專利名稱：磁性粒子測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測定樣品中磁粒子數(shù)的方法與設(shè)備。例如用于免疫測定中的測定磁粒子數(shù)的方法。
這種方法允許將涂層的順磁粒子(PMP)用作標(biāo)記，采用新穎的電子電路設(shè)計來探測它們。
PMP的直徑通常為2.8μm，包括順磁材料芯料涂以適當(dāng)?shù)木酆衔飳?，而在聚合物層上則根據(jù)PMP的具體應(yīng)用附有抗體/抗原層。當(dāng)前，這些磁粒子的主要應(yīng)用是免疫測定中的樣品分離、提純與用作固相。
在典型的免疫測定法中，PMP以蛋白質(zhì)涂層，使之能用作可于其上發(fā)生免疫反應(yīng)的固相材料。這種免疫反應(yīng)用酶、熒光或化學(xué)反光分子為標(biāo)記進行探測與定量化。PMP并非永磁化的而是被吸引到永磁鐵上允許進行簡單的洗滌處理，因此洗滌這種已涂層的PMP不要求進行過濾或離心處理。在洗滌步驟之后，用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ綔y已涂層的PMP表面上固定的標(biāo)記。
將鐵磁粒子用作免疫測定法中的標(biāo)記的方法已為Kriz等在兩篇論文中描述到。這兩篇論文是“磁性免疫測定法的進展”，Biosensors andBioelectronics 13(1998),pp817～823；“生物分析與生物傳感器中的磁導(dǎo)率的測量，Analgfical Chemistry 1996,68,1966～1970。但在這些方法中，鐵磁粒子是由置于Maxwell電橋中的簡單測量線圈進行探測，允許測量擬制備的樣品的磁導(dǎo)率。然后用此磁導(dǎo)率為指示數(shù)去測定此樣品物質(zhì)中的粒子數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用具有電容器與線圈的調(diào)諧電路來測定樣品內(nèi)的磁粒子數(shù)的方法，此方法包括a．測定此樣品在和不在該線圈中時，上述諧振電路的諧振頻率差；b．應(yīng)用此諧振頻率差來測定磁粒子的濃度。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用來測定樣品內(nèi)磁粒子濃度的設(shè)備，此設(shè)備包括a．具有電容器與線圈的調(diào)諧電路；b．產(chǎn)生用于驅(qū)動調(diào)諧電路的驅(qū)動信號的驅(qū)動器；c．探測此調(diào)諧電路諧振頻率的探測器，樣品在和不在線圈中時此諧振頻率的差即表示PMP的濃度。
據(jù)此，本發(fā)明提供了用來測定樣品中的磁粒子數(shù)的方法與設(shè)備。本發(fā)明利用了這樣一個事實磁粒子如順磁粒子、鐵磁粒子或類似粒子的存在，將導(dǎo)致樣品中磁導(dǎo)率的固有變化。由于線圈的自感取決于線圈中材料的磁導(dǎo)率，將含有磁粒子的樣品置于線圈中會導(dǎo)致線圈自感的變化。本發(fā)明通過測量包含線圈的LC電路的諧振頻率，求得線圈自感的指示數(shù)來利用上述效應(yīng)。樣品置于線圈內(nèi)與將樣品自此線圈中取出時，上述電路的諧振頻率是不同的。因此，通過測量LC電路中諧振頻率，就能測定樣品中的磁粒子數(shù)。此外，通過將這種線圈選擇為螺線管、環(huán)形線圈與扁平線圈之一，就有助于使線圈與樣品間的靜壓減至最少，由此可以保證獲得最佳信號。
通常，測定調(diào)諧電路的諧振頻率差包括將樣品置于線圈內(nèi)；測定此調(diào)諧電路的諧振頻率；從線圈中取出樣品；再測定此調(diào)諧電路的諧振效率。最好是去測定有樣品在然后除去樣品時的調(diào)諧電路的諧振頻率，以解決此線圈諧振頻率的長期變化影響。這種長期變化通常是由于周圍環(huán)境中的溫度變化以及其他這類因素造成。但由于這類變化通常是長期地發(fā)生這幾個小時之久，于是通過使樣品存在而隨即便除去樣品來進行此后的測量，就可以保證所測諧振頻率的變化唯一的原因是由于樣品的存在和/或不存在所致。于是，這將有助于防止線圈固有諧振頻率的變化影響到測量結(jié)果。但應(yīng)認識到，要是能提供足夠穩(wěn)定的調(diào)諧電路，則可以只需對無樣品的調(diào)諧電路的諧振頻率測量一次，然后以之用于所有的繼后測量中即可。
測定此諧振頻率的步驟一般包括對調(diào)諧電路施加驅(qū)動信號；測量此驅(qū)動信號與取自調(diào)諧電路的輸出信號間的相位差；然后調(diào)節(jié)所加信號的頻率，直至所加信號與輸出信號間無相位差。也可以采用其他的適當(dāng)方法，但上述方法的優(yōu)點是能用反饋機構(gòu)調(diào)節(jié)電路而使此電路能自動確定該諧振頻率。
此驅(qū)動信號所具的頻率通常大于200KHz，而最好是大于500KHz。這是由于在較高的頻率下時，線圈電感的一定變化會造成調(diào)諧電路諧振頻率的顯著變化。因此，使電路在較高頻率下運行會提高系統(tǒng)的靈敏度。
通常所用的磁粒子是順磁粒子，但也可采用鐵磁粒子或任何其他磁性粒子。
用于探測調(diào)諧電路諧振頻率的探測器可以包括相位比較器，用以測定驅(qū)動信號和從調(diào)諧電路取得的輸出信號之間的相位差，同時還包括用于將驅(qū)動信號施加到調(diào)諧電路上的驅(qū)動器，此驅(qū)動器則包括壓控振蕩器(VCO)。這樣的設(shè)備結(jié)構(gòu)有利于讓比較的相位直接耦合VCO，使此VCO能響應(yīng)相位比較器，改變驅(qū)動信號的頻率直至不存在相位差。
上述設(shè)備最好包括鎖相環(huán)振蕩器電路。這是特別有利的，因為如上所述，這樣能允許精確定測定調(diào)諧電路的諧振頻率而不受人為的干擾。這是一種能獲得高精確結(jié)果的自動化方法。
本發(fā)明特別適用于免疫測定。但它也可用于其他類型的樣品，如瓶罐與其他容器、標(biāo)記等。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了進行結(jié)合試驗的方法，此方法包括a．將分子層固定于基片上；b．提供許多磁粒子作為標(biāo)記；c．用分子層進行反應(yīng)，以使至少一些磁粒子結(jié)合到基片上。
d．通過測定基片暴露于線圈產(chǎn)生的磁場之下和基片未暴露于線圈產(chǎn)生的磁場下時調(diào)諧電路的諧振頻率差，由此來測定結(jié)合到基片上的磁粒子數(shù)。
因此，本發(fā)明還提供了用磁粒子為標(biāo)記進行試驗的方法。實現(xiàn)這項試驗時是用上面固定有適于此項試驗的分子層的基片。試驗的反應(yīng)設(shè)計成，使得磁粒子上的涂層與基片上的固定層之間形成結(jié)合。因此，通過測定此基片在和不在線圈內(nèi)時調(diào)諧電路的諧振頻率，就能測定結(jié)合到基片上的磁粒子數(shù)。
通常，磁粒子是結(jié)合到相應(yīng)個數(shù)的第二種分子上，其中的反應(yīng)使第二種分子與該分子層結(jié)合而使磁粒子結(jié)合到基片上。但也可用另一種方式，即將磁粒子設(shè)計成與結(jié)合到基片上的分子直接反應(yīng)。
這種反應(yīng)可以是任何反應(yīng)形式，例如DNA雜交反應(yīng)。此時，第一種與第二種分子將包含部分DNA。但這種結(jié)合試驗最好是這樣一種免疫測定試驗，其中的分子層是抗體/抗原層而第二種分子是抗原或抗體。因此，磁粒子可以耦合到此抗原或抗體上，然后結(jié)合到基片上形上的抗體/抗原層上。
如上所述，當(dāng)樣品設(shè)在基片上時，最好是使線圈與樣品間的靜壓最小化。為此，較為理想的是使調(diào)諧電路是螺線管、環(huán)線線圈與扁平線圈中的一種。這時，如果線圈是螺線管，此方法一般涉及到將樣品置于此種線圈內(nèi)而暴露于磁場之下。此外，這種線圈最好具有橢圓形剖面，雖然矩形剖面也是可以采用的。或者，可以采用扁平線圈而把樣品置于線圈鄰邊使之暴露于磁場之下。
應(yīng)該認識到，本發(fā)明的第三方面可以有利地利用本發(fā)明的第一與第二方面來實施。因此，可以用前述的電子電路來產(chǎn)生與基片上固定的PMP直接相關(guān)的輸出。在此方法中，PMP粒子此時被用作標(biāo)記物，而不需用獨立的熒光的、放射性的、化學(xué)發(fā)光的或其他的標(biāo)記物。這樣就能顯著地減少分析步驟數(shù)和縮短試驗所需的時間。此外，這種電子電路在形體上小到足以允許開發(fā)手持式儀器。
采用熒光或類似標(biāo)記物的當(dāng)前的分析式免疫測定系統(tǒng)需用昂貴的專門設(shè)備，把它們制造成手持式系統(tǒng)是不實際的。當(dāng)前市售的僅有的手持式系統(tǒng)是采用利用顏色標(biāo)記的測桿工藝。這種系統(tǒng)主要用于近乎病人的試驗例如懷孕試驗，而這種試驗的結(jié)果只會是陽性或陰性的。它們一般不適用于測定物質(zhì)的實際濃度。
下面參考


本發(fā)明的例子，附圖中圖1A是調(diào)諧電路第一例子的示意圖；圖1B是調(diào)諧電路第二例子的示意圖；圖2是傳統(tǒng)的振蕩器電路的示意圖；圖3是本發(fā)明的電路的示意圖；圖4是曲線圖，示明在圖3的電路中，頻率相對于所得到的磁粒子濃度減少而下降；圖5是適用于圖3電路中的振蕩器的電路圖；圖6是曲線圖，示明探測出的PMP粒子數(shù)相對于調(diào)諧電路諧振頻率的變化；圖7是用于圖3的調(diào)諧電路中的線圈第二例的示意圖；圖8是曲線圖，示明在圖7的線圈下，所探測到的PMP數(shù)相對于調(diào)諧電路的諧振頻率的變化；圖9是用于圖3中調(diào)諧電路的線圈的第三例的示意圖；圖10是曲線圖，示明探測出的PMP粒子數(shù)相對于調(diào)諧電路諧振頻率的變化；圖11A與11B例示了用于圖3的調(diào)諧電路中的兩種扁平線圈構(gòu)型；圖12是曲線圖，示明在圖7的線圈下，所探測到的PMP數(shù)相對于調(diào)諧電路的諧振頻率的變化；圖13是依據(jù)本發(fā)明的免疫測定反應(yīng)的示意圖。
在本發(fā)明的一個例子中，為了測定塑料片上涂層的順磁粒子數(shù)，將此塑料片置于絕緣導(dǎo)線的線圈中，同時觀察這些順磁粒子的存在對線圈自感L的影響。假設(shè)只是這種粒子的高的磁導(dǎo)率才會對線圈自感的變化才有顯著影響。
大匝數(shù)的均勻螺旋形線圈的自感給定為L≈μμom2lA(1)式中μo=真空的磁導(dǎo)率(4π×10-7Hm-1)；μ=(線圈)芯的相對磁導(dǎo)率；
m=每單位長度的匝數(shù)；l=長度；A=線圈的橫剖面積。
當(dāng)上面附有n個順磁粒子的塑料片置于線圈內(nèi)時，此線圈的μ的有效值是某個與塑料片中塑料磁導(dǎo)率μv、塑料片上任何殘余緩沖液的磁導(dǎo)率μs、順磁粒子的磁導(dǎo)率μp以及線圈中空氣間隙的磁導(dǎo)率μA有關(guān)的值。此時的自感成為L={Cvμv+CAμA+Csμs+nCμp}μom2lA={Cvμv+CAμA+Csμs}μom2lA+nCμpμom2lA(2)式中Cv=塑料片中塑料的有效量；Cs=塑料片上緩沖液的有效量；CA=線圈中空氣的有效量；C =使各個粒子的磁導(dǎo)率與它們對總的磁導(dǎo)率的影響相關(guān)的常數(shù)。
由于這些順磁粒子與線圈內(nèi)容積相比極其之小，各粒子周圍的磁場是不均勻的，但由于這些粒子的形狀與粒度(2.8μm直徑)都相同，它們對總的有效磁導(dǎo)率的影響都相等。對這些研究中的所有樣品來說，各塑料片均有一致的結(jié)構(gòu)，而緩沖液殘余物的體積可以假定為常數(shù)。于是第一項中所有的值為常數(shù)或小到可忽略的程度，從而式(1)可以改寫為L=Lo+kn(3)式中k=Cμpμom2lA=常數(shù)，Lo={Cvμv+CAμA+Csμs}μom2lA=包含著上面只有緩沖液殘余物而無粒子的塑料片的線圈的電感相對應(yīng)的另一常數(shù)。
于是，線圈的電感隨塑料片上順磁粒子數(shù)的增加而變得均勻。為使n對于L的影響最大而由此提高探測系統(tǒng)的靈敏度，Lo應(yīng)盡可能地小而k應(yīng)盡可能地大。通過減小線圈的內(nèi)部尺寸使之大到剛好足以盛納下此樣品片使線圈中的靜空間保持到最小，這樣就將減小CA，從而減小Lo。這也同樣保證了線圈中有更多的電磁場通過磁粒子，從而提高了C與k。
順磁粒子對線圈電感的影響是通過將樣品片置于與并聯(lián)電容器形成諧振電路的線圈中進行測定(圖1A)。
圖1A中電路的諧振頻率給定為f={2π(LC)1/2}-1(4)由式(3)與(4)得到f={2πC1/2(Lo+kn)1/2}-1={2π(LoC)1/2}-1{1+(k/Lo)n}-1/2f=fo{1+(k/Lo)n}-1/2(5)式中，fo=包含著上面只有剩余緩沖液而無磁粒子的塑料片的電路的諧振頻率。
用二項式定理展開式(5)，得f=fo{1-1/2(k/Lo)n+…}f=fo{1-1/2(k/Lo)n}(略去了高次項)(6)式(6)表明LC調(diào)諧電路的振蕩頻率將隨塑料片存在的順磁粒子數(shù)的增加作線性的減少。
在實際的LC電路中，如圖1B中例示，此線圈具有內(nèi)阻RL而電容器具有漏泄電阻RC，同時有雜散電容CL主要存在于線圈中的各繞組間。對于優(yōu)質(zhì)的電容器，RC很大，對電路性能的影響可略去不計。這種雜散電容在絕大程度上取決于線圈的結(jié)構(gòu)而會減少電路的諧振頻率。要是線圈具有剛性結(jié)構(gòu)，CL將不保不變而其存在可以基本上忽略。當(dāng)把空白的塑料片插入線圈內(nèi)時常可以觀察到諧振頻率略有減少，這是由于此塑料片較它移走的空氣有較高的介電常數(shù)使CL增加所致。內(nèi)阻RL由于它會減小諧振頻率可能具有最大的影響f={1-(RL2C/L)}1/2{2π(LC)1/2}-1(7)對于L=130μH、C=4.7nF和RL=17Ω的典型線圈而言，RL能使諧振頻率從f=203.61KHz(式4)減少到f=202.54KHz(式7)，即諧振頻率下降了1.07KHz。
實際的LC電路的諧振頻率與溫度關(guān)系至為密切。圖1B中所示各元件的值在某種程度上都會隨溫度變化，因而會影響到諧振頻率隨溫度漂移。線圈是由薄銅絲制成，這就加大了它的電阻隨溫度升高而增加的特性。此外，線圈的尺寸與電容器C的電容也隨溫度而改變。
于是，LC電路的振蕩頻率，從而塑料片上的順磁粒子數(shù)，是由采用LC電路來控制振蕩器電路的振蕩而決定的。試驗結(jié)果表明，當(dāng)把上面載有磁粒子的塑料片置于在約250KHz下振蕩的線圈中時，諧振頻率通常只減少幾個Hz。因此上述振蕩器電路必須非常穩(wěn)定。
傳統(tǒng)的振蕩器電路例如圖2所示的Colpitts振蕩器并未見穩(wěn)定到足以可靠地測出這樣小的頻率變化。性能如此差的可能原因是此電路是在式7給定的頻率下振蕩，因而諧振頻率受到LC電路內(nèi)阻的影響。在圖2所示的電路中，晶體管TR1的輸入阻抗也會影響LC電路的諧振頻率，而由于此阻抗也是溫度函數(shù)，它將加大振蕩器的不穩(wěn)定性。
為此需要有全新的方法，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，最穩(wěn)定的振蕩器電路乃是基于鎖相環(huán)(PLL)的振蕩器電路，它的一個例子示明于圖3。
圖3所示電路包括壓控振蕩器(VCO)1，它的輸出端耦連到頻率計2與鑒相器3上。VCO1的輸出端也通過電阻器5與包括線圈L和電容器C的調(diào)諧電路4耦連，如圖所示。鑒相器3除與VCO1的輸出端耦連外還與調(diào)諧電路4耦連。鑒相器3的輸出經(jīng)由環(huán)路濾波器6傳送給VCO1。
工作時，用VCO1產(chǎn)生一經(jīng)電阻器5施加給調(diào)諧電路4的驅(qū)動信號，驅(qū)使調(diào)諧電路4振蕩。
當(dāng)調(diào)諧電路4振蕩時，L與C的電位差由于它們的振蕩完全相同但相互180°(π弧度)異相而互消。LC電路在諧振時的阻抗完全是電阻的(在圖1B中約等于RL)，而在電路中流過的電流則與所加電壓同相。與LC電路串聯(lián)的電阻器兩端的電位差與在此電路諧振時所加的電壓同相。發(fā)生這種情形的頻率由式(4)給定但用C+CL取代了C。這一頻率在很大程度上與RL(它可能是影響LC電路不穩(wěn)定性的最主要因素之一)無關(guān)。
這樣，鑒相器3與VCO1的輸出端耦連來測定驅(qū)動信號的相位，同時與調(diào)諧電路耦連來測定調(diào)諧電路振蕩的相位。然后此鑒相器3產(chǎn)生一DC信號來代表輸出給環(huán)路濾波器6的振蕩相位差。上述信號經(jīng)此環(huán)路濾波器濾波后返回到VCO1。
VCO1經(jīng)控制成當(dāng)施加DC誤差信號時將改變其輸出頻率，直至此驅(qū)動信號與調(diào)諧電路振蕩間不存在相位差而由鑒相器3無誤差信號輸出時。
VCO的輸出頻率由頻率計測量。上述電路顯著提高了頻率穩(wěn)定性，在諧振頻率200～300KHz范圍內(nèi)可以測出的頻率變化小于1Hz。
適用于PLL VCO的電路給出于圖5中。IC1是具有正弦波輸出的VCO，可以在10KΩ的預(yù)設(shè)定下從約18KΩ變化到38KΩ。VCO的輸出經(jīng)10KΩ的電阻器饋送給LC電路。OP1是比較器，它從VCO輸出的正弦波導(dǎo)出方波，同時驅(qū)動IC2這一D型的觸發(fā)器。此LC電路上的正弦波電壓經(jīng)高輸入阻抗緩沖放大器(OP2)傳送給第二比較器(OP3)與觸發(fā)器(IC3)。這些觸發(fā)器接合NAND(“與非”)門(IC4)和二極管D1與D4，形成了邊緣敏感的超前-滯后(Ⅱ型)相敏檢測器。在PSD輸出端的±dC誤差信號由高增益低通濾波器(f3dB=16Hz)OP4放大。為了加速接通后的鎖定過程，由二極管D3與D4將上述誤差信號限制為約±0.6V。經(jīng)緩沖放大器(OP5)將dC誤差信號反饋給VCO，使上述環(huán)路閉合。
為了形成這種電路，首先必須用式(4)計算LC電路的諧振頻率的近似值(此值必需在VCO的輸出頻率范圍內(nèi))?，F(xiàn)在對這種預(yù)設(shè)定進行調(diào)節(jié)，直至IC1的輸出約為此近似值。存在預(yù)設(shè)定的調(diào)節(jié)范圍，其中的輸出頻率幾乎無變化。這表明PLL鎖定到LC電路的諧振頻率上。
圖3所示PLL電路的性能最初是用包含有大量懸浮的PMP的樣品進行研究的。所用的樣品具有懸浮于緩沖液中已知濃度的PMP(0、1.03、2.11、4.19、6.22與8.21mg/ml)。這些樣品盛放于30mm直徑與47mm高的密封圓柱形塑料瓶中。這種瓶含20ml的乳濁液。將瓶劇烈搖晃保證其均勻混合，然后放入接附于鎖相環(huán)電路(圖5)的線圈(50匝，24SWG的漆包銅線，電感≈75μH)中，測量振蕩頻率。此時除去樣品瓶，觀察頻率的增加。對于所有的瓶重復(fù)該試驗10次，如圖4所示，相對于瓶中粒子的濃度標(biāo)繪出兩種讀數(shù)的差。
結(jié)果清楚地表明，正如式(6)所示，LC調(diào)諧電路的諧振頻率的減少與瓶中乳濁液內(nèi)的粒子數(shù)直接相關(guān)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，這種方法是很可靠的，能將瓶中未知的磁粒子濃度測定到優(yōu)于1％的精度。
從上述試驗所得到的另一項重要發(fā)現(xiàn)是，盡管此振蕩電路具有良好的短期穩(wěn)定性，但仍然存在著主要因環(huán)境溫度變化致線圈電感改變而導(dǎo)致頻率普遍的長期漂移。經(jīng)過一晝夜的時間，室溫的變化可能導(dǎo)致基線頻率漂移大于±50Hz。但是發(fā)現(xiàn)，這對于樣品從線圈中取出時所產(chǎn)生的頻率改變幾乎無影響。于是，下面的測量方法有利于進行這種試驗觀察。
·將樣品插入線圈中；·測量頻率；·從線圈中快速地取出樣品；·再次測量頻率并記錄頻率的增加結(jié)果。
這樣，在整個測量時間內(nèi)所提供的記錄下頻率的變化大于基線頻率的漂移，于是所得結(jié)果與基線頻率無關(guān)。這一測量方法大大消除了溫度對所得結(jié)果的任何影響。因此，不必要對電子電路與線圈進行精致的溫度控制，而這在手持式電池供電的儀器中則是需要重點考慮的因素，其中的控溫包裝本身就將消耗頗多的電功率。
當(dāng)線圈L符合下述條件時，以此線圈L置于圖3的PLL電路中而樣品瓶含有順磁粒子(PMP)時得到了最佳的總體性能·所具的內(nèi)徑剛好大到足以置納下樣品而使靜區(qū)的量保持到最?。弧傂?；·在約200～300KHz發(fā)生諧振。
此種系統(tǒng)可以用于測量結(jié)合在基片上的許多PMP，例如在免役測定法中所出現(xiàn)的情形。
在此情形中，應(yīng)用與上述相同的操作方法，將上面載有未知數(shù)量的PMP的塑料片置于線圈內(nèi)，觀察電路的振蕩頻率。當(dāng)此塑料片從線圈中快速地取出后可觀察到頻率增加了，這可以用來測定塑料片上PMP數(shù)量的標(biāo)記。
然后，通過生產(chǎn)許多基片(在此情形下為塑料片，例如免疫測定法中所用的)，上面載有未知數(shù)量的PMP，由此來校正上述系統(tǒng)。然后用它們來測定在一定磁粒子數(shù)下所得到的頻率變化。
所用的磁粒子是Dynal H-280，直徑為2.8μm。樣品中磁粒子的濃度通過計算已知容積中的粒子數(shù)來測定。這可以用一種NewNeubauer血細胞計來完成，這種血細胞計具有在玻璃載片上蝕刻出的校準(zhǔn)過的方格和已知的深度。知道濃度后，可計算出加到塑料片上的粒子數(shù)。將這些磁粒子在塑料片上干燥。對于在3.33×106～1.68×105的磁粒子數(shù)制定了若干標(biāo)準(zhǔn)，這些標(biāo)準(zhǔn)已被用于儀器響應(yīng)的校準(zhǔn)中。
采用基本線圈構(gòu)型測定了圖3中PLL電路對標(biāo)準(zhǔn)塑料片的響應(yīng)。所用方法與前述的相同。將上面載有已知數(shù)量的PMP的試驗片插入線圈L中測量調(diào)諧電路4的諧振頻率。然后從線圈L中取出樣品再測量其諧振頻率。任意此諧振頻率的變化。用同一測試片將此試驗重復(fù)10次。再用另外的測試片重復(fù)此試驗。將此結(jié)果示明于如圖6所示的PMP數(shù)目相對于諧振頻率變化的曲線圖中。
上述結(jié)果標(biāo)明于log-log軸上，用線性回歸法確定出最佳的直線。圖中的點表示的是各樣品讀數(shù)的平均值，而誤差條則表示此平均的標(biāo)準(zhǔn)誤差。此PLL電路如式(6)所示對于增多的粒子數(shù)具有良好的線性響應(yīng)，靈敏度約為0.16Hz/105粒子。
這些結(jié)果中的某些分散值可能是由于樣品在所有的測試片上未能設(shè)置于完全同一的位置上，以及樣品在各次測量中未能每次總是在線圈中確切的同一位置上所致。
但是，為了改進這種系統(tǒng)，采用了若干較小的線圈以便減小線圈內(nèi)的靜區(qū)，從而提高線圈L在圖3中PLL電路上的靈敏度。業(yè)已確定，最優(yōu)的線圈乃是具有橢圓形橫剖面的且免疫測定法中所用的樣品基片能恰好配合于其中的螺線管。
這類線圈易用下述方法構(gòu)成·將4～6層管工用PTFE螺紋帶卷繞到空白塑料片上；·將線圈繞到PTFE帶的頂部上；·用速固的環(huán)氧樹脂給線圈作厚的涂層；·讓此環(huán)氧樹脂硬化；·仔細地牽引此塑料片將其從線圈中撤出；·從線圈中取出PTFE帶。
結(jié)果得到了內(nèi)部尺寸恰好大到足以容納此測試塑料片的剛性線圈。還可以在線圈內(nèi)側(cè)涂布環(huán)氧樹脂，用以保護導(dǎo)線不受意外損傷。
線圈的電感隨線圈有效橫剖面積以及線圈中匝數(shù)的增加而增加。減小線圈的橫剖面積就意味著必須增多線圈中的匝數(shù)來產(chǎn)生具有所需電感的線圈。為此，最好使線圈的長度恰好稍大于樣品的長度。這就是說，導(dǎo)線必須很細，不然就需生產(chǎn)出很厚的多層式線圈。
于是生產(chǎn)了圖7所示的線圈L，具有2.5×7mm的橢圓形剖面和7mm長。用市售的最細漆包銅線(42SWG)繞制線圈。采用了4層導(dǎo)線，最終的線圈L=131μH而R=17.18Ω。此線圈與C=3.3nF的電容器并聯(lián)，在217KHz下諧振。
然后如上所述，于圖3的PLL電路中測試此線圈。結(jié)果示于圖8的曲線圖中。
上述線圈裝置用于PLL電路中時，與測試塑料片上有約0.4Hz/105粒子的先有線圈設(shè)計相比，具有良好的線性響應(yīng)和改進了的靈敏度。誤差條也較小，這表明此電路一般較為穩(wěn)定。若將線圈制備得更小而使線圈與樣品間的靜區(qū)甚至更小，則可能進一步提高線圈裝置的靈敏度。更小的線圈將需要比上述結(jié)構(gòu)所用42SWG還要細的導(dǎo)線。用手來精確地繞制線圈對于這樣細的導(dǎo)線是很困難的，因而需要某種繞線機。
最近的觀察結(jié)果也指出，用于線圈結(jié)構(gòu)中的部件應(yīng)具有低的介電常數(shù)以提高調(diào)諧電路4的Q值。
這種線圈結(jié)構(gòu)的進一步發(fā)展形式示明于圖9中。它包括鐵氧體環(huán)20，上面繞有繞組20。鐵氧體是電的絕緣體，有很高的磁導(dǎo)率，可以在很高的頻率下工作。這說明具有鐵氧體磁心的線圈需要較少的匝數(shù)以具有高的電感。
上述鐵氧體環(huán)20包括厚約1mm的環(huán)隙21。此鐵氧體環(huán)兩端間的間隙小到由線圈產(chǎn)生的電磁場幾乎無損耗地通過置于此環(huán)隙中的樣品片。與前述例子相同，樣品中順磁粒子的存在將加大線圈的電感，因而這種構(gòu)型能用作調(diào)諧電路4中的線圈L。對此系統(tǒng)再次進行了測試，結(jié)果標(biāo)繪于圖10所示的曲線中。這時的鐵氧體環(huán)具有下述尺寸外徑=23.6mm，內(nèi)徑=13.4mm，高=7.6mm。將40SWG漆包銅線的120匝線圈繞到此環(huán)上并涂以厚的環(huán)氧樹脂層(L=880μH,R=4.6Ω,fo=206KHz而C=680pF)。
當(dāng)將此線圈用于圖3中的PLL電路中時，再次獲得了對磁粒子數(shù)的良好線性反應(yīng)。此線圈的靈敏度約為0.3Hz/105粒子，低于圖7中橢圓形線圈結(jié)構(gòu)的靈敏度。但此線圈裝置的性能，可以通過采用能夠與這種用途更好配合的鐵氧體材料且具有寬度(約0.25mm)剛好足以接納此樣品的較窄環(huán)隙，得到改進。
還可以采用以圓形或方形螺旋裝置為基礎(chǔ)的全扁平線圈(圖11A與11B)。這種設(shè)計比前述裝置有許多優(yōu)越之處。此種線圈可以與樣品緊密接觸而減小樣品與線圈間的靜區(qū)，而且能用光刻法或類似技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)有重顯性的線圈。要是將兩個線圈串聯(lián)而將樣品與它們相互面對的方式置于其間，則當(dāng)樣品中存在順磁粒子時將增大此線圈對的電感。
正如以前所述，這種線圈一般是在約200～300KHz間的頻率下工作。這種頻率范圍當(dāng)電路結(jié)合其中含有大量懸浮于水性緩沖液的PMP的瓶子使用時，已由試驗證明乃是最佳的工作頻率范圍。但水的存在會使此電路在較高頻率下工作時的穩(wěn)定性差。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在極高的頻率下能工作得更好。圖12示明以橢圓形剖面的線圈在529KHz下工作時的電路響應(yīng)。
在上述情形下，當(dāng)線圈是在217KHz下工作時，與0.4Hz/105粒子相比，靈敏度增加到1.2Hz/105。一般性的技術(shù)表明，在更高的頻率下可以提高靈敏度。但圖5中的VCO電路卻不能可靠地在遠高于519KHz的頻率下工作，這是由于所用到的一些部件受到了限制。為使其能在較高的頻率下工作，就必須采用能在這種頻率下工作的部件來改進此電路。
為了證明這種順磁粒子探測器具有實用性，用PMP為標(biāo)記開發(fā)了一種模型試驗系統(tǒng)。此系統(tǒng)是基于用于鐵傳遞蛋白的雙抗體夾層試驗的。將這種模型試驗發(fā)展成能使免疫反應(yīng)發(fā)生于塑料膜的表面上，同時能將測試區(qū)域容易地引到此探測器上。用于探測固定的免疫復(fù)合物的標(biāo)記是涂有適當(dāng)抗體的PMP，這于圖13中示意地表明。
使不同抗體層的濃度最優(yōu)化，以在工作的鐵傳遞蛋白范圍給出最大的響應(yīng)。對此模型試驗產(chǎn)生出劑量響應(yīng)曲線，用顯微鏡的手工計數(shù)和用探測器兩種方法確定磁粒子的數(shù)量。
先前的結(jié)果表明，鐵傳遞蛋白劑量響應(yīng)曲線的上部區(qū)域(約有1.3×105粒子)處在磁探測器的下部校準(zhǔn)范圍內(nèi)，而在由手工計數(shù)測定的測試塑料片上所結(jié)合的PMP數(shù)與用磁探測器測定的數(shù)之間有良好的一致性。
權(quán)利要求
1．一種用具有電容器與線圈的調(diào)諧電路測定樣品中磁粒子數(shù)的方法，此方法包括a)測定樣品暴露于此線圈產(chǎn)生的磁場下和樣品未暴露于此線圈產(chǎn)生的磁場下時所述調(diào)諧電路的諧振頻率差；b)利用此諧振頻率差來確定樣品中的磁粒子數(shù)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的步驟a)包括ⅰ)將樣品暴露于該線圈產(chǎn)生的磁場下；ⅱ)測定此調(diào)諧電路的諧振頻率；ⅲ)從該線圈產(chǎn)生的磁場中取出樣品；ⅳ)測定此調(diào)諧電路的諧振頻率。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中用于測定諧振頻率的步驟包括a)給此調(diào)諧電路施加驅(qū)動信號；b)測量此驅(qū)動信號與自該調(diào)諧電路得到的輸出信號間的相位差；c)調(diào)節(jié)所加驅(qū)動信號的頻率直到它與該輸出信號間不存在相位差。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述驅(qū)動信號具有高于200KHz的頻率。
5．根據(jù)上述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述磁粒子包括PMP。
6．根據(jù)上述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述線圈是螺線管、環(huán)形線圈與扁平線圈中之一。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中當(dāng)線圈是螺線管時，所述將樣品暴露于磁場下的方法包括將樣品置于此螺線管內(nèi)。
8．根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中當(dāng)線圈是扁平線圈時，所述方法包括將樣品置于此線圈的鄰邊。
9．一種進行結(jié)合試驗的方法，此方法包括a)將分子層固定于基片上；b)提供許多磁粒子作為標(biāo)記；c)應(yīng)用此分子層進行反應(yīng)，使至少將某些磁粒子結(jié)合到基片上；d)通過測定基片暴露和不暴露于線圈產(chǎn)生的磁場下兩種情形中調(diào)諧電路的諧振頻率差，來測定結(jié)合到此基片上的磁粒子數(shù)。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述磁粒子是結(jié)合到相應(yīng)個數(shù)的第二種分子上，而所述反應(yīng)則將此第二種分子與該分子層粘合從而將磁粒子結(jié)合到基片上。
11．根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述結(jié)合試驗是免疫測定試驗，所述分子層是抗體/抗原層而所述第二種分子是抗原或抗體。
12．根據(jù)權(quán)利要求9～11中任一項所述的方法，其中所述基片包括塑料片。
13．根據(jù)權(quán)利要求9～12中任一項所述的方法，其中所述線圈是螺線管、環(huán)形線圈與扁平線圈中之一。
14．根據(jù)權(quán)利要求9～13中任一項所述的方法，其中所述測定磁粒子數(shù)的方法包括依據(jù)權(quán)利要求1～8中任一項所述的方法。
15．一種測定樣品中磁粒子數(shù)的設(shè)備，此設(shè)備包括a)具有電容器與線圈的調(diào)諧電路；b)產(chǎn)生用于驅(qū)動調(diào)諧電路的驅(qū)動信號的驅(qū)動器；c)探測此調(diào)諧電路諧振頻率的探測器，其中當(dāng)樣品暴露和不暴露于該線圈產(chǎn)生的磁場下兩種情形中調(diào)諧電路的諧振頻率差，表示此樣品中的磁粒子數(shù)。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的設(shè)備，其中所述探測器包括用來測定此驅(qū)動信號與從該調(diào)諧電路獲得的輸出信號之間相位差的相位比較器。
17．根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的設(shè)備，其中所述驅(qū)動器包括壓控振蕩器(VCO)。
18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的設(shè)備，其中當(dāng)從屬于權(quán)利要求時，所述VCO響應(yīng)上述相位比較器，改變驅(qū)動信號的頻率至不存在相位差時。
19．根據(jù)權(quán)利要求15～18中任一項所述的設(shè)備，其中此設(shè)備形成鎖相環(huán)振蕩器電路。
20．根據(jù)權(quán)利要求15～19中任一項所述的設(shè)備，其中所述磁粒子是PMP。
21．根據(jù)權(quán)利要求15～20中任一項所述的設(shè)備，其中所述線圈是螺線管、環(huán)形線圈與扁平線圈中之一。
22．根據(jù)權(quán)利要求21所述的設(shè)備，其中當(dāng)線圈是形成于基本為平面上的扁平線圈時，將此樣品置于此線圈鄰近使樣品暴露于磁場之下。
23．根據(jù)權(quán)利要求21所述的設(shè)備，其中當(dāng)線圈是螺線管時，將此樣品置于螺線管內(nèi)使樣品暴露于磁場之下。
24．根據(jù)權(quán)利要求23所述的設(shè)備，其中所述螺線管具有橢圓形橫剖面。
25．根據(jù)權(quán)利要求21所述的設(shè)備，其中當(dāng)線圈為環(huán)形線圈時，將此樣品置于此環(huán)形線圈的環(huán)隙中使此樣品暴露于磁場之下。
26．根據(jù)權(quán)利要求15～25中任一項所述的設(shè)備，其中所述驅(qū)動信號具有高于200KHz的頻率。
全文摘要
應(yīng)用具有電容器(C)與線圈(L)的調(diào)諧電路測定樣品中磁粒子數(shù)的方法。此方法包括a)測定樣品暴露于和不暴露于此線圈產(chǎn)生的磁場下時兩種情形中的調(diào)諧電路的諧振頻率差；b)利用此諧振頻率差來測定樣品中的磁粒子數(shù)。
文檔編號G01N33/543GK1317693SQ0111636
公開日2001年10月17日 申請日期2001年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月10日
發(fā)明者彼得·霍金斯, 理查德·威廉·勒克司頓 申請人:蘭道克斯實驗有限公司