專利名稱：一種抗體芯片、其制備技術(shù)及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及一種抗體芯片、其制備技術(shù)及其檢測(cè)方法。
疾病的診斷和治療均與組織細(xì)胞在不同生長(zhǎng)時(shí)期所產(chǎn)生的各種基因和蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化有著密切的聯(lián)系，只有當(dāng)這些分子變化具有普遍性時(shí)才具有臨床價(jià)值。然而目前的各種臨床檢驗(yàn)方法只能進(jìn)行單個(gè)的、散在的、偶然的、孤立的試驗(yàn)研究。若要對(duì)一個(gè)分子標(biāo)志進(jìn)行正確的評(píng)價(jià)則需要同時(shí)對(duì)數(shù)百例甚至數(shù)千例不同病人以及不同發(fā)展時(shí)期的、不同病理類型的、甚至包括對(duì)不同治療方法的各種體液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)才能得出正確的結(jié)論，該過(guò)程十分漫長(zhǎng)和復(fù)雜，且則需花費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種抗體芯片，其特殊之處在于在固相載體的點(diǎn)樣面積上至少點(diǎn)有一個(gè)抗體點(diǎn)陣，每一個(gè)抗體點(diǎn)陣的點(diǎn)樣數(shù)目從幾個(gè)到數(shù)千個(gè)不等，每一個(gè)抗體點(diǎn)一種抗體芯片，其特殊之處在于在固相載體的點(diǎn)樣面積上至少點(diǎn)有一個(gè)抗體點(diǎn)陣，每一個(gè)抗體點(diǎn)陣的點(diǎn)樣數(shù)目從幾個(gè)到數(shù)千個(gè)不等，每一個(gè)抗體點(diǎn)陣可以包含一種或一種以上的特異性抗體，可用于檢測(cè)各種體液中一種或兩種以上以上相關(guān)的抗原分子的含量或水平的變化。
上述固相載體的點(diǎn)樣面積上至少點(diǎn)有兩個(gè)以上的抗體點(diǎn)陣。
上述固相載體是25mm×75mm×1mm的載玻片、5mm～55mm×5mm～75mm的硝酸纖維膜或尼龍膜。其上點(diǎn)樣面積為3mm～30mm×3mm～50mm。
上述單個(gè)抗體點(diǎn)陣的數(shù)目為6個(gè)～5100個(gè)樣點(diǎn)。
用于點(diǎn)樣的抗體濃度為0.01μg/ml～1mg/ml，點(diǎn)樣直徑為0.01mm～1.5mm，相鄰點(diǎn)的點(diǎn)樣間距為0.01mm～2.0mm，每個(gè)點(diǎn)的點(diǎn)樣量為1nl～500nl，每一種抗體重復(fù)點(diǎn)樣3點(diǎn)到6點(diǎn)。
用于點(diǎn)樣的抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，可以是針對(duì)一種標(biāo)志物的抗體，也可以是針對(duì)多種標(biāo)志物的多種抗體，可以是針對(duì)一種疾病的多種抗體，也可以是針對(duì)多種疾病的多種抗體。
一種抗體芯片的制備方法，其特殊之處在于依序包括下述步驟，①、按照每種疾病標(biāo)志物在體液中的不同濃度所表達(dá)的特定的臨床信息，將標(biāo)志物相應(yīng)的抗體配制成合適的濃度，濃度范圍在0.01μg/ml～1mg/ml為宜；②、將已知的各種不同的抗體樣品按不同的臨床需要和科研需要進(jìn)行特定的設(shè)計(jì)、組合、排序，然后用機(jī)器人點(diǎn)樣系統(tǒng)將這些疾病標(biāo)志物點(diǎn)在一張固相載體上，每種已知的抗體均重復(fù)點(diǎn)3點(diǎn)～6點(diǎn)。制成點(diǎn)樣數(shù)目、點(diǎn)樣種類、點(diǎn)陣大小、點(diǎn)陣多少均不同的系列化的各種各樣的不同用途的抗體芯片。
制備抗體芯片所需要的材料有①各種抗原物質(zhì)包括各種惡性腫瘤、各種良性腫瘤、各種癌前病變、各種炎癥性疾病、各種自身免疫性疾病、各種其他疾病、各種正常組織、各種胚胎組織、各種血液和造血組織、各種胸水、腹水、尿液、痰液、滲出液中捕獲的具有重要研究?jī)r(jià)值的腫瘤標(biāo)志物、細(xì)胞因子、受體、酶、可溶性膜表面標(biāo)記物、各種核酸、基因(DNA和RNA)和基因片斷、各種蛋白質(zhì)、多肽、多糖、激素、各種微生物(包括細(xì)菌、病毒、真菌及其他微生物和寄生蟲)的各種抗原以及其他生物大分子或其他生物活性物質(zhì)等等。②針對(duì)上述各種抗原性物質(zhì)所制備的各種各樣的單克隆或多克隆抗體包括來(lái)源于鼠、兔、羊、牛、馬或其他動(dòng)物。③點(diǎn)樣系統(tǒng)包括點(diǎn)樣用儀器和設(shè)備及其相關(guān)耗材如點(diǎn)樣板等等。④固相載體包括特殊處理的載玻片、硝酸纖維膜、尼龍膜等等。⑤其他包括硝酸纖維膜、尼龍膜等的支撐材料以及抗體芯片的相關(guān)包裝材料等等。
一種抗體芯片的應(yīng)用方法，其特殊之處在于依序包括下述步驟，①在抗體芯片上加足量待測(cè)血清或其他體液，反應(yīng)后洗滌；②加抗體芯片上所排列的各種抗體的混合性抗體，反應(yīng)后洗滌；③加化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光物質(zhì)或金、銀或其他金屬或放射性同位素標(biāo)記的異種單克隆抗抗體，反應(yīng)后洗滌；④用普通光學(xué)顯微鏡或特殊的顯色捕獲分析系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)分析，也可直接用化學(xué)發(fā)光捕獲分析系統(tǒng)、熒光捕獲分析系統(tǒng)、金屬顯色灰度捕獲分析系統(tǒng)以及放射線捕獲分析系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)閱讀和分析。⑤根據(jù)光信號(hào)、金屬顯色灰度或放射線強(qiáng)度的不同和變化，來(lái)反映待測(cè)樣本中各種抗原性物質(zhì)的含量。
上述應(yīng)用方法的第①步中，抗體芯片上加足量待測(cè)血清或其他體液，若37℃反應(yīng)則需10分鐘～2小時(shí)，若4℃反應(yīng)則需保濕過(guò)夜，若室溫反應(yīng)則需保濕30分鐘～3小時(shí)后洗滌；第②步中加抗體芯片上所排列的各種抗體的混合性抗體，若4℃反應(yīng)則需保濕過(guò)夜，室溫反應(yīng)則需保濕30分鐘～3小時(shí)，若37℃反應(yīng)則需保濕10分鐘～2小時(shí)后洗滌；第③步加化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光物質(zhì)或金、銀或其他金屬或放射性同位素標(biāo)記的異種單克隆抗體，若4℃反應(yīng)則需保濕過(guò)夜，若室溫反應(yīng)則需保濕30分鐘～3小時(shí)，若37℃保濕10分鐘～2小時(shí)后洗滌。
也可在第②步中直接加與抗體芯片上所排列抗體的特異性完全相同的用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光物質(zhì)或金、銀或其他金屬或放射性同位素標(biāo)記的異種單克隆抗體，4℃保濕過(guò)夜或室溫保濕30分鐘～3小時(shí)或37℃保濕10分鐘～2小時(shí)后洗滌。即在第①步完成后，將第②步中加的抗體芯片上所排列的各種抗體的混合性抗體和第③步中所加的與抗體芯片上所排列抗體的特異性完全相同的、用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光物質(zhì)或金、銀或其他金屬或放射性同位素標(biāo)記的異種單克隆抗體一起加入，然后4℃保濕過(guò)夜或室溫保濕30分鐘～3小時(shí)或37℃保濕10分鐘～2小時(shí)后洗滌。將上述方案中第②步與第③步合為一步。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是為生物醫(yī)學(xué)研究目的提供了一種高容量，大樣本的可溶性生物活性物質(zhì)的檢測(cè)方法，可同時(shí)對(duì)大量特定的抗原性物質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定和相關(guān)性分析；也可用于大量基因組表達(dá)產(chǎn)物的分析、定性和定量研究?？赏瑫r(shí)檢測(cè)體液中多種相關(guān)的各種可溶性抗原的水平和含量，再通過(guò)其水平或含量的不同或變化來(lái)反映體內(nèi)某種疾病的有無(wú)、發(fā)展、變化、轉(zhuǎn)歸、預(yù)后、機(jī)體的免疫狀態(tài)、以及某種疾病與多種相關(guān)的可溶性抗原的相關(guān)關(guān)系等。
本發(fā)明中抗體芯片的抗體點(diǎn)陣的排列順序是預(yù)先設(shè)定的，并可進(jìn)行多種組合排列，每張抗體芯片上可放置一個(gè)或數(shù)十個(gè)抗體陣列，進(jìn)行多種不同的生物學(xué)分析，同時(shí)比較和分析數(shù)十個(gè)乃至數(shù)千個(gè)同一類型或不同類型的不同個(gè)體的相關(guān)分子的異同、變化及其相互關(guān)系和臨床意義；1)單一疾病抗體芯片(1)單一腫瘤性疾病抗體芯片①肺癌標(biāo)志物抗體芯片將針對(duì)所有肺癌標(biāo)志物相應(yīng)的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含有54個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中每3個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗MDR1-mRNA、mRP-mRNA、MDR1產(chǎn)物、P-gp、P53蛋白、nm23蛋白、CD44v6、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、細(xì)胞角蛋白19可溶性片段、組織多肽抗原、細(xì)胞角蛋白18可溶性片段M3抗原決定簇、癌胚抗原、表皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體、肌酸激酶同功酶、總唾液蛋白、降鈣素、ACTH抗體。
應(yīng)用時(shí)，首先在抗體芯片上加50μl待測(cè)血清，37℃反應(yīng)1小時(shí)，待反應(yīng)完全后用PBS洗滌2次，加入與抗體芯片上所排列的抗體特異性相同的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的鼠單克隆抗體50μl，37℃保濕1小時(shí)后使用PBS洗滌2次，用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行自動(dòng)分析，根據(jù)光信號(hào)的強(qiáng)弱計(jì)算出待測(cè)樣品中相關(guān)的各種抗原的含量，②肝癌標(biāo)志物抗體芯片將針對(duì)各種肝癌標(biāo)志物相應(yīng)的羊多克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含84個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗甲胎蛋白、γ-谷胺酰轉(zhuǎn)移酶、異常凝血酶原、α-L-巖澡糖苷酶、堿性磷酸酶、AKP、醛縮酶、β2-微球蛋白、5｀-核苷酸酶、丙酮酸激酶、胎盤型谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶、α1-抗胰蛋白酶、鐵蛋白抗體。
應(yīng)用時(shí)，加待測(cè)血清100μl，37℃保濕30分鐘后使用PBS洗滌2次，加與抗體芯片上所排列的抗體特異性相同的鼠單克隆抗體，37℃保濕30分鐘后使用PBS洗滌2次，加熒光物質(zhì)標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體100μl，37℃保濕30分鐘后使用PBS洗滌2次，用特殊的顯色捕獲分析系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)分析，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱計(jì)算出待測(cè)樣品中相關(guān)的各種抗原的含量。
③胃癌標(biāo)志物抗體芯片將不同胃癌標(biāo)志物相應(yīng)的鼠的單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含72個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中每6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗MUC2mRNA、胃蛋白酶原、延酸化Tn抗原、甘氨酰脯氨酰二肽氨基肽酶、巨分子肌酸激酶、胃泌素、組織多肽抗原、AFU、CEA、CA50、CA19-9、CA72-4抗體。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌或肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
④乳腺癌標(biāo)志物抗體芯片即將針對(duì)各種乳腺癌標(biāo)志物的相應(yīng)的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含108個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中每6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗CD15mRNA、P16蛋白、nm23H1mRNA、nm23-H1、MUC1、CerbB-2、組織蛋白酶D、bc1-2、表皮生長(zhǎng)因子、CA15-3、CEA、鐵蛋白、乳清蛋白、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、CD44蛋白、P53蛋白、CA549、HCG抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌或肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
⑤卵巢癌標(biāo)志物抗體芯片即將針對(duì)各種卵巢癌標(biāo)志物的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含48個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中每6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗CA125、CEA、卵巢囊腺癌抗原、卵巢癌抗原、NB/70K、HCG、SIEX、CA19-9抗體。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
⑥白血病標(biāo)志物抗體芯片即將針對(duì)各種白血病標(biāo)志物的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含48個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中每3個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗CD44，HLA-DR，CD37，CD19，CD20，CD5，CD52，CD45RA，CD22，CD24，CD45，CD23，CD21，CD71，CD11c和CD9的相應(yīng)抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(2)單一炎癥性疾病抗體芯片①潰瘍性結(jié)腸炎的特異性抗原的抗體芯片即將針對(duì)各種潰瘍性結(jié)腸炎的特異性抗原的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含54個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中每6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗HLA-DR2，Nd，Inos，PANCA，PAF，12-HETE，TGFβ，氧自由基，IL-1的相應(yīng)抗體。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
②克隆病性結(jié)腸炎的特異性抗原的抗體芯片即將針對(duì)各種克隆病性結(jié)腸炎的特異性抗原的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含42個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中每6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗HLA-DR1，PANCA，PAF，12-HETE，TGFβ，氧自由基，IL-1的相應(yīng)抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(3)單一自身免疫性疾病抗體芯片①類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異性抗原的抗體芯片即將針對(duì)各種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的特異性抗原的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含66個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗類風(fēng)濕因子、IL-12、TNF、粘附分子、熱休克蛋白、IL-4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-□、可溶性白細(xì)胞介素2受體(sIL-2R)、可溶性Fas(sFas)、血管細(xì)胞粘附分子1(vascular cell adhesionmolecules 1，VCAM-1)、可溶性E-選擇素的相應(yīng)抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
②銀屑病特異性抗原的抗體芯片即將針對(duì)各種銀屑病特異性抗原的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含27個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中每3個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗銀屑病蛋白、CD34、酪氨酸蛋白激酶(TPK)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、P物質(zhì)(substanceP，SP)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、神經(jīng)激肽、生長(zhǎng)抑素的相應(yīng)抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(4)單一其他疾病抗體芯片即將針對(duì)某種疾病各種特異性抗原的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。然后按照相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行判定。
2)多種疾病抗體芯片(1)多種腫瘤性疾病抗體芯片將針對(duì)各種腫瘤標(biāo)志物的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。再參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。
(2)多種炎癥性疾病標(biāo)志物抗體芯片即將針對(duì)各種相關(guān)炎癥性疾病標(biāo)志物的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。再參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。
(3)多種自身免疫性疾病相關(guān)標(biāo)志物的抗體芯片即將針對(duì)各種自身免疫性疾病相關(guān)標(biāo)志物的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。再參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。
4)多類型疾病抗體芯片即將針對(duì)各種不同類型疾病如乙型肝炎、肝硬化和肝癌等疾病的標(biāo)志物的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含90個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中每6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗AFP，AFU，LDL，VLDL，GGT，可溶性IL-6受體，可溶性gp130c-fos基因表達(dá)產(chǎn)物，CD54，血漿內(nèi)皮素-1，HA，LN，HPCIII、CIV，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
5)單一組織類型抗體芯片①腺癌標(biāo)志物抗體芯片即根據(jù)研究需要可將針對(duì)腺癌的各種標(biāo)志物的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含30個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中每6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗CK/AE1，CK10，CK18，CK8，CK19抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
②鱗癌標(biāo)志物抗體芯片即根據(jù)研究需要可將針對(duì)鱗癌各種標(biāo)志物的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含24個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中每6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗CK/AE3，CK10，CK13，CK14抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
6)多種組織類型抗體芯片，如腺癌和鱗癌標(biāo)志物抗體芯片，即將針對(duì)腺癌和鱗癌的所有標(biāo)志物的鼠單克隆抗體按照上述的腺癌標(biāo)志物抗體芯片和鱗癌標(biāo)志物抗體芯片的陣列組合排列在一張抗體芯片上。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
7)不同性質(zhì)抗原的抗體芯片(1)腫瘤胚胎性抗原抗體芯片即將針對(duì)各種腫瘤性疾病的所有胚胎性抗原的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含42個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗腫瘤胚胎型抗原甲胎蛋白抗體、β-癌胚抗原抗體、癌胚鐵蛋白抗體、癌胚抗原抗體、胰癌胚抗原抗體、鱗狀細(xì)胞抗原抗體、組織多肽抗原抗體。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(2)糖類抗原標(biāo)志物抗體芯片即將針對(duì)各種腫瘤性疾病的所有糖類抗原的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。其中又分為三種a.糖類高分子粘蛋白抗原腫瘤標(biāo)志物抗體芯片；b.血型類抗原腫瘤標(biāo)志物抗體芯片；c.混合糖類抗原標(biāo)志物抗體芯片。
①糖類高分子粘蛋白抗原腫瘤標(biāo)志物抗體芯片即將針對(duì)不同腫瘤的糖類高分子粘蛋白抗原標(biāo)志物相應(yīng)的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含42個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗CA125抗體、CA15-3抗體、CA549抗體、CA27.29抗體、類粘蛋白抗體、腫瘤相關(guān)抗原抗體、DU-PAN-2抗體。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
②血型類抗原腫瘤標(biāo)志物抗體芯片即將針對(duì)不同腫瘤的血型類抗原標(biāo)志物相應(yīng)的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含36個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗CA19-9抗體、CA19-5抗體、CA50抗體、CA72-4抗體、CA242抗體、鱗狀細(xì)胞抗原抗體。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
③混合糖類抗原標(biāo)志物抗體芯片即將針對(duì)不同腫瘤的糖類抗原標(biāo)志物相應(yīng)的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含78個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含的抗體為抗CA125抗體、CA15-3抗體、CA549抗體、CA27.29抗體、類粘蛋白抗體、腫瘤相關(guān)抗原抗體、DU-PAN-2抗體、CA19-9抗體、CA19-5抗體、CA50抗體、CA72-4抗體、CA242抗體、鱗狀細(xì)胞抗原抗體。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(3)酶類標(biāo)志物抗體芯片即將針對(duì)各種酶類標(biāo)志物相應(yīng)的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含72個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗醛縮酶抗體、堿性磷酸酶抗體、淀粉酶抗體、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗體、肌酸激酶抗體、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶抗體、乳酸脫氫酶抗體、神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體、5-核苷酸酶抗體、α-L巖澡糖苷酶抗體、核糖核酸酶抗體、前列腺特異性抗原抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(4)蛋白或多肽類激素抗體芯片即將針對(duì)各種蛋白或多肽類激素相應(yīng)的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含60個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗抗利尿激素抗體、降鈣素抗體、生長(zhǎng)激素抗體、人絨毛膜促性腺激素抗體、人胎盤催乳素抗體、甲狀旁腺素抗體、催乳素抗體、胰高糖素抗體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(5)其他蛋白質(zhì)類標(biāo)志物抗體芯片即將針對(duì)各種其他蛋白質(zhì)類標(biāo)志物相應(yīng)的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含42個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含的抗體為抗β2-微球蛋白抗體、C多肽抗體、鐵蛋白抗體、本周蛋白抗體、免疫球蛋白抗體、銅藍(lán)蛋白抗體、甲狀腺球蛋白抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
8)細(xì)胞因子抗體芯片(1)白細(xì)胞介素抗體芯片即將針對(duì)各種白細(xì)胞介素的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含120個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20等抗體。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(2)集落刺激因子抗體芯片即將針對(duì)各種集落刺激因子相應(yīng)的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含48個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗粒細(xì)胞集落刺激因子抗體、巨噬細(xì)胞集落刺激因子抗體、粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞擊落刺激因子抗體、多集落刺激因子抗體、紅細(xì)胞生成素抗體、干細(xì)胞因子抗體、白血病抑制因子抗體、LIF抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(3)干擾素、腫瘤壞死因子抗體芯片即將針對(duì)各種干擾素抗體、腫瘤壞死因子的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含30個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗IFN-□抗體、IFN-□抗體、IFN-□抗體、TNF-□抗體和TNF-□抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(4)淋巴因子抗體芯片即將針對(duì)各種淋巴因子的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含84個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子抗體，有抗IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13等以及抗TNF-□和IFN-□抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(5)各種細(xì)胞因子抗體組合芯片即將各種細(xì)胞因子相應(yīng)的鼠單克隆抗體按特定組合排列在一張抗體芯片上。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
9)可溶性細(xì)胞膜分子、受體抗體芯片(1)促有絲分裂原受體抗體芯片即將針對(duì)各種促有絲分裂原受體的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含30個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗刀豆素A、植物血凝素A和E、美洲商陸絲裂原、大豆凝集素(110)、大豆凝集素(120)等抗體。實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片以及技術(shù)方案中相關(guān)內(nèi)容。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(2)IgFc受體抗體芯片即將針對(duì)各種IgFc受體的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含36個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗Fe□RI抗體、Fe□RII抗體、Fe□RIII抗體、Fc□R抗體、Fc□RI抗體、Fc□RII抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(3)細(xì)胞因子受體抗體芯片即將針對(duì)各種細(xì)胞因子受體的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含72個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗IL-1R抗體、IL-2R抗體、IL-3R抗體、IL-4R抗體、IL-6R抗體、IL-7R抗體、IL-8R抗體、IL-9R抗體、IL-12R抗體、TNF-□R、G-CSFR和TGF-□r抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(4)B細(xì)胞膜表面受體抗體芯片即將針對(duì)各種B細(xì)胞膜表面受體的鼠單克隆抗體排列在一張抗體芯片上。如含90個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗mIgM抗體、mIgD抗體、mIgG抗體、mIgA抗體、mIgE抗體、CD10抗體、CD19抗體、CD20抗體、CD21抗體、CD23抗體、CD80抗體、PC抗體、補(bǔ)體受體抗體、EB病毒受體抗體、致有絲分裂原受體抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(5)各種細(xì)胞膜分子和受體的組合抗體芯片即將針對(duì)各種細(xì)胞膜分子和受體的鼠單克隆抗體按設(shè)計(jì)組合排列在一張抗體芯片上。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
10)各種病原微生物特異性抗原的抗體芯片(1)各種細(xì)菌特異性抗原的抗體芯片即將針對(duì)各種細(xì)細(xì)菌特異性抗原的鼠單克隆抗體按設(shè)計(jì)組合排列在一張抗體芯片上。如含138個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗內(nèi)毒素(LPS)、金黃色葡萄球菌腸毒素A和B、A群鏈球菌M蛋白、大腸桿菌耐熱性腸毒素II、大腸桿菌細(xì)胞致死腫脹毒素、腸凝聚性大腸桿菌毒素、細(xì)菌蛋白毒素、沙門氏菌腸毒素、白喉毒素、綠膿桿菌外毒素A、破傷風(fēng)毒素、魏氏梭菌腸毒素、敗血梭菌α-毒素、百日咳毒素、空腸彎曲菌細(xì)胞毒素、肉毒E型毒素、李斯特菌溶血素、幽門螺桿菌細(xì)胞毒素、Q熱立克次體內(nèi)毒素、肺炎衣原體內(nèi)毒素、串珠鐮刀毒素、腐馬素抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肝癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(2)各種病毒特異性抗原的抗體芯片將針對(duì)各種病毒特異性抗原的鼠單克隆抗體按設(shè)計(jì)組合排列在一張抗體芯片上。如含108個(gè)點(diǎn)的抗體芯片，其中6個(gè)點(diǎn)為同一種抗體，所含有的抗體為抗LCM病毒的GP蛋白I型和II型、LCM病毒的NP蛋白、HSV-2病毒的gB蛋白、腺病毒的BIA蛋白、流感病毒的HA蛋白和NP蛋白、HIV-1病毒的No蛋白、HIV-2病毒的P2蛋白、EB病毒的EBNA蛋白、HBV病毒的HBC蛋白、乙型肝炎的HBsAg、HBeAg、anti-HBsAg、anti-HBeAg、anti-HBcAg、豆病毒p73k外膜蛋白、核蛋白4a和4b抗體等。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
(3)各種病原微生物特異性抗原的抗體組合芯片將針對(duì)各種病原微生物特異性抗原的鼠單克隆抗體按需要設(shè)計(jì)，組合排列在一張抗體芯片上。具體實(shí)驗(yàn)方法可參照肺癌標(biāo)志物抗體芯片的相關(guān)內(nèi)容。
本發(fā)明的作用原理是高效價(jià)單克隆或多克隆的針對(duì)各種疾病標(biāo)志物的特異性抗體被固定于固相載體上，芯片上的所有抗體即可以是購(gòu)買的也可以是自己制備的，即可以是單克隆抗體也可以是多克隆抗體。按照每種抗原或抗體物質(zhì)在體液中的不同濃度所表達(dá)的特定的臨床信息，將相應(yīng)的特異性抗體配制成合適的濃度，然后將已知的各種不同的抗體或抗原樣品按不同的臨床需要和科研需要進(jìn)行特定的設(shè)計(jì)、組合、排列，然后用機(jī)器人點(diǎn)樣系統(tǒng)將這些抗體或抗原點(diǎn)在一張固相載體如玻片、硝酸纖維膜或尼龍膜上，制成點(diǎn)樣數(shù)目、點(diǎn)樣種類、點(diǎn)陣大小、點(diǎn)陣多少均不同的系列化的各種各樣的不同用途的抗體或抗原芯片。以捕獲待測(cè)標(biāo)本中的與其可起結(jié)合反應(yīng)的特異性抗原或抗體，再用各種化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)、金、銀或其他金屬、放射性同位素標(biāo)記的具有相同特異性的抗體進(jìn)行結(jié)合，也可以先用異種即不同種屬的特異性抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，再用各種化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)、金、銀或其他金屬、放射性同位素標(biāo)記的抗此種抗體的抗抗體進(jìn)行結(jié)合，然后用普通光學(xué)顯微鏡或特殊的顯色捕獲分析系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)分析，從而得出結(jié)論；也可直接用化學(xué)發(fā)光捕獲分析系統(tǒng)、熒光捕獲分析系統(tǒng)、金屬顯色灰度捕獲分析系統(tǒng)以及放射線捕獲分析系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)閱讀和分析并得出結(jié)論。
結(jié)果的判定可根據(jù)抗體相應(yīng)的特異性抗原含量的不同和變化，輔助判斷體內(nèi)特定疾病的有無(wú)，組織類型、病情的發(fā)展、變化、轉(zhuǎn)歸、預(yù)后、治療方式的選擇及治療效果的判定等。
權(quán)利要求
1.一種抗體芯片，其特征在于在固相載體的點(diǎn)樣面積上至少點(diǎn)有一個(gè)抗體點(diǎn)陣，每一個(gè)抗體點(diǎn)陣的點(diǎn)樣數(shù)目從幾個(gè)到數(shù)千個(gè)不等，每一個(gè)抗體點(diǎn)陣可以包含一種或兩種以上的特異性抗體，可用于檢測(cè)各種體液中一種或兩種以上以上相關(guān)的抗原分子的含量或水平的變化。
2.如權(quán)利要求1所述的一種抗體芯片，其特征在于所述固相載體的點(diǎn)樣面積上至少點(diǎn)有兩個(gè)以上的抗體點(diǎn)陣。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種抗體芯片，其特征在于所述固相載體是25mm×75mm×1mm的載玻片、5mm～55mm×5mm～75mm的硝酸纖維膜或尼龍膜。其上點(diǎn)樣面積為3mm～30mm×3mm～50mm。
4.如權(quán)利要求3所述的一種抗體芯片，其特征在于一個(gè)抗體點(diǎn)陣的數(shù)目為6個(gè)～5100個(gè)樣點(diǎn)。
5.如權(quán)利要求4所述的一種抗體芯片，其特征在于用于點(diǎn)樣的抗體濃度為0.01μg/ml～1mg/ml，點(diǎn)樣直徑為0.01mm～1.5mm，相鄰點(diǎn)的點(diǎn)樣間距為0.01mm～2.0mm，每個(gè)點(diǎn)的點(diǎn)樣量為1nl～500nl，每一種抗體重復(fù)點(diǎn)樣3點(diǎn)到6點(diǎn)。
6.如權(quán)利要求5所述的一種抗體芯片的制備方法，其特征在于用于點(diǎn)樣的抗體是單克隆抗體、多克隆抗體；一種標(biāo)志物的抗體、多種標(biāo)志物的多種抗體；一種疾病的多種抗體、多種疾病的多種抗體。
7.如權(quán)利要求1所述的一種抗體芯片的制備方法，其特征在于依序包括下述步驟，①、按照每種疾病標(biāo)志物在體液中的不同濃度所表達(dá)的特定的臨床信息，將標(biāo)志物相應(yīng)的抗體配制成合適的濃度，濃度范圍在0.01μg/ml～1mg/ml為宜；②、將已知的各種不同的抗體樣品按不同的臨床需要和科研需要進(jìn)行特定的設(shè)計(jì)、組合、排序，然后用機(jī)器人點(diǎn)樣系統(tǒng)將這些疾病標(biāo)志物點(diǎn)在一張固相載體上，每種已知的抗體均重復(fù)點(diǎn)3點(diǎn)～6點(diǎn)。制成點(diǎn)樣數(shù)目、點(diǎn)樣種類、點(diǎn)陣大小、點(diǎn)陣多少均不同的系列化的各種各樣的不同用途的抗體芯片。
8.如權(quán)利要求1所述的一種抗體芯片的應(yīng)用方法，其特征在于依序包括下述步驟，①在抗體芯片上加足量待測(cè)血清或其他體液，反應(yīng)后洗滌；②加抗體芯片上所排列的各種抗體的混合性抗體，反應(yīng)后洗滌；③加化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光物質(zhì)或金、銀或其他金屬或放射性同位素標(biāo)記的異種單克隆抗抗體，反應(yīng)后洗滌；④用普通光學(xué)顯微鏡或特殊的顯色捕獲分析系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)分析，也可直接用化學(xué)發(fā)光捕獲分析系統(tǒng)、熒光捕獲分析系統(tǒng)、金屬顯色灰度捕獲分析系統(tǒng)以及放射線捕獲分析系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)閱讀和分析。⑤根據(jù)光信號(hào)、金屬顯色灰度或放射線強(qiáng)度的不同和變化，來(lái)反映待測(cè)樣本中各種抗原性物質(zhì)的含量。
9.如權(quán)利要求8所述的一種抗體芯片的應(yīng)用方法，其特征在于第①步中，抗體芯片上加足量待測(cè)血清或其他體液，37℃反應(yīng)10分鐘～2小時(shí)或4℃反應(yīng)保濕過(guò)夜或室溫反應(yīng)保濕30分鐘～3小時(shí)后洗滌；第②步中加抗體芯片上所排列的各種抗體的混合性抗體，若4℃反應(yīng)保濕過(guò)夜或室溫反應(yīng)保濕30分鐘～3小時(shí)或37℃反應(yīng)保濕10分鐘～2小時(shí)后洗滌；第③步加化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光物質(zhì)或金、銀或其他金屬或放射性同位素標(biāo)記的異種單克隆抗體，4℃保濕過(guò)夜或室溫保濕30分鐘～3小時(shí)或37℃保濕10分鐘～2小時(shí)后洗滌。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,進(jìn)一步涉及一種用于檢測(cè)體液中各種分子含量的抗體芯片、抗體芯片的制作方法及其應(yīng)用。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不能同時(shí)提供、同時(shí)比較和分析數(shù)十個(gè)乃至數(shù)千個(gè)同一類型或不同類型的不同個(gè)體的相關(guān)分子的異同、變化及其相互關(guān)系的缺點(diǎn)。一種抗體芯片,其特征在于:在固相載體點(diǎn)樣面積上至少點(diǎn)有一個(gè)或兩個(gè)以上的抗體點(diǎn)陣,每一個(gè)抗體點(diǎn)陣的點(diǎn)樣數(shù)目是6個(gè)～5100個(gè)樣點(diǎn),每一個(gè)抗體點(diǎn)陣可以包含一種或兩種以上的特異性抗體,可用于檢測(cè)各種體液中一種或一種以上的相關(guān)的抗原分子的含量或水平的變化。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1374525SQ01145240
公開日2002年10月16日 申請(qǐng)日期2001年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月31日
發(fā)明者李軍, 步雪, 王偉華 申請(qǐng)人:陜西超英生物醫(yī)學(xué)研究開發(fā)有限公司