃保溫30分鐘；e)以大于310nm波長(zhǎng)的紫外光照射步驟d)的混合物30分鐘；以及f)免疫熒光檢測(cè)以確定外周血淋巴細(xì)胞樣品中抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的存在。
具體地，本發(fā)明的內(nèi)容是構(gòu)建和制備MHC I類分子的突變體蛋白，通過(guò)體外孵育得到MHC I類分子突變體-肽復(fù)合物，將所述復(fù)合物與光交聯(lián)劑首先進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，使已經(jīng)交聯(lián)了光交聯(lián)劑的復(fù)合物與樣品中所要檢測(cè)的抗原特異性CTLs相互結(jié)合，在溫和條件下進(jìn)行光交聯(lián)而將MHC I類分子突變體-肽復(fù)合物不可逆地共價(jià)結(jié)合在CTL表面的TCR上，阻止其解離，隨后用免疫熒光檢測(cè)抗原特異性CTL。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，MHC I類分子突變體涉及組成MHC I類分子重鏈的HLA-A2分子的突變。
交聯(lián)劑早在二十世紀(jì)五十年代就應(yīng)用于增加酶的穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)中。眾所周知二硫鍵可以穩(wěn)定蛋白分子的構(gòu)象，而交聯(lián)劑類似二硫鍵，它具有兩個(gè)功能基團(tuán)，與蛋白質(zhì)等大分子的側(cè)鏈或主鏈發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，可以被應(yīng)用于分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，從而使高溫下分子構(gòu)象的穩(wěn)定性增加。隨著對(duì)細(xì)胞膜受體及其配體相互作用的研究的深入，七十年代初交聯(lián)劑被應(yīng)用于該研究領(lǐng)域。但是至本發(fā)明作出之日起，尚未有交聯(lián)劑應(yīng)用于檢測(cè)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的任何報(bào)道或暗示。
已知交聯(lián)劑包括兩種類型化學(xué)交聯(lián)劑和光交聯(lián)劑。本發(fā)明方法使用的是光交聯(lián)劑中的一類，即苯甲酮(BP)類光交聯(lián)劑。本發(fā)明方法中所用的BP類光交聯(lián)劑的例子包括但不限于苯甲酮-4-馬來(lái)酰亞胺，4，4′-二馬來(lái)酰亞氨基苯甲酮，4-(2-碘乙酰氨基)苯甲酮(BPIA)，苯甲酮-4-異硫氰酸酯等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用苯甲酮-4-馬來(lái)酰亞胺(BPM)作為光交聯(lián)劑，它是BP類光交聯(lián)劑的一種，有兩個(gè)功能基團(tuán)，一個(gè)是與巰基反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)功能基團(tuán)，另一個(gè)是光反應(yīng)功能基團(tuán)，長(zhǎng)度大約為1nm。與其它光交聯(lián)劑相比，BP類光交聯(lián)劑的穩(wěn)定性更高；不象其它光交聯(lián)劑必須避光操作，BP類光交聯(lián)劑可以在暗光下操作，但優(yōu)選是避光操作；而且BP類光交聯(lián)劑不需短波紫外線照射，只要在350-360nm的長(zhǎng)波紫外線下即可完成交聯(lián)反應(yīng)，從而可以防止短波紫外線對(duì)蛋白質(zhì)及細(xì)胞的損傷；BP類光交聯(lián)劑可以與惰性較大的C-H鍵反應(yīng)，甚至可以在水溶液中、親核試劑中進(jìn)行反應(yīng)。
為了使MHC I類分子能標(biāo)記上BP光交聯(lián)劑，本發(fā)明人設(shè)想在不改變MHC I類分子構(gòu)象及與TCR結(jié)合的功能的前提下把MHC I類分子重鏈的某一個(gè)氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，從而提供一巰基以與BP類光交聯(lián)劑的巰基基團(tuán)反應(yīng)。應(yīng)理解的是，根據(jù)現(xiàn)有的MHC I類分子的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定這種突變的位點(diǎn)。
在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的MHC I類分子中的重鏈為HLA-A2類分子。現(xiàn)有技術(shù)的大量研究表明，HLA-A2類分子的第58位氨基酸突變后，并不改變其空間構(gòu)象和與TCR結(jié)合的功能，因此本發(fā)明的此實(shí)施方案中將HLA-A2的第58位氨基酸突變成半胱氨酸(即HLA-A2 E58C突變體)，它的側(cè)鏈提供了一個(gè)巰基，可以與BP類光交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，使HLA-A2分子標(biāo)記上交聯(lián)劑。當(dāng)含有這種光交聯(lián)劑標(biāo)記的突變HLA-A2分子和抗原特異性肽的復(fù)合物與抗原特異性CTLs表面的TCR相互作用而結(jié)合時(shí)，通過(guò)光交聯(lián)劑的光交聯(lián)反應(yīng)，其不可逆地結(jié)合到CTLs表面，隨后可利用免疫熒光檢測(cè)以確定抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的存在。所述的免疫熒光檢測(cè)可以是本領(lǐng)域熟知的任何技術(shù)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的檢測(cè)是利用原核表達(dá)的HLA-A2融合蛋白末端6×His的單克隆抗體及熒光標(biāo)記的二抗熒光染色，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
本發(fā)明的方法適用于CTLs在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要作用的感染性疾病和腫瘤患者以及同種異體移植排斥反應(yīng)的診斷或輔助診斷以及預(yù)后，例如乙型肝炎病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、人類免疫缺陷病毒-1、單純皰疹病毒、C型肝炎病毒、EB病毒和小鼠巨細(xì)胞病毒的感染；惡性黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、EB病毒相關(guān)的B細(xì)胞淋巴增殖性疾病、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、內(nèi)眼腫瘤、宮頸癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。本發(fā)明方法還適用于疫苗的評(píng)價(jià)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知各種病毒和腫瘤的抗原特異性肽，從而可以容易地設(shè)計(jì)和制備用于本發(fā)明方法中與MHC I類分子形成復(fù)合物的抗原特異性肽，以便通過(guò)本發(fā)明方法鑒別抗原特異性CTL。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法用于檢測(cè)乙型肝炎病毒抗原特異性CTL，所用抗原特異性肽為肽HBc18-27(FLPSDFFPS)和肽HBs335-343(WLSLLVPFV)。
本發(fā)明的方法是一種簡(jiǎn)便、靈敏度高的體外檢測(cè)抗原特異性CTLs的新方法，該方法通過(guò)獨(dú)創(chuàng)性的光交聯(lián)反應(yīng)，使MHC-肽復(fù)合物單體不可逆結(jié)合于TCR，從根本上解決解離快的問(wèn)題，即使解離平衡被打破后仍然可使MHC-肽復(fù)合物不可逆地停留在CTLs表面。利用該方法能鑒定相關(guān)疾病特異性CTLs及其表位，為疫苗研制工作或基因治療領(lǐng)域提供了新的工具。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于體外檢測(cè)外周血抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括BP類光交聯(lián)劑，MHC I類分子突變體蛋白及抗原特異性肽，以及進(jìn)行檢測(cè)所必需的其它輔助試劑。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1HLA-A2 E58C突變體基因和蛋白質(zhì)序列圖。
圖2示出根據(jù)實(shí)施例4獲得的MHC-肽復(fù)合物的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。其中泳道1純化的HLA-A2 E58C；泳道2純化的β2m；泳道3肽HIVpol(ILKEPVHGV)、HLA-A2 E58C和β2m的重建體系；泳道4肽HBc18-27(FLPSDFFPS)、HLA-A2 E58C和β2m的重建體系；泳道5肽HBs335-343(WLSLLVPFV)、HLA-A2 E58C和β2m的重建體系。
圖3示出實(shí)施例5進(jìn)行的抗原特異性CTLs的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。其中A為非HLA-A2乙型肝炎患者PBMCs的空白對(duì)照；B為HLA-A2乙型肝炎患者PBMCs的空白對(duì)照；C為非HLA-A2乙型肝炎患者PBMCs中HBc抗原肽特異性CTLs；D為HLA-A2乙型肝炎患者PBMCs中HBc抗原肽特異性CTLs，占CD8+T淋巴細(xì)胞的4.27％；E為非HLA-A2乙型肝炎患者PBMCs中HIV非相關(guān)抗原肽特異性CTLs；F為HLA-A2乙型肝炎患者PBMCs中HIV非相關(guān)抗原肽特異性CTLs。
實(shí)施例1HLA-A2 E58C突變體基因的克隆和β2m cDNA序列的克隆1、編碼HLA-A2前271個(gè)氨基酸的cDNA序列和β2微球蛋白(β2m)cDNA序列的獲得取HLA-AB分型為A2的健康成人外周靜脈血淋巴細(xì)胞，用TRIZOL試劑盒(Gibco BRL，USA)提取總RNA。利用RT-PCR技術(shù)獲得HLA-A2部分cDNA序列和β2m cDNA序列，引物如下HLA-A2上游引物5′-cccaagcttatcgaaggtcgttgcggtggaggtggatctggctctcactccatgaggtat-3′HLA-A2下游引物5′-cgggatcccgggtgaggggcttgggcaaacc-3′反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，然后進(jìn)行如下循環(huán)程序5次94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘；再進(jìn)行如下循環(huán)程序25次94℃變性1分鐘，68℃退火和延伸2分鐘，循環(huán)結(jié)束后72℃繼續(xù)延伸10分鐘，擴(kuò)增產(chǎn)物為862bp。
β2m上游引物5′-cgggatccatcgaaggtcgtatccagcgtactccaaagatt-3′(含BamH I酶切位點(diǎn))β2m下游引物5′-cccaagctttcacatgtctcgatcccactt-3′(含Hind III酶切位點(diǎn))反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，然后進(jìn)行如下循環(huán)程序5次94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘；再進(jìn)行如下循環(huán)程序25次94℃變性1分鐘，68℃退火和延伸1.5分鐘，循環(huán)結(jié)束后72℃C繼續(xù)延伸10分鐘，擴(kuò)增產(chǎn)物為326bp。
將上述PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T EASY質(zhì)粒(Promega USA)中，送大連寶生物公司測(cè)序。所得HLA-A2 E58C突變體基因序列如圖1所示。
2、HLA-A2 E58C突變體的獲得利用定點(diǎn)突變PCR技術(shù)，把HLA-A2的第58位氨基酸由谷氨酸E突變?yōu)榘腚装彼酑。所需的兩對(duì)引物分別為HLA-A2 5’端引物5’-agatctgatcgaaggtcgtggctctcactccatgaggtat-3’(含Bgl II酶切位點(diǎn)(下劃線)HLA-A2 3’端引物5’-gcggccgcttaacc ggtgaggggcttgggcaaacc-3’(含Not I酶切位點(diǎn)(下劃線)和6×His序列(黑體))；上鏈引物5’-gagggtccg tattgggacggggag-3’下鏈引物5’-gtcccaata ggaccctcctgctc-3’第一步PCR的反應(yīng)條件以HLA-A2 5’端引物和下鏈引物為引物對(duì)，94℃變性5分鐘，然后進(jìn)行如下循環(huán)程序5次94℃變性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；再進(jìn)行如下循環(huán)程序20次94℃變性30秒，68℃退火和延伸1.5分鐘，循環(huán)結(jié)束后72℃繼續(xù)延伸10分鐘，擴(kuò)增產(chǎn)物為202bp；以上鏈引物和HLA-A2 3’端引物為引物對(duì)，94℃變性5分鐘，然后進(jìn)行如下循環(huán)程序5次94℃變性30秒，64℃退火30秒，72。C延伸1分鐘；再進(jìn)行如下循環(huán)程序20次94℃變性30秒，68℃退火和延伸1.5分鐘，循環(huán)結(jié)束后72℃繼續(xù)延伸10分鐘，擴(kuò)增產(chǎn)物為683bp。第二步PCR的反應(yīng)條件為第一步的兩種PCR產(chǎn)物純化后，混合，94℃變性5分鐘，然后進(jìn)行如下循環(huán)程序5次94℃變性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環(huán)結(jié)束后72℃繼續(xù)延伸5分鐘；從PCR儀中取出Eppendorf管迅速加入HLA-A2 5’端引物和HLA-A2 3’端引物各1μl，94℃變性5分鐘，再進(jìn)行如下循環(huán)程序25次94℃變性30秒，68℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘，循環(huán)結(jié)束后72℃繼續(xù)延伸10分鐘，擴(kuò)增產(chǎn)物為864bp，克隆到pGEM-T EASY質(zhì)粒中，送大連寶生物公司測(cè)序。所得HLA-A2 E58C突變體蛋白質(zhì)序列如圖1所示。實(shí)施例2HLA-A2 E58C突變體基因和β2m基因的原核表達(dá)及蛋白的純化1.原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)用Bgl II和Not I分別雙酶切克隆了HLA-A2突變cDNA序列的pGEM-T EASY質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-30a(+)(Novagen，USA)，用BamH I和HindIII分別雙酶切克隆了β2mcDNA序列的pGEM-TEASY質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-30a(+)，分別利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。將正確的克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21株，經(jīng)37℃ IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)，得到HLA-A2 E58C突變體融合蛋白和β2m融合蛋白。2.HLA-A2 E58C突變體融合蛋白和β2m融合蛋白的純化利用Invitrogen公司的ProBondTM6×His蛋白純化樹(shù)脂根據(jù)廠商對(duì)原核表達(dá)的蛋白進(jìn)行金屬螯合親和層析純化。進(jìn)行SDS-PAGE分析檢測(cè)純化結(jié)果。實(shí)施例3抗原特異性肽的合成本例中以乙型肝炎病毒(HBV)的抗原特異性肽作為本發(fā)明方法中使用的抗原特異性肽。當(dāng)然還可以根據(jù)檢測(cè)CTL的目的選用不同的病毒或腫瘤抗原特異性肽。
HBsAg335-343(WLSLLVPFV)和HBcAg18-27(FLPSDFFPSV)表位已經(jīng)被證明是HBV抗原特異性表位(Nayersina，R.et al.J Immunol150，4659-71.(1993))，所以本發(fā)明人選擇了這兩個(gè)表位作為抗原特異性肽，選擇HIVpol(ILKEPVHGV)作為陰性對(duì)照。上述三個(gè)肽由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院合成。實(shí)施例4MHC-肽復(fù)合物的形成對(duì)上述原核表達(dá)的重組融合蛋白進(jìn)行復(fù)性及重建HLA-A2-肽復(fù)合物，重建體系如下每1ml重建反應(yīng)體系如下1M Tris-HCl(pH8.0)100μl2M L-精氨酸鹽酸鹽 200μl0.5M EDTA 4μl0.1M還原型谷光甘肽50μl0.1M氧化型谷光甘肽5μl0.1M PMSF 5μl原核表達(dá)的HLA-A2突變體蛋白35μg原核表達(dá)的β2m蛋白 34μg抗原特異性肽 10μg去離子水 600μl其中原核表達(dá)的HLA-A2突變體蛋白和原核表達(dá)的β2m蛋白的配制如下
分別取實(shí)施例2獲得的HLA-A2突變體融合蛋白和β2m融合蛋白各99μl(200μg)，加入10mM DTT 1μl，混勻待用。
把上述重建體系放入10℃水浴中孵育24小時(shí)。對(duì)重建的復(fù)合物單體進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖2。對(duì)比泳道1、2，泳道3、4和5可以很明顯地看到除了HLA-A2 E58C和β2m以外的第三條蛋白條帶(箭頭所示)。實(shí)施例5外周靜脈血淋巴細(xì)胞中HBV抗原特異性CTLs的檢測(cè)本實(shí)施例以檢測(cè)外周血中HBV抗原特異性CTL為例說(shuō)明了本發(fā)明方法。
乙型肝炎病毒感染目前仍是威脅健康的主要原因，世界人口的5％存在著HBV的持續(xù)感染，具有發(fā)展成慢性乙型肝炎或肝細(xì)胞癌的可能性。急性乙型肝炎病人外周血中的CTLs具有多克隆、多特異性的特點(diǎn)，可以對(duì)HBV蛋白的多種表位產(chǎn)生特異的CTL反應(yīng)，大多數(shù)急性乙型肝炎病人外周血中都可以檢測(cè)到病毒特異的CTLs，因此本例選擇了急性乙型肝炎病人作為外周靜脈血的來(lái)源。另外，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)可以作為乙型肝炎病人病情的一個(gè)衡量指標(biāo)，ALT越高，肝細(xì)胞的損傷越嚴(yán)重，CTLs的數(shù)量和活性越大，同時(shí)考慮到乙型肝炎病人數(shù)量多，本實(shí)驗(yàn)的病人外周靜脈血樣容易獲得，因此本例選擇ALT大于正常值20倍的急性乙型肝炎病人作為研究對(duì)象(ALT正常值＜40)，并且患者的血清HBsAg、HBeAg和IgM HBc-Ab陽(yáng)性，HCV陰性，HIV檢測(cè)為陰性。
1.突變的HLA-A2-肽復(fù)合物和BPM進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)取0.2μl的BPM(20mM)直接加入1ml實(shí)施例4的重建反應(yīng)體系中，4℃過(guò)夜，避光；之后10μl10mM的DTT加入1ml重建體系中，終止反應(yīng)；4℃透析過(guò)夜，透析液的配制(500ml)如下
1M Tris-HCl(PH8.0) 50ml0.5M EDTA2ml0.1M PMSF2.5ml加去離子水至500ml。2.乙肝病人單核細(xì)胞的分離及HLA分型(1)取急性乙型肝炎患者(ALT＞800)外周靜脈血5ml，以肝素抗凝，輕搖1分鐘后，室溫放置1小時(shí)；將抗凝血用RPMI1640培養(yǎng)基1∶1的體積混勻；將稀釋血懸于5ml的淋巴細(xì)胞分層液(購(gòu)于鼎國(guó)生物技術(shù)公司)的界面上，1800rpm離心20分鐘；用吸管將分離出的中間層細(xì)胞取出放入另一已加入RPMI1640不完全培養(yǎng)基的試管中，充分混勻后，1500rpm離心10分鐘；棄上清，用RPMI 1640不完全培養(yǎng)基混勻后，1000rpm離心10分鐘，重復(fù)一次；調(diào)細(xì)胞數(shù)至2×106/ml，備用。
(2)用HLA-AB分型板(購(gòu)自中日友好醫(yī)院臨檢所)分型將上述已經(jīng)分離好的1μl淋巴細(xì)胞加在HLA-AB分型板上，室溫孵育30分鐘；加5μl ABC補(bǔ)體于HLA血清板中，室溫孵育60分鐘；加2μl 5％伊紅染色5分鐘；加5μl甲醛溶液固定，2小時(shí)后讀結(jié)果。3.外周靜脈血抗原特異性CTLs的檢測(cè)(1)取HLA分型為A2的急性乙肝病人外周靜脈血單核細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI 1640洗一次，計(jì)數(shù)，調(diào)至2×106個(gè)/ml；每個(gè)反應(yīng)加0.5ml的細(xì)胞(1×106個(gè))，再迅速加入1ml上述用BPM化學(xué)交聯(lián)的復(fù)合物(其中含有相應(yīng)的HLA-A2為35μg)，混勻，4℃孵育30分鐘。上述步驟皆需要避光。
用手提紫外燈(UVGL-25)的長(zhǎng)波段(大于310nm)照射，以減少細(xì)胞和蛋白的損傷，紫外照射(距離約1cm)30分鐘，PBS沖洗至少二次。
(2)免疫熒光染色每個(gè)樣本加入1μg6×His單克隆抗體(Qiagen USA)，4℃，30分鐘；PBS至少?zèng)_洗二次；加入15μl FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗(中山生物技術(shù)公司)，4℃避光30分鐘；PBS至少?zèng)_洗二次；每個(gè)樣本加入20μl PE(藻紅素)標(biāo)記的小鼠抗人CD8 IgG(購(gòu)于晶美生物公司)，4℃避光30分鐘；PBS至少?zèng)_洗二次；用含有0.15M氯化鈉的1％多聚甲醛固定；流式細(xì)胞儀(型號(hào)庫(kù)爾特XLB49333)分析。
圖3是兩位急性乙型肝炎患者(非HLA-A2和HLA-A2)外周靜脈血的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，圖中示出非HLA-A2患者的HBc抗原肽特異性CTLs的數(shù)量為0，HIV非相關(guān)抗原肽特異性CTLs的數(shù)量為0；而HLA-A2患者的HBc抗原肽特異性CTLs的數(shù)量為4.27％，HIV非相關(guān)抗原肽特異性CTLs的數(shù)量為0。表明本發(fā)明方法既簡(jiǎn)便又靈敏性高。
在本實(shí)施例中用HLA-A2 E58C突變體-肽復(fù)合物檢測(cè)了19例HLA分型為A2的急性乙型肝炎患者、1例非HLA-A2的急性乙型肝炎患者(ALT＞800)和3例HLA-A2型慢性乙型肝炎患者(以上患者HIV感染皆為陰性)。發(fā)現(xiàn)19例HLA分型為A2的急性肝炎患者中13例患者的外周血存在HBcAg18-27或HBsAg335-343抗原肽特異性CTLs，占外周血單核細(xì)胞中CD8+T淋巴細(xì)胞的2.75％-31.61％，同時(shí)還檢測(cè)了這些患者的HIVpol(ILKEPVHGV)抗原肽特異性CTLs，結(jié)果為陰性，這說(shuō)明本發(fā)明方法的假陽(yáng)性率低，也就是說(shuō)BPM在與TCR上的C-H鍵發(fā)生光交聯(lián)時(shí)的非特異性交聯(lián)發(fā)生的幾率低，只有在MHC-肽復(fù)合物特異地結(jié)合在TCR上，BPM與TCR上的C-H鍵很接近(1nm)時(shí)，才能在光的激發(fā)下發(fā)生光交聯(lián)反應(yīng)，這一結(jié)果與本發(fā)明人的預(yù)測(cè)和一些文獻(xiàn)報(bào)道相一致，因此在本發(fā)明中應(yīng)用光交聯(lián)劑可以避免假陽(yáng)性的發(fā)生；1例非HLA-A2的急性乙型肝炎患者和3例HLA-A2的慢性乙型肝炎患者的HBcAg18-27抗原肽特異性CTLs檢測(cè)結(jié)果也為陰性，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致，以上結(jié)果均證明本發(fā)明的方法是可行的。
急性乙型肝炎病人外周血中的CTLs具有多克隆、多特異性的特點(diǎn)，由于患者的個(gè)體差異，可以對(duì)HBV蛋白的多種表位產(chǎn)生特異的CTL反應(yīng)，本實(shí)施例中HBc特異性CTLs為陰性的患者可能具有HBV蛋白其它表位特異的CTLs，本發(fā)明人檢測(cè)了其中一例患者的HBs抗原特異性的CTLs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBs抗原特異性的CTLs占外周血單核細(xì)胞中CD8+T淋巴細(xì)胞的3.22％，進(jìn)一步證明了本發(fā)明的可行性。實(shí)施例6本發(fā)明方法與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)法的比較細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)方法是一個(gè)比較新的應(yīng)用流式細(xì)胞儀的單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)(Prussin，C.& Metcalfe，D.D.J.Immunol.Med.188，117-128(1995))，細(xì)胞在體外受到某種刺激(抗原特異性肽或離子霉素)開(kāi)始產(chǎn)生細(xì)胞因子，用BFA(Brefeldin A)等細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸阻斷劑阻斷細(xì)胞因子在高爾基體內(nèi)的運(yùn)輸，使細(xì)胞因子不能分泌到細(xì)胞外，在細(xì)胞內(nèi)蓄積，利用其特異性抗體可以發(fā)現(xiàn)分泌該細(xì)胞因子的特異性細(xì)胞，同時(shí)也可以檢測(cè)該種細(xì)胞表面的特異性蛋白。因此根據(jù)細(xì)胞毒性T細(xì)胞分泌IFNγ的特點(diǎn)，利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)方法作為本發(fā)明的對(duì)照。步驟如下1)取兩個(gè)15ml的離心管，分別標(biāo)記為刺激組和非刺激組，向每個(gè)離心管中加入0.5ml肝素抗凝血。刺激組加入5μl CD28/CD49d單克隆抗體(終濃度為1μg/ml)和2.5μl抗原特異性肽(前文提及的抗原特異性肽)(抗原特異性肽溶于DMSO中，濃度為2mg/ml，分裝成5μl一管，凍存于-80℃，每1ml血加入5μl使終濃度為10μg/ml)；非刺激組只加5μl CD28/CD49d單克隆抗體(終濃度為1μg/ml)。輕柔混勻，置37℃孵育2小時(shí)；2)取BFA儲(chǔ)存液，用無(wú)菌PBS按1∶10的比例稀釋，向刺激組和非刺激組各加入10μl稀釋液，混勻，37℃孵育4小時(shí)；3)各加50μl EDTA溶液，劇烈震蕩，室溫孵育15分，再次震蕩10秒；4)取4個(gè)5ml的離心管，分別標(biāo)記為刺激空白管、刺激樣本管、非刺激空白管和非刺激樣本管，每管加入上述經(jīng)抗原肽刺激的血樣200μl；5)各加2ml 1×BD FACS裂解溶液，混勻，室溫孵育10分；6)各加2ml沖洗緩沖液(用1×PBS配制0.5％BSA和0.1％疊氮鈉)，500g室溫離心5分鐘；7)棄上清，加入0.5ml 1×BD FACS通透化溶液2，震蕩使細(xì)胞重懸，室溫孵育10分鐘；8)各加入2ml沖洗緩沖液，500g室溫離心5分鐘；9)棄上清，向刺激樣本管和非刺激樣本管各加入20μl FITC標(biāo)記的抗人INF-γ單克隆抗體和20μl PE標(biāo)記的CD8單克隆抗體，向刺激空白管和非刺激空白管各加入上述抗體的同型抗體或用PBS代替，室溫避光孵育30分鐘；10)各加入2ml沖洗緩沖液，500g室溫離心5分鐘；11)棄上清，加入200μl 1％多聚甲醛重懸細(xì)胞，4℃避光保存，F(xiàn)ACS檢測(cè)。
本實(shí)施例中分別用本發(fā)明的方法和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)方法檢測(cè)了5例HLA分型為A2的急性乙型肝炎患者的外周靜脈血，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用上述兩種方法分別檢測(cè)出4例患者的外周靜脈血單核CD8+T淋巴細(xì)胞中存在著HBc特異性CTLs，一例患者HBc特異性CTLs為陰性，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的可行性。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)利用本發(fā)明檢測(cè)出的HBc特異性CTLs占外周靜脈血單核CD8+T淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)普遍高于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)方法的百分?jǐn)?shù)，因此本發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明的新方法的靈敏性比細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)方法高。由于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)方法要在體外刺激被檢測(cè)的細(xì)胞使其產(chǎn)生細(xì)胞因子，一些細(xì)胞雖然在機(jī)體內(nèi)環(huán)境中具有分泌細(xì)胞因子的能力，但是在體外的模擬環(huán)境中很快會(huì)失去功能，最終走向凋亡，所以目前功能性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞檢測(cè)方法都受到這一條件的制約而使檢測(cè)結(jié)果偏低，然而本發(fā)明中的新方法是以細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的表型結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，檢測(cè)CTLs表面的蛋白分子和MHC-肽復(fù)合體的一種表型分析方法，因此被檢測(cè)的CTLs不會(huì)受外界環(huán)境的影響，不存在檢測(cè)結(jié)果偏低的問(wèn)題，從而使結(jié)果更接近真實(shí)值。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)外周血抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法，所述方法包括如下步驟a)構(gòu)建和制備MHC I類分子的突變體蛋白，以使之能與苯甲酮類光交聯(lián)劑結(jié)合而同時(shí)不改變其空間構(gòu)象及與TCR結(jié)合的功能；b)將突變體蛋白與抗原特異性肽保溫形成復(fù)合物；c)將所述復(fù)合物與苯甲酮類光交聯(lián)劑在4℃避光保溫過(guò)夜；d)將步驟c)的復(fù)合物與可能含有抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的外周血淋巴細(xì)胞樣品4℃保溫30分鐘；e)以大于310nm波長(zhǎng)的紫外光照射步驟d)的混合物30分鐘；以及f)免疫熒光檢測(cè)步驟e)的混合物以確定外周血淋巴細(xì)胞樣品中抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的MHC I類分子的重鏈為HLA-A2分子，其突變體為HLA-A2第58位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼帷?br> 3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的苯甲酮類光交聯(lián)劑選自苯甲酮-4-馬來(lái)酰亞胺，4，4′-二馬來(lái)酰亞氨基苯甲酮，4-(2-碘乙酰氨基)苯甲酮，苯甲酮-4-異硫氰酸酯。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的苯甲酮類光交聯(lián)劑為苯甲酮-4-馬來(lái)酰亞胺。
5.權(quán)利要求1的方法，其中免疫熒光檢測(cè)為流式細(xì)胞檢測(cè)法。
6.權(quán)利要求1的方法，其用于檢測(cè)病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)感染性疾病、腫瘤或同種異體移植排斥反應(yīng)中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
7.權(quán)利要求1的方法，其用于評(píng)價(jià)疫苗。
8.權(quán)利要求1的方法，其用于檢測(cè)外周血中乙型肝炎病毒抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所用抗原特異性肽為肽HBc18-27(FLPSDFFPS)和肽HBs335-343(WLSLLVPFV)。
10.一種用于體外檢測(cè)外周血抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括苯甲酮類光交聯(lián)劑，MHC I類分子突變體蛋白及抗原特異性肽，以及進(jìn)行檢測(cè)所必需的其它輔助試劑。
11.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述的苯甲酮類光交聯(lián)劑選自苯甲酮-4-馬來(lái)酰亞胺，4，4′-二馬來(lái)酰亞氨基苯甲酮，4-(2-碘乙酰氨基)苯甲酮，苯甲酮-4-異硫氰酸酯。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述的苯甲酮類光交聯(lián)劑為苯甲酮-4-馬來(lái)酰亞胺。
13.權(quán)利要求10的試劑盒，其用于檢測(cè)病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)感染性疾病、腫瘤或同種異體移植排斥反應(yīng)中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
14.權(quán)利要求10的試劑盒，其用于評(píng)價(jià)疫苗。
15.權(quán)利要求10的試劑盒，其用于檢測(cè)外周血中乙型肝炎病毒抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所含的抗原特異性肽為肽HBc18-27(FLPSDFFPS)和肽HBs335-343(WLSLLVPFV)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)外周血抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的新方法,包括構(gòu)建和制備MHC I類分子的突變體蛋白,通過(guò)體外孵育得到MHC I類分子突變體－肽復(fù)合物,將所述復(fù)合物與光交聯(lián)劑化學(xué)交聯(lián),使已經(jīng)交聯(lián)了光交聯(lián)劑的復(fù)合物與樣品中所要檢測(cè)的抗原特異性CTLs相互結(jié)合,在溫和條件下進(jìn)行光交聯(lián)而將MHC I類分子突變體－肽復(fù)合物不可逆地共價(jià)結(jié)合在CTL表面的TCR上,隨后用免疫熒光檢測(cè)抗原特異性CTL。本發(fā)明還涉及使用所述方法的試劑盒及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/576GK1387046SQ0111591
公開(kāi)日2002年12月25日 申請(qǐng)日期2001年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月22日
發(fā)明者王恒 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所