專利名稱：肝病診斷蛋白質(zhì)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明肝病診斷蛋白質(zhì)芯片屬于生命科學(xué)領(lǐng)域。蛋白質(zhì)芯片是一種在固態(tài)基底上有序排布的蛋白質(zhì)或多肽陣列，以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行并行檢測(cè)、識(shí)別、鑒定和診斷的器件。可應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
病毒性肝炎是法定乙類傳染病，主要分甲型，乙型，丙型，丁型和戊型；具有傳染性較強(qiáng)，傳播途徑復(fù)雜，流行面廣泛，發(fā)病率高，治愈困難等特點(diǎn)。部分乙型、丙型和丁型肝炎患者可演變成慢性，并可發(fā)展成為原發(fā)性肝細(xì)胞癌。原發(fā)性肝細(xì)胞癌為我國(guó)常見惡性腫瘤之一，死亡率在惡性腫瘤中居第三位；值得注意的是它的發(fā)病率有上升趨勢(shì)，且其中40％發(fā)生在中國(guó)。病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。臨床上通過檢測(cè)各種抗原和抗體來檢測(cè)肝炎感染情況，為預(yù)防肝炎感染，控制治療進(jìn)程，了解愈后狀況提供必要的資料。原發(fā)性肝癌的病因與發(fā)病原理迄今尚未確定。但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床上均發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞能夠合成一種特殊蛋白-甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)。AFP是原發(fā)性肝癌最靈敏最特異的腫瘤標(biāo)志。臨床上可憑借檢測(cè)血清AFP的含量以診斷原發(fā)性肝癌，陽性率可達(dá)90％左右，且可發(fā)現(xiàn)無癥狀病例；為肝癌的早期診斷，早期治療提供了可能，同時(shí)還可作為治療效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本發(fā)明主要針對(duì)病毒性肝炎(Viral Hepatitis)和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(PrimaryCarcinoma of the liver)的肝病聯(lián)合診斷芯片。
目前臨床上進(jìn)行病毒性肝炎診斷的方法主要是用酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(Enzyme-Linked Immunoassay，EIA)檢測(cè)血清中的抗體(IgG或IgM)和抗原。而臨床上進(jìn)行AFP檢查的方法有三種1.反向間接血球凝集法(血凝法)2.放射火箭電泳自顯影法(火箭法)3.放射免疫測(cè)定法(放免法)。病毒性肝炎的EIA試劑盒是逐項(xiàng)進(jìn)行檢查，每次反應(yīng)只能檢測(cè)一個(gè)指標(biāo)，速度慢，效率低，診斷費(fèi)時(shí)費(fèi)力；且靈敏度有局限，實(shí)驗(yàn)中所用底物也是劇毒化學(xué)品，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成威脅。用血凝法和火箭法檢測(cè)原發(fā)性肝癌靈敏度較高，但假陽性率也隨之增高；放免法雖較精確，但操作煩瑣，且放射物亦會(huì)對(duì)檢測(cè)人員造成傷害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的肝病診斷蛋白質(zhì)芯片，以及芯片的制備方法和檢測(cè)方法。
本發(fā)明目的可通過下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)是把病毒性肝炎和原發(fā)性肝癌的多項(xiàng)血液檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的抗原或抗體同時(shí)點(diǎn)陣于固相載體上，肝病診斷蛋白質(zhì)芯片，特點(diǎn)是，將病毒性肝炎(Viral Hepatitis)的多項(xiàng)血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的抗原、抗體，原發(fā)性肝癌(PrimaryCarcinoma of the liver)的血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的抗體以及陽性對(duì)照、陰性對(duì)照同時(shí)高密度點(diǎn)陣于固相載體上，蛋白質(zhì)通過化學(xué)鍵連接于固相載體上而被固定，所述固相載體可以是經(jīng)戊二醛活化的玻璃。僅僅通過一次反應(yīng)即可得到多種肝病指標(biāo)的逐項(xiàng)反應(yīng)結(jié)果，從而大大提高檢測(cè)的速度和效率。
其中，抗原檢測(cè)指標(biāo)包括乙肝表面抗原(HBsAg)，乙肝e抗原(HbeAg)，甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)；抗體檢測(cè)指標(biāo)包括甲肝病毒抗體(anti-HAV IgG或IgM)，乙肝表面抗體(HbsAb)，乙肝e抗體(HbeAb)，乙肝核心抗體(HBcAb)，丙肝病毒抗體(anti-HCVIgG或IgM)，丁肝病毒抗體(anti-HDV IgG或IgM)，戊肝病毒抗體(anti-HEV IgG或IgM)。在固相載體上點(diǎn)陣的抗體或抗原為純化的針對(duì)上述指標(biāo)的特征性抗體或抗原。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，本發(fā)明的目的可通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)采用多樣品微陣列生物芯片技術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)人份的多種肝病，包括病毒性肝炎和原發(fā)性肝癌。肝病診斷蛋白質(zhì)芯片，是將肝病抗體檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的抗原及陽性對(duì)照、陰性對(duì)照點(diǎn)陣于多樣品微陣列生物芯片的同一個(gè)腔室內(nèi)；肝病抗原檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的抗體以及陽性對(duì)照、陰性對(duì)照點(diǎn)陣于多樣品微陣列生物芯片的另一個(gè)腔室內(nèi)，多樣品微陣列生物芯片的每一個(gè)腔室均點(diǎn)陣了上述指標(biāo)的抗原或抗體。
在上述方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明也可以采用抗原—抗體—熒光二抗方法檢測(cè)病人血清中的病毒性肝炎抗體，即是將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待測(cè)抗體分別與固定在芯片上的相對(duì)應(yīng)的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標(biāo)記的二抗，洗去未結(jié)合的二抗，樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與血清中抗體濃度大小成正比。如圖1抗原—抗體—熒光二抗方法檢測(cè)血清中抗體的原理圖所示。
也可以采用雙抗體夾心法檢測(cè)病人血清中病毒性肝炎的抗原和AFP，即是將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待測(cè)抗原分別與固定在芯片上的相對(duì)應(yīng)的抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標(biāo)記的另一種抗體，可以用多種熒光染料標(biāo)記多種抗體，洗去未結(jié)合的抗體，樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與血清中抗原濃度大小成正比。如圖2雙抗體夾心法檢測(cè)血清中抗原的原理圖所示。
本發(fā)明肝病診斷蛋白質(zhì)芯片的制備方法如下第一步，根據(jù)樣品數(shù)目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；第二步，點(diǎn)樣針從多孔板取出蛋白質(zhì)樣品(肝病檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)的相應(yīng)抗原或抗體以及陽性對(duì)照、陰性對(duì)照)后直接高密度點(diǎn)印于固相載體上；第三步，室溫過夜或37℃溫育1小時(shí)，以固定樣品；第四步，利用制作蛋白質(zhì)芯片的常規(guī)方法封閉、洗滌、干燥、包裝、保存。
本發(fā)明具有下述優(yōu)越性第一，多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)。本技術(shù)把肝病的多項(xiàng)指標(biāo)的抗原和抗體同時(shí)點(diǎn)陣于一張玻璃片上，僅僅通過一次反應(yīng)即可得到多種指標(biāo)的抗體和抗原逐項(xiàng)反應(yīng)結(jié)果，因而大大提高了檢測(cè)的速度和效率。第二，該芯片的組合為綜合診斷肝病提供了良好的依據(jù)。第三，由于采用了多樣品微陣列生物芯片技術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)人份的肝病指標(biāo)。第四，靈敏度高于傳統(tǒng)方法。第五，特異性高，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，可靠性高。第六，工藝簡(jiǎn)單，操作安全，不僅效率高而且降低了成本，從而使診斷費(fèi)用降低，實(shí)用性強(qiáng)。


附圖1，抗原—抗體—熒光二抗方法檢測(cè)血清中抗體的原理圖。附圖2，雙抗體夾心法檢測(cè)血清中抗原的原理圖。附圖3，檢測(cè)抗體的腔室中的點(diǎn)樣陣列實(shí)施例，其中●——陽性對(duì)照○——生物探針 ——陰性對(duì)照A1HAV-AgA2HCV-AgA3HDV-AgB1HBsAgB2HBeAgB3HBcAgC1HEV-AgC2、C3陰性對(duì)照附圖4，檢測(cè)抗原的腔室中的點(diǎn)樣陣列，其中●——陽性對(duì)照○——生物探針 ——陰性對(duì)照A1HBsAbA2HBeAb HCVB1HDV-AbB2AFP-Ab附圖5，該病人抗-HAV-IgG陽性，表明感染甲肝。附圖6，該病人抗-HCV-IgG陽性，表明感染丙肝。附圖7，該病人抗HBsAg陽性，表明曾感染過乙肝，并已恢復(fù)。附圖8，該病人抗HEV-Ag陽性，表明感染戊肝。附圖9，該病人HbsAg，HbeAg，HBcAb均陽性，表明感染乙肝(大三陽)。
附圖10，該病人AFP陽性，表明可能患有原發(fā)性肝癌。
附圖11，該病人HbsAg，HbeAb，HBcAb均陽性，表明感染乙肝(小三陽)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明肝病診斷蛋白質(zhì)芯片是將病毒性肝炎的多項(xiàng)血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)的抗原、抗體，原發(fā)性肝癌的血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)的抗體以及陽性對(duì)照、陰性對(duì)照同時(shí)高密度點(diǎn)陣于固相載體上，抗原檢測(cè)指標(biāo)和抗體檢測(cè)指標(biāo)分別位于微陣列生物芯片的不同腔室內(nèi)?？乖瓩z測(cè)指標(biāo)包括HBsAg，HbeAg，AFP)；抗體檢測(cè)指標(biāo)包括anti-HAV IgG或IgM，HbsAb，HbeAb，HBcAb，anti-HCV IgG或IgM，anti-HDV IgG或IgM，anti-HEV IgG或IgM。將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待測(cè)抗體分別與固定在芯片上的相對(duì)應(yīng)的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標(biāo)記的二抗，洗去未結(jié)合的二抗，樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與血清中抗體濃度大小成正比。或者病人血清中的待測(cè)抗原分別與固定在芯片上的相對(duì)應(yīng)的抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標(biāo)記的另一種抗體，(可以用多種熒光染料標(biāo)記多種抗體)，洗去未結(jié)合的抗體，樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與血清中抗原濃度大小成正比。本實(shí)施例點(diǎn)陣法采用如附圖3檢測(cè)抗體的腔室中的點(diǎn)樣陣列實(shí)施例和附圖4檢測(cè)抗原的腔室中的點(diǎn)樣陣列所示的點(diǎn)樣陣列，檢測(cè)病人血清，檢測(cè)結(jié)果圖5至圖11所示，附圖5至附圖11使用上述肝病診斷芯片診斷病人血清舉例，左圖為肝病抗體檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果，右圖為肝病抗原檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果，其中點(diǎn)樣、制作技術(shù)第一步，根據(jù)樣品數(shù)目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；第二步，點(diǎn)樣針從多孔板取出蛋白質(zhì)樣品(肝病檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)的相應(yīng)抗原或抗體以及陽性對(duì)照、陰性對(duì)照)后直接高密度點(diǎn)印于固相載體上；第三步，室溫過夜或37℃溫育1小時(shí)，以固定樣品；第四步，利用制作蛋白質(zhì)芯片的常規(guī)方法封閉、洗滌、干燥、包裝、保存。
雜交反應(yīng)第一步，在點(diǎn)好樣的芯片上滴加病人血清樣品，37℃溫育1小時(shí)，使抗原抗體充分反應(yīng)；第二步，用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干；第三步，加封阻液封阻并再次洗凈晾干；第四步，滴加以封阻液稀釋過的熒光標(biāo)記二抗或熒光標(biāo)記抗原；第五步，37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干。
結(jié)果的檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，利用專業(yè)的芯片掃描分析儀進(jìn)行結(jié)果的判讀和分析。
結(jié)果如附圖5，該病人抗-HAV-IgG陽性，表明感染甲肝。附圖6，該病人抗-HCV-IgG陽性，表明感染丙肝。附圖7，該病人抗HBsAg陽性，表明曾感染過乙肝，并已恢復(fù)。附圖8，該病人抗HEV-Ag陽性，表明感染戊肝。附圖9，該病人HbsAg，HbeAg，HBcAb均陽性，表明感染乙肝(大三陽)。附圖10，該病人AFP陽性，表明可能患有原發(fā)性肝癌。附圖11，該病人HbsAg，HbeAb，HBcAb均陽性，表明感染乙肝(小三陽)。
權(quán)利要求
1，肝病診斷蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，將病毒性肝炎(Viral Hepatitis)的多項(xiàng)血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的抗原、抗體，原發(fā)性肝癌(PrimaryCarcinoma of the liver)的血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的抗體以及陽性對(duì)照、陰性對(duì)照同時(shí)高密度點(diǎn)陣于固相載體上，蛋白質(zhì)通過化學(xué)鍵連接于固相載體上而被固定，所述固相載體經(jīng)戊二醛活化的玻璃。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝病診斷蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，肝病檢測(cè)指標(biāo)分為抗原檢測(cè)和抗體檢測(cè)兩部分抗原檢測(cè)指標(biāo)包括乙肝表面抗原(HBsAg)，乙肝e抗原(HbeAg)，甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)；抗體檢測(cè)指標(biāo)包括甲肝病毒抗體(anti-HAV IgG或IgM)，乙肝表面抗體(HbsAb)，乙肝e抗體(HbeAb)，乙肝核心抗體(HBcAb)，丙肝病毒抗體(anti-HCV IgG或IgM)，丁肝病毒抗體(anti-HDV IgG或IgM)，戊肝病毒抗體(anti-HEV IgG或IgM)，所述在固相載體上點(diǎn)陣的抗體或抗原為純化的針對(duì)上述指標(biāo)的特征性抗體或抗原，陰性對(duì)照采用牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin，BSA)或者人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)，抗體檢測(cè)區(qū)陽性對(duì)照采用人類免疫球蛋白G或M(IgG或IgM)，抗原檢測(cè)區(qū)陽性對(duì)照采用相應(yīng)的抗原。
3，根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的肝病診斷蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，采用多樣品微陣列生物芯片技術(shù)。即是將肝病抗體檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的抗原及陽性對(duì)照、陰性對(duì)照點(diǎn)陣于多樣品微陣列生物芯片的同一個(gè)腔室內(nèi)；肝病抗原檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的抗體以及陽性對(duì)照、陰性對(duì)照點(diǎn)陣于多樣品微陣列生物芯片的另一個(gè)腔室內(nèi)，多樣品微陣列生物芯片的每一個(gè)腔室均點(diǎn)陣了上述指標(biāo)的抗原或抗體。
4，根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的肝病診斷蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，采用抗原—抗體—熒光二抗方法檢測(cè)病人血清中的病毒性肝炎抗體，即是將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待測(cè)抗體分別與固定在芯片上的相對(duì)應(yīng)的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標(biāo)記的二抗，洗去未結(jié)合的二抗，樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與血清中抗體濃度大小成正比。
5，根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的肝病診斷蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，采用雙抗體夾心法檢測(cè)病人血清中病毒性肝炎的抗原和AFP，即是將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待測(cè)抗原分別與固定在芯片上的相對(duì)應(yīng)的抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標(biāo)記的另一種抗體，其中，用多種熒光染料標(biāo)記多種抗體，洗去未結(jié)合的抗體，樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與血清中抗原濃度大小成正比。
6，肝病診斷蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于，第一步，根據(jù)樣品數(shù)目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；第二步，點(diǎn)樣針從多孔板取出蛋白質(zhì)樣品(肝病檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)的相應(yīng)抗原或抗體以及陽性對(duì)照、陰性對(duì)照)后直接高密度點(diǎn)印于固相載體上；第三步，室溫過夜或37℃溫育1小時(shí)，以固定樣品；第四步，利用制作蛋白質(zhì)芯片的常規(guī)方法封閉、洗滌、干燥、包裝、保存。
7，肝病診斷蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)方法，其特征在于，進(jìn)行雜交反應(yīng)第一步，在點(diǎn)好樣的芯片上滴加病人血清樣品，37℃溫育1小時(shí)，使抗原抗體充分反應(yīng)；第二步，用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干；第三步，加封阻液封阻并再次洗凈晾干；第四步，滴加以封阻液稀釋過的熒光標(biāo)記二抗或熒光標(biāo)記抗原；第五步，37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干；第六步，反應(yīng)結(jié)束后，利用專業(yè)的芯片掃描分析儀進(jìn)行結(jié)果的判讀和分析。
全文摘要
本發(fā)明肝病診斷蛋白質(zhì)芯片涉及一種蛋白質(zhì)芯片、制備方法及檢測(cè)方法,將病毒性肝炎的多項(xiàng)血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的抗原、抗體,原發(fā)性肝癌的血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的抗體以及陽性對(duì)照、陰性對(duì)照同時(shí)高密度點(diǎn)陣于固相載體上,蛋白質(zhì)通過化學(xué)鍵連接于固相載體上而被固定。將所述的蛋白質(zhì)樣品按抗原、抗體分類,分別點(diǎn)陣于多樣品微陣列生物芯片的不同腔室內(nèi)。具有僅僅通過一次反應(yīng)即可得到多種指標(biāo)的抗體和抗原逐項(xiàng)反應(yīng)結(jié)果,可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)人份的肝病指標(biāo),靈敏度高,特異性高,檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定,可靠性高,工藝簡(jiǎn)單,操作安全,不僅效率高而且降低了成本,從而使診斷費(fèi)用降低,實(shí)用性強(qiáng)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1356554SQ0113229
公開日2002年7月3日 申請(qǐng)日期2001年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月23日
發(fā)明者張濤, 李賓, 彭永濟(jì), 陳瑩, 丁力, 任一萍 申請(qǐng)人:上海晶泰生物技術(shù)有限公司