專利名稱：熒光定量pcr分析系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用于定量分析聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)原始靶基因濃度的裝置。
在本發(fā)明作出前，還沒有全自動定量檢測聚合酶鏈反應(yīng)原始靶基因的儀器。傳統(tǒng)的方法是先將靶基因置于由微機(jī)自動控制電路控制加熱和制冷的熱循環(huán)裝置，完成PCR要求的變性、復(fù)性和延伸，使靶基因被擴(kuò)增數(shù)百萬倍。然后再將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳來判斷是否具有欲檢測的靶基因。由于PCR擴(kuò)增的效率很高，極少量的靶基因和大量的靶基因被同時擴(kuò)增最終達(dá)到飽和，在電泳檢測時的結(jié)果是一樣的，因此這種方法只能獲得特定基因是否存在的定性結(jié)果，而無法對其數(shù)量或濃度定量檢測，另外這種方法由于在操作過程中需要將檢測樣本轉(zhuǎn)移，因此容易受環(huán)境的污染而造成結(jié)果的不準(zhǔn)確(假陽性和假陰性)。同時還存在操作過程復(fù)雜，檢測時間長等缺點(diǎn)。
本發(fā)明的目的是提供一種能自動、快速完成對靶基因的定量檢測，并在整個檢測過程中不受環(huán)境污染的熒光定量PCR分析系統(tǒng)。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是利用控制電路在控制熱循環(huán)裝置對靶基因擴(kuò)增的同時對被測反應(yīng)物的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行檢測，由于熒光信號強(qiáng)度與靶基因的濃度是成比例關(guān)系的，因此檢測熒光強(qiáng)度就能知道特定基因的數(shù)量或濃度(單位容積內(nèi)的數(shù)量)。
整個裝置包括置于箱體內(nèi)的熱循環(huán)裝置，熒光檢測裝置、控制電路和置于箱體外的計算機(jī)，所說的熱循環(huán)裝置包括具有一排插孔的變溫金屬模塊、與變溫金屬模塊緊貼的熱電制冷器，設(shè)在熱電制冷器旁的散熱器、風(fēng)扇和插放在插孔中的試管，試管上蓋有帶加熱器的熱蓋，在熱蓋、散熱器和變溫金屬模塊中分別設(shè)有溫度傳感器；熒光檢測裝置包括位于變溫金屬模塊下方的與金屬模塊上的一排插孔平行，并由步進(jìn)電機(jī)帶動來回移動的同步帶，固定在同步帶上的殼體，殼體上設(shè)有位置傳感器，殼體頂端有孔，自頂端孔而下依次設(shè)有透鏡，與軸線呈45°傾角的二向分色鏡，與軸線垂直的橫桿及光電倍增管，橫桿貫穿于殼體相對兩壁，該橫桿隨殼體來回移動，其二端與箱體上的定位板撞擊作水平滑動，在橫桿上設(shè)有若干不同波長的濾光片，在殼體內(nèi)位于橫桿上方設(shè)有激發(fā)光源、濾光片、透鏡，光源發(fā)出的光經(jīng)濾光片、透鏡水平照射到二向分色鏡上；
控制電路包括通過接口與外設(shè)計算機(jī)相連的微處理器，分別將來自變溫金屬模塊溫度傳感器和光電倍增管的輸出信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號輸給微處理器的A/D轉(zhuǎn)換器，輸入端與微處理器相連，輸出與熱電制冷器電連接的用于使電壓換向的固態(tài)換向橋，輸入端與溫度傳感器相連，輸出與熱蓋上加熱器和風(fēng)扇相連的溫度控制電路以及開關(guān)電源，開關(guān)電源與微處理器相連，其輸出電壓分別輸給固態(tài)換向橋，溫度控制電路及步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器，微處理器輸出的驅(qū)動信號輸入步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器，位置傳感器的輸出信號輸入微處理器。
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述

圖1是本發(fā)明的熒光定量PCR分析系統(tǒng)的示意圖；圖2是熱循環(huán)裝置示意圖；圖3是圖1的A-A剖視圖；圖4是控制電路構(gòu)成框圖；圖5是控制電路的固態(tài)換向橋一種具體電路實例；圖6是控制電路中的開關(guān)電源的具體電路實例；圖7是溫度控制電路的具體電路實例。
參照圖1，本發(fā)明的熒光定量PCR分析系統(tǒng)包括置于箱體V內(nèi)的熱循環(huán)裝置I，熒光檢測裝置II、控制電路III和置于箱體外的計算機(jī)IV，其熒光檢測裝置位于熱循環(huán)裝置的下方。熱循環(huán)裝置和熒光檢測裝置的結(jié)構(gòu)見圖2、圖3所示。
所說的熱循環(huán)裝置I包括具有一排插孔21的變溫金屬模塊4、與變溫金屬模塊4緊貼的熱電制冷器3，設(shè)在熱電制冷器3旁的散熱器2、風(fēng)扇1和插放在插孔21中的用于盛放反應(yīng)物的試管5，在試管5的上方蓋有防止試管內(nèi)反應(yīng)物蒸發(fā)的帶加熱器的熱蓋6，在熱蓋6、散熱器2中分別設(shè)有溫度傳感器7，在變溫金屬模塊4中設(shè)有溫度傳感器8；使用時，用若干個試管盛放已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)物，在其余試管中盛放被測反應(yīng)物，并在反應(yīng)物中加入熒光劑。
熒光檢測裝置II包括位于變溫金屬模塊4下方的與金屬模塊上的一排插孔21平行，并由步進(jìn)電機(jī)17帶動來回移動的同步帶16，固定在同步帶16上的殼體22，殼體上設(shè)有位置傳感器36，殼體頂端有孔19，自頂端孔而下依次設(shè)有透鏡13，與軸線呈45°傾角的二向分色鏡12，與軸線垂直的橫桿20及光電倍增管15，橫桿20貫穿于殼體相對兩壁，該橫桿隨殼體來回移動，其二端與箱體上的定位板18撞擊作水平滑動，在橫桿上設(shè)有若干不同波長的濾光片14，在殼體內(nèi)位于橫桿上方設(shè)有激發(fā)光源9、濾光片10、透鏡11。通常，使用LED激發(fā)光源，激發(fā)光源9發(fā)出的激發(fā)光通過濾光片10過濾成特定波長的單色光，再由透鏡11聚焦成平行光照射到二向分色鏡12上，特定波長的單色光經(jīng)二向分色鏡反射通過透鏡13聚焦在試管5的底部，使試管內(nèi)的反應(yīng)物發(fā)出特定波長的熒光，熒光通過透鏡13照射在二向分色鏡12上，波長大于一定值的熒光穿過二向分色鏡12，經(jīng)濾光片14過濾成特定波長的單色光，被光電倍增管15接收變成電信號輸給控制電路。步進(jìn)電機(jī)17正反向轉(zhuǎn)動帶動同步帶16直線運(yùn)動，從而使固定在同步帶上的具有光學(xué)檢測器件的殼體來回移動，對各個試管的熒光逐一檢測，同時通過定位板18撞擊橫桿20切換濾光片14，用于過濾不同波長的熒光。
熱循環(huán)裝置及熒光檢測裝置由控制電路控制進(jìn)行工作和信息傳遞。
控制電路見圖4所示，它包括通過接口24與外設(shè)計算機(jī)IV相連的微處理器25，分別將來自溫度傳感器8和光電倍增管15的輸出信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號輸給微處理器25的A/D轉(zhuǎn)換器26、27，輸入端與微處理器相連，輸出與熱電制冷器3電連接的用于使電壓換向的固態(tài)換向橋28，輸入端與溫度傳感器7相連，輸出與熱蓋上加熱器和風(fēng)扇1相連的溫度控制電路30以及開關(guān)電源29，開關(guān)電源29與微處理器25相連，其輸出電壓分別輸給固態(tài)換向橋28、溫度控制電路30及步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器34，微處理器輸出的驅(qū)動信號輸入步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器34，位置傳感器36的輸出信號輸入微處理器。
工作時，計算機(jī)IV傳出的指令信號經(jīng)微處理器25轉(zhuǎn)換成控制信號，微處理器的控制信號一方面輸給固態(tài)換向橋28，由其對來自開關(guān)電源29的電壓進(jìn)行換向和調(diào)節(jié)，供熱電制冷器3加熱或制冷或恒溫，控制PCR擴(kuò)增的溫度要求，另一方面輸給步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器34，控制步進(jìn)電機(jī)實現(xiàn)往復(fù)式直線步進(jìn)，依次完成對全部(包括標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)物和被測反應(yīng)物)試管反應(yīng)物在不同波長下的熒光強(qiáng)度檢測。同時，熱循環(huán)裝置中的溫度傳感器8輸出的溫度信號和熒光檢測裝置中的光電倍增管15輸出的電信號分別由A/D轉(zhuǎn)換器26、27轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，以及位置傳感器36輸出的位置信號均經(jīng)微處理器傳輸給計算機(jī)，經(jīng)過計算機(jī)軟件處理后，一方面發(fā)出控制指令輸給微處理器轉(zhuǎn)換成控制信號，另一方面將擴(kuò)增過程中輸入的被測反應(yīng)物和標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)物的熒光強(qiáng)度作比較，處理成直觀易懂的曲線或圖表在顯示器顯示，實現(xiàn)對靶基因的定量檢測。控制電路中的溫度控制電路30接收溫度傳感器7輸出的溫度信號，其輸出接通熱蓋加熱器，風(fēng)扇，以使熱蓋及周圍溫度始終控制在所需范圍。
圖5是控制電路的固態(tài)換向橋一種具體電路實例；
此例中，固態(tài)換向橋是由二片IR2110集成塊和MOSFET管Q1～Q4構(gòu)成，圖中TE+、TE-端與熱電制冷器相連，COOL、HEAT、PWM端是來自于微處理器的CPU接口信號，該電路實現(xiàn)了無觸點(diǎn)的電子換向。
圖6是控制電路中的開關(guān)電源的具體電路實例。
此例中，交流電源經(jīng)TVS管保護(hù)，經(jīng)整流濾波及熔斷器后，進(jìn)入隔離的直流/直流變換器模塊PH300F，在HV+、HV-端輸出安全特性較高的直流電壓。直流電壓提供給固態(tài)換向橋用于熱電制冷器的驅(qū)動，也提供給步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動電壓，同時給溫度控制電路提供了12VDC，用于熱蓋、散熱器的溫度控制。PH300F中的CNT與SG間與微處理器的電源控制接口相連。
圖7是溫度控制電路的具體電路實例。
熱蓋上溫度傳感器的溫度信號從SEN6、OUT6端接入，并與由電阻R7、R8決定的溫度設(shè)置點(diǎn)在集成電路U5(TLC2202)中進(jìn)行放大比較，驅(qū)動Q5的開關(guān)狀態(tài)，對接于HOTL10端的熱蓋加熱膜實現(xiàn)自動控溫。同理，散熱器上溫度傳感器的溫度信號從SEN7、OUT7端接入，并與由電阻R12決定的溫度設(shè)置點(diǎn)在集成電路U6(TLC2202)中進(jìn)行放大比較，驅(qū)動Q6的開關(guān)狀態(tài)，控制接于FAN端的風(fēng)扇動作，實現(xiàn)散熱器的溫度自動控制，U3和U4是恒流源，它起到了穩(wěn)定被測溫度信號的作用。
控制電路中的微處理器可用80C196。接口可采用RS232。
本發(fā)明的熒光定量PCR分析系統(tǒng)，利用計算機(jī)、微處理器控制，在熱循環(huán)裝置對靶基因?qū)嵤U(kuò)增的同時，采用熒光檢測裝置對被檢物和標(biāo)準(zhǔn)物的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測，并由計算機(jī)軟件將被檢物和標(biāo)準(zhǔn)物的熒光強(qiáng)度作比較，由于靶基因強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度成比例，因此可自動、快速實現(xiàn)對靶基因濃度的實時定量檢測，由于整個檢測過程是在完全密閉的試管中進(jìn)行，而加入試管的熒光劑并不污染反應(yīng)物，因此檢測物不會受到環(huán)境污染。
權(quán)利要求
1.熒光定量PCR分析系統(tǒng)，其特征在于它包括置于箱體內(nèi)的熱循環(huán)裝置[I]，熒光檢測裝置[II]、控制電路[III]和置于箱體外的計算機(jī)[IV]，所說的熱循環(huán)裝置[I]包括具有一排插孔[21]的變溫金屬模塊[4]、與變溫金屬模塊[4]緊貼的熱電制冷器[3]，設(shè)在熱電制冷器[3]旁的散熱器[2]、風(fēng)扇[1]和插放在插孔[21]中的試管[5]，試管[5]上蓋有帶加熱器的熱蓋[6]，在熱蓋[6]、散熱器[2]中分別設(shè)有溫度傳感器[7]，在變溫金屬模塊[4]中設(shè)有溫度傳感器[8]；熒光檢測裝置[II]包括位于變溫金屬模塊[4]下方的與金屬模塊上的一排插孔[21]平行，并由步進(jìn)電機(jī)[17]帶動來回移動的同步帶[16]，固定在同步帶[16]上的殼體[22]，殼體上設(shè)有位置傳感器[36]，殼體頂端有孔[19]，自頂端孔而下依次設(shè)有透鏡[13]，與軸線呈45°傾角的二向分色鏡[12]，與軸線垂直的橫桿[20]及光電倍增管[15]，橫桿[20]貫穿于殼體相對兩壁，該橫桿隨殼體來回移動，其二端與箱體上的定位板[18]撞擊作水平滑動，在橫桿上設(shè)有若干不同波長的濾光片[14]，在殼體內(nèi)位于橫桿上方設(shè)有激發(fā)光源[9]、濾光片[10]、透鏡[11]，光源發(fā)出的光經(jīng)濾光片[10]、透鏡[11]水平照射到二向分色鏡[12]上；控制電路[III]包括通過接口[24]與外設(shè)計算機(jī)[IV]相連的微處理器[25]，分別將來自溫度傳感器[8]和光電倍增管[15]的輸出信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號輸給微處理器[25]的A/D轉(zhuǎn)換器[26、27]，輸入端與微處理器相連，輸出與熱電制冷器[3]電連接的用于使電壓換向的固態(tài)換向橋[28]，輸入端與溫度傳感器[7]相連，輸出與熱蓋上加熱器和風(fēng)扇[1]相連的溫度控制電路[30]以及開關(guān)電源[29]，開關(guān)電源[29]與微處理器[25]相連，其輸出電壓分別輸給固態(tài)換向橋[28]，溫度控制電路[30]及步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器[34]，微處理器輸出的驅(qū)動信號輸入步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器[34]，位置傳感器[36]的輸出信號輸入微處理器。
2.按權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR分析系統(tǒng)，其特征在于所說的固態(tài)換向橋是由二片IR2110集成塊和MOSFET管[Q1～Q4]構(gòu)成。
全文摘要
熒光定量PCR分析系統(tǒng)。它包括置于箱體內(nèi)的熱循環(huán)裝置,熒光檢測裝置、控制電路和置于箱體外的計算機(jī),利用計算機(jī)、微處理器控制,在熱循環(huán)裝置對靶基因?qū)嵤U(kuò)增的同時,采用熒光檢測裝置對被檢物和標(biāo)準(zhǔn)物的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測,并由計算機(jī)軟件將被檢物和標(biāo)準(zhǔn)物的熒光強(qiáng)度作比較,由于靶基因強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度成比例,因此可自動、快速實現(xiàn)對靶基因濃度的實時定量檢測,由于整個檢測過程是在完全密閉的試管中進(jìn)行,因此檢測物不會受到環(huán)境污染。
文檔編號G01N21/64GK1379236SQ0111642
公開日2002年11月13日 申請日期2001年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月12日
發(fā)明者李社剛, 毛立新, 李建峰, 項偉平, 劉志華, 吳志和 申請人:杭州大和熱磁電子有限公司