專利名稱：丹參藥材指紋圖譜建立的方法及其標準指紋圖譜的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥的指紋圖譜的建立方法，具體地說是丹參水溶性提取物HPLC指紋圖譜的建立方法，本發(fā)明還涉及由此方法所得到的丹參藥材標準指紋圖譜。
丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。全國大部分地區(qū)均產(chǎn)。由于丹參因品種、產(chǎn)地、采收期不同而造成質(zhì)量參差不齊，因而其制成品質(zhì)量的穩(wěn)定性也難以保證。目前，對丹參及其復方制劑的鑒定，往往是選取丹參的一、二個活性成分或指標成分進行含量測定，并以其含量多少來判定質(zhì)量。例如，以丹參酮ⅡA含量(中國藥典2000年版一部58頁)或丹參素含量(張友芹等，中醫(yī)藥學報，2000,28(3):68)等來鑒別丹參藥材的質(zhì)量；以丹參酮來判定丹參品種和產(chǎn)地情況(裘飛君，中國現(xiàn)代應用藥學，1998,15(5):16；胡世林等，中國中藥雜志，1999,24(12):721)；用丹參素含量(嚴常開等，中國醫(yī)院藥學雜志，2000,20(10):600)、原兒茶醛含量(鄭末晶等，中國藥事，2000,14(4):254)或丹參酮ⅡA含量(林偉忠等，中成藥，2000,22(11):766)等判別復方丹參制劑的質(zhì)量，用丹參酮ⅡA含量鑒別不同廠家生產(chǎn)的復方丹參片的質(zhì)量(邵水娟，中國藥業(yè)，2000,9(7):27)等。已知的丹參的化學成分有幾十種，其脂溶性成分大多為醌型紅黃色物質(zhì)，如丹參酮Ⅰ、ⅡA、ⅡB，丹參醌A、B、C，丹參酸鉀脂，異丹參酮Ⅰ、Ⅱ，隱丹參酮等。其水溶性成分大多為酚性醛、酚性酸、二萜酸，如丁二酸、丹酚酸A、B、C,3,4-二羥基苯甲酸等。此外，還分離出β-谷甾醇、維生素E等(王伯祥主編，中醫(yī)肝膽病學，第一版，中國醫(yī)藥科技出版社，1993年，96頁)。如果用一、二種丹參的活性成分來說明丹參及其成方制劑的內(nèi)在質(zhì)量，具有一定的片面性，更不用說無藥效的指標成分了。要控制丹參及其成方制劑的功效，就不能只針對其一、二個化學成分，必須對它的物質(zhì)群整體予以控制。所以，除了“微觀分析”外，還應用某種“宏觀分析”方法，從整體上有效地表征中藥質(zhì)量。中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，對于有效控制中藥材或中成藥的質(zhì)量，具有重要的意義。日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)在20世紀80年代就已經(jīng)在企業(yè)內(nèi)部采用高效液相指紋圖譜控制質(zhì)量。德國、法國在對銀杏葉提取物聯(lián)合開發(fā)的過程中，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物的醫(yī)療作用是提取物所得物質(zhì)群的整體作用結果，而對這樣一個整體的質(zhì)量控制，亦采用高效液相指紋圖譜方法。美國FDA最近幾年制定的植物草藥指南中已經(jīng)明確把指紋圖譜作為混合物質(zhì)群的質(zhì)量控制方法(FDA.Guidance of Industry:Botanical Drug(Draft).2000 August)。指紋圖譜作為中草藥及其提取物質(zhì)量控制方法，目前已經(jīng)成為國際共識?，F(xiàn)在，對丹參中活性成分如丹參酮、丹參素等的測定方法較多，但對丹參指紋圖譜的建立方法卻未見報道。為解決丹參質(zhì)量不穩(wěn)的問題，本申請人對不同產(chǎn)地丹參進行了考察比較，于1997年在商洛建成天士力商洛丹參基地，并對基地實施GAP管理。為建立丹參藥材質(zhì)量的綜合控制方法，特以國家藥品監(jiān)督局2000頒發(fā)的關于中藥材指紋圖譜技術要求，對天士力商洛丹參基地的丹參10批藥材進行了測定，建立起丹參指紋圖譜測定方法。
本發(fā)明的目的是通過對丹參水溶性提取物HPLC指紋圖譜的研究，摸索出一種丹參質(zhì)量控制的方法，確立建立丹參的標準指紋圖譜的方法，借此可將丹參指紋譜作為質(zhì)量控制及真?zhèn)舞b別的指標之一。本發(fā)明還同時提供了丹參的標準指紋圖譜。
本發(fā)明通過下列步驟實施。
一種丹參藥材指紋圖譜建立的方法，它是采取如下步驟步驟一供試品溶液的制備取過30目篩的丹參藥材粉末加水，精密稱重；回流提取1-3小時，放冷至室溫，補足失水；取提取液少量置量瓶中，甲醇定容至刻度，離心，取上清液作為供試品溶液；步驟二對照品溶液的制備取對照品適量，用流動相稀釋，制成對照品溶液；步驟三測定分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，以對照品的色譜峰的相對保留時間和峰面積為1計算相對保留時間和相對峰面積，即得到丹參標準指紋圖譜。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案如下(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為甲醇-水-冰醋酸(8∶92∶1)；檢測波長254±1nm；理論塔板數(shù)以丹參素峰計算，應不低于2500；
(2)供試品溶液制備取丹參藥材粉末(過30目篩)4.00g，加水50ml，精密稱重，回流提取2小時，放冷至室溫，補足失水，取提取液2ml置25ml量瓶，甲醇定容至刻度，離心，取上清液作為供試品溶液；(3)對照品溶液的制備取丹參素鈉，原兒茶醛對照品適量，用流動相稀釋，制成每1ml中含丹參素鈉20μg，原兒茶醛5.0μg，作為對照品溶液；(4)測定法分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各20μl、10μl，分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄80分鐘的色譜圖，即得。以原兒茶醛的色譜峰(S峰)的相對保留時間和峰面積為1計算相對保留時間和相對峰面積；(5)建立丹參標準指紋圖譜，待測丹參樣品指紋圖譜與標準指紋圖譜對比，區(qū)別其異同。
本發(fā)明的原理是根據(jù)丹參水溶性成分為其主要活性成分，建立起丹參水溶性提取物HPLC指紋圖譜，從色譜的整體面貌特征上把握丹參的品種和質(zhì)量情況。
本發(fā)明的優(yōu)點如下(1)以丹參水溶性提取物建立起來的HPLC指紋圖譜，代表著丹參大部分藥理活性，能有效地表征丹參藥材的質(zhì)量。對丹參的全部化學成分進行檢測，既不可能也沒有必要。大量的藥理和臨床研究結果表明丹參的水溶性成分的活性強于脂溶性成分，故用丹參的水溶性成分作為監(jiān)控指標就更具有代表性。
(2)以丹參整個指紋圖形作為一個整體看待，注重各個構成指紋特征峰的前后順序和相互關系，注重整體面貌特征，既避免了因只測定一、二個化學成分而判定丹參整體質(zhì)量的片面性，又減少了為質(zhì)量達標而人為處理的可能性。本發(fā)明為完整、準確評價丹參的質(zhì)量提供了新的對照標準，將為提高丹參及其成方制劑的質(zhì)量及療效做出貢獻。
(3)本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握的特點。文獻中用于測定丹參素或原兒茶醛的檢測波長一般為281±1nm(張友芹等，中醫(yī)藥學報，2000,28(3):68；鄭末晶等，中國藥事，2000,14(4):254)，但指紋圖譜不是為了測定某個成分的精確含量，而是要充分反映化學成分的信息。與檢測波長281±1nm相比，用254nm進行測定，出峰較多，反應的信息較完全，故采用254nm為檢測波長，這也是與現(xiàn)有方法的不同之處。另外，為測定丹參中某種化學成分的含量，文獻方法往往要對樣品進行較復雜的處理，如水提醇沉、過吸附樹脂等(李文春等，黑龍江醫(yī)藥，1999,12(24):193)，而本發(fā)明只需用水熱提，樣品處理大為簡便，節(jié)約了檢驗的成本和時間。
本發(fā)明的實施例如下。1儀器與試藥1.1儀器惠普1100高效液相色譜儀；惠普VWD紫外可變波長檢測器；美國奧泰色譜之星工作站。1.2試藥丹參素鈉對照品，自制，純度大于99％；原兒茶醛對照品，市售分析純精制，純度大于99％；甲醇，色譜純；冰醋酸，分析純；蒸餾水；丹參藥材為天士力商洛丹參藥材基地所產(chǎn)丹參。市售丹參，購自市藥材公司。2方法與結果2.1色譜條件色譜柱十八烷基鍵合硅膠(4.6×250mm,5μ)美國Alltech公司；流動相甲醇-水-冰醋酸(8∶92∶1)；檢測波長254nm；流速1ml/min；柱溫40℃；理論塔板數(shù)以丹參素峰計算，應不低于2500。2.2檢測波長的選擇3指紋圖譜測定3.1丹參指紋圖譜制備對照品溶液的制備取丹參素鈉，原兒茶醛對照品適量，用流動相稀釋，制成每1ml中含丹參素鈉20μg，原兒茶醛5.0μg，作為對照品溶液。
參照物選用原兒茶醛為參照物(S)。
供試品溶液制備取丹參藥材粉末(過30目篩)4.00g，加水50ml，精密稱重，回流提取2小時，放冷至室溫，補足失水，取2ml置25ml量瓶，甲醇定容至刻度，離心取上清液作為供試品溶液。
分別取對照品及供試品溶液20μl、10μl進樣，照高效液相色譜法測定，記錄80分鐘的色譜圖。以原兒茶醛的色譜峰(S峰)的相對保留時間和峰面積為1計算相對保留時間和相對峰面積。3.2共有峰確定通過10批商洛丹參藥材指紋圖譜測定，比較其色譜圖，確定共有峰為12個，其中以原兒茶醛為參照物超過總峰面積10％指紋峰為1號峰(RT0.183)、8號峰(丹參素、RT0.525)、11號峰(原兒茶醛、RT1.00)及12號峰(RT2.576)，見圖2-商洛丹參藥材。10批藥材共有峰相對保留時間及相對峰面積統(tǒng)計結果見表1、表2。3.3指紋圖譜重現(xiàn)性試驗以商洛丹參藥材0801批為供試品(N=5)，按照指紋圖譜重現(xiàn)性規(guī)定方法操作，分別對共有峰的相對保留時間及相對峰面積有規(guī)定的峰面積進行統(tǒng)計，RSD％不超過3％。結果見表3。
表1 10批丹參藥材峰面積統(tǒng)計
表2 10批丹參藥材相對保留時間統(tǒng)計
表3 重現(xiàn)性實驗結果
3.4指紋圖譜精密度試驗按照指紋圖譜精密度規(guī)定方法操作，以商洛丹參藥材0801批為供試品，取1份，連續(xù)進樣5次，分別對共有峰的相對保留時間及相對峰面積有規(guī)定的峰面積進行統(tǒng)計，RSD％不超過3％。3.5指紋圖譜穩(wěn)定性試驗按照指紋圖譜穩(wěn)定性測定方法操作，以商洛丹參藥材0801批為供試品，考察24小時溶液穩(wěn)定，分別對共有峰的相對保留時間及相對峰面積有規(guī)定的峰面積進行統(tǒng)計，RSD％不超過3％。供試品24小時穩(wěn)定。
以上試驗顯示，該測定方法穩(wěn)定可靠。通過對基地實施GAP管理，嚴控化肥、農(nóng)藥、采收加工等環(huán)節(jié)，使丹參質(zhì)量可控，指紋圖譜相對穩(wěn)定。
下面進一步給出商洛丹參指紋圖譜與市售丹參藥材圖譜的比較，但并不對本發(fā)明限制。
附圖及圖面說明

圖1對照品圖譜。1---丹參素對照品2---原兒茶醛對照品(參照物)圖2商洛丹參指紋圖譜(0～90分鐘)圖3市售丹參指紋圖譜(0～90分鐘)圖4商洛丹參指紋圖譜(0～30分鐘)圖5市售丹參商洛丹參指紋圖譜(0～30分鐘)市售丹參藥材的測定方法同商洛丹參指紋圖譜測定方法，采樣時間為90分鐘，測定3批。與商洛丹參區(qū)別見表4，色譜圖見圖1～5。
表4 市售丹參及商洛丹參區(qū)別
結果表明市售丹參其色譜圖中缺乏共有峰4(RT0.264),5(RT0.283)；原兒茶醛峰面積低于標準圖譜50％；市售丹參指紋圖譜中與商洛丹參標準指紋圖譜共有峰1(RT0.183)、3(RT0.214)、8(RT0.524)相對峰面積有較大差異；其非共有峰占總面積超過10％。二者指紋圖譜有較大區(qū)別，不能相互替代。
權利要求
1．一種丹參藥材指紋圖譜建立的方法，其特征是它是采取如下步驟步驟一供試品溶液的制備取過30目篩的丹參藥材粉末加水，精密稱重；回流提取1-3小時，放冷至室溫，補足失水；取提取液少量置量瓶中，甲醇定容至刻度，離心，取上清液作為供試品溶液；步驟二對照品溶液的制備取對照品適量，用流動相稀釋，制成對照品溶液；步驟三測定分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，以對照品的色譜峰的相對保留時間和峰面積為1計算相對保留時間和相對峰面積，即得到丹參標準指紋圖譜。
2.根據(jù)權利要求1所說的丹參藥材指紋圖譜建立的方法，其特征是步驟三中的色譜條件為色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為甲醇-水-有機酸的混合物；檢測波長254±1nm；理論塔板數(shù)以丹參素峰計算，不低于2500;步驟一中供試品溶液制備具體操作為取過30目篩丹參藥材粉末4.00g，加水50ml，精密稱重，回流提取2小時，放冷至室溫，補足失水，提取液2ml置25ml量瓶，甲醇定容至刻度，離心取上清液作為供試品溶液；步驟二對照品溶液的制備具體操作為取丹參素鈉、原兒茶醛對照品適量，用流動相稀釋，制成每1ml中含丹參素鈉20μg、原兒茶醛5.0μg，作為對照品溶液；步驟三中具體操作為分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各20μl、10μl，分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，以原兒茶醛的色譜峰的相對保留時間和峰面積為1計算相對保留時間和相對峰面積，即得到丹參標準指紋圖。
3.根據(jù)權利要求2所說的丹參藥材指紋圖譜建立的方法，其特征是所說的流動相為8∶92∶1的甲醇-水-冰醋酸。
4.一種丹參藥材的HPLC指紋圖譜，其特征是它為丹參水溶性提取物的按權利要求3所說的方法得到的HPLC圖譜。
5.根據(jù)權利要求4所述的丹參藥材的HPLC指紋圖譜，其特征是商洛丹參藥材指紋圖譜，其共有峰不少于8個。
6.據(jù)權利要求4所述的丹參藥材的HPLC指紋圖譜，其特征是通過10批商洛丹參藥材指紋圖譜測定，比較其色譜圖，確定共有峰為12個。
7.權利要求6所述的丹參藥材的HPLC指紋圖譜，其特征是所說的商洛丹參的12個共有峰相對保留時間的相對標準偏差RSD均小于3％。其中，1號峰平均相對保留時間RT0.186(相對標準偏差RSD2.82％)、2號峰RT0.206(RSD2.17％)、3號峰RT0.217(RSD2.93％)、4號峰RT0.266(RSD1.15％)、5號峰RT0.283(RSD0.78％)、6號峰RT0.404(RSD1.40％)、7號峰RT0.424(RSD1.34％)、8號峰丹參素RT0.524(RSD0.41％)、9號峰RT0.615(RSD1.32％)、10號峰RT0.682(RSD0.79％)、11號峰原兒茶醛RT1.000(此峰為參照峰)、12號峰RT2.576(RSD1.58％)；其中超過總峰面積10％的指紋峰為1號峰(相對峰面積38.10％～52.17％)、8號峰(丹參素)(相對峰面積38.07～47.96％)、11號峰(原兒茶醛)(相對峰面積為1)及12號峰(相對峰面積28.84％～44.10％)。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥丹參水溶性提取物HPLC指紋圖譜建立的方法及其標準指紋圖譜。首先制備供試品溶液,取丹參藥材粉末(過30目篩)4.00g,加水50ml,精密稱重,回流提取2小時,放冷至室溫,補足失水,取2ml置25ml量瓶,甲醇定容至刻度,離心,取上清液作為供試品溶液。再配制對照品溶液,取丹參素鈉、原兒茶醛對照品適量,用流動相稀釋,制成每1ml中含丹參素鈉20μg,原兒茶醛5.0μg,作為對照品溶液。測定法是分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各20μl、10μl,分別注入液相色譜儀,照高效液相色譜法測定,計算,即得。建立丹參標準指紋圖譜。將待測丹參樣品指紋圖譜與標準指紋圖譜對比,比較其異同。本發(fā)明的優(yōu)點是方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握,能從色譜的整體特征面貌上把握丹參的品種和質(zhì)量情況,可將其作為丹參質(zhì)量控制及真?zhèn)舞b別的指標之一。
文檔編號G01N30/40GK1322951SQ0111992
公開日2001年11月21日 申請日期2001年6月29日 優(yōu)先權日2001年6月29日
發(fā)明者葉正良, 張文生, 岳洪水, 李旭, 宋曉濤 申請人:天津市金士力藥物研究開發(fā)有限公司