專(zhuān)利名稱(chēng)：反向蛋白質(zhì)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反向蛋白質(zhì)芯片及其制備、檢測(cè)。蛋白質(zhì)芯片屬于生命科學(xué)領(lǐng)域。蛋白質(zhì)芯片是一種在固態(tài)基底上有序排布的蛋白質(zhì)或多肽陣列，以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行并行檢測(cè)、識(shí)別、鑒定和診斷的器件。廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我們以前申請(qǐng)的蛋白質(zhì)芯片專(zhuān)利，用于免疫分析的蛋白質(zhì)芯片(申請(qǐng)?zhí)?1105795.5)，主要技術(shù)路線是將待測(cè)蛋白質(zhì)所對(duì)應(yīng)的探針點(diǎn)樣于固態(tài)基底，然后加待測(cè)樣品與探針雜交，并加入熒光標(biāo)記物，最后根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷待測(cè)樣品中某種待測(cè)成分的濃度。這種方法用于抗原、抗體或配體、受體的分析、檢測(cè)，有非常好的效果，也可用于多樣品多指標(biāo)的檢測(cè)(見(jiàn)多樣品微陣列生物芯片，申請(qǐng)?zhí)?1112783.X)。
但是，第一，這種方法可檢測(cè)的樣本數(shù)有局限，如果用于多樣品微陣列生物芯片，由于每個(gè)腔室只能檢測(cè)一個(gè)樣本，因此上述技術(shù)只適用于幾個(gè)至幾十個(gè)樣本的檢測(cè)。如果腔室過(guò)多，造成的后果，其一為腔室間距很小，操作較困難，容易造成交叉污染；其二為腔室本身空間很小，會(huì)增加點(diǎn)樣的難度，減少可檢測(cè)的項(xiàng)目。因此，目前的技術(shù)尚不適用于大量樣品的檢測(cè)分析。其次，由于通常采用一種熒光標(biāo)記，每一個(gè)點(diǎn)只能檢測(cè)一個(gè)指標(biāo)，而生物芯片的目的就是要高度集成，因此，如果能突破一個(gè)點(diǎn)只檢測(cè)一個(gè)樣本、一個(gè)指標(biāo)的現(xiàn)狀，則更能體現(xiàn)生物芯片的有效性。第三，目前的蛋白質(zhì)芯片應(yīng)用過(guò)程中，需要經(jīng)過(guò)兩次雜交，如果能減少雜交次數(shù)，必然方便操作使用，減少誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以將一個(gè)樣品的多種成分的檢測(cè)集成于同一個(gè)點(diǎn)上的反向蛋白質(zhì)芯片。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)將待測(cè)樣品點(diǎn)陣于固相載體上，樣品中的待測(cè)蛋白質(zhì)或多肽及其他生物分子通過(guò)化學(xué)鍵連接于固相載體上而被固定，固相載體表面經(jīng)過(guò)封閉后，加入標(biāo)記了熒光的探針，與固相生物分子進(jìn)行雜交反應(yīng)，洗去未結(jié)合的物質(zhì)后，樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與樣品中待測(cè)成分的濃度成正比。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，所述點(diǎn)陣于固相載體上的待測(cè)樣品，可以是血清、體液、組織液、組織的細(xì)胞裂解液、也可以取細(xì)胞培養(yǎng)液、組織培養(yǎng)液，或分子生物學(xué)表達(dá)產(chǎn)物等；所述探針為待測(cè)成分相應(yīng)的抗體、受體或配體。這樣的點(diǎn)樣方式，可以同時(shí)測(cè)大量的樣品，密度可以超過(guò)每平方厘米100個(gè)樣品，可以用于大量樣本的檢測(cè)分析，例如大規(guī)模體檢、篩藥、組織分析、不同個(gè)體的比較分析、表達(dá)分析等。
本發(fā)明用一種或多種熒光進(jìn)行標(biāo)記，每一種熒光標(biāo)記一種探針，將多種熒光探針同時(shí)與樣品點(diǎn)進(jìn)行雜交，最后用相應(yīng)于不同熒光標(biāo)記物的不同的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，分別檢測(cè)到幾種熒光的成像?？梢詫⒁粋€(gè)樣品的多種成分的檢測(cè)集成于同一個(gè)點(diǎn)上，突破了一個(gè)點(diǎn)檢測(cè)一個(gè)樣品、一種成分的束縛。還可以在這幾個(gè)成分之間進(jìn)行比較分析。所加入的熒光探針，亦可以選擇具有競(jìng)爭(zhēng)性的幾種探針，讓它們競(jìng)爭(zhēng)性地與某種固相分子結(jié)合，以研究該待測(cè)標(biāo)本中某種分子的特性。
其中，固相載體可以是表面帶有活化基團(tuán)的玻璃片，也可以是醋酸纖維薄膜、硝酸纖維薄膜、尼龍膜、硅片、鋼片、陶瓷片等。
如果本發(fā)明與多樣品微陣列生物芯片結(jié)合使用，更可以隨需要增加檢測(cè)指標(biāo)，或做重復(fù)性實(shí)驗(yàn)等。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于第一，可多樣品同時(shí)檢測(cè)。反向蛋白質(zhì)芯片可以把大量的待測(cè)樣品點(diǎn)陣于固相載體之上，可以同時(shí)測(cè)大量的樣品，密度可以超過(guò)每平方厘米100個(gè)樣品，適用于大量樣本的檢測(cè)分析，例如大規(guī)模體檢、篩藥、比較分析等。第二，采用多種熒光標(biāo)記，突破了一個(gè)點(diǎn)檢測(cè)一個(gè)樣品、一種成分的束縛。而且增加了檢測(cè)結(jié)果的應(yīng)用范圍，可以應(yīng)用于檢測(cè)多種成分，幾種成分的比較，也可以用來(lái)研究某種分子的特性。第三，更節(jié)省待測(cè)樣品的量，每個(gè)點(diǎn)需要樣品量達(dá)到納升級(jí)。第四，大量標(biāo)本的檢測(cè)操作更簡(jiǎn)單，更準(zhǔn)確，更減少交叉污染。


圖1反向蛋白質(zhì)芯片作用原理圖。
圖2用反向蛋白質(zhì)芯片同時(shí)進(jìn)行兩種配體-受體的測(cè)定。
圖3用反向蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行腫瘤三項(xiàng)綜合檢查。
具體實(shí)施例方式
如圖1反向蛋白質(zhì)芯片作用原理圖所示，反向蛋白質(zhì)芯片，是將待測(cè)樣品點(diǎn)陣于固相載體上，樣品中的待測(cè)蛋白質(zhì)或多肽及其他生物分子通過(guò)化學(xué)鍵連接于固相載體上而被固定，固相載體表面經(jīng)過(guò)封閉后，加入標(biāo)記了熒光的探針，與固相生物分子進(jìn)行雜交反應(yīng)，洗去未結(jié)合的物質(zhì)后，樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與樣品中待測(cè)成分的濃度成正比。
其中載體材料的選擇固相載體可以是表面帶有活化基團(tuán)的玻璃片，也可以是醋酸纖維薄膜、硝酸纖維薄膜、尼龍膜、硅片、鋼片、陶瓷片等。
反向蛋白質(zhì)芯片的點(diǎn)樣、制作技術(shù)(1)樣品的制備采血清、取組織液，或?qū)⒔M織搗碎、裂解后，取細(xì)胞裂解液，也可以取細(xì)胞培養(yǎng)液、組織培養(yǎng)液，或分子生物學(xué)表達(dá)產(chǎn)物。(2)用高速點(diǎn)樣機(jī)器人，根據(jù)樣品的數(shù)量和種類(lèi)確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置。(3)點(diǎn)樣針從多孔板取出樣品后直接高密度點(diǎn)陣于固相載體上。(4)室溫過(guò)夜或37℃溫育1小時(shí)，以固定樣品。(5)在載體表面加上封閉液，37℃溫育1小時(shí)。(6)用雙蒸水充分洗滌并室溫干燥。
探針的標(biāo)記用不同的熒光染料標(biāo)記不同的探針，除去未結(jié)合成分后，將幾種標(biāo)記探針混合。
雜交反應(yīng)在點(diǎn)好樣的芯片上滴加熒光標(biāo)記探針混合液，37℃避光溫育30分鐘。洗凈并室溫晾干。
結(jié)果的檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，利用專(zhuān)業(yè)的芯片掃描分析儀進(jìn)行結(jié)果的判讀。具體為針對(duì)每一種熒光染料，采用相應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)，并在相應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行掃描。搜集數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析。
本發(fā)明應(yīng)用例1如圖2用反向蛋白質(zhì)芯片同時(shí)進(jìn)行兩種配體-受體的測(cè)定，即同時(shí)用不同熒光標(biāo)記的腫瘤壞死因子(TNF)和Fas配體(FasL)檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的TNF受體(TNF-R)和Fas。點(diǎn)樣陣列為4×4，其中A1、B1為陽(yáng)性對(duì)照，C1、D1為陰性對(duì)照，其它為待測(cè)標(biāo)本。左圖為檢測(cè)TNF-R結(jié)果，熒光的強(qiáng)弱代表細(xì)胞中TNF-R含量的高低；右圖為檢測(cè)Fas結(jié)果，熒光的強(qiáng)弱代表細(xì)胞中Fas含量的高低。
本發(fā)明應(yīng)用例2如圖3用反向蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行腫瘤三項(xiàng)綜合檢查。點(diǎn)樣方式如應(yīng)用例1，待測(cè)樣品為病人血清，探針為相應(yīng)抗體。左、中、右圖分別為甲胎蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)和癌胚抗原(CEA)指標(biāo)的檢測(cè)掃描結(jié)果。
權(quán)利要求
1，反向蛋白質(zhì)芯片，是將待測(cè)樣品點(diǎn)陣于固相載體上，特征在于樣品中的待測(cè)蛋白質(zhì)或多肽及其他生物分子通過(guò)化學(xué)鍵連接于固相載體上而被固定，固相載體表面經(jīng)過(guò)封閉后，加入標(biāo)記了熒光的探針，與固相生物分子進(jìn)行雜交反應(yīng)，洗去未結(jié)合的物質(zhì)后，樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與樣品中待測(cè)成分的濃度成正比。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的反向蛋白質(zhì)芯片，特征在于所述點(diǎn)陣于固相載體上的待測(cè)樣品，可以是血清、體液、組織液、組織的細(xì)胞裂解液、也可以取細(xì)胞培養(yǎng)液、組織培養(yǎng)液，或分子生物學(xué)表達(dá)產(chǎn)物，探針為待測(cè)成分相應(yīng)的抗體、受體或配體。
3，根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的反向蛋白質(zhì)芯片，特征在于用一種或一種以上熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，每一種熒光染料標(biāo)記一種探針，將多種熒光探針同時(shí)與樣品點(diǎn)進(jìn)行雜交，最后用相應(yīng)于不同熒光標(biāo)記物的不同的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，分別檢測(cè)到幾種熒光的成像。
4，根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的反向蛋白質(zhì)芯片，特征在于固相載體可以是表面帶有活化基團(tuán)的玻璃片，也可以是醋酸纖維薄膜、硝酸纖維薄膜、尼龍膜、硅片、鋼片、陶瓷片等。
5，一種反向蛋白質(zhì)芯片的制備方法，包括樣品制備及點(diǎn)樣，特征在于樣品的制備采血清、取組織液，或?qū)⒔M織搗碎、裂解后，取細(xì)胞裂解液，也可以取細(xì)胞培養(yǎng)液、組織培養(yǎng)液，或分子生物學(xué)表達(dá)產(chǎn)物；點(diǎn)樣用高速點(diǎn)樣機(jī)器人，根據(jù)樣品的數(shù)量和種類(lèi)確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；點(diǎn)樣針從多孔板取出樣品后直接高密度點(diǎn)陣于固相載體上；固定樣品室溫過(guò)夜或37℃溫育1小時(shí)；在載體表面加上封閉液，37℃溫育1小時(shí)；用雙蒸水充分洗滌并室溫干燥。
6，一種反向蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)方法，利用專(zhuān)業(yè)的芯片掃描分析儀進(jìn)行結(jié)果的判讀，特征在于針對(duì)每一種熒光染料，采用相應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)，并在相應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行掃描、搜集數(shù)據(jù)、結(jié)果分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及反向蛋白質(zhì)芯片及其制備、檢測(cè)。蛋白質(zhì)芯片屬于生命科學(xué)領(lǐng)域。廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域。反向蛋白質(zhì)芯片,樣品中的待測(cè)蛋白質(zhì)或多肽及其他生物分子通過(guò)化學(xué)鍵連接于固相載體上而被固定,固相載體表面經(jīng)過(guò)封閉后,加入標(biāo)記了熒光的探針,與固相生物分子進(jìn)行雜交反應(yīng),洗去未結(jié)合的物質(zhì)后,樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與樣品中待測(cè)成分的濃度成正比。本發(fā)明可以把大量的待測(cè)樣品點(diǎn)陣于固相載體之上;采用了多種熒光標(biāo)記,突破了一個(gè)點(diǎn)檢測(cè)一個(gè)樣品、一種成分的束縛,可以應(yīng)用于檢測(cè)多種成分,幾種成分的比較,研究某種分子特性;節(jié)省待測(cè)樣品量;大量標(biāo)本的檢測(cè)操作更簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確,減少交叉污染。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1335506SQ0112648
公開(kāi)日2002年2月13日 申請(qǐng)日期2001年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月15日
發(fā)明者張濤, 李賓, 彭永濟(jì), 任一萍 申請(qǐng)人:上海晶泰生物技術(shù)有限公司