專利名稱：一種高靈敏檢測生物分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種高靈敏度檢測生物分子的方法。
然而，納米金顆粒標(biāo)記方法存在的矛盾是，從提高標(biāo)記效率的角度，需要納米金顆粒的粒徑越小越好，從易于觀察和提高檢測靈敏度的角度，則需要納米金顆粒的粒徑越大越好。以往人們主要利用硝酸銀和對苯二酚作為增強(qiáng)劑來解決這一矛盾(Hayat，M.A.Ed.Colloid GoldPrinciples，Methods and Applications，vol.1.；AcademicPress，New York，1989.)，并將這一方法應(yīng)用于微孔濾膜上，開發(fā)出微孔濾膜免疫金銀法(L.A.Dykman，V.A.Bogatyrev，F(xiàn)EMS Immunol.Med.Microbiol.2000，27，135-137；M.G.Sumi，A.Mathai，C.Sarada，V.V.Radhakrishnan，J.Clin.Microbiol.1999，37，3925-3927.)。其基本原理為將待檢測的抗體、抗原或蛋白質(zhì)固定在微孔濾膜的表面，然后用金標(biāo)記的與待檢測的抗體、抗原或蛋白質(zhì)相對應(yīng)的抗原、抗體或受體處理微孔濾膜，再用硝酸銀和對苯二酚作為增強(qiáng)劑來處理微孔濾膜。若在微孔濾膜的表面存在待檢測的抗體、抗原或蛋白質(zhì)，則會出現(xiàn)具有一定灰度的斑點(diǎn)，以此作為檢測的依據(jù)。此法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，而且不需要特殊的儀器；缺點(diǎn)是檢測靈敏度只有ng/mL，遠(yuǎn)低于熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)顯色法的檢測靈敏度，限制了此法的實(shí)際應(yīng)用。
一種高靈敏檢測生物分子的方法，是用擴(kuò)增試劑來處理用微孔濾膜免疫金銀法得到的微孔濾膜；所述擴(kuò)增試劑為濃度大于0.001％的氯金酸水溶液或緩沖液溶液及濃度大于0.01mmol/L的羥胺水溶液或緩沖液溶液。
所述氯金酸緩沖液溶液的緩沖液為Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液或HEPS緩沖液。緩沖液溶液的pH＝3-9。
所述羥胺緩沖液溶液的緩沖液為Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液或HEPS緩沖液。緩沖液溶液的pH＝3-9。
所述氯金酸水溶液或緩沖液溶液中氯金酸的優(yōu)選濃度為0.01-10％。
所述羥胺水溶液或緩沖液溶液中羥胺的優(yōu)選濃度為0.01-10mmol/L。
通過比較，考慮檢測的靈敏度、成本、所用時間等因素，用擴(kuò)增試劑處理微孔濾膜兩次為較好的選擇。
所述用擴(kuò)增試劑處理微孔濾膜的時間每次均大于0.5分鐘，優(yōu)選為1-30分鐘。
用微孔濾膜免疫金銀法得到微孔濾膜的步驟如下(1)將顆粒度小于50nm的金顆粒水溶液與濃度大于0.01g/mL，pH＝3～9的與待檢測的抗體、抗原或蛋白質(zhì)相對應(yīng)的抗原、抗體或受體緩沖溶液，按照金顆粒與待檢測的抗體、抗原或蛋白質(zhì)相對應(yīng)的抗原、抗體或受體摩爾比為1∶1～1000的比例，在20～60的條件下混合5分鐘以上，制備成納米金顆粒標(biāo)記的生物探針；(2)將待檢測的抗體、抗原或蛋白質(zhì)點(diǎn)加在微孔濾膜的表面，在30-90的條件下固定20分鐘以上；(3)用與納米金顆粒標(biāo)記的生物探針不發(fā)生作用的蛋白溶液，在20～60的條件下封閉20分鐘以上；(4)用納米金顆粒標(biāo)記的生物探針處理濾膜，在室溫下反應(yīng)20分鐘以上。
在操作過程中，作為氧化劑的氯金酸溶液與作為還原劑的羥胺溶液可以先后分別使用，也可以同時使用，為保證測試效果，一般應(yīng)采用過量的羥胺溶液。
使用本發(fā)明的方法，可以顯著提高抗體、抗原或蛋白質(zhì)的檢測靈敏度，只要生物分子的含量達(dá)到10pg/mL，即可準(zhǔn)確檢出。本發(fā)明的方法操作簡便、快捷、不需要特殊的儀器設(shè)備，可以廣泛用于臨床診斷、抗體、抗原的檢測、衛(wèi)生檢疫、環(huán)境檢測等領(lǐng)域，具有十分廣泛的應(yīng)用前景與開發(fā)價值。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
(2)將人IgG溶液2L點(diǎn)加在微孔濾膜的表面，在60℃的條件下固定60分鐘；(3)用3％牛血清白蛋白溶液(Tris-HCl緩沖液，pH7.4)，在55℃的條件下封閉60分鐘；(4)用第(1)步得到的納米金顆粒標(biāo)記的生物探針處理濾膜，在室溫下反應(yīng)，時間60分鐘；(5)用濃度為0.1％的氯金酸水溶液及0.01mmol/L的羥胺水溶液作為擴(kuò)增試劑，混合處理微孔濾膜二次，每次5分鐘，人IgG的最低檢出限為10pg/mL。
實(shí)施例2檢測伴刀豆球蛋白(1)將30nm的金顆粒水溶液5mL與濃度50g/mL的pH＝6.5的親和素(Tris-HCl緩沖液，pH7.4)溶液2mL混合15min，制備成納米金顆粒標(biāo)記的生物探針；(2)將生物素標(biāo)記的伴刀豆球蛋白溶液2L點(diǎn)加在微孔濾膜的表面，在60℃的條件下固定120分鐘；(3)用馬血清溶液(Tris-HCl緩沖液，pH7.0)，在30℃的條件下封閉60分鐘；(4)用納米金顆粒標(biāo)記的生物探針處理濾膜，在室溫下反應(yīng)，時間30分鐘；(5)用濃度5％的氯金酸緩沖液(Tris-HCl緩沖液，pH7.0)及3mmol/L的羥胺水溶液作為擴(kuò)增試劑，在步驟4的基礎(chǔ)上，分別處理微孔濾膜，各15分鐘，伴刀豆球蛋白的最低檢出限為15pg/mL。
實(shí)施例3(1)將5nm的金顆粒水溶液5mL與濃度300g/mL的pH＝8.2的兔抗羊IgG(Tris-HCl緩沖液，pH8.2)溶液1mL混合8min，制備成納米金顆粒標(biāo)記的生物探針；(2)將羊IgG溶液2L點(diǎn)加在微孔濾膜的表面，在80℃的條件下固定30分鐘；(3)用5％牛血清白蛋白溶液(Tris-HCl緩沖液，pH7.4)，在37℃的條件下封閉120分鐘；(4)用納米金顆粒標(biāo)記的生物探針處理濾膜，在室溫下反應(yīng)，時間120分鐘；(5)用濃度10％的氯金酸水溶液及10mmol/L的羥胺緩沖液(PBS緩沖液pH7.0)。作為擴(kuò)增試劑。在步驟4的基礎(chǔ)上，混合處理微孔濾膜二次，每次25分鐘，羊IgG的最低檢出限為12pg/mL。
權(quán)利要求
1.一種高靈敏檢測生物分子的方法，是用擴(kuò)增試劑至少一次處理用微孔濾膜免疫金銀法得到的微孔濾膜；所述擴(kuò)增試劑為濃度大于0.001％的氯金酸水溶液或緩沖液溶液及濃度大于0.01mmol/L的羥胺水溶液或緩沖液溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏檢測生物分子的方法，其特征在于所述氯金酸緩沖液溶液的緩沖液為Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液、或HEPS緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高靈敏檢測生物分子的方法，其特征在于所述氯金酸緩沖液溶液的pH＝3-9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏檢測生物分子的方法，其特征在于所述羥胺緩沖液溶液的緩沖液為Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液、或HEPS緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高靈敏檢測生物分子的方法，其特征在于所述羥胺緩沖液溶液的pH＝3-9。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏檢測生物分子的方法，其特征在于所述氯金酸水溶液或緩沖液溶液中氯金酸的濃度為0.01-10％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏檢測生物分子的方法，其特征在于所述羥胺水溶液或緩沖液溶液中羥胺的濃度為0.01-10mmol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的高靈敏檢測生物分子的方法，其特征在于用擴(kuò)增試劑處理微孔濾膜兩次。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的高靈敏檢測生物分子的方法，其特征在于所述用擴(kuò)增試劑處理微孔濾膜的時間每次均大于0.5分鐘，優(yōu)選為1-30分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的高靈敏檢測生物分子的方法，其特征在于所述用微孔濾膜免疫金銀法得到微孔濾膜的步驟如下(1)將顆粒度小于50nm的金顆粒水溶液與濃度大于0.01g/mL，pH＝3～9的與待檢測的抗體、抗原或蛋白質(zhì)相對應(yīng)的抗原、抗體或受體緩沖溶液，按照金顆粒與待檢測的抗體、抗原或蛋白質(zhì)相對應(yīng)的抗原、抗體或受體摩爾比為1∶1～1000的比例，在20～60的條件下混合5分鐘以上，制備成納米金顆粒標(biāo)記的生物探針；(2)將待檢測的抗體、抗原或蛋白質(zhì)點(diǎn)加在微孔濾膜的表面，在30-90的條件下固定20分鐘以上；(3)用與納米金顆粒標(biāo)記的生物探針不發(fā)生作用的蛋白溶液，在20～60的條件下封閉20分鐘以上；(4)用納米金顆粒標(biāo)記的生物探針處理濾膜，在室溫下反應(yīng)20分鐘以上。
全文摘要
本發(fā)明的名稱為一種高靈敏檢測生物分子的方法，涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是提供一種在微孔濾膜免疫金銀法的基礎(chǔ)上，利用納米金顆粒原位擴(kuò)增技術(shù)，高靈敏度檢測生物分子的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種高靈敏檢測生物分子的方法，是用擴(kuò)增試劑來處理用微孔濾膜免疫金銀法得到的微孔濾膜；所述擴(kuò)增試劑為濃度大于0.001％的氯金酸水溶液或緩沖液溶液及濃度大于0.01mmol/L的羥胺水溶液或緩沖液溶液。使用本發(fā)明的方法，可以顯著提高抗體、抗原或蛋白質(zhì)的檢測靈敏度，只要生物分子的含量達(dá)到10pg/mL，即可準(zhǔn)確檢出。本發(fā)明的方法操作簡便、快捷、不需要特殊的儀器設(shè)備，可以廣泛用于臨床診斷、抗體、抗原的檢測、衛(wèi)生檢疫、環(huán)境檢測等領(lǐng)域，具有十分廣泛的應(yīng)用前景與開發(fā)價值。
文檔編號G01N33/543GK1410773SQ0114141
公開日2003年4月16日 申請日期2001年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月24日
發(fā)明者馬占芳, 隋森芳 申請人:清華大學(xué)