專利名稱：高密度生物芯片裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，涉及一種對基因、蛋白質(zhì)、藥物或受體、多糖或凝集素、組織或細(xì)胞進(jìn)行并行檢測、識別、鑒定的裝置，特別是一種高密度生物芯片裝置。
現(xiàn)有的生物芯片(Bio-chip)是指包被在固相載體上的高、中、低密度核酸(cDNA、mRNA、PNA)探針、蛋白質(zhì)(多肽、酶分子、抗原、抗體)、藥物或受體、細(xì)胞或組織的微點陣(Microarray)。是利用生物大分子間具有特異相互識別的能力而將他們有序的排列在固相載體基片(膜、玻璃片、硅片、瓷片等)上，與待檢樣品和相應(yīng)的標(biāo)記生物分子同時進(jìn)行特異性反應(yīng)或雜交，通過自動閱讀設(shè)備可獲得大量有用的生命科學(xué)信息。
基因芯片(Gene chip)，又稱DNA芯片，是一種高、中密度的寡聚核苷酸(cDNA、mRNA、PNA探針)微陣列。其制備方法有其一是采用光蝕刻和原位組合合成化學(xué)技術(shù)，將大量特定序列的核酸探針有序地固化在載體基片上；其二是將已純化好的核酸探針利用自動點樣設(shè)備點樣(噴印)于載體基片上；其三是利用光誘導(dǎo)技術(shù)使基因探針在光導(dǎo)纖維的一端生長；其四是采用分子印章方法多次壓印原位定點DNA合成于載體基片上；從而構(gòu)成儲存有大量生命信息點陣的基因芯片。
蛋白質(zhì)芯片(Protein chip)又稱肽芯片，是將蛋白質(zhì)(多肽、酶分子、抗原或抗體)固定到固相載體基片上，利用蛋白質(zhì)分子能特異性與配體分子(抗原或抗體、受體)相結(jié)合的原理，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記分子，用來大規(guī)模檢測抗原、抗體、受體或酶分子、多肽片段。其制作方法其一是將已純化好的蛋白質(zhì)分子通過不同的方式點樣(噴印)于固相載體上；其二是采用光導(dǎo)向多肽合成技術(shù)，將具有特定氨基酸序列的多肽鏈有序地固化在載體基片上。
在上述生物芯片的制作方法中，點樣法適用于低密度生物芯片的制作，具有操作簡易、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點，但點陣密度低(100-1000點陣/cm2)，點陣材料需預(yù)先合成和純化；噴印法適用于中密度生物芯片的制作，所用點陣材料可預(yù)先合成和純化，也可以原位噴印合成，點陣密度為5000-10000點陣/cm2，缺點是需要特殊的噴印設(shè)備，價格昂貴；光誘導(dǎo)原位合成法適用于高密度生物芯片的制作，點陣密度可達(dá)10-40萬/cm2，探針的空間尺度是10-20μm，但合成的探針分子長度有限且錯誤率高，重復(fù)性極差，隨著點陣密度的增加相鄰點陣常發(fā)生污染而產(chǎn)生串?dāng)_現(xiàn)象，且需要價格昂貴的光掩膜。總之上述生物芯片的制作方法還存在密度低或重復(fù)性差或工藝復(fù)雜、需要昂貴設(shè)備等不足，不利于常規(guī)應(yīng)用。
生物芯片常用的固相載體基片有有機和無機聚合物薄膜、玻璃片、硅片、瓷片等，該類載體基片通常經(jīng)過修飾處理，即用各種不同的活化試劑通過化學(xué)反應(yīng)在載體基片表面鍵合上各種各樣的活性基團，以便與點樣物共價結(jié)合，形成具有不同生物特異性的親和型載體基片，即生物芯片，用來固定和檢測各種不同的活性生物分子，如蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸、抗原、抗體、藥物和受體等；甚至在載體基片上構(gòu)建各種各樣的微結(jié)構(gòu)(微坑、微溝、微槽、微管、微泵等微型結(jié)構(gòu)或裝置)，以利于樣品的處理和試劑的分配。
毛細(xì)纖維或光纖作為生物芯片的載體具有結(jié)構(gòu)細(xì)微(外徑為5-20μm)、易于大批量處理和加工的優(yōu)點，可以在毛細(xì)纖維或光纖的三維立體結(jié)構(gòu)上固定大量的生物點陣(包括核苷酸探針、酶分子或多肽、抗原或抗體、藥物或受體、多糖或凝集素、細(xì)胞或組織等)，其點陣密度可達(dá)10-400萬/cm2。
本實用新型的任務(wù)是提供一種結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、點陣密度高和靈敏、準(zhǔn)確、無串?dāng)_現(xiàn)象且制備工藝簡單，成本低廉，可進(jìn)行大規(guī)模自動化生產(chǎn)的高密度生物芯片裝置。
本實用新型的任務(wù)是這樣實現(xiàn)的一種高密度生物芯片裝置，用于檢測待測樣品中的蛋白質(zhì)、互補DNA或RNA、抗原或抗體、藥物或受體、多糖或凝集素、組織或細(xì)胞的存在與否，主要由固化在毛細(xì)纖維載體單元上(或內(nèi))的生物點陣和親和型載體單元之間的微結(jié)構(gòu)、圖案、區(qū)域及沉積在微結(jié)構(gòu)、圖案、區(qū)域內(nèi)的相應(yīng)標(biāo)記物試劑和標(biāo)示毛細(xì)纖維組成，其特征在于生物點陣固化于毛細(xì)纖維載體單元上(或內(nèi))構(gòu)成親和型載體單元，通過編(紡)織技術(shù)使親和型載體單元和標(biāo)示毛細(xì)纖維縱橫交錯有序排列，呈二維或三維立體分布，親和型載體單元之間構(gòu)成微結(jié)構(gòu)、圖案和區(qū)域，在該微結(jié)構(gòu)、圖案、區(qū)域內(nèi)沉積有相應(yīng)的標(biāo)記物試劑，上述親和型載體單元、微結(jié)構(gòu)、圖案和區(qū)域、標(biāo)記物試劑和標(biāo)示毛細(xì)纖維相互組合共同構(gòu)成一層或多層親和型載體基片，剪切或重疊或卷曲或拼接該而成為本實用新型。其厚度為5μm-2mm，長為1cm-100m，寬為1cm-2m；本實用新型中生物點陣呈二維或三維立體分布，生物點陣的密度為10-400萬/cm2，其點陣大小為0.1-500μm；上述生物點陣和標(biāo)記物試劑在親和型載體基片上呈點狀或線形分布，在親和型載體基片上相同一面的小片段中和正反兩面相對應(yīng)的位點上的生物點陣和標(biāo)記物試劑是相同的。
本實用新型由于采用預(yù)先設(shè)有生物點陣的毛細(xì)纖維親和型載體單元為骨架編織加工或拼接后再編(紡)織加工而成和微結(jié)構(gòu)內(nèi)相關(guān)標(biāo)記物試劑的存在，只需向本實用新型上加入待測樣品和附加試劑包括其他相應(yīng)標(biāo)記物和洗滌液，待測樣品中如果含有相應(yīng)待測物質(zhì)，則待測樣品中的待測物質(zhì)就被特異性結(jié)合到本發(fā)明相應(yīng)生物點陣的位點上而不被洗滌出去，然后再特異性地結(jié)合相應(yīng)標(biāo)記物而被顯示，否則，待測樣品中無待測物質(zhì)，就不能結(jié)合相應(yīng)標(biāo)記物，該位點就不被顯示，顯示與否的結(jié)果通過判讀儀自動化判讀。本實用新型具有結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、點陣密度高和靈敏、準(zhǔn)確且無串?dāng)_現(xiàn)象的優(yōu)點，而且制備工藝簡單，成本低廉，可進(jìn)行大規(guī)模自動化生產(chǎn)。使用本實用新型可微量化、并行化快速進(jìn)行蛋白質(zhì)或多肽、抗原或抗體、互補DNA或RNA、藥物或受體、多糖或凝集素的檢測、識別和鑒定，適用于基因測序、疾病診斷、法醫(yī)鑒定、藥物篩選、基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)研究等眾多生命科學(xué)領(lǐng)域。
附

圖1為本實用新型中親和型載體單元的橫向拉長的剖面圖。
附圖2為本實用新型中親和型載體基片的縱橫向拉長的頂視圖。
以下結(jié)合附圖對本實用新型作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
附圖1中，1為毛細(xì)纖維載體單元、22為生物點陣、32為親和型載體單元。
附圖2中，2為親和型載體基片、3為標(biāo)示毛細(xì)纖維、4為圖案、5為區(qū)域、22為生物點陣、32為親和型載體單元、42為微結(jié)構(gòu)、52為標(biāo)記物試劑如附圖1、2所示，本實用新型為一種高密度生物芯片裝置，主要由固化在毛細(xì)纖維載體單元1上(或內(nèi))的生物點陣22和親和型載體單元32之間的微結(jié)構(gòu)42、圖案4、區(qū)域5及沉積在微結(jié)構(gòu)42、圖案4、區(qū)域5內(nèi)的相應(yīng)標(biāo)記物試劑52和標(biāo)示毛細(xì)纖維3組成，其特征在于生物點陣22固化于毛細(xì)纖維載體單元1上(或內(nèi))構(gòu)成親和型載體單元32，通過編(紡)織技術(shù)使親和型載體單元32和標(biāo)示毛細(xì)纖維3縱橫交錯有序排列，呈二維或三維立體分布，親和型載體單元32之間構(gòu)成微結(jié)構(gòu)42、圖案4和區(qū)域5，在該微結(jié)構(gòu)42、圖案4、區(qū)域5內(nèi)沉積有相應(yīng)的標(biāo)記物試劑52，上述親和型載體單元32、微結(jié)構(gòu)42、圖案4和區(qū)域5、標(biāo)記物試劑52和標(biāo)示毛細(xì)纖維3相互組合共同構(gòu)成一層或多層親和型載體基片2，剪切或重疊或卷曲或拼接該親和型載體基片2而成為本實用新型。其厚度為5μm-2mm，長為1cm-100m，寬為1cm-2m；本實用新型中生物點陣22呈二維或三維立體分布，生物點陣22的密度為10-400萬/cm2，其點陣大小為0.1-500μm；上述生物點陣22包括核苷酸探針、酶分子或多肽、抗原或抗體、藥物或受體、多糖或凝集素、組織或細(xì)胞中的任一種或任一組合；上述毛細(xì)纖維載體單元1或標(biāo)示毛細(xì)纖維3包括一根或一束有機或無機聚合物纖維、玻璃纖維、光纖、塑料光纖、金屬絲的絲、線、管；所述的微結(jié)構(gòu)42包括微坑、微溝、微槽、微管、微孔、微縫、微凹凸和微網(wǎng)格中的任一種或任一組合；所述的圖案4包括動植物、人物、建筑物、機械物、及各種字符等圖案中的任一種或任一組合；所述的區(qū)域5包括三角形、正方形、長方形、菱形、梯形、多邊形中的任一種或任一組合；上述生物點陣22和標(biāo)記物試劑52在親和型載體基片2上呈點狀或線形分布，在親和型載體基片2上相同一面的小片段中和正反兩面相對應(yīng)的位點上的生物點陣22和標(biāo)記物試劑52是相同的。
上述生物點陣22和標(biāo)記物試劑52多是已合成或純化好的并采用海藻糖進(jìn)行穩(wěn)定化處理。
本實用新型的制作方法主要包括a)將已合成或純化好的穩(wěn)定化的不同類型的生物大分子固化于已活化的一根或一束毛細(xì)纖維載體單元1上(或內(nèi))或?qū)⒁鸦罨玫囊桓蛞皇?xì)纖維載體單元1浸入或插入或吸入不同的穩(wěn)定化的生物大分子溶液中進(jìn)行原位合成或生長或結(jié)合以制作不同類型的一根或一束親和型載體單元32；b)將上述親和型載體單元32和標(biāo)示毛細(xì)纖維3編(紡)織加工成一層或多層親和型載體基片2或多層親和型載體基片2重疊或卷曲或拼接或加剪切工而成為本實用新型；或?qū)⑸鲜鲇H和型載體單元32拼接后再編(紡)織加工成一層或多層親和型載體基片2或多層親和型載體基片2重疊或卷曲或拼接或剪切加工而成為本實用新型；c)在親和型載體基片2上編(紡)織加工或重疊或卷曲或加工形成微結(jié)構(gòu)42、圖案4和區(qū)域5；d)在上述微結(jié)構(gòu)42、圖案4和區(qū)域5內(nèi)沉積相關(guān)的標(biāo)記物試劑52。
本實用新型中毛細(xì)纖維載體單元1的活化，是通過化學(xué)反應(yīng)用各種不同的活化試劑在毛細(xì)纖維載體單元1表面鍵合上各種各樣的活性基團，以便與生物點陣22共價結(jié)合，形成具有不同生物特異性的親和型載體單元32，用來固定和檢測各種不同的活性生物分子，如蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸、抗原、抗體、藥物或受體、組織或細(xì)胞等。不同材質(zhì)的毛細(xì)纖維載體單元1可以用不同的活化試劑把毛細(xì)纖維載體單元1表面活化，如表面為羧基的毛細(xì)纖維載體單元1，用1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)把表面變成活潑酯，然后再同生物點陣22中的各種不同的生物分子偶聯(lián)，如此采用類似公知共用的方法，可以分別把含有羥基、氨基、醛基、肼基、巰基等基團的毛細(xì)纖維載體單元1表面活化成不同的活性基團，然后再與生物點陣22中的各種不同的生物分子進(jìn)行不同的鍵和反應(yīng)，從而把生物點陣22中的各種不同的生物活性分子以共價結(jié)合的方式固定于毛細(xì)纖維載體單元1上，從而形成各種各樣的具有不同生物特異性的親和型載體單元32。
采用編(紡)織技術(shù)使相鄰或不相鄰親和型載體單元32之間就會形成各種各樣的微結(jié)構(gòu)42，包括微坑、微溝、微槽、微管、微孔、微縫、微凹凸和微網(wǎng)格，用于加入和容納待檢樣品或其他附加材料或試劑包括洗滌液，同時也為親和型載體單元32上的生物點陣22同待檢樣品中的待檢物和相應(yīng)標(biāo)記物試劑52發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)提供了必要的場所和空間，使它們在二維或三微立體空間內(nèi)發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，從而避免空間位阻現(xiàn)象的發(fā)生，同時也使各種生物大分子有更多的空間取向，避免了串?dāng)_現(xiàn)象的發(fā)生，相對也增加了生物點陣22的密度。
采用涂復(fù)、滲透、摻入等方法向上述微結(jié)構(gòu)42、圖案4和區(qū)域5內(nèi)沉積相關(guān)的標(biāo)記物試劑52，包括金屬標(biāo)記、酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、染料標(biāo)記中的任一種或任一組合，使待檢樣品中的待檢物與生物點陣22發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的同時特異性結(jié)合該標(biāo)記物試劑52，然后通過標(biāo)記物試劑52的顯色反應(yīng)來顯示待檢樣品中待檢物的存在與否。該標(biāo)記物試劑52是以物理吸附、氫鍵、范德華力等非共價鍵沉積在上述微結(jié)構(gòu)42、圖案4和區(qū)域5內(nèi)的，容易被洗滌液洗滌除去，從而避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。
操作時，取1-2ml的待檢樣品加入本發(fā)明的微結(jié)構(gòu)42中或?qū)⒈景l(fā)明侵入待檢樣品中。本發(fā)明由于在親和型載體基片2上同時含有生物點陣22和標(biāo)記物試劑52，加入待檢樣品后，37℃待反應(yīng)30-60分鐘，標(biāo)記物試劑52和生物點陣22中的生物大分子與待檢樣品中的待檢物組分發(fā)生特異性的生化或免疫或互補或偶合反應(yīng)，然后取洗滌液洗滌該高密度生物芯片，共洗三遍，洗滌掉未發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)，或隨后加入顯色劑，待反應(yīng)，通過標(biāo)記物試劑52的顯色反應(yīng)判讀結(jié)果，或用洗滌液洗滌后在激光掃描儀或共聚焦激光掃描顯微鏡或CCD芯片掃描儀上判讀結(jié)果，斑點顯色為陽性，斑點無色為陰性。如果待檢樣品中有相應(yīng)的待檢物組分，就能特異性結(jié)合標(biāo)記物試劑52而發(fā)生顯色反應(yīng)，結(jié)果為陽性；如果待檢樣品中沒有相應(yīng)的待檢物組分，就不能特異性結(jié)合標(biāo)記物試劑52，標(biāo)記物試劑52被洗滌除去，就不能發(fā)生顯色反應(yīng)，結(jié)果為陰性。
本實用新型中的基因芯片裝置為本實用新型的一種特殊形式，其主要區(qū)別為標(biāo)記物試劑52即為待測樣品中DNA的標(biāo)記物，可以是金屬標(biāo)記、酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、染料標(biāo)記或放射性標(biāo)記等標(biāo)記物。向上述親和型載體基片2上的微結(jié)構(gòu)42內(nèi)沉積待測樣品DNA標(biāo)記物的過程就是加待測樣品的過程，之后待測樣品DNA標(biāo)記物與親和型載體基片2上的生物點陣22包括DNA探針、cDNA探針、PNA探針和mRNA探針相互作用，用于顯示被生物點陣22捕獲的待檢樣品中的互補DNA或RNA的存在與否。其具體操作是加入或沉積待檢樣品DNA標(biāo)記物后，37℃待反應(yīng)30-60分鐘，待檢樣品DNA標(biāo)記物與親和型載體基片2上生物點陣22包括DNA探針、cDNA探針、PNA探針和mRNA發(fā)生互補作用，然后取洗滌液洗滌本發(fā)明，共洗三遍，洗滌掉未發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)，或隨后加入顯色劑待反應(yīng)，通過DNA標(biāo)記物的顯色反應(yīng)判讀結(jié)果，或用洗滌液洗滌后直接在激光掃描儀或共聚焦激光掃描顯微鏡或CCD芯片掃描儀上判讀結(jié)果，斑點顯色為陽性，斑點無色為陰性。如果待檢樣品中有互補DNA或RNA的存在，就能特異性結(jié)合在親和型載體基片2上而不能被洗滌除去，繼而發(fā)生顯色反應(yīng)，結(jié)果為陽性；如果待檢樣品中無互補DNA或RNA的存在，就不能特異性結(jié)合在親和型載體基片2上而被洗滌除去，就不能發(fā)生顯色反應(yīng)，結(jié)果為陰性。
權(quán)利要求1.一種高密度生物芯片裝置，主要由固化在毛細(xì)纖維載體單元(1)上(或內(nèi))的生物點陣(22)和親和型載體單元(32)之間的微結(jié)構(gòu)(42)、圖案(4)、區(qū)域(5)及沉積在微結(jié)構(gòu)(42)、圖案(4)、區(qū)域(5)內(nèi)的相應(yīng)標(biāo)記物試劑(52)和標(biāo)示毛細(xì)纖維(3)組成，其特征在于生物點陣(22)固化于毛細(xì)纖維載體單元(1)上(或內(nèi))構(gòu)成親和型載體單元(32)，通過編(紡)織技術(shù)使親和型載體單元(32)和標(biāo)示毛細(xì)纖維(3)縱橫交錯有序排列，呈二維或三維立體分布，親和型載體單元(32)之間構(gòu)成微結(jié)構(gòu)(42)、圖案(4)和區(qū)域(5)，在該微結(jié)構(gòu)(42)、圖案(4)、區(qū)域(5)內(nèi)沉積有相應(yīng)的標(biāo)記物試劑(52)，上述親和型載體單元(32)、微結(jié)構(gòu)(42)、圖案(4)和區(qū)域(5)、標(biāo)記物試劑(52)和標(biāo)示毛細(xì)纖維(3)相互組合共同構(gòu)成親和型載體基片(2)。其厚度為5μm-2mm，長為1cm-100m，寬為1cm-2m；本發(fā)明中生物點陣(22)呈二維或三維立體分布，生物點陣(22)的密度為10-400萬/cm2，其點陣大小為0.1-500μm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度生物芯片裝置，其特征在于上述親和型載體單元(32)上生物點陣(22)中的各種不同的生物活性分子以共價結(jié)合的方式固化于毛細(xì)纖維載體單元1上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度生物芯片裝置，其特征在于上述微結(jié)構(gòu)(42)為微坑、微溝、微槽、微管、微孔、微縫、微凹凸和微網(wǎng)格中的任一種或任一組合。上述圖案(4)為動、植物、人物、建筑物、機械物及各種字符圖案中的任一種或任一組合；上述區(qū)域(5)為三角形、正方形、長方形、菱形、梯形及多邊形中的任一種或任一組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的高密度生物芯片裝置，其特征在于上述標(biāo)記物試劑(52)是以物理吸附、氫鍵、范德華力或其他非共價鍵的形式沉積在上述微結(jié)構(gòu)(42)、圖案(4)和區(qū)域(5)內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度生物芯片裝置，其特征在于上述毛細(xì)纖維載體單元(1)和標(biāo)示毛細(xì)纖維(3)為一根或一束有機或無機聚合物纖維、玻璃纖維、光纖、塑料光纖、金屬絲的絲、線、管中的任一種或任一組合，其外徑為5μm-2mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的高密度生物芯片裝置，其特征在于上述的標(biāo)示毛細(xì)纖維(3)上涂有有色染料或發(fā)光物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高密度生物芯片裝置，其特征在于上述親和型載體單元(32)包括用一根或一束含有多種生物點陣(22)的親和型載體單元(32)拼接而成的任一種或任一組合，其拼接后的外徑為5μm-2mm，長為1cm-100m。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度生物芯片裝置，其特征在于上述生物點陣(22)和標(biāo)記物試劑(52)在親和型載體基片(2)上呈點狀或線形分布。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的高密度生物芯片裝置，其特征在于在親和型載體基片(2)上相同一面的小片段中和正反兩面相對應(yīng)的位點上的生物點陣(22)和標(biāo)記物試劑(52)是相同的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或8或9所述的高密度生物芯片裝置，其特征在于親和型載體基片(2)是一層或多層親和型載體基片(2)經(jīng)過剪切或重疊或卷曲或拼接后的任一種或任一組合。
專利摘要本實用新型涉及一種高密度生物芯片裝置，用于檢測待檢樣品中的抗原或抗體、藥物或受體、組織或細(xì)胞、互補DNA或RNA的存在與否，主要由固化在毛細(xì)纖維載體單元上的生物點陣及親和型載體單元之間的微結(jié)構(gòu)、圖案、區(qū)域內(nèi)沉積的標(biāo)記物試劑和標(biāo)示毛細(xì)纖維組成，其特點是以預(yù)先設(shè)有生物點陣的親和型載體單元為骨架編(紡)織加工或拼接后再編(紡)織加工而形成的親和型載體基片，具有結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、點陣密度高和靈敏、準(zhǔn)確、無串?dāng)_現(xiàn)象的優(yōu)點，其制備工藝簡單，成本低廉，可進(jìn)行大規(guī)模自動化生產(chǎn)。
文檔編號G01N33/68GK2551653SQ0122786
公開日2003年5月21日 申請日期2001年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月20日
發(fā)明者郭占軍, 趙華, 郭愛芹 申請人:郭占軍