專(zhuān)利名稱：多分析物免疫測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多分析物免疫測(cè)定，例如使用在其上面具有一系列分析物特異性配體的生物芯片或微片進(jìn)行的多分析物免疫測(cè)定。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中已描述過(guò)生物芯片/微片在免疫測(cè)定或核苷酸雜交測(cè)定的大量測(cè)定中的應(yīng)用。對(duì)于通常設(shè)計(jì)的裝配式陣列，有大量獨(dú)立反應(yīng)位點(diǎn)位于固體載體上的空間不同區(qū)域中。這些陣列可包含高密度的固定在固體載體表面上的相同或不同分子。
不論在何時(shí)測(cè)試一組多分析物，都需要正確地定量測(cè)定出存在于未知樣本中的各分析物的量。因此，對(duì)于呈現(xiàn)在一組多分析物上的各個(gè)分析物，必須產(chǎn)生最佳標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線必須覆蓋適用于測(cè)定其所呈現(xiàn)的特定分析物和適于欲測(cè)定的患者樣本類(lèi)型的動(dòng)態(tài)范圍。該動(dòng)態(tài)范圍是衡量該測(cè)定法對(duì)所測(cè)定的分析物的靈敏度的量度標(biāo)準(zhǔn)。
在必須檢測(cè)各分析物的濃度范圍方面會(huì)產(chǎn)生困難。因?yàn)閷?duì)于一組分析物，必需測(cè)定的各分析物的濃度范圍可能相差很大，所以對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)曲線的最優(yōu)化會(huì)帶來(lái)靈敏度問(wèn)題。
在一組多分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線中必須包括的這種動(dòng)態(tài)范圍的多樣性會(huì)在必須加到各生物芯片中的多綴合物的生成過(guò)程中帶來(lái)實(shí)際問(wèn)題。這樣的多綴合物是用于將適于各獨(dú)立免疫測(cè)定的可檢測(cè)標(biāo)記物加到生物芯片中的試劑。這樣的可檢測(cè)標(biāo)記物使得各免疫測(cè)定能夠顯現(xiàn)出來(lái)，并且隨后能夠在生物芯片上被定量測(cè)定。
例如，對(duì)于一系列結(jié)合生物芯片格式中濫用藥物的配體，需要控制標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀。常規(guī)篩選指標(biāo)覆蓋廣泛的濃度范圍；例如，截止范圍是從LSD的0.5ng/ml到鴉片劑的2000ng/ml。
如果所討論的分子在其分子量和免疫原性方面非常類(lèi)似，這有相當(dāng)?shù)碾y度。因此這些分子的所有抗體在可達(dá)到的檢測(cè)限方面具有非常類(lèi)似的特征。在目前的測(cè)試方法中，各種藥物有其自己的特異性試驗(yàn)。這使得試驗(yàn)廠商可以調(diào)整各獨(dú)立試驗(yàn)以給該特定藥物試驗(yàn)提供最好的篩選指標(biāo)。然而，在多分析物格式中，將這些條件應(yīng)用于生物芯片上出現(xiàn)的全部的測(cè)定范圍。因此，可用于提供寬范圍截止限的選擇很有限。
US-A-4722889和US-A-5026653公開(kāi)了通過(guò)與對(duì)分析物有特異性的標(biāo)記抗體反應(yīng)來(lái)測(cè)定樣本中分析物的方法。此外，可使用對(duì)分析物有低特異性、但是對(duì)起干擾物作用的類(lèi)似物有高特異性的清除單克隆抗體。
WO-A-98/26644公開(kāi)了使用與分析物反應(yīng)的“檢測(cè)抗體”來(lái)測(cè)定樣本中的分析物例如濫用的藥物的方法。第二個(gè)反應(yīng)使用了“中和抗體”(可能與檢測(cè)抗體相同)，這樣的抗體結(jié)合分析物，并由此阻止分析物在用檢測(cè)抗體進(jìn)行的測(cè)定中發(fā)生正反應(yīng)。因此，與檢測(cè)抗體發(fā)生正反應(yīng)、但是在第二個(gè)反應(yīng)中反應(yīng)下降的樣本含有目的分析物；在這兩個(gè)反應(yīng)中給出類(lèi)似正反應(yīng)的樣本含有干擾物。該方法的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需知道干擾物的確切性質(zhì)。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于下述認(rèn)識(shí)，即當(dāng)考慮到每一分析物必須在與一組分析物的其它分析物非常不同的濃度下檢測(cè)，并且每一綴合物必須以適于其所識(shí)別的特定分析物的濃度/稀釋度呈現(xiàn)在多綴合物試劑中時(shí)，可能難以將動(dòng)態(tài)范圍最優(yōu)化?，F(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，可能需要以彼此非常不同的濃度檢測(cè)和定量測(cè)定一組分析物中的分析物。
具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及改變發(fā)現(xiàn)在一個(gè)區(qū)域中靈敏度太高、而在另一區(qū)域中靈敏度不夠高的標(biāo)準(zhǔn)曲線(對(duì)于在所考慮的一組多分析物中發(fā)現(xiàn)的一種分析物/一系列分析物)的靈敏度。它包括向測(cè)定系統(tǒng)中，例如向測(cè)定緩沖液中加入一定量的清除抗體或其它清除物質(zhì)。這樣的清除物質(zhì)可以與固定在生物芯片表面上以捕獲分析物的清除劑相同或不同。使用清除物質(zhì)的目的是特異性地清除/掃除樣本(標(biāo)準(zhǔn)或患者樣本)中的一些分析物，并由此降低其有效的可檢測(cè)濃度。這也降低了標(biāo)準(zhǔn)曲線的非常靈敏部分的靈敏度，并改善了標(biāo)準(zhǔn)曲線另一區(qū)域的靈敏度。
本發(fā)明描述用于本發(fā)明的生物芯片可通過(guò)已知方法制得。參見(jiàn)例如GB-A-2324866。
這樣的生物芯片提供了一組配體，例如抗體?？赡苡袔追N對(duì)于不同分析物有特異性的不同配體。這種新的測(cè)定方法可用于測(cè)試一種或多種這樣的分析物，并且可使用一種或多種抗體。可以使用的其它清除物質(zhì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，并包括aptamer。這樣的清除物質(zhì)一般包含在測(cè)定緩沖液中，測(cè)定緩沖液通常含有常規(guī)組分如溶劑等。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏度是B/Bo的函數(shù)，其中B和Bo分別代表結(jié)合物質(zhì)和零標(biāo)準(zhǔn)物的光單位值?？梢栽谛枰繙y(cè)定的每一情況下構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線?；蛘撸鐚?duì)于濫用藥物測(cè)定，是/否測(cè)定是令人滿意的，對(duì)于此在100％截止的校準(zhǔn)是合適的。
為了舉例說(shuō)明，本發(fā)明涉及一組濫用藥物多分析物，并使用抗體作為清除劑。典型的這樣一組多分析物包括用于測(cè)定下述濫用藥物的競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定苯丙胺、脫氧麻黃堿、THC、苯并二氮雜、鴉片劑、巴比妥類(lèi)藥物、苯甲酰愛(ài)康寧、美沙酮、PCP和LSD。
對(duì)于濫用藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線(0％-300％)，100％標(biāo)準(zhǔn)含有每一這些藥物的截止?jié)舛?，即在截止?jié)舛纫韵履軘喽颖驹谒幬锓矫娉赎幮?，在截止?jié)舛纫陨夏軘喽颖驹谒幬锓矫娉赎?yáng)性。是如下所列出的寬范圍截止?jié)舛仍趶募尤攵嗑Y合物中獲得所有分析物的合適標(biāo)準(zhǔn)曲線過(guò)程中引起問(wèn)題。濫用藥物 截止苯丙胺 1000ng/ml脫氧麻黃堿 1000ng/mlTHC 50ng/ml苯并二氮雜 200ng/ml鴉片劑 2000ng/ml或300ng/ml巴比妥類(lèi)藥物 200ng/ml苯甲酰愛(ài)康寧 300ng/ml美沙酮 300ng/mlPCP25ng/mlLSD0.5ng/ml在確定清除抗體的用量時(shí)，通常必須在下述兩個(gè)方面折中即在0％-25％標(biāo)準(zhǔn)之間增加B/Bo的值，和在75％-100％-125％之間不減小降低值。換句話說(shuō)，雖然目的是使得曲線的靈敏度在0％-25％之間降低，但是在確定每種藥物的截止判定值的75％-125％之間靈敏度必須不能降低。因此非常重要的是，使靈敏度在截止區(qū)域附近最大，以精確地確定樣本的肯定性或否定性。
任一特定分析物的截止區(qū)域是已知的，或者可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定出。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以容易地確定出如何使曲線的靈敏度在截止點(diǎn)附近最大。
使用PCP、BZG和苯丙胺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)通過(guò)加入不同量的適當(dāng)清除抗體在截止區(qū)域所達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的改變程度。更具體地說(shuō)，下述PCP、BZG和苯丙胺的數(shù)據(jù)證實(shí)了在不加入清除抗體的情況下標(biāo)準(zhǔn)曲線在截止區(qū)域不夠靈敏(對(duì)于每一種情況下其在0％-25％之間過(guò)于靈敏)。對(duì)于本發(fā)明目的和這些分析物，曲線在0％-25％之間過(guò)于靈敏，在超過(guò)該點(diǎn)的區(qū)域內(nèi)不夠靈敏。
PCP的結(jié)果如下所示
表1
加入1-2mg/L PCP抗體顯著地改善了曲線在75-125％截止區(qū)域附近的靈敏度。這清楚地表明了抑制下降百分比從沒(méi)有加入抗體時(shí)的11.45％(B/Bo從75％時(shí)的31.79減小到125％時(shí)的20.34)減小到加入2mg/L PCP抗體時(shí)的46.22％(B/Bo從75％時(shí)的95.72減小到125％時(shí)的49.50)。
BZG的結(jié)果如下所示表2
為了顯著改善此標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏度，必須加入大量BZG抗體。必須加入50-80mg/L來(lái)改善截止區(qū)域的靈敏度。在沒(méi)有加入抗體時(shí)，抑制下降百分比是4.99％(B/Bo從75％時(shí)的14.46減小到125％時(shí)的9.47)，加入80mg/L BZG抗體時(shí)改善至17.51％(B/Bo從75％時(shí)的47.89減小到125％時(shí)的30.38)。苯丙胺的結(jié)果如下所示表3
為了改善標(biāo)準(zhǔn)曲線的截止區(qū)域的靈敏度，1.25mg/L苯丙胺抗體是最佳加入量。超過(guò)1.25mg/L的濃度不能進(jìn)一步改善結(jié)果。在沒(méi)有加入抗體時(shí)，抑制下降百分比是2.12％(B/Bo從75％時(shí)的5.61％減小到125％時(shí)的3.49％)，加入1.25mg/L苯丙胺抗體時(shí)改善至26.92％(B/Bo從75％時(shí)的67.83％減小到125％時(shí)的40.91％)。
權(quán)利要求
1.測(cè)定樣本中分析物的方法，其中是將樣本與包括對(duì)分析物有特異性的配體在內(nèi)的一組配體接觸，并且還加入能結(jié)合分析物以由此降低其有效濃度的清除物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定方法，其中所述分析物是濫用藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的測(cè)定方法，其中抗體的加入量使得標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏度在截止區(qū)域附近達(dá)到最大。
4.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的測(cè)定方法，其中所述清除物質(zhì)是抗體。
全文摘要
測(cè)定樣本中分析物的方法,其中是將樣本與包括對(duì)分析物有特異性的配體在內(nèi)的一組配體接觸,并且還加入能結(jié)合分析物以由此降低其有效濃度的清除物質(zhì)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1353312SQ01137938
公開(kāi)日2002年6月12日 申請(qǐng)日期2001年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月6日
發(fā)明者S·P·菲茨格拉德, J·V·拉蒙特, R·I·麥克康奈爾 申請(qǐng)人:蘭道克斯實(shí)驗(yàn)有限公司