專利名稱：抗獨(dú)特型微抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人源化基因工程抗體領(lǐng)域
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危及人類生命的主要因素之一。近十年來(lái)常規(guī)治療手段(手術(shù)、化療和放療)雖不斷改進(jìn)，但多數(shù)病人最終還是出現(xiàn)復(fù)發(fā)與耐藥，對(duì)此，臨床醫(yī)師常常束手無(wú)策。
卵巢癌發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中占第二位，而死亡率居首位。其起病隱匿，初診時(shí)約70～80％已屬晚期(III～I(xiàn)V期)，5年生存率僅30％左右。常規(guī)治療方法難以治愈；即使暫時(shí)緩解，亦常在2～3年后復(fù)發(fā)；反復(fù)手術(shù)和化療嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此，迫切需要尋找新的治療手段，提高卵巢癌的生存率，改善病人的生活質(zhì)量。
隨著生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一種有效的生物治療方法是目前解決惡性腫瘤治療的重要途徑之一。
目前，已廣泛利用基因工程抗體技術(shù)研制和開發(fā)用于腫瘤檢測(cè)、治療的抗體。在人體內(nèi)，完整的抗體由四條鏈組成，兩條輕鏈和兩條重鏈組成，見圖4。單鏈抗體scFv(single chain Fv)，見圖3。大多數(shù)單克隆抗體均為鼠源性，作為異源性蛋白，可在人體內(nèi)誘發(fā)免疫反應(yīng)而限制了其在人體內(nèi)的應(yīng)用。因此，從80年代中期人們就開始研究用基因工程的方法對(duì)鼠單抗進(jìn)行改造或人源化。其中小分子抗體是重要的方法之一。由于小分子抗體具有分子量小，穿透性強(qiáng)，抗原性低，可在原核系統(tǒng)表達(dá)，以及易于在基因水平上進(jìn)行操作等優(yōu)點(diǎn)而倍受重視。小分子抗體種類繁多，如Fab段，F(xiàn)v段，ScFv，DsFv，以及diabody和minibody等。研究最多的是單鏈抗體(ScFv)，而后三者均是在ScFv的基礎(chǔ)上發(fā)展出來(lái)的性能更為優(yōu)越的小分子抗體。1990年Gillies和Wesolowski證實(shí)了抗體的CH2區(qū)刪除后仍然保留其抗原的結(jié)合功能。并且能夠形成二聚體。在體內(nèi)具有抗體的診斷和治療的作用。1993年，意大利學(xué)者Pessi首先在其文章中使用了微抗體(minibody)一詞，來(lái)命名一種人工合成的僅有61個(gè)殘基，但又具有結(jié)合金屬活性的抗體。1996年Shi-zhen Hu等報(bào)道了一種新的基因工程抗CEA小分子抗體(VL-VH-CH3)，并將其也稱為minibody。有作者在荷瘤小鼠比較完整Ig，F(xiàn)(ab’)2，ScFv，diabody，和minibody的免疫顯像效果和治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)minibody和diabody的顯像效果最好，而在治療效果中以完整Ig和minibody為佳。
但上述還屬于腫瘤抗體范疇，只能作為腫瘤抗體用于腫瘤的檢測(cè)和治療，而不能作為腫瘤抗原或腫瘤疫苗用于腫瘤的診斷、治療和預(yù)防。
利用基因工程抗體技術(shù)研制和開發(fā)具有模擬卵巢癌抗原作用的抗獨(dú)特型疫苗，配合手術(shù)和化療治療晚期卵巢癌，可殺滅和/或控制經(jīng)手術(shù)和化療后殘余的微小癌灶，提高治愈率，推遲或減少?gòu)?fù)發(fā)，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，同時(shí)提高患者的生存質(zhì)量。
根據(jù)免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)(獲1976年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng))，抗獨(dú)特型抗體(anti-Id或Ab2)中的Ab2β具有模擬原始抗原的作用。對(duì)Ab2β模擬抗原的機(jī)制研究表明，Ab2β可以通過(guò)模擬抗原的序列或結(jié)構(gòu)，激活特異的細(xì)胞克隆，從而擴(kuò)大對(duì)特定抗原的體液免疫反應(yīng)。此外，機(jī)體還可將Ab2β以抗獨(dú)特型肽的形式提呈給T細(xì)胞，使CD4+T細(xì)胞大量增殖，參與細(xì)胞免疫，有實(shí)驗(yàn)表明此種反應(yīng)有可能不受MHC限制。因此Ab2β不僅具有模擬抗原的作用，同時(shí)又是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。由于目前已發(fā)現(xiàn)的腫瘤抗原極少，且難以大量制備，純化，因而利用Ab2β的特性制備腫瘤疫苗倍受重視，稱為“抗獨(dú)特型疫苗”。目前國(guó)外已制備了能模擬結(jié)腸癌，惡性黑色素瘤，淋巴瘤，腎癌及卵巢癌等多種腫瘤相關(guān)抗原的抗獨(dú)特型抗體，部分已進(jìn)入臨床I，II期研究，用來(lái)治療一些晚期腫瘤病人，取得了一定療效。Wagner等用抗獨(dú)特型抗體ACA125作為疫苗治療了16例晚期或復(fù)發(fā)的上皮性卵巢癌。這些患者接受了3-9次的ACA125免疫治療，其中9例患者誘導(dǎo)產(chǎn)生了Ab3和特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，3例患者IFN-γ升高。這些患者的平均無(wú)進(jìn)展生存期為11個(gè)月，而Ab3陰性組為8個(gè)月。Reinartz等用ACA125對(duì)45例晚期或復(fù)發(fā)的卵巢癌患者進(jìn)行主動(dòng)免疫治療，患者外周血T淋巴細(xì)胞內(nèi)IFN-r，IL-2，IL-4增加。國(guó)內(nèi)亦有制備鼻咽癌抗獨(dú)特型疫苗，并用于臨床治療晚期鼻咽癌的報(bào)道。
但以下原因限制了腫瘤抗獨(dú)特型疫苗的臨床應(yīng)用1)一般腫瘤抗獨(dú)特型抗體為鼠源性，人體內(nèi)應(yīng)用可產(chǎn)生抗體反應(yīng)，使其滅活或排出體外，難以發(fā)揮作用；2)缺乏有效并適合于人體應(yīng)用的免疫佐劑，難以引起足夠強(qiáng)的免疫反應(yīng)。
目前關(guān)于微抗體的制備國(guó)內(nèi)外均僅見個(gè)別報(bào)道，抗獨(dú)特型微抗體尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種抗獨(dú)特型微抗體，使其人源化，能夠降低鼠源性，增加免疫原性。
本發(fā)明的目的還在于提供一種人源化的卵巢癌抗獨(dú)特型微抗體，可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗卵巢癌體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，作為抗原或疫苗用于卵巢癌的診斷、治療或預(yù)防。
本發(fā)明的目的還在于提供一種制備上述抗獨(dú)特型微抗體的方法。
技術(shù)方案本發(fā)明的抗獨(dú)特型微抗體，包括抗獨(dú)特型抗體的輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)，免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH3區(qū)，抗獨(dú)特型抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH3區(qū)，分為(VL+VH)型和(VH+VL)型。
所述(VL+VH)型抗獨(dú)特型微抗體，由抗獨(dú)特型抗體的輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH3，其序列為，抗獨(dú)特型抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、免疫球蛋白分子的亞單位CH3，即VL+VH+Hinge+CH3。
所述(VL+VH)型抗獨(dú)特型微抗體，由抗獨(dú)特型抗體的輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、氨基酸連接和CH3，其序列為，抗獨(dú)特型抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，氨基酸連接和免疫球蛋白分子的亞單位CH3，即VL+VH+Hinge+氨基酸連接+CH3。
所述(VL+VH)型抗獨(dú)特型微抗體，可以包括兩個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)，其第一個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，和免疫球蛋白分子的亞單位CH3，即VL+VH+Hinge+CH3；第二個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，和免疫球蛋白分子的亞單位CH3，即VL+VH+Hinge+CH3；第一條鏈和第二條鏈由鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連接。
所述(VL+VH)型抗獨(dú)特型微抗體，可以包括兩個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)，其第一個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，氨基酸連接和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第二個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，氨基酸連接和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第一條鏈和第二條鏈由鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連接。
所述(VH+VL)型抗獨(dú)特型微抗體，由抗獨(dú)特型抗體的重鏈可變區(qū)連接輕鏈可變區(qū)，融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH3，其序列為，抗獨(dú)特型抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，和免疫球蛋白分子的亞單位CH3，即VH+VL+Hinge+CH3。
所述(VH+VL)型抗獨(dú)特型微抗體，由抗獨(dú)特型抗體的重鏈可變區(qū)連接輕鏈可變區(qū)，融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、氨基酸連接和CH3，其序列為，抗獨(dú)特型抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、氨基酸連接和免疫球蛋白分子的亞單位CH3，即VH+VL+Hinge+氨基酸連接+CH3。
所述(VH+VL)型抗獨(dú)特型微抗體，可以包括兩個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)，其第一個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由重鏈可變區(qū)連接輕鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第二個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由重鏈可變區(qū)連接輕鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第一條鏈和第二條鏈由鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連接。
所述(VH+VL)型抗獨(dú)特型微抗體，可以包括兩個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)，其第一個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由重鏈可變區(qū)連接輕鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，氨基酸連接和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第二個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由重鏈可變區(qū)連接輕鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，氨基酸連接和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第一條鏈和第二條鏈由鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連接。
本發(fā)明所述氨基酸連接由甘氨酸和絲氨酸構(gòu)成。
本發(fā)明所述抗獨(dú)特型抗體為卵巢癌抗獨(dú)特型抗體6B11，免疫球蛋白分子為人IgG。
本發(fā)明所述抗獨(dú)特型抗體也可為卵巢癌抗獨(dú)特型單鏈抗體6B11scFV，免疫球蛋白分子為人IgG。
本發(fā)明的制備抗獨(dú)特型微抗體的方法，其步驟包括1)構(gòu)建抗獨(dú)特型微抗體提供一個(gè)含有抗獨(dú)特型抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的單鏈抗體；融合上述單鏈抗體和免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH3區(qū)；2)產(chǎn)生抗獨(dú)特型微抗體用含有抗獨(dú)特型微抗體基因的核酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中可在上述宿主細(xì)胞表達(dá)抗獨(dú)特型微抗體的融合基因。
上述抗獨(dú)特型抗體卵巢為癌抗獨(dú)特型抗體6B11，免疫球蛋白分子為人IgG。
上述抗獨(dú)特型抗體也可為卵巢癌抗獨(dú)特型單鏈抗體6B11scFV。
所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)。
本發(fā)明的抗獨(dú)特型微抗體可作為腫瘤抗原或腫瘤疫苗用于腫瘤的診斷、治療或預(yù)防。
發(fā)明的積極效果10年前，本發(fā)明發(fā)明人用卵巢上皮癌可溶性抗原OC166-9免疫BALB/c小鼠制備了抗卵巢癌單克隆抗體COC166-9，免疫組化研究表明約80％卵巢癌表達(dá)OC166-9抗原。隨后在應(yīng)用單抗對(duì)卵巢癌患者進(jìn)行放射免疫顯像(RII)時(shí)發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)注射過(guò)單抗行RII患者的三年生存率比未行RII患者有明顯的提高，分別為63.5％和25％。推測(cè)生存率的差異與Ab2β產(chǎn)生相關(guān)。用COC166-9免疫BALB/c小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備出一株Ab2β型抗獨(dú)特型抗體6B11，并證實(shí)其可模擬卵巢癌相關(guān)抗原OC166-9。動(dòng)物體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，6B11可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗卵巢癌體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可作為疫苗用于卵巢癌的治療。
本發(fā)明應(yīng)用基因工程抗體技術(shù)克隆并高效表達(dá)出6B11的單鏈可變區(qū)基因(ScFv)(檢索EMBL Gene Bank，證實(shí)為國(guó)際上新發(fā)現(xiàn)的基因序列；在-NationalCenter for Biotechnology Information的gene bank上的登錄號(hào)為VHD85524、VLD85749)。分子量?jī)H為完整抗體的1/6，使其小型化，以減少體內(nèi)抗鼠抗體反應(yīng)。DNA序列分析表明該抗體輕、重鏈可變區(qū)基因均符合小鼠IgG特性。
然后應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建6B11ScFv和人GM-CSF融合蛋白基因(6B11GM)，并獲得高效表達(dá)(占菌體蛋白的30％)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)6B11GM融合蛋白既具有6B11模擬卵巢癌抗原的免疫活性，又具有支持人GM-CSF依賴細(xì)胞株生長(zhǎng)的功能。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)6B11GM融合蛋白能夠誘導(dǎo)抗原特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。動(dòng)物體內(nèi)免疫時(shí)，不用佐劑就可誘導(dǎo)出有效的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明為雙價(jià)的抗獨(dú)特型微抗體(anti-idiotype minibody)，見圖1、圖2，進(jìn)一步人源化，增加6B11scFv的免疫原性，提高分子量，降低鼠源性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下1.本發(fā)明抗獨(dú)特型微抗體為中等分子量，與小分子單鏈抗體ScFv相比，增大了其分子量，既保持了一定的穿透力，又延長(zhǎng)了在體內(nèi)的半衰期；2.本發(fā)明的抗獨(dú)特型微抗體融合了人免疫球蛋白分子，降低了鼠源性，進(jìn)一步人源化；3.本發(fā)明的抗獨(dú)特型微抗體為雙價(jià)二聚體，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，模擬抗原的能力增強(qiáng)，增加了免疫原性；4.本發(fā)明的抗獨(dú)特型微抗體不需要免疫佐劑就可引起足夠強(qiáng)的免疫反應(yīng)。


圖1本發(fā)明(VH-VL)型抗獨(dú)特型抗體結(jié)構(gòu)示意2本發(fā)明(VL-VH)型抗獨(dú)特型抗體結(jié)構(gòu)示意3單鏈抗體scFv結(jié)構(gòu)示意4完整人體抗體結(jié)構(gòu)示意5原核表達(dá)載體pET30a6B11VHVLhC微抗體構(gòu)建技術(shù)路線6原核表達(dá)載體pET306B11VLVHhC微抗體構(gòu)建技術(shù)路線圖實(shí)施方案實(shí)施例1(VH+VL+Hinge+CH3)型抗獨(dú)特型微抗體制備(如基因序列表四所示)
技術(shù)路線如圖5所示一、重疊PCR擴(kuò)增人IgG1hinge+CH3 regionPCR引物設(shè)計(jì)及鉸鏈區(qū)加CH3區(qū)基因的擴(kuò)增根據(jù)鉸鏈區(qū)加CH3區(qū)基因序列(如基因序列表一所示)設(shè)計(jì)5’和3’三對(duì)引物。在5’引物5’端加上BanH I酶切位點(diǎn)；在鉸鏈區(qū)及CH3區(qū)的連接處加上XhoI酶切位點(diǎn)；在3’引物的5’端加上EcoRI酶切位點(diǎn)。引物F1CGGGATCCGAGTCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCACTCGAGGGGCAGCCCCGAGF2ACTCGAGGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACF3GAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAR1CGGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGGTGCAGAGCCTCATGCATCACGGAGCR2GCGTGGTCTTGTAGTTGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCTCCCACTCCACGGCGATGTCGCTGGGATAGAAR3GCGATGTCGCTGGGATAGAAGCCTTTGACCAGGCAGGTCAGGCTGACCTGGTTCTTGGTCAGCTCATCCC二、重疊PCR擴(kuò)增人IgG1鉸鏈區(qū)和CH3區(qū)的融合基因的條件1、鏈伸長(zhǎng)反應(yīng)F2 R3Frag.I-(1)SolutionF4 R1Frag.II-(1)Solution變性溫度94℃變性時(shí)間5分鐘退火溫度55℃退火時(shí)間5分鐘延伸溫度72℃延伸時(shí)間5分鐘2、PCR反應(yīng)(1)第一步PCR反應(yīng)F1、R2、Frag.I-(1)SolutionFrag.I-(2)SolutionF3、R1、Frag.II-(1)Solution Frag.II-(2)Solution(2)第二步PCR反應(yīng)F1、R1、Frag.I-(2)Solution、Frag.II-(2)Solution得到PCR Frag.
兩步PCR的反應(yīng)條件均為變性溫度94℃變性時(shí)間30秒退火溫度55℃退火時(shí)間30秒延伸溫度72℃延伸時(shí)間30秒循環(huán)數(shù)30PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I、EcoR I酶切分別定向克隆到pUC18中，挑選兩個(gè)片段大小相符的克隆測(cè)序。三、表達(dá)載體的構(gòu)建對(duì)載體pET30a(+)6B11mGM用BamH I、EcoR I酶切回收大片段6B11VH-VL(如基因序列表二)，測(cè)序正確的pUC18hC同樣用BamH I、EcoR I酶切回收小片段，然后通過(guò)T4DNA連接酶構(gòu)建成所要得重組表達(dá)載體。四、誘導(dǎo)表達(dá)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，挑單克隆。分別不同濃度IPTG不同誘導(dǎo)時(shí)間37℃誘導(dǎo)表達(dá)，得到的包涵體進(jìn)行裂解復(fù)性后經(jīng)純化得到目的蛋白。五、活性的測(cè)定1、Western Blot主要步驟為SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜及免疫雜交。
(1)SDS-PAGE分離樣品，溴酚藍(lán)接近凝膠底邊時(shí)停止電泳。
(2)電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜取出凝膠，修剪膠塊，切10張與凝膠同樣大小的濾紙及硝酸纖維素膜(NC)于電轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5min；依次將5張濾紙、凝膠、NC及5張濾紙精確對(duì)齊，玻璃棒排盡氣泡，凝膠置于陰極一側(cè)；0.65mA/cm2電轉(zhuǎn)移2-3小時(shí)；轉(zhuǎn)移完畢后用麗春紅染色，觀察轉(zhuǎn)移效果，標(biāo)出分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置，然后進(jìn)行雜交。(3)免疫雜交用5％脫脂奶粉在室溫下緩慢搖動(dòng)封閉2小時(shí)后，依次用雙蒸水、PBS、PBS-T，每次10分；加稀釋COC166-9(1∶10)37℃搖床上溫育1小時(shí)后，4℃過(guò)夜后依次用漂洗液II、PBS-T洗三遍，每次10min；加入1∶500稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃搖床上溫育1小時(shí)，依次漂洗液II、PBS-T和PBS洗，每次10min；加DAB顯色。2.ELISA檢測(cè)純化微抗體的活性(1)直接ELISA法包被不同濃度純化抗獨(dú)特型微抗體的蛋白及陽(yáng)性(卵巢漿液性囊腺癌抗原OC166-9)與陰性對(duì)照，100ul/孔，4℃過(guò)夜。PBS-T洗三次，加含1％BSA的PBS 100ul/孔，37℃溫育1小時(shí)，棄孔內(nèi)液，PBS-T洗三次后加酶標(biāo)(HRP)COC166-9(1∶1000)，100ul/孔，37℃反應(yīng)2小時(shí)，PBS-T洗三次，每次三分鐘，OPD顯色，2M H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)OD490值。(2)ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法包被卵巢癌抗原OC166-9(2ug/ml)，100ul/孔，4℃過(guò)夜，PBS-T洗三次，加含1％BSA的PBS 100ul/孔，37℃封閉1小時(shí)后PBS-T洗三次，加入不同稀釋度純化表達(dá)蛋白與稀釋HRP-COC166-9(1∶1000)混合液(預(yù)先在室溫下反應(yīng)30-40分鐘)，以只加COC166-9孔為陽(yáng)性孔，37℃反應(yīng)2小時(shí)，PBS-T洗三次，每次三分鐘，OPD顯色，測(cè)OD490值，計(jì)算抑制率，作競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。同時(shí)檢測(cè)6B11單克隆抗體，將其與6B11微抗體進(jìn)行比較。實(shí)施例2(VL+VH+Hinge+CH3)型抗獨(dú)特型微抗體的制備(如基因序列表五)技術(shù)路線如圖6所示一、重疊PCR擴(kuò)增卵巢癌抗獨(dú)特型單鏈抗體6B11VL-VH(如基因序列表三所示)卵巢癌抗獨(dú)特型單鏈抗體6B11VL-VH基因的擴(kuò)增重疊PCR引物(使6B11scFv的輕重鏈顛倒)F1CGGAATTCCCATGGGAGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGAF2AAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGF3TACATTGGRACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACATAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAF4CAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGTCAAACTGCAGGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGF5GGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGCTTTCACTGCACACTTATGGTATAGGAGTAF6ACACTTATGGTATAGGAGTAGGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACTTTTGGTGGAATR1CGGGATCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTGCCTTGGCCCCAGACATCGAAGTACCACGCTATR2ACATCGAAGTACCACGCTATTTTCGTAGTAATAAGGGCTATTCGAGCACAGTAGTATGTGGCAGTATCTGR3GTAGTATGTGGCAGTATCTGCAGTGTCCACACTGGCGATGTTGAGGAATACCTGGTTGTTGGAGGCGTCCTTGGAGACAGR4GGAGGCGTCCTTGGAGACAGTGAGCCGGCTCTTCAGGGCTGTGTTATAGTACTTATTATTATTCCACCAAATGTGTGCCAR5GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCCCTCCGAACGTGTACGGAAAATR6TCCGAACGTGTACGGAAAATGTGTACTCTGAGAGCAGAAATAAACTCCCAGATCATCAGCCTCCACTCTGCTGATCTTGAR7CTCCACTCTGCTGATCTTGAGTGTGAAATCTGTCCCTGATCCACTGCCACTGAACCTGTCTGGGACCCCAGAAAATCGGT擴(kuò)增的片段為780bp。二、重疊PCR擴(kuò)增人6B11VLVH條件1、鏈伸長(zhǎng)反應(yīng)F3 R7Frag.I-(1)SolutionF6 R4Frag.II-(1)Solution變性溫度94℃ 變性時(shí)間5分鐘退火溫度55℃ 退火時(shí)間5分鐘延伸溫度72℃ 延伸時(shí)間5分鐘2、PCR反應(yīng)(1)第一步PCR反應(yīng)F2、R6、Frag.I-(1)Solution Frag.I-(2)SolutionF5、R3、Frag.II-(1)Solution Frag.II-(2)Solution(2)第二步PCR反應(yīng)F2、R5、Frag.I-(2)Solution Frag.I-(3)SolutionF4、R2、Frag.II-(2)Solution Frag.II-(3)Solution(3)第三步PCR反應(yīng)F1、R1、Frag.I-(3)Solution、Frag.II-(3)Solution得到PCR Frag.變性溫度94℃變性時(shí)間30秒退火溫度55℃退火時(shí)間30秒延伸溫度72℃延伸時(shí)間30秒循環(huán)數(shù)30PCR產(chǎn)物經(jīng)Noc I、BamH I酶切分別定向克隆到pUC18中，挑選兩個(gè)片段大小相符的克隆測(cè)序。三、表達(dá)載體的構(gòu)建對(duì)載體pET30a(+)6B11VHVLhC用Noc I、BamH酶切回收大片段，測(cè)序正確的pUC186B11scFv(VL-VH)同樣用Noc I、BamH酶切回收小片段，然后通過(guò)T4DNA連接酶構(gòu)建成所要得重組表達(dá)載體。四、誘導(dǎo)表達(dá)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，挑單克隆。分別不同濃度IPTG不同誘導(dǎo)時(shí)間37℃誘導(dǎo)表達(dá)得到的包涵體進(jìn)行裂解復(fù)性后經(jīng)純化得到目的蛋白。五、活性的測(cè)定1、Western Blot主要步驟為SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜及免疫雜交。(1)SDS-PAGE分離樣品，溴酚藍(lán)接近凝膠底邊時(shí)停止電泳。(2)電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜取出凝膠，修剪膠塊，切10張與凝膠同樣大小的濾紙及硝酸纖維素膜(NC)于電轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5min；依次將5張濾紙、凝膠、NC及5張濾紙精確對(duì)齊，玻璃棒排盡氣泡，凝膠置于陰極一側(cè)；0.65mA/cm2電轉(zhuǎn)移2-3小時(shí)；轉(zhuǎn)移完畢后用麗春紅染色，觀察轉(zhuǎn)移效果，標(biāo)出分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置，然后進(jìn)行雜交。(3)免疫雜交用5％脫脂奶粉在室溫下緩慢搖動(dòng)封閉2小時(shí)后，依次用雙蒸水、PBS、PBS-T，每次10分；加稀釋COC166-9(1∶10)37℃搖床上溫育1小時(shí)后，4℃過(guò)夜后依次用漂洗液II、PBS-T洗三遍，每次10min；加入1∶500稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃搖床上溫育1小時(shí)，依次漂洗液II、PBS-T和PBS洗，每次10min；加DAB顯色。2.ELISA檢測(cè)純化微抗體的活性(1)直接ELISA法包被不同濃度純化抗獨(dú)特型微抗體的蛋白及陽(yáng)性(卵巢漿液性囊腺癌抗原OC166-9)與陰性對(duì)照，100ul/孔，4℃過(guò)夜。PBS-T洗三次，加含1％BSA的PBS 100ul/孔，37℃溫育1小時(shí)，棄孔內(nèi)液，PBS-T洗三次后加酶標(biāo)(HRP)COC166-9(1∶1000)，100ul/孔，37℃反應(yīng)2小時(shí)，PBS-T洗三次，每次三分鐘，OPD顯色，2M H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)OD490值。(2)ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法包被卵巢癌抗原OC166-9(2ug/ml)，100ul/孔，4℃過(guò)夜，PBS-T洗三次，加含1％BSA的PBS 100ul/孔，37℃封閉1小時(shí)后PBS-T洗三次，加入不同稀釋度純化表達(dá)蛋白與稀釋HRP-COC166-9(1∶1000)混合液(預(yù)先在室溫下反應(yīng)30-40分鐘)，以只加COC166-9孔為陽(yáng)性孔，37℃反應(yīng)2小時(shí)，PBS-T洗三次，每次三分鐘，OPD顯色，測(cè)OD490值，計(jì)算抑制率，作競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。同時(shí)檢測(cè)6B11單克隆抗體，將其與6B11微抗體進(jìn)行比較?；蛐蛄斜硪?人IgG1 hinge+CH3基因序列)gga tcc gag tcc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca ctc gag ggg cag ccc cgagaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgcctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aactac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gacaag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tacacg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga gaa ttcG S ESKSCDKTHTCPPCPLEGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.EF基因序列表二(6B11VHVL基因序列)atg gga cag gtc aaa ctg cag gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag acc ctc agt ctg acttgt tct ttc tct ggg ctt tca ctg cac act tat ggt ata gga gta ggc tgg att cgt cag cct tca ggg aagggt ctg gag tgg ctg gca cac att tgg tgg aat aat aat aag tac tat aac aca gcc ctg aag agc cggctc act gtc tcc aag gac gcc tcc aac aac cag gta ttc ctc aac atc gcc agt gtg gac act gca gat actgcc aca tac tac tgt gct cga ata gcc ctt att act acg aaa ata gcg tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caaggc acc acg gtc acc gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcggac atc gag ctc act cag tct cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc agatct agt cag aac ctt gta cac agt aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tctcca aag ctc ctg atc tac ata gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tcaggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gat gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct cagagt aca cat ttt ccg tac acg ttc gga ggg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cggMGQVKLQESGPGILQPSQTLSLTCSFSGLSLHTYGIGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNNNKYYNTALKSRLTVSKDASNNQVFLNIASVDTADTATYYCARIALITTKIAWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYIVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYFCSQSTHFPYTFGGGTKLEIKR基因序列表三(6B11VLVH基因序列)atg gga gac atc gag ctc act cag tct cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atctct tgc aga tct agt cag aac ctt gta cac agt aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag ccaggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac ata gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggcagt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gat gat ctg gga gtt tat ttc tgctct cag agt aca cat ttt ccg tac acg ttc gga ggg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgg ggt gga ggcggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg cag gtc aaa ctg cag gag tct ggc cct ggg atattg cag ccc tcc cag acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ctt tca ctg cac act tat ggt ata gga gtaggc tgg att cgt cag cct tca ggg aag ggt ctg gag tgg ctg gca cac att tgg tgg aat aat aat aagtac tat aac aca gcc ctg aag agc cgg ctc act gtc tcc aag gac gcc tcc aac aac cag gta ttc ctcaac atc gcc agt gtg gac act gca gat act gcc aca tac tac tgt gct cga ata gcc ctt att act acg aaaata gcg tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggc acc acg gtc acc gtc tcc tcaMGDIELTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYIVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYFCSQSTHFPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGPGILQPSQTLSLTCSFSGLSLHTYGIGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNNNKYYNTALKSRLTVSKDASNNQVFLNIASVDTADTATYYCARIALITTKIAWY FDVWGQGTTVTVSS基因序列表四(6B11VHVLhC基因序列)atg gga cag gtc aaa ctg cag gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag acc ctc agt ctg acttgt tct ttc tct ggg ctt tca ctg cac act tat ggt ata gga gta ggc tgg att cgt cag cct tca ggg aagggt ctg gag tgg ctg gca cac att tgg tgg aat aat aat aag tac tat aac aca gcc ctg aag agc cggctc act gtc tcc aag gac gcc tcc aac aac cag gta ttc ctc aac atc gcc agt gtg gac act gca gat actgcc aca tac tac tgt gct cga ata gcc ctt att act acg aaa ata gcg tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caaggc acc acg gtc acc gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcggac atc gag ctc act cag tct cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc agatct agt cag aac ctt gta cac agt aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tctcca aag ctc ctg atc tac ata gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tcaggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gat gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct cagagt aca cat ttt ccg tac acg ttc gga ggg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgg gga tcc gag tcc aaatct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca ctc gag ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tacacc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttctat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cctccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cagcag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctctcc ctg tct ccg ggt aaa tga gaa ttcMGQVKLQESGPGILQPSQTLSLTCSFSGLSLHTYGIGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNNNKYYNTALKSRLTVSKDASNNQVFLNIASVDTADTATYYCARIALITTKIAWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYIVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYFCSQSTHFPYTFGGGTKLEIKRG S ESKSCDKTHTCPPCPLEGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.EF基因序列表五(6B11VLVHhC基因序列)atg gga gac atc gag ctc act cag tct cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atctct tgc aga tct agt cag aac ctt gta cac agt aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag ccaggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac ata gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggcagt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gat gat ctg gga gtt tat ttc tgctct cag agt aca cat ttt ccg tac acg ttc gga ggg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgg ggt gga ggcggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg cag gtc aaa ctg cag gag tct ggc cct ggg atattg cag ccc tcc cag acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ctt tca ctg cac act tat ggt ata gga gtaggc tgg att cgt cag cct tca ggg aag ggt ctg gag tgg ctg gca cac att tgg tgg aat aat aat aagtac tat aac aca gcc ctg aag agc cgg ctc act gtc tcc aag gac gcc tcc aac aac cag gta ttc ctcaac atc gcc agt gtg gac act gca gat act gcc aca tac tac tgt gct cga ata gcc ctt att act acg aaaata gcg tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggc acc acg gtc acc gtc tcc tca gga tcc gag tcc aaatct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca ctc gag ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tacacc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttctat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cctccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cagcag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctctcc ctg tct ccg ggt aaa tga gaa ttcMGDIELTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYIVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEADDLGVYFCSQSTHFPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGPGILQPSQTLSLTCSFSGLSLH TYGIGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNNNKYYNTALKSRLTVSKDASNNQVFLNIASVDTADTATYYCARIALITTKIAWY FDVWGQGTTVTVSSG S ESKSCDKTHTCPPCPLEGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.EF
權(quán)利要求
1.一種抗獨(dú)特型微抗體，包括抗獨(dú)特型抗體的輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)，免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH3區(qū)，其特征抗獨(dú)特型抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH3區(qū)，分為(VL+VH)型和(VH+VL)型。
2.如權(quán)利要求1所述的抗獨(dú)特型微抗體，其特征在于所述(VL+VH)型抗獨(dú)特型微抗體，由抗獨(dú)特型抗體的輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)，融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH3，其序列為，抗獨(dú)特型抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、免疫球蛋白分子的亞單位CH3。
3.如權(quán)利要求1所述的抗獨(dú)特型微抗體，其特征在于所述(VL+VH)型抗獨(dú)特型微抗體，由抗獨(dú)特型抗體的輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)，融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、氨基酸連接和CH3，其序列為，抗獨(dú)特型抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，氨基酸連接和免疫球蛋白分子的亞單位CH3，即VL+VH+Hinge+氨基酸連接+CH3。
4.如權(quán)利要求1所述的抗獨(dú)特型微抗體，其特征在于所述(VL+VH)型抗獨(dú)特型微抗體包括兩個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)，其第一個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第二個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第一條鏈和第二條鏈由鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連接。
5.如權(quán)利要求1所述的抗獨(dú)特型微抗體，其特征在于所述(VL+VH)型抗獨(dú)特型微抗體，可以包括兩個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)，其第一個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，氨基酸連接和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第二個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，氨基酸連接和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第一條鏈和第二條鏈由鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連接。
6.如權(quán)利要求1所述的抗獨(dú)特型微抗體，其特征在于所述(VH+VL)型抗獨(dú)特型微抗體，由抗獨(dú)特型抗體的重鏈可變區(qū)連接輕鏈可變區(qū)，融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH3，其序列為，抗獨(dú)特型抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，和免疫球蛋白分子的亞單位CH3。
7.如權(quán)利要求1所述的抗獨(dú)特型微抗體，其特征在于所述(VH+VL)型抗獨(dú)特型微抗體，由抗獨(dú)特型抗體的重鏈可變區(qū)連接輕鏈可變區(qū)，融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、氨基酸連接和CH3，其序列為，抗獨(dú)特型抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、氨基酸連接和免疫球蛋白分子的亞單位CH3。
8.如權(quán)利要求1所述的抗獨(dú)特型微抗體，其特征在于所述(VH+VL)型抗獨(dú)特型微抗體，包括兩個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)，其第一個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由重鏈可變區(qū)連接輕鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第二個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由重鏈可變區(qū)連接輕鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第一條鏈和第二條鏈由鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連接。
9.如權(quán)利要求1所述的抗獨(dú)特型微抗體，其特征在于所述(VH+VL)型抗獨(dú)特型微抗體，包括兩個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)，其第一個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由重鏈可變區(qū)連接輕鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，氨基酸連接和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第二個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)由重鏈可變區(qū)連接輕鏈可變區(qū)，其序列為，抗獨(dú)特型抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)，氨基酸連接和免疫球蛋白分子的亞單位CH3；第一條鏈和第二條鏈由鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連接。
10.如權(quán)利要求1-9任一所述之抗獨(dú)特型微抗體，其特征在于所述氨基酸連接由甘氨酸和絲氨酸構(gòu)成。
11.如權(quán)利要求1-9任一所述之抗獨(dú)特型微抗體，其特征在于所述抗獨(dú)特型抗體為卵巢癌抗獨(dú)特型抗體6B11，免疫球蛋白分子為人IgG。
12.如權(quán)利要求1-9任一所述之抗獨(dú)特型微抗體，其特征在于所述抗獨(dú)特型抗體也可為卵巢癌抗獨(dú)特型單鏈抗體6B11scFV，免疫球蛋白分子為人IgG。
13.一種制備權(quán)利要求1所述抗獨(dú)特型微抗體的方法，其步驟包括1)構(gòu)建抗獨(dú)特型微抗體提供一個(gè)含有抗獨(dú)特型抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的單鏈抗體；融合上述單鏈抗體和免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH3區(qū)；2)產(chǎn)生抗獨(dú)特型微抗體用含抗獨(dú)特型微抗體基因的核酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中可在上述宿主細(xì)胞表達(dá)抗獨(dú)特型微抗體的融合基因。
14.如權(quán)利要求13所述的制備抗獨(dú)特型微抗體的方法，其特征在于所述抗獨(dú)特型抗體為卵巢癌抗獨(dú)特型抗體6B11，免疫球蛋白分子為人IgG。
15.如權(quán)利要求13所述的制備抗獨(dú)特型微抗體的方法，其特征在于上述抗獨(dú)特型抗體也可為卵巢癌抗獨(dú)特型單鏈抗體6B11scFV。
16.如權(quán)利要求13所述的制備抗獨(dú)特型微抗體的方法，其特征在于所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)。
17.一種如權(quán)利要求1所述抗獨(dú)特型微抗體的應(yīng)用，其特征在于可作為腫瘤抗原或腫瘤疫苗用于腫瘤的診斷、治療或預(yù)防。
全文摘要
本發(fā)明屬于人源化基因工程抗體領(lǐng)域,涉及一種人源化的抗獨(dú)特型微抗體,包括抗獨(dú)特型抗體的輕鏈可變區(qū),重鏈可變區(qū),免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH3區(qū),其特征是:抗獨(dú)特型抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)融合免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH3區(qū),分為(VL+VH)型和(VH+VL)型;中等分子量,既保持了一定的穿透力,又延長(zhǎng)了在體內(nèi)的半衰期;融合了人免疫球蛋白分子,降低了鼠源性,進(jìn)一步人源化;其為雙價(jià)二聚體,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,模擬抗原的能力增強(qiáng),增加了免疫原性;不需要免疫佐劑就可引起足夠強(qiáng)的免疫反應(yīng)。該人源化的抗獨(dú)特型微抗體可作為腫瘤抗原或腫瘤疫苗廣泛應(yīng)用于腫瘤的診斷、治療或預(yù)防。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1356341SQ0113075
公開日2002年7月3日 申請(qǐng)日期2001年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月23日
發(fā)明者崔恒, 馮捷, 昌曉紅, 錢和年, 成夜霞, 姚煜 申請(qǐng)人:北京大學(xué)人民醫(yī)院