專利名稱：用于轉基因及定向誘變篩選的系統、方法和裝置的制作方法
相關申請的交叉參考
根據U.S.C.§119(e)，本申請要求2000年9月6日申請的美國臨時申請60/230,371的優(yōu)先權。該申請全文引入本文作參考。發(fā)明背景發(fā)明領域
本發(fā)明涉及用于轉基因及定向誘變篩選地系統。另外，本發(fā)明涉及檢測和篩選來自組織樣品的指定遺傳序列或其部分的各種方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于轉基因及定向誘變篩選的高容積裝置。相關現有技術的描述
得自生物體DNA的突變的基因組修飾可被轉移至子代，如果這類突變存在于該生物體的配子中，這稱為種系突變。這些突變可使用重組DNA技術得自基因的遺傳操作，或者可通過用化學或物理手段攻擊DNA而引入。通過重組DNA技術引入的DNA可衍生自許多來源，包括但不限于來自病毒、支原體、細菌、真菌、酵母和脊索動物門包括哺乳動物如人。重組DNA技術使得可以導入、刪除或置換生物體的DNA。將DNA隨機導入細胞可通過諸如轉染(包括電穿孔、脂轉染)、注射(原核注射、核移植)或轉導(病毒感染)等技術實現。隨機突變(點突變、缺失、擴增)可通過用化學誘變原處理細胞或將細胞進行物理處理如X-輻射或線性能量轉移輻射(LET)而產生。在生物體內定向添加、缺失或置換DNA(誘導的或非誘導的)可通過同源重組實現。誘導系統采用序列特異性重組酶如Cre-LoxP(美國專利號5,654,182和5,677,177)和FLP/FRT酶如Cre-LoxP(美國專利號5,654,1 82和5,677,177)和FLP/FRT(美國專利號5,527,695)(引入本文作參考)。
轉基因生物體是攜帶衍生自另一物種的穩(wěn)定整合入它們的基因組的DNA序列(基因或基因片段)的生物體。轉基因哺乳動物一般通過將DNA微注射進受精卵的原核而產生，這項技術中DNA的拷貝數及DNA整合入宿主基因組的位點是不可控的。轉基因品系是指將外來DNA序列傳遞至其子代的生物體。
定向突變、定位誘變或基因定向所描述的是這樣的方法，其采用DNA的同源重組改變宿主基因組內的特異DNA序列。這可導致一基因的失活(剔除突變)，或該基因的遺傳改變(敲入(knock-in)突變)。在哺乳動物中這可通過將一克隆的突變基因片段(定向構建體)轉染進胚胎干細胞(ES細胞)，之后經同源重組置換ES細胞中的內源基因片段而實現。衍生自這些ES細胞的動物將在其基因組中攜帶所述的定向突變。這一技術的進一步的改進包括誘導型基因改變，其中一含有位點特異性重組酶(Cre，FLP)的識別序列(LoxP或FRT序列)的DNA片段定向到該內源基因。重組酶在該定向的ES細胞或ES細胞衍生的動物中的表達將導致以該識別位點為側翼的DNA片段的缺失。根據定向構建體的構造，可導致定向基因的失活、活化或改變。動物中的誘導型系統的優(yōu)點是根據特異激活重組酶的活性，基因改變可在任何時間點或任何組織中導入。這可通過將重組酶置于誘導型啟動子(化學或激素誘導型啟動子)的控制下而實現。
轉基因及定向誘變篩選用于確定一基因組是否具有內源存在的或已被修飾、突變或基因工程化的特異基因序列。篩選基因組DNA是否具有這些修飾或突變?；蚪MDNA由于其大小足以固定在基質上?；蚪MDNA包括編碼和非編碼區(qū)，因此，基因組DNA含有外顯子和內含子、啟動子和基因調控區(qū)、端粒、復制源點和非功能性基因間DNA?；蚪MDNA是甲基化雙鏈分子。固定化cDNA與基因間DNA?；蚪MDNA是甲基化雙鏈分子。固定化cDNA與PCR擴增子的不同在于分子小得多。另外，生物化學修飾事件如甲基化在小分子中不發(fā)生。Shena，M.(2000)DNA微陣列一種實用途徑，牛津大學出版社，紐約(引入本文作參考)。
轉基因篩選目前是手工操作。目前的手工系統耗時，且由于實驗室甚至實驗室人員的技術不同而可能產生不同的結果。目前，使用southern印跡技術的研究人員需要超過一周的時間篩選組織樣品中的轉基因或定向突變。在一替代技術中，可在一Eppendorfmicrotube_(Brinkmann Instruments，Westbery，NY)中進行多達30個PCR(聚合酶鏈反應)，并在一凝膠上分離。這一方法在大多數實驗室中需要3-7天。產業(yè)上需要提供用于更精確、更快和高容積轉基因及定向誘變篩選的系統和方法。
發(fā)明簡述
本發(fā)明提供了對上述問題的獨特的解決方案，即提供了用于自動化轉基因及定向誘變測試的方法和系統。
本發(fā)明的目的在于提供對轉基因及定向誘變樣品中的指定遺傳序列進行的比現有技術方法更高容積的篩選。本發(fā)明的另一目的在于將篩選結果比現有技術更快地提供給研究人員以篩選轉基因及定向突變樣品。這些目的通過本發(fā)明的幾種特征而實現。這些特征包括將原核或真核基因組DNA沉積在基質上并用微陣列成象儀檢測基因組DNA以促進高容積篩選。另外，一提供遠端用戶選擇參數以進行樣品的篩選并提供相關試劑的命令程序以協同方式促進轉基因及定向誘變樣品中指定遺傳序列的高容積篩選。除了這一特征之外，已發(fā)現用磁粒篩選來自細胞裂解物的基因組DNA并用配制成在樣品從遠端用戶傳遞至篩選實驗室期間起作用的裂解緩沖液裂解組織樣品可促進高容積篩選。應注意本說明書中教導的能實現更高容積篩選基因組DNA的指定遺傳序列的技術可被本領域技術人員更廣泛地用于各種檢測基因組DNA樣品中的基因序列的方法中。用于各種檢測基因組DNA樣品中的基因序列的方法中。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了檢測基因組DNA樣品中指定遺傳序列的方法。這一方法包括將基因組DNA沉積在基質上；加入特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針；檢測來自特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針的信號，以檢測基因組DNA樣品中的指定遺傳序列。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了通過將樣品與指定的基因組DNA對照樣品進行比較而檢測基因組DNA樣品中的指定遺傳序列的方法。該方法包括如下步驟將來自樣品的基因組DNA沉積在基質上的第一個位置；將來自指定的對照樣品的基因組DNA沉積在基質上的第二個位置；將特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針加入到基質上的第一個和第二個位置上；檢測來自基質上的第一個位置和第二個位置的特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針的信號，并比較來自基質上的第一個位置和第二個位置的信號，以檢測基因組DNA樣品中的指定遺傳序列。
在本發(fā)明的另一方面中，提供了檢測組織樣品中的指定遺傳序列的方法，其通過將該樣品與指定的對照組織樣品進行比較而進行。該方法包括如下步驟用足夠量的裂解緩沖液處理組織樣品和指定的對照組織樣品，以獲得包括基因組DNA的細胞碎片；從細胞碎片分離組織樣品和指定的對照組織樣品的基因組DNA；將來自樣品的基因組DNA沉積在一基質上的第一個位置；將來自指定的對照樣品的基因組DNA沉積在該基質上的第二個位置；將特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針加入到基質上的第一個和第二個位置上；檢測來自基質上的第一個位置和第二個位置的特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針的信號，并比較來自基質上的第一個位置和第二個位置的信號，以檢測組織樣品中的指定遺傳序列。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了檢測組織樣品中的指定遺傳序列的方法，其通過將該樣品與指定的對照組織樣品進行比較而進行。該方法包括如下步驟用足夠量的裂解緩沖液處理組織樣品和指定的對照組織樣品，以獲得包括基因組DNA的細胞碎片；使用磁粒從細胞碎片分離組織樣品和指定的對照組織樣品的基因組DNA；將來自樣品的基因組DNA沉積在一基質上的第一個位置；將來自指定的對照樣品的基因組DNA沉積在該基質上的第二個位置；將特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針加入到基質上的第一個和第二個位置上；檢測來自基質上的第一個位置和第二個位置的特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針的信號，并比較來自基質上的第一個位置和第二個位置的信號，以檢測組織樣品中的指定遺傳序列。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了檢測組織樣品中的指定遺傳序列的方法，其通過將該樣品與指定的對照組織樣品進行比較而進行。該方法包括如下步驟用足夠量的裂解緩沖液處理組織樣品和指定的對照組織樣品，以獲得包括基因組DNA的細胞碎片；用磁粒從細胞碎片分離組織樣品和指定的對照組織樣品的基因組DNA；調整基因組DNA濃度以促進指定遺傳序列的檢測；將來自樣品的基因組DNA沉積在一基質上的第一個位置；將來自指定的對照樣品的基因組DNA沉積在該基質上的第二個位置；將特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針加入到基質上的第一個和第二個位置上；檢測來自基質上的第一個位置和第二個位置的特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針的信號，并比較來自基質上的第一個位置和第二個位置的信號，以檢測組織樣品中的指定遺傳序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了篩選樣品中的指定遺傳序列的方法，其通過將該樣品與指定的對照組織樣品進行比較而進行，所述篩選方法利用至少一個標記的靶結合探針和至少一個標記的參照結合探針。該方法包括如下步驟用足夠量的裂解緩沖液處理所述組織樣品和指定的對照組織樣品，以獲得包括基因組DNA的細胞碎片；用磁粒從細胞碎片分離組織樣品和指定的對照組織樣品的基因組DNA；將來自樣品的基因組DNA沉積在一基質上的第一個位置；將來自指定的對照樣品的基因組DNA沉積在該基質上的第二個位置；將特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針加入到基質上的第一個和第二個位置上；將至少一個標記的參照結合探針加入到基質上的第一個和第二個位置上；檢測來自基質上的第一個位置和第二個位置的特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針的信號，檢測來自基質上的第一個和第二個位置上的至少一個標記的參照結合探針的信號；并比較來自基質上的第一個位置和第二個位置的信號，以篩選樣品中的指定遺傳序列。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了篩選基因組DNA中的指定遺傳序列的方法，其中包括基因組DNA的組織樣品由一遠端用戶送至一篩選實驗室。該方法包括如下步驟通過給遠端用戶提供裂解緩沖液以促進從組織樣品中提取基因組DNA；將組織樣品從遠端用戶傳遞給篩選實驗室；在篩選實驗室接受來自遠端用戶的裂解的組織樣品；用磁粒從裂解的組織樣品分離基因組DNA；將來自樣品的基因組DNA沉積在一基質上的第一個位置；將來自指定的對照樣品的基因組DNA沉積在該基質上的第二個位置；將特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針加入到基質上的第一個和第二個位置上；將至少一個標記的參照結合探針加入到基質上的第一個和第二個位置上；檢測來自基質上的第一個位置和第二個位置的特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針的信號，檢測來自基質上的第一個和第二個位置上的至少一個標記的參照結合探針的信號；并比較來自基質上的第一個位置和第二個位置的信號，以篩選樣品中的指定遺傳序列。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了通過將樣品與指定的對照組織樣品進行比較而篩選組織樣品中的指定遺傳序列的方法，其中包括基因組DNA的組織樣品由一遠端用戶送至一篩選實驗室。該方法包括如下步驟通過給遠端用戶提供裂解緩沖液以促進從組織樣品中提取基因組DNA；用足夠量的裂解緩沖液處理所述組織樣品和指定的對照組織樣品，以獲得包括基因組DNA的細胞碎片；將在裂解緩沖液中的組織樣品從遠端用戶傳遞給篩選實驗室；在篩選實驗室接受來自遠端用戶的裂解的組織樣品；用磁粒從細胞碎片分離組織樣品和指定的對照組織樣品的基因組DNA；將來自樣品的基因組DNA沉積在一基質上的第一個位置；將來自指定的對照樣品的基因組DNA沉積在該基質上的第二個位置；將特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針加入到基質上的第一個和第二個位置上；檢測來自基質上的第一個位置和第二個位置的特異于指定遺傳序列的一部分的至少一個標記探針的信號，并比較來自基質上的第一個位置和第二個位置的信號，以篩選組織樣品中的指定遺傳序列。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了篩選由遠端用戶送至篩選實驗室的至少一個樣品的基因組DNA中的指定基因組DNA序列的方法，該遠端用戶通過電子通訊鏈接將篩選參數提供給篩選實驗室和供應商。該方法包括如下步驟通過電子通訊鏈接將一訪問請求從遠端用戶發(fā)送給篩選實驗室；通過電子通訊鏈接將允許訪問應答從篩選實驗室發(fā)送給遠端用戶，允許訪問應答包括篩選參數；由遠端用戶選擇篩選參數；經電子通訊鏈接將選定的篩選參數選擇從遠端用戶發(fā)送給篩選實驗室；由篩選實驗室經所述通訊鏈接從遠端用戶接受篩選參數選擇；經電子通訊鏈接將一請求從遠端用戶發(fā)送給供應商以獲得符合選定的篩選參數的探針；由所述實驗室接受探針；將樣品從遠端用戶傳送給篩選實驗室；根據選定的篩選參數進行樣品篩選以獲得數據；將數據經電子通訊鏈接發(fā)送給遠端用戶。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了篩選由遠端用戶送至篩選實驗室的至少一個樣品的基因組DNA中的指定基因組DNA序列的方法，該遠端用戶通過電子通訊鏈接將篩選參數提供給篩選實驗室。該方法包括如下步驟通過電子通訊鏈接將一訪問請求從遠端用戶發(fā)送給篩選實驗室；通過電子通訊鏈接將允許訪問應答從篩選實驗室發(fā)送給遠端用戶，允許訪問應答包括篩選參數；由遠端用戶選擇篩選參數；經電子通訊鏈接將選定的篩選參數選擇從遠端用戶發(fā)送給篩選實驗室；由篩選實驗室經通訊鏈接接收來自遠端用戶的篩選參數選擇；經一電子通訊鏈接將一請求從篩選實驗室發(fā)送給一供應商以獲得符合選定的篩選參數的探針；由篩選實驗室接收探針；將樣品從遠端用戶傳送給篩選實驗室，根據選定的篩選參數進行樣品的篩選以獲得數據；經一電子通訊鏈接將數據發(fā)送給遠端用戶。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了篩選由遠端用戶送至篩選實驗室的至少一個樣品的基因組DNA中的指定基因組DNA序列的方法，該遠端用戶通過電子通訊鏈接將篩選參數提供給篩選實驗室。該方法包括如下步驟將一訪問請求從遠端用戶發(fā)送給篩選實驗室；通過電子通訊鏈接將允許訪問應答從篩選實驗室發(fā)送給遠端用戶，允許訪問應答包括篩選參數；由遠端用戶選擇篩選參數；經電子通訊鏈接將選定的篩選參數選擇從遠端用戶發(fā)送給篩選實驗室；由篩選實驗室經所述通訊鏈接從遠端用戶接受篩選參數選擇；經電子通訊鏈接將一請求從篩選實驗室發(fā)送給供應商以獲得符合選定的篩選參數的探針；由篩選實驗室接受探針，將在裂解緩沖液中的組織樣品從遠端用戶傳送給篩選實驗室，該裂解緩沖液配制用于在從遠端用戶至篩選實驗室轉運期間裂解樣品中的組織；根據選定的篩選參數進行樣品篩選以獲得數據；將數據經電子通訊鏈接發(fā)送給遠端用戶。
根據本發(fā)明另一方面，提供了用于高容積篩選和定向誘變篩選由遠端用戶送至篩選實驗室的組織樣品的自動化裝置。該裝置包括用于經電子通訊鏈接將一訪問請求從遠端用戶發(fā)送至篩選實驗室的裝置；用于經電子通訊鏈接將允許訪問應答及篩選參數從篩選實驗室發(fā)送至遠端用戶的裝置；用于將篩選參數選擇從遠端用戶發(fā)送至篩選實驗室的裝置；用于將樣品從遠端用戶傳送至篩選實驗室的裝置；用于分離樣品的基因組DNA的裝置；用于將基因組DNA沉積在基質上的裝置；用于篩選基因組DNA的裝置；和用于傳遞數據至遠端用戶的裝置。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了用于根據遠端用戶選擇的篩選參數篩選組織樣品中修飾的或突變的基因組DNA的高容積裝置。該裝置包括一自動化進入工作站，用于將液體從第一個微孔板轉移至第二個微孔板；一個分離工作站，用于在第二個微孔板中分離基因組DNA；一個光學標準化工作站，用于調整第二個微孔板中的DNA濃度；一個陣列工作站，用于將來自第二個測試微孔板的基因組DNA沉積在一基質上；一個雜交工作站，用于雜交與基因組DNA的部分結合的標記探針；一個檢測工作站，用于檢測結合的標記探針；用于由遠端用戶選擇篩選參數的裝置，該遠端用戶提供一電子通訊鏈接與所述裝置通訊；用于經一電子通訊鏈接將篩選結果告知遠端用戶的裝置。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了篩選樣品的基因組DNA中的指定基因組DNA序列的系統。所述系統包括一臺計算機，其具有處理器、存儲器和網絡瀏覽器，其中該計算機適于接收來自遠端用戶的篩選參數選擇；一個工作站，其用篩選參數選擇分析基因組DNA樣品，該工作站包括一微陣列成象儀。附圖簡述
由以下優(yōu)選實施方案的描述結合附圖將更完整地理解本發(fā)明及其優(yōu)點，其中


圖1是本發(fā)明的遠程自動測試程序的示意圖。
圖2是系統的一個實施方案的框圖。
圖3是指令程序的框圖。
圖4是帳號登記的框圖。
圖5是工作調查的框圖。
圖6是用于樣品標識及指明的方向的示意圖。
圖7A是實驗室操作系統框圖。
圖7B是實驗室操作系統框圖。
圖7C是實驗室操作系統框圖。
圖7D是實驗室操作系統框圖。
圖8是標準實驗室工作站框圖。
圖9是加熱盒示意圖。
圖10是示出轉基因篩選實驗室網址上關于結果文件的一個文件的屏幕顯示。
圖11是結果的圖形表示。優(yōu)選實施方案的詳細描述
本發(fā)明提供了一種用于高容積轉基因和定向誘變篩選的方法和系統。本發(fā)明提供了快速鑒別生物體的方法，該生物體的基因組具有內源性存在的或經修飾、突變或遺傳工程化的特異的遺傳序列。本說明書中討論或參照的所有專利、專利申請和文章均引入本文作參考。
下述術語和縮寫貫穿全文使用1.定義互補——由于氫鍵所致的含氮堿基之間的化學親和性。負責核酸鏈之間的堿基配對。Klug，W.S.and Cummings，M.R.(1997)《遺傳學概念》，第5版，Prentice-Hall，Upper Saddle River，NJ.(引入本文作參考)。拷貝數——隨機整合入基因組的轉基因的數目。缺失突變——從基因或染色體中除去一或多個核苷酸引起的突變。指定遺傳序列——包括一轉基因插入序列、選擇標記、重組位點或任何基因或基因片段。DNA(脫氧核糖核酸)——編碼遺傳信息的分子。DNA是一種通過核苷酸堿基對之間的弱鍵結合在一起的雙鏈分子。DNA中的4種核苷酸含有如下堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。天然條件下，僅在A和T之間以及G和C之間形成堿基對，因此每一個單鏈的堿基序列可從其配偶體中推導出。電穿孔——將細胞暴露于高壓電流的快速脈沖，使得細胞質膜變成可通透的，由此可進行轉染。胚胎干細胞(ES細胞)——一種早期胚胎細胞，其可以獨立復制并分化成其它細胞，干細胞可作為新細胞的持續(xù)來源。基因組——一特定生物體的染色體中的全部遺傳物質，其大小通常以其堿基對總數表示?；蚪MDNA——在一個細胞中編碼的全部遺傳信息。Lehninger，A.L.，Nelson，D.L.，Cox，M.M.(1993)生物化學原理，第2版，WorthPublishers，紐約(引入本文作參考)?；蛐汀獋€體細胞或生物體的基因組成。種系——經配子傳遞至子代的未修飾的遺傳物質?；蚨ㄏ颉ㄟ^同源重組或基因置換產生無效或突變等位基因。加熱盒——加熱時玻璃基質的容納機構。成象盒——成象時玻璃基質的容納機構。誘導型基因定向——通過實驗操作如給予一種藥物而使得定向基因誘導型失活(活化)的一種基因定向方法。例如Cre重組酶是一種位點特異性重組酶，其催化側翼為lox識別序列的DNA的切割。由于用于Cre表達的啟動子對干擾素敏感，因而可誘導定向缺失?；ヂ摼W——由一系列標準方案鏈接在一起形成全球分配網絡的互聯(公共和/或私人)網絡的集合。萬維網(以下成為網)既指可通過互聯網訪問的互聯的用戶可視超文本文件(通常稱為網頁)的分配集合，也指為用戶提供用標準互聯網方案訪問這類文件的用戶和服務商軟件成分。品系——品系是針對一種遺傳條件培育的群體。脂轉染——用由胞吞作用形成的脂質體小泡將轉基因引導通過細胞膜的方法，這一方法的優(yōu)點在于它是組織特異性的。微陣列成象儀——是一種用于檢測來自與光學平基質結合或附著的樣品的發(fā)光性的閱讀器。微陣列技術——是一種能同時定量許多核酸種類的基于雜交的方法，其描述見M.Schena，D.Shalon，R.W.Davis，and P.O.Brown，″用互補DNA微陣列定量監(jiān)控基因表達模式”，科學，270(5235)，467-70，1995；J.DeRisi，L.Penland，P.O.Brown，M.L.Bittner，P.S.Meltzer，M.Ray，Y.Chen，Y.A.Su，and J.M.Trent，“cDNA微陣列在分析人類癌癥中的基因表達模式中的用途”，自然遺傳學，14(4)，457-60(″DeRisi″)，1996；M.Schena，D.Shalon，R.Heller，A Chai，P.O.Brown，and R.W.Davis，“平行人類基因組分析100個基因的基于微陣列的表達監(jiān)控”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(20)，10614-9，1996，所有文獻引入本文作參考。這一技術組合了少量各純化核酸種類在玻璃表面的自動斑點，多重熒光標記核酸與這一陣列的雜交，以及用掃描共焦顯微鏡對產生的熒光標記的雜交體的檢測和定量。這一技術開發(fā)用于研究基因表達。微量注射——用細微毛細移液器將DNA溶液導入受精卵的胚泡或原核中的技術。突變——由誘變劑導致的DNA序列中的可遺傳改變。有各種類型的突變，包括移碼突變、錯義突變和無義突變。無效突變——完全消除一基因的功能，通常由于該基因已被物理學缺失。重組——子代產生不同于其任一親代的基因組合的過程，在高等生物中，這可通過交換產生。重組DNA——用重組DNA技術連接起來的不同來源DNA分子的組合。逆轉錄病毒感染——具有重組DNA的逆轉錄病毒將其基因組摻入其感染的細胞的染色體。選擇標記——通過降低對隨機整合子的檢測而非增加定向效率而促進定向細胞的檢測的途徑。有兩種類型的選擇基因指定的和陰性的。指定的選擇基因如新霉素賦予對正常情況下導致細胞死亡的藥物的抗性。已通過同源重組而將新霉素摻入其基因組的細胞將對藥物新霉素有抗性。相反，非同源重組事件將保持陰性選擇基因。陰性選擇基因入HSV tk賦予對某些藥物的敏感性(表達HSV tk的細胞對gancyclovir敏感)，導致細胞死亡。選擇標記是一種遺傳序列。位點特異性重組酶——一種促進特異DNA序列之間的重組的酶。次級微孔板——獲得DNA印的板。源微孔板——遠端用戶填充樣品和凍干的試劑的板。定向缺失——通過將基因從基因組中缺失而失活該基因的技術?？梢酝ㄟ^同源重組或誘導型基因定向實現。定向誘變——通過導入定位突變而改變種系。轉染——真核細胞對重組DNA的吸收、摻入和表達。轉基因——外源基因或DNA。轉基因的——這一術語描述了通過重組DNA技術而將來自另一生物體的基因置入其基因組的生物體。這些生物體通常通過將DNA微量注射進受精卵的原核并使DNA隨機整合而制備。轉基因品系——轉基因已經穩(wěn)定整合進種系并因此通過繼代以孟德爾方式遺傳的轉基因小鼠或生物體株系。網址——使用萬維網標準方案通過網絡提供信息含量的計算機系統。網址相應于一特定的互聯網域名如TransnetYX.com。系統組成和操作概述
本發(fā)明提供了用于轉基因及定向誘變篩選的方法和系統。根據本文所述特征操作的系統和方法可用于每天篩選約2000個樣品(僅使用一個自動陣列儀)，或者如果完全自動化則可每天篩選約100000個樣品。另外，根據本文所述特征操作的系統和方法可在接收針對多個樣品的篩選參數選擇的48小時內從篩選實驗室20將篩選結果提供給遠端用戶1。
圖1-3提供了本發(fā)明某些特征的概述。本發(fā)明使得遠端用戶1能訪問計算機5以發(fā)出它們送至轉基因或定向誘變篩選網址19(以下稱為篩選實驗室)的樣品的轉基因及定向誘變篩選的指令。使用互聯網或其它通訊鏈接7，遠端用戶1將一訪問請求7從該遠端用戶的計算機5經一電子通訊鏈接7如互聯網發(fā)送給篩選實驗室的計算機9。篩選實驗室網址16經一電子通訊鏈接如互聯網將允許訪問應答發(fā)送給遠端用戶1。這一應答包括3個獨立部分，這3個部分是賬號登記21、工作調查23和樣品標識及指明25。
參照圖2，遠端用戶1可經一通訊鏈接7訪問篩選實驗室的網址19。網址19可由指令管理器22如Dotlogix_(Memphis，TN)收藏(housed)。指令管理器是一種軟件指令管理系統。在優(yōu)選的實施方案中，該軟件是Spaceworks(Manugistics，Inc.，(Rockville，MD))。指令管理器22用于管理指令的放置并負責網址19。網址19中紀錄的接收自遠端用戶1的指令報告給與篩選實驗室的計算機9鏈接的電子通訊7。篩選實驗室的計算機9包括LIMS 24，其與過程控制器26通訊鏈接。
LIMS 24是實驗室信息管理系統軟件的學名。LIMS 24的功能是數據庫(repository)、實驗室的控制自動化、跟蹤樣品、繪制工作流程和提供電子數據捕獲。在另一實施方案中，LIMS 24還可以直接與遠端用戶1經一電子通訊鏈接7通訊。任何標準實驗室信息系統軟件均可用于提供這些功能。在優(yōu)選的實施方案中，使用Nautilis_程序(Thermal Lab System，Bevereley，Mass.)。
過程控制器26與工作站14通訊鏈接。過程控制器提供命令給工作站14的任何適于自動化的部分。參見，例如，Layne等，美國專利5,968,731(引入本文作參考)。例如，過程控制器26指導將探針送至雜交工作站96中的基質229。工作站14經通訊鏈接28與LIMS24鏈接。以此方式，工作站14可提供數據給LIMS 24以形成結果報告249，經電子通訊鏈接7如互聯網發(fā)送至指令管理器22或遠端用戶1。在另一實施方案中，遠端用戶1可通過直接電話線、電纜或衛(wèi)星連接而鏈接7至篩選實驗室20。
參照圖4，在接收時，用戶的賬號登記部分21需要訪問篩選實驗室的網址，遠端用戶1通過鍵入賬號31而訪問一已有賬號。用戶然后鍵入一密碼。用戶將被詢問是否是初次用戶33或另一授權用戶35。如果鍵入正確的密碼，則用戶可發(fā)出一新指令39。或者，用戶可通過提供指令號43檢查指令狀態(tài)41，并可進行跟蹤(tracking)45?；蛘?，可以通過提供機構名稱、主要研究者、地址、電話號碼、傳真號、電子郵件地址、付款信息、其它授權名稱49而開一新賬號47。選擇51、證實53一密碼，并由用戶提供付款信息55。
工作調查部分23有一下拉(drop down)部分，其使得用戶進行篩選傳送選擇。參照圖5，這些選擇包括指定樣品是轉基因的60還是定向突變70。轉基因生物體通過重組DNA技術將來自另一生物體的基因置入其基因組。這些動物通常通過將DNA微量注射進受精卵的原核并使DNA隨機整合而制備。整合進基因組的轉基因精卵的原核并使DNA隨機整合而制備。整合進基因組的轉基因的拷貝數是不可控的。轉基因品系指其中轉基因穩(wěn)定整合進種系并因此通過繼代而以孟德爾方式遺傳的生物體株系。轉基因是任何外源DNA序列或基因。
在優(yōu)選的實施方案中，篩選小鼠即Mus屬的轉基因及定向突變。在工作調查站23中指定的某些探針源自Mus。另外，在一個物種的所有成員中存在的一遺傳序列被篩選實驗室20用作篩選參照物。例如，在Mus屬中，主要尿蛋白MUP可以是一參照遺傳序列。Hogan，B.，Beddington，R.，Constantini，F.and Lacy，E.(1994)小鼠胚胎的操作，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(引入本文作參考)。
用這一方法可以篩選Mus的所有物種。另外，預計可使用本方法篩選其它物種。本領域技術人員能夠進行針對不同物種的篩選參數選擇，篩選實驗室可以選擇針對不同屬物種的參照遺傳序列。
如果樣品是轉基因的60，要求遠端用戶指明遺傳序列61，即轉基因插入序列，待測品系數目，每個品系的樣品數33以及每個品系待定向的靶遺傳序列63。靶遺傳序列是指定遺傳序列的一部分，其與探針序列相應。遠端用戶1被要求鑒別篩選所要使用的每個品系的探針序列64(通常17-30bp)，該序列與指定遺傳序列的一部分互補。應注意使用術語“篩選”的場合中的方法也可稱為“檢測”。探針序列與靶遺傳序列互補。遠端用戶1鑒別與靶遺傳序列63雜交即結合的探針序列64，如果其存在于樣品中。這一探針序列然后提供給供應商，由探針供應商制備的靶結合探針應包括這一序列。
遠端用戶1然后被要求指出關于由遠端用戶1提供的指定對照的特征65。指定對照是已知含有指定遺傳序列的一種基因組DNA樣品。指定對照由遠端用戶1提供給篩選實驗室20。另外，遠端用戶1提供指定對照的一些已知特征，包括指出指定對照的接合性、拷貝數和嵌合性質。未知的樣品拷貝數可以外推，并可伴隨與指定對照樣品相關的定量結果。
對于定向誘變篩選70，要求遠端用戶1指出品系和樣品數7 1。遠端用戶1被詢問該遺傳修飾是一剔除(knock-out)還是敲入(knock-in)72。如果遠端用戶1指出存在73選擇標記，則標記的選擇被提供74給用戶。選擇標記序列是指定遺傳序列。常用選擇標記包括但不限于新霉素抗性、潮霉素抗性和嘌呤霉素抗性的遺傳序列。一旦遠端用戶1指出存在何種選擇標記，則該遺傳序列被提供給用戶1。新霉素序列ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA(SEQ ID NO1)潮霉素序列ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAG(SEQ ID NO2)嘌呤霉素序列ATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGTGCCCGAAGGACCGCGCGACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGA(SEQ ID NO3)
要求遠端用戶1逐個堿基核對該序列并證實所提供的序列確實存在于它們的樣品74中。選擇標記的一部分被指定為靶遺傳序列63。探針序列被指定為64。探針序列64與靶遺傳序列63結合。
如果遠端用戶1指出選擇標記已被除去或者樣品已進行定位重組突變75，則遠端用戶1被指導指出采用了何種重組技術突變他們的樣品。將常用重組技術提供給遠端用戶1，這些技術包括但不限于Cre-lox 78和酵母FLP/FRT 79。在選擇了一種技術后，一種序列如ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT(SEQ ID NO4)和GAAGTTCCTATAC TTTCTAGA GAATAGGAACTTC C GAATAGGAACTTCCTTCAAGGATATG AAAGATCT CTTATCCTTGAAG G CTTATCCTTGAAG(SEQ ID NO5)被提供給遠端用戶1，它們分別與Lox-p位點78和FRT位點79相關。要求遠端用戶1逐個堿基核對該序列并證實所提供的序列確實存在于它們的樣品中。這些重組位點是除去選擇標記的指導遺傳序列。遠端用戶1指定相應于重組序列78或79的一部分的靶遺傳序列。遠端用戶1指出與靶遺傳序列雜交即結合的探針序列77，如果該序列存在于樣品中。這一探針序列77然后被告知給供應商并根據指定而制備。
隨后遠端用戶1被要求指出由遠端用戶1提供的指定對照的特征。指定對照是一種已知具有指定遺傳序列的基因組DNA樣品。指定對照由遠端用戶1提供給篩選實驗室20。另外，遠端用戶1提供指定對照的一些已知特征，包括指出指定對照的接合性、拷貝數和嵌合性質。未知的樣品拷貝數可以外推，并可伴隨與指定對照樣品相關的定量結果。
在一優(yōu)選的實施方案中，要求遠端用戶1指出其名稱、獨特的預注冊帳號、密碼并將它們的指令提供給公司。轉基因樣品的插入序列或者用于定向誘變篩選的選擇標記的遺傳序列可被統稱為指定遺傳序列。靶是指定遺傳序列的任何子集合。
參照圖6，一旦遠端用戶1提交了工作調查部分，樣品鑒別和指定部分25將會被提供給遠端用戶1。樣品標識及指明部分25包括96孔板位置。遠端用戶1指出每一孔中放入的是何種樣品。如果遠端用戶1有超過96個樣品，存在后續(xù)的源96孔板和指定。參照圖6，將會示出一具有條碼登錄號3的96孔板，其方向是X軸標記有H至A，Y軸標記為1-12，見80。X和Y軸指示一孔位置如A1，見81。
參照圖6，要求遠端用戶1提供板登錄號82，品系數83，遺傳品系代碼84，樣品數85，靶序列86，探針序列87和孔位置88。隨后詢問遠端用戶1沉積在孔A1中的材料是否是一對照，如果該材料是對照89，則遠端用戶指出該材料的接合性、嵌合性質和拷貝數90。如果所有這些參數均是未知的，則遠端用戶鍵入已知的所有信息。然后詢問遠端用戶1有關任何內部樣品標識號91。
參照圖1和圖2，遠端用戶1將其指令包括完成的篩選參數選擇經電子通訊形式7如互聯網或直線發(fā)送給篩選實驗室20。遠端用戶1可經一電子通訊7鏈接將選定的篩選參數選擇發(fā)送給篩選實驗室。這一鏈接7可以是直接的也可以是間接的。在間接途徑中，篩選參數發(fā)送給網址19，其中指令管理器22提供具有篩選參數選擇的LIMS 24。在優(yōu)選的實施方案中，指令產生兩個電子訊息，它們將被發(fā)送至不同位置。第一個訊息在LIMS 24中與儲存探針目錄交叉參照，如果由用戶指定的探針沒有儲存，則一指令訊息發(fā)送給供應商16如一合同探針供應商。這一請求可由遠端用戶1經任何形式的電子通訊發(fā)送給篩選實驗室20，然后經電子通訊10發(fā)送給供應商的計算機8，或者指令訊息可從用戶1經任何形式的電子通訊12發(fā)送給供應商的計算機8。
這一供應商11制備用戶1在其指令中指定的探針以供篩選基因組DNA中的指定基因組序列。這種根據指令制備的探針可被稱為靶結合探針。供應商11然后給靶結合探針打上條碼并連夜遞送(步驟13)給篩選實驗室20。篩選實驗室20接收用于該些天篩選的每一指令的靶結合探針后，將靶結合探針上的條碼掃描進LIMS 24。LIMS 24記錄收到靶結合探針的日期和時間以及由探針供應商提供的質量控制數據。
在優(yōu)選的實施方案中，靶結合探針置于工作站14，LIMS 24將記錄探針的條碼并記錄其在工作站14平臺上的具體位置，這將在下述對雜交工作站96的描述中更詳細地討論。另外，篩選實驗室20和LIMS 24系統將確定何種靶結合探針用于何種樣品，這將在下述對雜交工作站96的描述中更詳細地討論。
在優(yōu)選的實施方案中，由遠端用戶1發(fā)送指令產生的第二個訊息將保證用戶有合適的供應來包裝和運送其樣品。這一訊息指出微孔板數量，運送標記和用戶所需試劑量。這一請求將在遠端用戶處與LIMS 24中的詳細目錄交叉參照。這一請求可經任何形式的電子通訊7從遠端用戶發(fā)送給實驗室20，然后經電子通訊10發(fā)送給供應商11或供應商的計算機8，或者，該請求可從遠端用戶1經任何形式的電子通訊12發(fā)送給供應商11。如果用戶附近有合適量的供應，則一訊息會發(fā)送給用戶告知它們在何處可得到所需運送材料。但是，在交叉參照已知的詳細目錄時，如果在用戶處不能證實有足量供應時，則這些物資將被打包18并寄送14給用戶。遠端用戶1將會接到一訊息通知他們這些材料正被寄送給他們并告知預計到達時間。
遠端用戶1獲得或收到這些供應后，他們將合適的樣品放入源微孔板2中。樣品可得自原核或真核生物。樣品可以是來自小鼠8的組織樣品，也可以來自其它動物和植物。在優(yōu)選的實施方案中，剪斷小鼠尾巴或耳朵以提供組織樣品。源微孔板2的一側附有登錄號3，登錄號由LIMS 24使用以跟蹤微孔板2的來源。遠端用戶1在發(fā)出指令的同時，將合適樣品放入他們預先指定的源微孔板2的孔位置中，圖6。樣品被置入源微孔板2的正確的孔中后，遠端用戶1用移液器將預定量的復水凍干緩沖液4分配到各孔中以覆蓋樣品。緩沖液配制成用于裂解組織以獲得包括基因組DNA的細胞碎片。更具體地，緩沖液配制成在樣品從遠端用戶1送至篩選實驗室的過程14期間裂解該樣品。傳送時間約為24小時，因為所有樣品均經特快專遞服務如Federal Express_(Memphis，TN)寄送。更具體地，例如，緩沖液可由4M脲、0.1M Tris-HCl(pH7.5)、180mM NaCl、10mM EDTA 1％SDS、5mM DDT和415mg蛋白酶K和RNA酶制成。遠端用戶1將裂解緩沖液4加至源微孔板2的每個孔中。緩沖液4應完全覆蓋樣品。樣品和裂解緩沖液均加入到源微孔板2中后，將源微孔板2封上以防止樣品泄漏。然后為了運輸在密封上蓋一塑料蓋。遠端用戶1隨后將源微孔板2放入連夜遞送服務包裝15中，遠端用戶1密封包裝并將其發(fā)送16給篩選實驗室20，并申請一條碼寄送標簽。
參照圖7A-D，其示出本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。在圖7A中，源微孔板2到達101篩選實驗室20。用條碼機103閱讀寄送標簽的示蹤號，如果寄送標簽無法閱讀105，則手工鍵入107示蹤號。示蹤號的掃描在LIMS 24中被接收104，接收的訊息如在跟蹤區(qū)所示被寄至用戶帳號。從包裝中取出源微孔板2并送至一清潔房間109。源微孔板2含有原始生物物質和裂解緩沖液。由條碼機111掃描源微孔板2具體條碼并記錄106在LIMS 24中作為登錄號。LIMS 24可經指令管理器22發(fā)送106探針指令給供應商11。如果源微孔板2具體條碼不能被掃描113，則手工鍵入115登錄號。如果示蹤號、登錄號、用戶指令和工作目錄正確相關，則LIMS 24將激活(未示出)一有效記錄號用于這些板。
源微孔板2放置116進清潔房間中的輸送裝置中。輸送裝置是承載微孔板的任何裝置，其可?？吭诠ぷ髡?。在優(yōu)選的實施方案中，輸送裝置包括在一移動的容納裝置中垂直疊放的幾個硬托盤。這一輸送裝置可在不同自動工作站直接移動、停靠，硬托盤可以自動方式取出并在工作站平臺上加工。每個硬托盤由9個微孔板位置，每個托盤的這9個位置的每一個均有一獨特的條碼，指示其在輸送模塊中的具體位置。
源微孔板2登錄號3用條碼機掃描，輸送裝置中的條碼化微孔板位置被掃描。源微孔板2的條碼在LIMS 24中與輸送裝置中的獨特的條碼位置結合106，用于跟蹤目的。源微孔板2物理放置117于輸送裝置中。LIMS 24記錄并將微孔板與該位置相關106。將源微孔板2放置在輸送裝置上后，將輸送裝置?？?19進工作站14。
LIMS 24產生供實驗室人員使用的工作表(未示出)。工作表列出所需的分析板數以及所需的各種探針。LIMS 24工作目錄將產生一個單文件，文件格式可包括但不限于ASCII，XML或HTML。文件可寫進網絡驅動器的規(guī)定目錄中。文件名稱是獨特的并與批號(runnumber)相關。擴展名可以是工作目錄文件獨有的。
參照圖8，其是描述了工作站的一個實施方案的框圖。標準實驗室工作站是實驗室操作的邏輯組合，但這些組合無需參考不同的物理工作站。這些組合包括自動添加工作站92、分離/純化工作站93、光學標準化工作站94、陣列工作站95、雜交工作站96和檢測工作站97。
以下描述提供了以下的實施方案，但是本領域技術人員可根據需要選擇不同自動化程度進行這些方法。自動添加工作站92
自動添加工作站92提供了一種將液體從源微孔板2移至初級主微孔板(primary master well plate)的裝置。初級主微孔板是分離DNA的板。任何市售自動添加裝置均可實現這一功能，如Genesis_Tecan(Raleigh-Durham，NC)或Multimeck_Beckman(Indianapolis，IN)。這些裝置被稱為液體處理器(handler)。液體處理器打開源微孔板的硬塑料蓋121。在優(yōu)選的實施方案中，通過刺穿屏障密封機制123由液體處理器進行液體檢測。液體處理器進行液體檢測以證實原始樣品的存在125。源微孔板2條碼被再次掃描127。這一測量將被記錄并寄送108至LIMS 24數據庫并反映在結果報告249中。另外，LIMS 24保證108微孔板在從輸送裝置至自動添加工作站92是保持一致的。如果沒有足夠量的原始測試材料則產生錯誤代碼。液體處理器使用不銹鋼或類似的移液器尖，其可以在每次樣品轉移之間進行洗滌。
DNA被轉移129至一清潔微孔板中，稱為初級主微孔板。初級主微孔板的條碼被掃描131，LIMS 24將一新條碼與初級主微孔板結合102。持續(xù)進行自動添加過程直至所有樣品均添加進初級主微孔板中。分離/純化工作站93
初級主微孔板的托盤由輸送裝置移動至分離/純化工作站93。在這一工作站中，用諸如磁性或順磁顆粒的分離方法分離和純化基因組DNA。術語“磁性”在本說明書中是指磁性和順磁性。磁粒平均直徑可以從0.1微米至100微米。磁粒可以如Hawkins，美國專利5,705,628第3欄(以下稱為′628專利并引入本文作參考)所示進行官能化。在優(yōu)選的實施方案中，磁粒是1微米羧基化鐵芯顆粒，但是具有不同大小的不同官能團的其它磁粒也可使用。
例如，在分離/純化工作站93中，初級主微孔板的每個孔用磁粒133填充。磁粒通過一注射泵分配進孔中。第二個注射泵將結合緩沖液分配進含有原始生物磁粒和活性顆粒133的孔中。分配本身即足以實現樣品的混合。次級混合機制如移液器尖可吸取和再分配液體。使用結合緩沖液如20％聚乙二醇(PEG)8000、0.02％疊氮化鈉和2.5M氯化鈉以將基因組DNA非特異性結合至磁粒表面。PEG能夠氫鍵結合水，導致DNA的濃縮。其它結合參數見Hawkins′628專利所述。在室溫保溫顆粒、結合緩沖液和原始生物材料10分鐘，保溫后，將一磁鐵與初級主微孔板的底部接觸幾分鐘，即2-6分鐘137。附著有基因組DNA的磁粒被磁性吸引至主微孔板的底部，消除顆粒沉淀。除去139上清。用洗滌緩沖液例如70％乙醇和30％去離子水重懸141顆粒。用磁鐵143將附著有基因組DNA的磁粒與上清分離。吸取145上清。顆粒洗滌步驟重復2-4次。
具有沉淀的顆粒的初級主微孔板空氣干燥147。在另一方法中，沉淀的顆?？捎脡嚎s氮氣干燥。顆粒完全干燥后，除去149磁鐵。附著有基因組DNA的顆粒重懸在懸浮緩沖液151中。懸浮緩沖液配制用于從顆粒洗脫結合的DNA，這種懸浮緩沖液的一個例子為0.01M Tris(pH7.4)，0.02％疊氮化鈉或檸檬酸鈉鹽水(SSC)，二甲亞砜(DMSO)，蔗糖(20％)或甲酰胺(100％)。在優(yōu)選的實施方案中，加熱153初級主微孔板至80℃，保持2分鐘以使DNA從顆粒上解離。
加熱并將DNA重懸在溶液中之后，用磁鐵將磁粒與純化的DNA分離155。上清從顆粒中除去157并移液進次級微孔板2。讀取次級微孔板的條碼。LIMS 24將初級和次級微孔板的條碼相關114。將少量(1-10微升)DNA上清移液159進一清潔條碼化光學微孔板1536。
如果需要完全自動化的系統，則磁性分離器可自動化并從工作站的底部上升與所有初級主微孔板的底部同時接觸。
在一個實施方案中，可在與磁粒分離之前或之后超聲處理161基因組DNA。在優(yōu)選的實施方案中，基因組DNA在與細胞碎片分離后被超聲處理。超聲處理可用任何常規(guī)裝置進行，如固定角儀器。在優(yōu)選的實施方案中，基因組DNA被超聲處理5分鐘以產生DNA片段。盡管片段范圍從100bp直至1kb，但是片段的平均大小約500bp(約意味50bp)。光學標準化和微孔板工作站94
光學標準化涉及DNA定量。提供了一種光學板，如1536微孔板，其具有一透明底部，由此可測量吸收讀數。在優(yōu)選的實施方案中，使用1536 ULTRAMARK(Bio-Rad，Hercules，CA)。光學板的條碼被掃描161。來自次級主微孔板的少量DNA上清經由LIMS 24被跟蹤110至DNA濃度光學微孔板內的特異孔位置。光學微孔板進行DNA濃度分析163，該分析涉及本領域技術人員已知的光密度掃描(260/280比)或熒光光度分析。DNA濃度值定量并記錄112在LIMS24中。
將次級孔中的基因組DNA濃度調節(jié)至優(yōu)選在約12.5-500ng/μl次級主微孔板中的液體的范圍，更優(yōu)選在17-250ng/μl次級主微孔板中的液體的范圍。
光學標準化工作站94基于次級主微孔板中具有已知DNA濃度的已知樣品體積進行調節(jié)，以計算水合體積或干燥每個樣品的時間。次級微孔板樣品可通過自動液體處理系統用去離子水水合以降低DNA濃度165。反之，可用壓縮氣體干燥樣品一段計算時間框架以濃縮DNA樣品167。如果DNA濃度為零或者定量值低于優(yōu)化參數，LIMS 24將產生數量不足報告以在結果報告上注明(未示出)。次級主微孔板中的優(yōu)化樣品169被再次掃描，驗證濃度171。陣列工作站95
在陣列工作站95中，來自次級微孔板的基因組DNA樣品沉積在一基質229上?；|如圖9所示，基質229是光學平的，從而它可被激光掃描，并且它包括足夠數量的官能團與待篩選基因組DNA結合。基質229可以是玻璃、塑料、膜或其組合。典型地，基質229附著有某些表面化學(surface chemistry)，這些表面化學包括但不限于胺基、醛基或聚賴氨酸。反應基團將核酸(DNA、cDNA、EST、擴增子等)共價或非共價附著于基質229的表面。在優(yōu)選的實施方案中，每平方厘米有醛官能團(5.0×1012)反應性基團附著于光學平載片上。載片(SMA-1000)購自TeleChem(Sunnyvale，CA)。
在陣列工作站95中，基因組DNA用自動陣列儀沉積175在具有固體針式工具的基質229上。陣列儀是一種將鈦尖或類似物浸入基質上的孔或印跡中的儀器。自動陣列儀包括跟蹤具體樣品在基質上的位置的軟件。陣列儀與LIMS 24呈通訊連接，每一樣品的信息被發(fā)送114給LIMS。典型地，自動陣列儀包括但不限于固體針、開口針/滾針、鑷子、TeleChem公司的Micro Spotting Pin(Sunnyvale，CA)、針和環(huán)、壓電技術和注射—螺線管技術?？筛鶕S商運行指南不經修改而在本方法中使用自動陣列儀。
使用醛包被的載片，基因組DNA斑點無需進一步加工即可附著在基質上。但是，使用其它官能團，基因組樣品通過紫外交聯至表面和/或加熱附著樣品而附著在基質229上。例如，以1200μ/j、30秒將基因組DNA紫外附著在基質上。類似地，在80℃加熱2-4小時也可實現附著?；|上的斑點大小為1-100微米。在一個基質229上約有相應于非連續(xù)可跟蹤樣品的1-130000個基因組DNA斑點。
參照圖7C，例如，基質條碼231被掃描173。LIMS 24將微孔板與基質條碼231聯系起來118。另外，LIMS 24將基質條碼231與在該基質上一個位置的具體樣品聯系起來114。來自待測樣品的基因組DNA和來自由遠端用戶1提供的指定對照的基因組DNA沉積在基質上的指定位置，例如，如果僅指一個組織樣品的測試，則為基質上的第一個和第二個位置。在將基因組DNA沉積在基質上之前，基因組DNA樣品與足夠量的斑點緩沖液混合以促進在基質229上的沉積。
在優(yōu)選的實施方案中，斑點緩沖液是3×SSC，但是也可使用其它等價緩沖液，包括DSMO，1×SSC或市售斑點緩沖液?；蚪MDNA沉積175在基質229上。為了質量控制目的，基因組DNA樣品在基質229上沉積3次。LIMS 24記錄114從接收自自動微陣列裝置的信息而來的沉積的基因組DNA樣品在基質229上的精確位置。在另一實施方案中，特異于一參照遺傳序列的至少一種探針也被加入到每一斑點處。所述探針特異于參照遺傳序列。
在另一實施方案中，少量形態(tài)學序列核酸被加入到177次級微孔板的每個孔中。形態(tài)學序列可以是任何來源如原核或真核生物的任何核酸序列，其在待測生物材料基因組中不天然存在。摻入樣品中的λDNA可用作形態(tài)學對照。形態(tài)學序列的例子可包括但不限于外源基因、部分基因、隨機重復序列、任意序列或合成寡核苷酸。形態(tài)學序列被移液進次級微孔板的基因組DNA中并通過輕輕吹吸而混合。形態(tài)學對照用于確定是否樣品以成功轉移至基質229。
參照圖7D，在優(yōu)選的實施方案中，當沉積到基質229的過程完成后，將次級微孔板從陣列工作站95上取下197。密封199次級微孔板，將初級主微孔板重新蓋上蓋，再次掃描這些板的條碼，并給予203儲存單元位置。LIMS 24將主微孔板與輸送裝置位置204結合。次級微孔板隨后移動到冷凍機205。含有DNA樣品和任選地形態(tài)學對照序列的次級微孔板用一屏障密封而封上。屏障密封防止樣品降解并提供一安全儲存機構。處理后容納次級微孔板的輸送儲存單元具有一特定號碼和單元內的特定位置。單元內每一位置具有相關的獨特條碼。從工作站14移出的每一次級微孔板的條碼將被掃描，并掃描輸送儲存單元內的一特定位置的條碼。LIMS 24記錄次級微孔板號以及其特定位置。如果需要再添加204樣品，則將次級微孔板與其位置結合是有用的。輸送儲存單元將被送至一冷藏間進行長期儲存。雜交工作站96
基質229被放入一加熱盒177進行雜交。參照圖9，其示出了加熱盒的一個例子。這一加熱盒220由成斜角的頂部225、多個間隔226、金屬框架227和張力鉗230組成?；|229放入金屬框架227中，塑料間隔226置于基質229頂部，沿邊緣長度滑動。成斜角的頂板225隨后降至基質229周圍，僅由多個間隔226分離。金屬張力鉗230隨后用于加熱盒220，其將盒220緊固夾持在一起。基質231的條碼將延伸超過加熱盒220以利于掃描。
參照圖7C，在優(yōu)選的實施方案中，加熱盒220被組裝178。加熱盒220中的基質229被轉移179至加熱模塊中(Gene Paint_-Tecan)(Raleigh-Durham，NC)。加熱模塊的功能是升溫和降溫。在優(yōu)選的實施方案中，加熱模塊被加熱至95-99℃保持2分鐘以分離雙鏈DNA使其更適于雜交181。隨后用10-20體積的乙醇115洗滌基質229。在優(yōu)選的實施方案中，基質229然后通過將壓縮氮氣通入加熱盒頂部斜角排除任何殘留乙醇而干燥。將足夠量的Casine，牛血清白蛋白(BSA)或任何市售封閉劑分配183至加熱盒的斜角以封閉未結合的表面化學即醛。加熱盒220在加熱模塊上保溫184。用封閉劑封閉表面化學后，洗滌185基質229。在優(yōu)選的實施方案中，基質229用去離子水洗1分鐘，共3次。
固定在基質229上的基因組DNA與探針雜交187。LIMS 24指導雜交工作站96分配遠端用戶1在工作調查23中所選擇的試劑如探針。在優(yōu)選的實施方案中，各種探針被加到基質229上的每個DNA斑點處。斑點可以是待測樣品或斑點可以是相應的對照DNA樣品。第一種探針特異于指定遺傳序列的一部分，對于轉基因和定向誘變篩選，該序列均被稱為靶遺傳序列63。特異于靶遺傳序列的靶探針被稱為靶結合探針。
在優(yōu)選的實施方案中，另外，至少一個特異于參照遺傳序列的第二種探針被加至雜交緩沖液中。這一探針可以被稱為參照結合探針。參照結合探針的功能是提供指定的質量控制點。參照結合探針具有與被篩選的物種中的基因或基因片段互補的遺傳序列，即參照遺傳序列。
用作參照遺傳序列的內源性基因具有與轉基因類似的重復頻率，從而用每一探針可獲得類似量的雜交和線性曲線。攜帶1-10個拷貝轉基因的個體，任何單拷貝小鼠基因可被用作參照遺傳序列。物種Mus中存在的單拷貝小鼠基因的例子示于表1。表132.MMHAP9FLC5.seq.53F ATCACAAGTACTGGGAGAGG(SEQ ID NO6)MHAa67g1.seq.120F GTCTCAGAGGTTAACTCACC(SEQ ID NO7)D9Mit211.1.38 TTCTTATCTTCAGCCCCACC(SEQ ID NO8)X61434.129F ATAACACGGTGTGCACCACG(SEQ ID NO9)U11075.95FTCCCTTCCTGTTGACTACAG(SEQ ID NO10)Z49987.38FTACCCACACGGGCTTAAAAC(SEQ ID NO11)32.MMHAP9FLC5.seq.53R CACTGCCAGTGTGTTTTCAC(SEQ ID NO12)
另外，例如，小鼠主要尿蛋白基因家族包括20-30個拷貝/單倍體基因組。主要蛋白家族中包括的基因序列包括Mup_ctgtgacgtatgatggattcaataca(SEQ ID NO13)mup tcggccatagagctccatcagctgga(SEQ ID NO14)mup ctgtatggataggaagggatgatgc(SEQ ID NO15)mup ggctcaggccattcttcattctcgggcct(SEQ ID NO16).
為了評價含有非常多個轉基因整合事件的個體，用于核糖體RNA基因的探針運行良好。核糖體RNA基因可合適地驗證50至幾百個拷貝。Hogan，B.，Beddington，R.，Constantini，F.and Lacy，E.(1994)，小鼠胚胎操作，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(引入本文作參考)。
除了靶結合探針和參照結合探針，形態(tài)學結合探針可被加到雜交緩沖液中。形態(tài)學結合探針的功能是提供質量控制點以保證印跡過程是成功的。這一質量控制使得可以確定靶樣品是否被加到基質上。另外，它使得可以評價沉積樣品的形狀以評價樣品和基質的可重復性。
當靶結合探針、參照結合探針和任選地形態(tài)學結合探針被懸浮在雜交緩沖液中之后，將探針擴增分子或二級信號產生試劑也加到該混合物中。擴增分子如樹突探針具有與靶結合探針、形態(tài)學結合探針或參照結合探針互補的核酸捕獲序列?；蛘?，靶結合探針、形態(tài)學結合探針和參照結合探針的附加體可在45-50℃保溫以將探針與二級信號產生試劑預雜交。
可采用不同技術標記探針，直接標記技術和間接標記均可提供可接受的結果。間接方法學如美國專利5,731,158；5,583,001；5,196,306和5,182,203所述(引入本文作參考)。在直接標記技術中，標記探針與靶遺傳序列雜交。探針被直接修飾以使每個探針含有至少一種熒光、放射性或染色分子，如氰胺、辣根過氧化物酶(HRP)或任何其它熒光信號產生試劑。熒光信號產生試劑包括例如FITC、DTAF和FAM。FAM是由羧基熒光素琥珀酰亞胺酯制備的熒光素生物綴合物(例如5-FAM(Molecular Probes，Eugene，OR))。DTAF是熒光素二氯三嗪生物綴合物。
間接標記技術使用與選定的遺傳靶序列結合并已被修飾含有規(guī)定的附加體的探針，或者如果其具有核酸結合序列，則其形成二分探針。探針基于遠端用戶1的篩選參數選擇而制備。遠端用戶1提供與靶遺傳序列63相關的探針序列64。除了靶序列63，在指明的靶序列63之外的附加結合序列被加入。這兩個元件的組合產生二分探針。
例如，探針的結合序列可具有逆轉錄酶5’末端相同的序列。因此二分探針含有如下結合序列5’CCG GCT GAG TGA CGCGCA GAA GAC AGG GAC G-探針序列3’(SEQ ID NO17)。這一結合序列將與Cy3樹突的捕獲序列5’GGC CGA CTC ACT GCGCGT CTT CTG TCC CGC C-3’(SEQ ID NO18)互補。
靶遺傳序列63特異于探針遺傳序列64。二分體的結合序列是游離的，不與靶遺傳序列63結合。以與參照遺傳序列相同方式，參照結合探針序列特異于參照遺傳序列。二分探針的結合序列是游離的且不與相關遺傳序列結合?；パa于單拷貝小鼠基因的二分探針的例子示于下表
表2
與小鼠主要尿蛋白的二分探針的例子示于下表。這些二分探針由一個MUP遺傳序列和與擴增分子互補的第二種遺傳序列組成。
表3Mup探針15′-GGCCGACTCACTGCGCGTCTTCTGTCCCGCCCTGTGACGTATGATGGATTCAATACA(SEQ ID NO26)Mup探針25′-GGCCGACTCACTGCGCGTCTTCTGTCCCGCCTCGGCCATAGAGCTCCATCAGCTGGA(SEQ ID NO27)Mup探針35′-GGCCGACTCACTGCGCGTCTTCTGTCCCGCCCTGTATGGATAGGAAGGGATGATGC(SEQ ID NO28)Mup探針45′-GGCCGACTCACTGCGCGTCTTCTGTCCCGCCGGCTCAGGCCATTCTTCATTCTCGGGCCT(SEQ ID NO29)
引入擴增分子如樹狀物或酪酰胺。擴增分子與核酸結合序列或附加體直接或間接結合。游離的二分探針和過量擴增分子經幾次相繼洗滌步驟除去。結合的擴增分子發(fā)射與結合的分子數線性相關的信號。
結合探針的典型修飾包括但不限于生物素化和熒光素附著。二級信號產生試劑如酶隨后與附加體結合。二級信號產生因子可以具有與其直接附著的信號分子，或者其可活化或促進另一信號單元的附著。多重信號單元可被用于擴增靶信號。
樹狀物、酪酰胺等是常規(guī)用于擴增cDNA用于基因表達分析的擴增分子的例子，并可用于本發(fā)明方法。
在優(yōu)選的實施方案中，LIMS 24指導雜交工作站96去指導—液體分配器移液選定的結合探針和雜交緩沖液。多種雜交緩沖液均是可接受的，如水和鹽水檸檬酸鈉(SSC)。或者，緩沖液如0.25％NaPO4，4.5％SDS，1mM EDTA，1×SSC或40％甲酰胺，4×SSC，1％SDS也可使用。
雜交溶液隨后可施加187至加熱盒220的斜角頂部225。加熱盒220中的基質229被保溫189。在優(yōu)選的實施方案中，在靶結合探針、參照結合探針和任選的形態(tài)學結合探針與其各自靶雜交后，雜交混合物在加熱模塊上于40-65℃保溫4-12小時189。應注意雜交溶液可以含有擴增分子或二級信號試劑，或者它們可以隨后加入。
基質229與雜交溶液保溫189后，洗滌191基質表面若干次以除去任何過量試劑如探針擴增分子或二級信號試劑。在優(yōu)選的實施方案中，基質229首先在55℃用幾個體積的2×SSC，0.2％SDS洗滌191并保溫10分鐘189?；|再用幾個體積的2×SSC在室溫洗滌10分鐘。最終洗滌用0.2×SSC在室溫進行10分鐘。
基質被干燥197以促進成象。在優(yōu)選的實施方案中，通過將壓縮氮氣通入加熱盒的頂部斜角而干燥基質。壓縮氮氣干燥持續(xù)若干分鐘直至殘留緩沖液被排出加熱盒且基質干燥。檢測工作站97
這一檢測工作站97涉及檢測來自特異于在所述基質上的第一個和第二個位置的所述指定遺傳序列的一部分的至少一種標記探針的信號，并比較來自基質上的第一個和第二個位置的信號以檢測基因組DNA樣品中的指定遺傳序列。
在優(yōu)選的所述方案中，基質229隨后被轉移至檢測工作站97?；|229被置入市售成象盒如GSI Lumonics(Watertown，MA)，成象盒被置入根據廠商指導使用的微陣列成象儀GSI Lumonics 5000(Watertown，MA)中?；|229被暴露于激發(fā)能源以從信號分子產生可定量的信號195。更具體地，基質的條碼將被掃描和報告120給LIMS 24?；|表面將被掃描且至少三種不同通道和結果被紀錄120在LIMS 24中。各個基質229的條碼將被掃描并與一儲存位置條碼結合。參照結合探針、靶結合探針和任選地形態(tài)學探針信號將被紀錄和分析。
參照圖10，LIMS 24準備結果報告249。在LIMS 24中進行若干計算，然后它們被加到結果報告249中。在優(yōu)選的實施方案中，這種計算包括評價每個樣品的所有三份復制品。用靶結合探針獲得的曲線斜率(定量的雜交強度/ng DNA)除以每個樣品的指定對照探針的曲線的斜率，這稱為誘導比。誘導比隨后進行比較以確定復制品與對照和其它復制品誘導比的接近性。計算出誘導比后，定量和定性結果被加到結果報告249中。計算實驗定量信號和指定對照的定量信號之間的線性關系以證明樣品的拷貝數、接合性或嵌合性質。純合個體的該比率應是雜合個體該比率的2倍。另外，從回收自分離過程的基因組DNA量確定細胞數。
參照圖10，樣品結果報告240可包括賬號登記250、微孔板登錄號252、對照樣品位置250和指定對照252的遺傳特征。另外，結果報告249可包括孔位置254、樣品標識256、液體水平感應258、DNA濃度260、靶序列262、探針序列264、信號定量266、定性結果268、接合性/拷貝數270、校正前每孔光密度讀數274、校正后光密度讀數276、估計的所分析細胞數278、經與指定對照信號強度比較進行的能估計拷貝數、接合性或嵌合性質的定量分析270。結果報告249還可包括照片文件(email)或圖示結果表示272。另外，應遠端用戶請求從優(yōu)化過程收集的信息、序列確定質量對照數據和錯誤訊息也包括在結果報告249中。遠端用戶1可選擇使這一文件電子發(fā)送或電子通知。另外，遠端用戶1可選擇經郵政服務寄送硬拷貝。
LIMS 24匯集了結果報告249所需的全部數據后，結果報告被送7至遠端用戶1。在優(yōu)選的實施方案中，LIMS 24經一遠端鏈接7發(fā)送至遠端用戶1或指令管理器22，指令管理器22可將結果公布在網址16上或經一電子鏈接7發(fā)送結果報告249。LIMS 24 224將保留結果6個月，然后該結果被紀錄到長期存儲盤上并存檔。
在另一實施方案中，高通量聚合酶鏈反應(PCR)或PCR反應變化形式如Taqman_(Perkin Elmer，Inc.Wellsley，MA)或IDT(Coralville，IA)出售的分子信號(beacons)可用于進行自動化轉基因和定向誘變篩選。用戶賬號登記、工作調查和樣品標識及指明可以考慮到相同或等價因素而創(chuàng)建。另外，供應、寄送跟蹤、樣品跟蹤、質量控制和結果軟件結構可以以類似方式重復。使用PCR反應的修改需要在指令過程特別是工作調查中指出額外的信息。使用這一等價化學將需要用戶指定標準如反應緩沖液、鎂濃度、引物序列、引物濃度、dNTP濃度、循環(huán)條件和反應體積。自動液體處理可以調節(jié)這些變量并將反應緩沖液分配至合適位置。當通過自動系統跟蹤樣品時，基因組DNA可以以自動方式經真空歧管分離、微粒分離或化學提取而分離。分離的哺乳動物DNA可上樣至高通量熱循環(huán)儀如IAS的Genomatron(Bostonk MA)中?；蛘?，基質如化學處理玻璃、塑料、膜或任何組合可用作反應基質。這些基質可以容納在加熱模塊上，以根據PCR熱參數加熱或冷卻。液體處理平臺將合適的反應緩沖液加至孔的每個樣品中或基質表面。擴增的檢測可以經凝膠電泳或毛細管電泳而染色。檢測也可以通過在PCR反應中摻入熒光或放射標記的dNTP或經間接染色方法而定性/定量。
另一種PCR檢測方法包括使用Taqman_(Perkin Elmer，Inc.，Wellsley，MA)探針。Taqman_(Perkin Elmer，Inc.，Wellsley，MA)探針由信號產生因子(報道染料)和正常條件下不能檢測信號產生因子的猝滅因子(猝滅染料)組成。寡核苷酸Taqman_(Perkin Elmer，Inc.，Wellsley，MA)探針序列與PCR擴增子中存在的內部靶序列同源。Taqman_(Perkin Elmer，Inc.，Wellsley，MA)探針與擴增子的特異雜交反應使得猝滅因子與信號產生因子分離。被釋放的信號分子是可定量的。信號強度與結合的Taqman_(Perkin Elmer，Inc.，Wellsley，MA)引物數成比例。
與Taqman_(Perkin Elmer，Inc.，Wellsley，MA)技術接近的是分子信號技術。分子信號可區(qū)分單堿基變異。探針配有信號產生因子如熒光分子和猝滅劑因子。當探針與其互補序列正確結合時，猝滅劑因子被除去，然后熒光分子可被檢測。
下述實施例用于舉例示出而非限制本發(fā)明范圍。實施例實施例1-轉基因篩選
遠端用戶1訪問篩選實驗室20的網址19以訂購測試服務。遠端用戶1鍵入預先由篩選實驗室特異給出的賬號31。在遠端用戶1完成賬號登記21后，工作調查部分23被提供給遠端用戶1。工作調查部分23所需的由遠端用戶1做出的第一個指定是指出樣品是轉基因的還是定向誘變性質的。
在本實施例中的遠端用戶1指出待測樣品是轉基因60性質。遠端用戶1指示62僅有1個轉基因品系待測。待測的指定遺傳序列61是“HUPPCA”。遠端用戶1隨后指出47來自這一品系62的需要篩選的轉基因樣品。遠端用戶1指出待檢測靶遺傳序列63。遠端用戶1提供探針的堿基序列64為GCA AGG ACG CAA GGA AGC AGA G(SEQ ID NO30)。其與靶遺傳序列63互補。用戶指出的探針序列與結合序列5’-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGC(SEQ ID NO31)相連，產生二分探針5’-GGC CGA CTC ACT GCGCGT CTT CTG TCC CGC GCA AGG ACG CAA GGA AGC AGA G(SEQ ID NO32)。這一結合序列特異地與Cyanine 3(Cy3)樹狀物的逆轉錄酶序列的捕獲臂偶聯。
圖6所示的樣品標識及指明屏被提供給遠端用戶1。該屏提供了正確方向的源96孔板圖像。圖示幫助用戶特異指定每個樣品的正確源96孔位置。遠端用戶的每個樣品與圖6所示的源微孔板的特定孔相關、被紀錄和跟蹤。
遠端用戶1將合適樣品置于圖6所示正確位置而裝載源微孔板2。證實指定對照的性質的信息。這一信息包括已知的接合性和拷貝數90。用戶用去離子水將所提供的凍干裂解緩沖液復水。用戶將足量的裂解緩沖液4加入源微孔板2的每個孔中以覆蓋樣品。然后用屏障機構密封源微孔板2。為增加額外的結構整體性，源微孔板2用一硬蓋密封。將源微孔板2置于所提供的包裝和運輸材料17中。包裝寄送16給篩選實驗室。
篩選實驗室20接收包裝并將源微孔板2取出放入工作站14。在跟蹤所有樣品的同時，提取樣品基因組DNA并優(yōu)化。記錄DNA的量。將基因組DNA樣品和指定對照樣品沉積在光學平載片上并與如下探針雜交如下探針雜交參照結合探針5′-CCG GCT GAG TGA CGC GCA GAA TCA AGG GCGCTTCTTATCTTCAGCCCCACC(SEQ ID NO33)此二分探針的5′-CCG GCT GAG TGA CGC GCA GAA TCA AGGGCG部分特異地結合Cyanine 5(Cy5)樹狀物的獨特捕獲臂；以及靶結合探針5′-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGC GCA AGGACG CAA GGA AGC AGA G(SEQ ID NO32)以及擴增分子(Cy3和Cy5樹狀物)。
將光學平載片置于激發(fā)能量激光下并記錄定量數據。產生結果報告249并經互聯網7發(fā)送給遠端用戶1。結果報告249包含帳號登記信息250、微孔板數量252、遺傳特征254、孔位置、樣品標識256、DNA濃度260、靶序列262、探針序列264、信號定量266、結果268、接合性/拷貝數270、估計細胞數278、圖示表示272、圖形表示280、錯誤訊息274和質量控制數據274。實施例2定向誘變
遠端用戶1訪問篩選實驗室20的網址19以訂購測試服務。遠端用戶1鍵入預先由篩選實驗室20特異給出的賬號31。在遠端用戶1完成賬號登記21后，工作調查部分23被提供給遠端用戶1。工作調查部分23所需的由遠端用戶1做出的第一個指定是指出樣品是轉基因的還是定向誘變性質的。
在本實施例中的遠端用戶1指出待測樣品是定向誘變性質的70。遠端用戶1指出僅有1個71剔除品系72即NSE-PPCA(神經元特異性烯醇化酶)需要測試。剔除品系待測的指定遺傳序列是選擇標記潮霉素(SEQ ID NO2)。遠端用戶1隨后指出來自這一品系的47個NSE-PPCA樣品需要被篩選。遠端用戶1給出待檢測潮霉素選擇標記靶序列74。遠端用戶1特異指出這一選擇標記沒有經重組技術如Cre-lox或FLP/FRT除去75。選擇標記靶遺傳序列被提供63。潮霉素探針的探針序列是CAG GAT TTG GGC AAC ATC TT(SEQ ID NO34)，被指定64。遠端用戶1指出的探針序列64與結合序列5’-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGC(SEQ ID NO31)相連。這一結合序列特異地與Cyanine 3(Cy3)樹狀物的逆轉錄酶序列的捕獲臂偶聯。
樣品標識及指明屏被提供給遠端用戶1。該屏提供了圖6所示正確方向的源微孔板2圖像。這一圖示幫助用戶特異指定每個樣品的正確源微孔板2位置。遠端用戶1的每個樣品與圖6所示的源微孔板的特定孔相關、被紀錄和跟蹤。用戶指出來自源微孔板條碼的登錄號3。
遠端用戶1將合適樣品置于圖6所示正確位置而裝載源微孔板2。證實90指定對照的性質的信息。遠端用戶1用去離子水將所提供的凍干裂解緩沖液復水。用戶將足量的裂解緩沖液4加入源微孔板2的每個孔中以覆蓋樣品。然后用屏障機構密封源微孔板2。為增加額外的結構整體性，源微孔板2用一硬蓋密封。將源微孔板置于所提供的包裝和運輸材料17中。遠端用戶1將包裝15寄送16給篩選實驗室20。
篩選實驗室20接收包裝15并將源微孔板2取出放入工作站14。在跟蹤所有樣品的同時，以自動化方式提取樣品基因組DNA并優(yōu)化。記錄DNA的量。將基因組DNA樣品印跡在基質上并與如下探針雜交參照探針5′-CCG GCT GAG TGA CGC GCA GAA TCA AGG GCGCTTCTTATCTTCAGCCCCACC(SEQ ID NO35)此二分探針的5′-CCG GCT GAG TGA CGC GCA GAA TCA AGGGCG部分特異地結合Cyanine 5(Cy5)樹狀物的獨特捕獲臂；以及靶結合探針5′-GGC CGA CTC ACT GCG CGT CTT CTG TCC CGC CAG GATTTG GGC AAC ATC TT(SEQ ID NO36)以及擴增分子(Cy3和Cy5樹狀物)。
將光學平載片置于激發(fā)能量激光下并記錄定量數據。產生結果報告249并經互聯網7發(fā)送給遠端用戶1。結果報告249包含帳號登記信息250、微孔板數量252、遺傳特征254、孔位置、樣品標識256、DNA濃度260、靶序列262、探針序列264、信號定量266、結果268、接合性/拷貝數270、估計細胞數278、圖示表示272、圖形表示280、錯誤訊息274和質量控制數據274。實施例3真核基因組DNA磁粒分離
測試用若干小鼠尾巴得自St.Jude兒童醫(yī)院。裂解樣品排出包括染色體DNA的細胞含量。裂解緩沖液由4M脲、0.1M Tris-HCl(pH7.5)、180mM NaCl、10mM EDTA 1％SDS、5mM DDT和415mg蛋白酶K和RNA酶制成。樣品在運輸中于室溫保溫24小時。裂解物產生一溶液含有基因組DNA，而無來自原核工作的克隆的DNA因子。分離基因組DNA。裂解物與羧基末端的氧化鐵顆粒組合。加入聚乙二醇(PEG)8000，0.02％疊氮化鈉，2.5M NaCl并輕輕混合。樣品在室溫包括10分鐘。樣品暴露于磁場幾分鐘直至上清澄清。吸出上清并棄去。用70％乙醇和30％去離子水洗滌微粒并重懸以除去任何鹽。樣品暴露于磁場直至上清澄清。然后吸出上清并棄去。重復乙醇洗滌。將微粒于空氣中工作幾分鐘。微粒重懸于0.01MTris(pH7.4)，0.02％疊氮化鈉中。將Tris-微粒溶液在80℃保溫幾分鐘。樣品重新暴露于磁場直至上清澄清。吸出上清并置于清潔試管中。為確定基因組DNA回收率，進行Picogreen定量分析。Picogreen(Molecular Probes，Eugene，OR)是一種市售染料，其僅與雙鏈DNA結合。樣品上樣于小玻璃管中并在480nm激發(fā)。用熒光光度計在520nm測量熒光發(fā)射強度并以DNA濃度為函數作圖。
表4小鼠尾組織基因組DNA
結果示出組織或細胞中的哺乳動物基因組DNA成功地在室溫被裂解，且基因組DNA用磁粒得以回收。實施例4哺乳動物基因組DNA的固定化、雜交和檢測
為評價小鼠基因組DNA與基質結合、與探針雜交以及可檢測到定量信號的差異和確定最佳條件，進行幾種標準。用兩種不同類型的小鼠基因組DNA進行研究，即超聲處理的和未超聲處理的。用兩種類型小鼠基因組DNA制備在4種不同緩沖液中的系列稀釋液。兩種小鼠基因組DNA均制備6個稀釋液，從538ng/μl至17ng/μl。用PCR擴增在所有小鼠物種中均存在的7個內源性基因作為指定對照。
用PCR擴增在小鼠基因組中天然存在的7個小鼠標記，這些標記作為未知儲存基因組DNA的對照。這些標記為
表5
在瓊脂糖凝膠上分離PCR片段并用Hawkins′628專利所述程序用磁粒分離擴增子。采用一定量分析(Picogreen，Molecular Probes，Eugene，OR)確定PCR擴增子DNA的具體濃度。將已知濃度的PCR擴增子對照的系列稀釋液和超聲處理的和未超聲處理的儲存內源性小鼠基因組DNA的系列稀釋液印跡在基質上。經過共價和/或非共價連接將擴增子(擴增DNA的遺傳系列的一部分的學名)和基因組DNA固定在基質上。
表6 對照定量的結果對照基因組DNA信號系列稀釋液的結果
PCR擴增子在基質上的印跡、探查和檢測在文獻中有詳細記載。PCR擴增子通常用于基因表達工作。這些PCR擴增子對照制成在4種不同緩沖液中的6個系列稀釋液，其濃度梯度等同于小鼠基因組DNA的濃度梯度(538ng/μL至17ng/μL)。超聲處理的和未超聲處理的小鼠基因組DNA系列稀釋液以及PCR擴增子對照稀釋液一起印跡在6種不同類型的基質上。這些基質用兩種不同類型的探針探查。FAM探針(直接標記)和用樹狀物擴增的二分探針。
如下產生裝載系列稀釋液的微孔板
將超聲處理的和未超聲處理的真核和原核DNA以不同濃度重懸在4種不同緩沖液中。這4種緩沖液包括3×SSC、50％DMSO、5.5M NaSCN，第4種緩沖液是市售Tel-Chem(Sunnyvale，CA)印跡緩沖液。小鼠基因組DNA半數稀釋6次(538ng/μL、269ng/μL、135ng/μL、68ng/μL、34ng/μL和17ng/μL)。還產生了PCR對照系列稀釋液。對照稀釋液制備自預先擴增的內源性小鼠基因的PCR擴增子。PCR對照如下產生前4種對照系列稀釋液用3×SSC緩沖液、5.5M NaSCN、50％DMSO和Tel-Chem(Sunnyvale，CA)市售緩沖液制備。PCR擴增子DNA的起始濃度是538ng/μL。有6種PCR擴增子稀釋液(38ng/μL、269ng/μL、135ng/μL、68ng/μL、34ng/μL和17ng/μL)。第5種和第6種對照也在一單獨微孔板中以起始濃度538ng/μL進行稀釋。它們同樣懸浮于3×SSC緩沖液、5.5M NaSCN、50％DMSO和Tel-Chem(Sunnyvale，CA)市售緩沖液中。
表7 384孔板設計使用下述二分探針
表8使用FAM修飾的探針(直接標記)
表9小鼠基因組DNA的超聲處理
小鼠基因組DNA用角超聲處理器的固定設置超聲處理5分鐘。陣列設計
陣列設計如下陣列儀有6個棘爪，各承載14個載片。除了右上象限之外，每個棘爪承載一個格式的載片。每個棘爪承載一個格式的載片。左上象限棘爪承載14個超級醛載片。中上象限棘爪承載14個Schliecher Schuell(Dassel，德國)載片。右上象限承載5個sigma載片及9個超級胺載片。左下象限承載14個超級胺載片。中下象限承載聚賴氨酸載片，右下象限承載氨基sylinated載片(SCA載片)。
將384孔板置于陣列儀中。校準陣列儀以用開口針尖將正確量的樣品精確沉積在每個基質上。陣列儀將384孔板內容物置于84個載片上。這一過程約需40分鐘以完成全部印跡。印跡后，除去來自Schliecher Schuell(Dassel，德國)的Fast Slides_，因為硝酸纖維素膜被損壞。交聯DNA
除醛載片外，這些載片在1200μJ進行紫外交聯。所有載片煮沸5分鐘以分離基質表面上的雙鏈DNA。基質的煮沸在載片容器和水中進行?；|在水中煮沸5分鐘后，將其浸入100％乙醇中1分鐘，以促進載片的干燥。
重懸FAM探針，制備每個探針類型的原液。279mM/279μL等于1μM。每種原液為1μM。
將所有直接標記的FAM探針組合(多重化)在一個雜交緩沖液中。這一雜交緩沖液施加到不同基質上。1μM探針或0.3pM于30μL中。雜交緩沖液如下制備每個基質需要約30μL溶液。雜交緩沖液的總體積為180μL。這一雜交緩沖液包括18μL 20×SSC、0.2μL探針1、0.2μL探針2、0.2μL探針3、0.2μL探針4、1.2μL 10％SDS、6μL BSA和154μL水，等于總共180μL緩沖液。應注意FAM通常具有高背景和低信號。在渦旋幾秒鐘以保證合適混合后在微型離心管中離心FAM雜交緩沖液幾秒鐘。FAM混合物施加到超級胺載片012320、聚賴氨酸載片012370、sigma載片012800、超級醛基質012850和CSA基質012440上。將30μL雜交緩沖液施加到載片上。然后用來自Schliecher Schuell(Dassel，德國)的蓋玻片覆蓋具有雜交緩沖液的基質并設法除去可能導致雜交效果不佳的蓋玻片下的氣泡。將基質置于具有濕毛巾的雜交室中以保證載片不會干燥。將雜交室置于45.1℃溫箱30分鐘。用牛血清白蛋白(BSA)合適地封閉基質表面上的化學基團。雜交完成之后，在含有1％SDS的2×SSC中洗滌載片5分鐘。再在2×SSC中洗滌載片5分鐘。隨后在0.6×SSC中洗滌載片5分鐘，之后用100％乙醇洗滌。探查7天后對FAM載片成象，定量檢測信號。
在優(yōu)選的實施方案中，表7所示二分探針全部組合(多重化)在一種雜交緩沖液中。這一雜交緩沖液施加到不同基質上并保溫。然后用Cyanme 3(Cy3)樹狀物結合探針。參照圖11，Y軸282示出標記探針的熒光強度，X軸284是樣品載片。使用來自一個載片的數據產生結果的圖形表示，如圖11所示。掃描載片并記錄定量數據。圖11顯示基因組DNA可用微陣列成象儀檢測。
更具體地，這些結果如表10所示。
表10與PCR對照相關的超聲處理的和未超聲處理的小鼠基因組DNA定量結果
結果示出超聲處理的或未超聲處理的基因組DNA當于光學平基質附著時均可產生可報道的信號并可用微陣列成象儀閱讀。
結果本發(fā)明已結合優(yōu)選實施方案和優(yōu)選用途進行了描述，但是其并非是限制性的，因為在本發(fā)明范圍內可以進行修改和改變。
序列表<110> Hodge，Timothy A.<120> 用于轉基因及定向誘變篩選的系統、方法和裝置<130> 023131.41500<150> 60/230,371<151> 2000-06-09<160> 40<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 795<212> DNA<213> Streptomyces fradiae<400> 1atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca120gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg180caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg240ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag300gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg360cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc420atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa480gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac540ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat600ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac660atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc720ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt780gacgagttct tctga 795<210> 2<211> 1026<212> DNA<213> Streptomyces hygroscopicus<400> 2atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat120gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat180cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt240ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg300caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat360gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga420atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat480cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag540ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc600tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg660atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct720tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg780cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac840ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga900gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc960tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag1020gaatag 1026<210> 3<211> 600<212> DNA<213> streptomyces alboniger<400> 3atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc ccgggccgta60cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgacccggac120cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac180atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag240agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt300tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag360cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc420agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg480gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc540gacgtcgagt gcccgaagga ccgcgcgacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga600<210> 4<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 美國專利5,654,182和5,677,177中描述的人工重組突變<400> 4ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34<210> 5<211> 96<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 美國專利5,527,695中描述的人工重組突變<400> 5gaagttccta tactttctag agaataggaa cttccgaata ggaacttcct tcaaggatat60gaaagatctc ttatccttga aggcttatcc ttgaag 96<210> 6<211> 20<212> DNA<213> Mus sp.<400> 6atcacaagta ctgggagagg20<210> 7<211> 20<212> DNA<213> Mus sp.<400> 7gtctcagagg ttaactcacc20<210> 8<211> 20<212> DNA<213> Mus sp.<400> 8ttcttatctt cagccccacc20<210> 9<211> 20<212> DNA<213> Mus sp.<400> 9ataacacggt gtgcaccacg20<210> 10<211> 20<212> DNA<213> Mus sp.<400> 10tcccttcctg ttgactacag20<210> 11<211> 20<212> DNA<213> Mus sp.<400> 11tacccacacg ggcttaaaac20<210> 12<211> 20<212> DNA<213> Mus sp.<400> 12cactgccagt gtgttttcac20<210> 13<211> 26<212> DNA<213> Mus sp.<400> 13ctgtgacgta tgatggattc aataca 26<210> 14<211> 26<212> DNA<213> Mus sp.<400> 14tcggccatag agctccatca gctgga 26<210> 15<211> 25<212> DNA<213> Mus sp.<400> 15ctgtatggat aggaagggat gatgc 25<210> 16<211> 29<212> DNA<213> Mus sp.<400> 16ggctcaggcc attcttcatt ctcgggcct 29<210> 17<211> 31<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 含有Mus加互補于一擴增分子的序列<400> 17ccggctgagt gacgcgcaga agacagggac g31<210> 18<211> 31<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mus加互補于一樹狀物的序列<400> 18ggccgactca ctgcgcgtct tctgtcccgc c31<210> 19<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mus DNA加互補于一樹狀物的DNA<400> 19ggccgactca ctgcgcgtct tctgtcccgc catcacaagt actgggagag g 51<210> 20<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mus DNA加互補于一樹狀物的DNA<400> 20ggccgactca ctgcgcgtct tctgtcccgc cgtctcagag gttaactcac c 51<210> 21<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mus DNA加互補于一樹狀物的DNA<400> 21ggccgactca ctgcgcgtct tctgtcccgc cttcttatct tcagccccac c 51<210> 22<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mus DNA加互補于一樹狀物的DNA<400> 22ggccgactca ctgcgcgtct tctgtcccgc cataacacgg tgtgcaccac g 51<210> 23<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mus DNA加互補于一樹狀物的DNA<400> 23ggccgactca 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DNA<213> 人工序列<220><223> 互補于一樹狀物的人工DNA<400> 31ggccgactca ctgcgcgtct tctgtcccgc 30<210> 32<211> 52<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工DNA加互補于″HUPPCA″的DNA<400> 32ggccgactca ctgcgcgtct tctgtcccgc gcaaggacgc aaggaagcag ag 52<210> 33<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mus加互補于一樹狀物的DNA<400> 33ccggctgagt gacgcgcaga atcaagggcg cttcttatct tcagccccac c 51<210> 34<211> 20<212> DNA<213> Streptomyces hygroscopicus<400> 34caggatttgg gcaacatctt 20<210> 35<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mus DNA加互補于一樹狀物的DNA<400> 35ccggctgagt gacgcgcaga atcaagggcg cttcttatct tcagccccac c 51<210> 36<211> 50<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Mus DNA加互補于一樹狀物的DNA<400> 36ggccgactca ctgcgcgtct tctgtcccgc caggatttgg gcaacatctt 50<210> 37<211> 20<212> DNA<213> Mus sp.<400> 37atcacaagta ctgggagagg20<210> 38<211> 20<212> DNA<213> Mus sp.<400> 38gtctcagagg ttaactcacc20<210> 39<211> 20<212> DNA<213> Mus sp.<400> 39ttcttatctt cagccccacc20<210> 40<211> 20<212> DNA<213> Mus sp.<400> 40ataacacggt gtgcaccacg20
權利要求
1、一種檢測基因組DNA樣品中的指定遺傳序列的方法，包括
(a)將基因組DNA沉積在一基質上；
(b)加入至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探
針；
(c)檢測來自所述至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的
標記探針的信號，以檢測所述基因組DNA樣品中的所述指
定遺傳序列。
2、權利要求1的方法，其中所述指定遺傳序列是一種轉基因插入序列。
3、權利要求1的方法，其中所述指定遺傳序列是一種選擇標記。
4、權利要求3的方法，其中所述選擇標記選自由SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5組成的組。
5、權利要求1的方法，其中所述至少一種探針特異于一種靶遺傳序列和一種擴增分子。
6、權利要求5的方法，其中所述擴增分子是一種樹狀物(dendrimer)。
7、權利要求5的方法，其中所述擴增分子是一種酪酰胺(tyramide)。
8、權利要求1的方法，進一步包括加入至少一種特異于一參照遺傳序列的標記探針至所述基質的步驟。
9、權利要求1的方法，其中所述參照遺傳序列選自由SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15和SEQ ID NO16組成的組。
10、權利要求1的方法，進一步包括在將所述基因組DNA沉積在所述基質上之前向所述基因組DNA中加入一形態(tài)學對照的步驟。
11、權利要求10的方法，其中所述的形態(tài)學對照是λDNA。
12、權利要求1的方法，其中所述基質是玻璃。
13、權利要求1的方法，其中所述基質是塑料。
14、權利要求1的方法，其中所述基質是一種膜。
15、權利要求1的方法，其中所述基質用結合所述基因組DNA的一化學部分官能化。
16、權利要求1的方法，其中所述基因組DNA通過紫外交聯固定在所述基質上。
17、權利要求1的方法，其中所述基因組DNA通過加熱固定在所述基質上。
18、權利要求1的方法，其中所述基質是光學平載片，其具有足夠的醛基用于固定所述基因組DNA。
19、一種通過將基因組DNA樣品與一指定的基因組對照樣品進行比較而檢測所述樣品中的指定遺傳序列的方法，包括如下步驟
(a)將來自所述樣品的所述基因組DNA沉積在一種基質的第
一個位置；
(b)將來自所述指定的對照樣品的所述基因組DNA沉積在所
述基質的第二個位置；
(c)將至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探針
加入至所述基質上的所述第一個和第二個位置；
(d)檢測在所述基質上的所述第一個和第二個位置處的來自所
述至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探針的
信號；
(e)比較來自所述基質上的所述第一個和第二個位置的信號，
以檢測所述基因組DNA樣品中的指定遺傳序列。
20、權利要求19的方法，其中所述指定遺傳序列是一種轉基因插入序列。
21、權利要求19的方法，其中所述指定遺傳序列是一種選擇標記。
22、權利要求21的方法，其中所述選擇標記選自由SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5組成的組。
23、權利要求19的方法，其中所述至少一種探針特異于一種靶遺傳序列和一種擴增分子。
24、權利要求23的方法，其中所述擴增分子是一種樹狀物。
25、權利要求23的方法，其中所述擴增分子是一種酪酰胺。
26、權利要求19的方法，進一步包括加入特異于一參照遺傳序列的標記探針至所述基質的所述第一個和第二個位置的所述樣品處的步驟。
27、權利要求26的方法，其中所述特異于一參照遺傳序列的至少一種探針由至少二個結合區(qū)組成，一個結合區(qū)特異于所述參照遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于所述擴增分子。
28、權利要求26的方法，其中所述參照遺傳序列選自由SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15和SEQ ID NO16組成的組。
29、權利要求19的方法，進一步包括在將所述基因組DNA沉積在所述基質上之前向所述基因組DNA中加入一形態(tài)學對照的步驟。
30、權利要求29的方法，其中所述的形態(tài)學對照是λDNA。
31、權利要求19的方法，其中所述基質是玻璃。
32、權利要求19的方法，其中所述基質是塑料。
33、權利要求19的方法，其中所述基質是一種膜。
34、權利要求19的方法，其中所述基質用結合所述基因組DNA的一化學部分官能化。
35、權利要求19的方法，其中所述基因組DNA通過紫外交聯固定在所述基質上。
36、權利要求19的方法，其中所述基因組DNA通過加熱固定在所述基質上。
37、權利要求19的方法，其中所述基質是光學平載片，其具有足夠的醛基用于固定所述基因組DNA。
38、一種通過將組織樣品與一指定的對照組織樣品進行比較而檢測所述樣品中的指定遺傳序列的方法，包括如下步驟
(a)用足夠量的裂解緩沖液處理所述組織樣品和所述指定的對
照組織樣品，以獲得包括基因組DNA的細胞碎片；
(b)從所述組織樣品和所述指定的對照組織樣品的細胞碎片中
分離基因組DNA；
(c)將來自所述樣品的所述基因組DNA沉積在一種基質的第一
個位置；
(d)將來自所述指定的對照樣品的所述基因組DNA沉積在所述
基質的第二個位置；
(e)將至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探針加
至所述基質上的所述第一個和第二個位置；
(f)檢測在所述基質上的所述第一個和第二個位置處的來自所述
至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探針的信
號；
(g)比較來自所述基質上的所述第一個和第二個位置的信號，以
檢測所述組織樣品中的指定遺傳序列。
39、權利要求38的方法，其中所述基因組DNA用磁粒從細胞碎片中分離。
40、權利要求38的方法，其中所述基因組DNA用磁粒從細胞碎片中分離，所述方法進一步包括在用磁粒分離所述基因組DNA之后，超聲處理所述基因組DNA以獲得約100bp-1kb的基因組DNA片段。
41、權利要求38的方法，其中所述基因組DNA用磁粒從細胞碎片中分離，所述方法進一步包括在用磁粒分離所述基因組DNA之后，超聲處理所述基因組DNA以獲得平均大小約500bp的基因組DNA片段。
42、權利要求38的方法，其中所述裂解緩沖液由在將所述樣品從遠端用戶連夜傳送給篩選實驗室期間裂解所述樣品的組分組成。
43、權利要求38的方法，其中所述裂解緩沖液由4M脲、0.1MTris-HCl(pH7.5)、180mM NaCl、10mM EDTA 1％SDS、5mM DDT和415mg蛋白酶K和RNA酶組成。
44、權利要求38的方法，其中由遠端用戶將足夠量的所述裂解緩沖液加入到所述樣品和所述指定對照樣品中，以覆蓋在微孔板的孔中的所述樣品和所述指定對照樣品。
45、權利要求38的方法，其中所述指定遺傳序列選自由SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ IDNO5組成的組。
46、權利要求38的方法，其中所述指定遺傳序列是一種轉基因插入序列。
47、權利要求38的方法，其中所述指定遺傳序列是一種選擇標記。
48、權利要求38的方法，其中所述指定遺傳序列是一種敲入序列(knock-in)。
49、權利要求38的方法，其中所述指定遺傳序列是一種剔除序列(knock-out)。
50、權利要求38的方法，其中所述特異于所述指定序列的一部分的探針由至少二個結合區(qū)組成，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于擴增分子。
51、權利要求50的方法，其中所述擴增分子是一種樹狀物。
52、權利要求50的方法，其中所述擴增分子是一種酪酰胺。
53、權利要求38的方法，進一步包括加入特異于一參照遺傳序列的標記探針至所述基質上的所述第一個和第二個位置的所述樣品處的步驟。
54、權利要求53的方法，其中所述特異于一參照遺傳序列的至少一種探針由至少二個結合區(qū)組成，一個結合區(qū)特異于所述參照遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于所述擴增分子。
55、權利要求53的方法，其中所述參照遺傳序列選自由SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15和SEQ ID NO16組成的組。
56、權利要求38的方法，進一步包括在將所述基因組DNA沉積在所述基質上之前向所述基因組DNA中加入一形態(tài)學對照的步驟。
57、權利要求56的方法，其中所述的形態(tài)學對照是λDNA。
58、一種通過將組織樣品與一指定的對照組織樣品進行比較而檢測所述組織樣品中的指定遺傳序列的方法，包括如下步驟
(a)用足夠量的裂解緩沖液處理所述組織樣品和所述指定的對照
組織樣品，以獲得包括基因組DNA的細胞碎片；
(b)用磁粒從所述組織樣品和所述指定的對照組織樣品的細胞碎
片中分離基因組DNA；
(c)將來自所述樣品的所述基因組DNA沉積在一種基質的第一
個位置；
(d)將來自所述指定的對照樣品的所述基因組DNA沉積在所述
基質的第二個位置；
(e)將至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探針加
至所述基質上的所述第一個和第二個位置；
(f)檢測在所述基質上的所述第一個和第二個位置處的來自所述
至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探針的信
號；
(g)比較來自所述基質上的所述第一個和第二個位置的信號，以
檢測所述組織樣品中的指定遺傳序列。
59、權利要求58的方法，所述方法進一步包括在用磁粒分離所述基因組DNA之后，超聲處理所述基因組DNA以獲得約100bp-1kb的基因組DNA片段。
60、權利要求58的方法，所述方法進一步包括在用磁粒分離所述基因組DNA之后，超聲處理所述基因組DNA以獲得平均大小約500bp的基因組DNA片段。
61、權利要求58的方法，其中所述裂解緩沖液由在將所述樣品從遠端用戶連夜傳送給篩選實驗室期間裂解所述樣品的組分組成。
62、權利要求58的方法，其中所述裂解緩沖液由4M脲、0.1MTris-HCl(pH7.5)、180mM NaCl、10mM EDTA 1％SDS、5mM DDT和415mg蛋白酶K和RNA酶組成。
63、權利要求58的方法，其中由遠端用戶將足夠量的所述裂解緩沖液加入到所述樣品和所述指定對照樣品中，以覆蓋在微孔板的孔中的所述樣品和所述指定對照樣品。
64、權利要求58的方法，其中所述指定遺傳序列選自由SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ IDNO5組成的組。
65、權利要求58的方法，其中所述指定遺傳序列是一種轉基因插入序列。
66、權利要求58的方法，其中所述指定遺傳序列是一種選擇標記。
67、權利要求58的方法，其中所述指定遺傳序列是一種敲入序列(knock-in)。
68、權利要求58的方法，其中所述指定遺傳序列是一種剔除序列(knock-out)。
69、權利要求58的方法，其中所述特異于所述指定序列的一部分的探針由至少二個結合區(qū)組成，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于擴增分子。
70、權利要求69的方法，其中所述擴增分子是一種樹狀物。
71、權利要求69的方法，其中所述擴增分子是一種酪酰胺。
72、權利要求69的方法，進一步包括加入特異于一參照遺傳序列的標記探針至所述基質上的所述第一個和第二個位置的所述樣品處的步驟。
73、權利要求72的方法，其中所述特異于一參照遺傳序列的至少一種探針由至少二個結合區(qū)組成，一個結合區(qū)特異于所述參照遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于擴增分子。
74、權利要求72的方法，其中所述參照遺傳序列選自由SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15和SEQ ID NO16組成的組。
75、權利要求58的方法，進一步包括在將所述基因組DNA沉積在所述基質上之前向所述基因組DNA中加入一形態(tài)學對照的步驟。
76、權利要求75的方法，其中所述的形態(tài)學對照是λDNA。
77、一種通過將組織樣品與一指定的對照組織樣品進行比較而檢測所述組織樣品中的指定遺傳序列的方法，包括如下步驟
(a)用足夠量的裂解緩沖液處理所述組織樣品和所述指定的對照
組織樣品，以獲得包括基因組DNA的細胞碎片；
(b)用磁粒從所述組織樣品和所述指定的對照組織樣品的細胞碎
片中分離基因組DNA；
(c)調整基因組DNA濃度以促進所述指定遺傳序列的檢測；
(d)將來自所述樣品的所述基因組DNA沉積在一種基質的第一
個位置；
(e)將來自所述指定的對照樣品的所述基因組DNA沉積在所述
基質的第二個位置；
(f)將至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探針加
至所述基質上的所述第一個和第二個位置；
(g)檢測在所述基質上的所述第一個和第二個位置處的來自所述
至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探針的信
號；
(h)比較來自所述基質上的所述第一個和第二個位置的信號，以
檢測所述組織樣品中的指定遺傳序列。
78、權利要求77的方法，所述方法進一步包括在用磁粒分離所述基因組DNA之后，超聲處理所述基因組DNA以獲得約100bp-1kb的基因組DNA片段。
79、權利要求77的方法，所述方法進一步包括在用磁粒分離所述基因組DNA之后，超聲處理所述基因組DNA以獲得平均大小約500bp的基因組DNA片段。
80、權利要求77的方法，其中所述裂解緩沖液由在將所述樣品從遠端用戶連夜傳送給篩選實驗室期間裂解所述樣品的組分組成。
81、權利要求77的方法，其中所述裂解緩沖液由4M脲、0.1MTris-HCl(pH7.5)、180mM NaCl、10mM EDTA 1％SDS、5mM DDT和415mg蛋白酶K和RNA酶組成。
82、權利要求77的方法，其中由遠端用戶將所述裂解緩沖液加入到所述樣品中。
83、權利要求77的方法，其中所述指定遺傳序列是一種轉基因插入序列。
84、權利要求77的方法，其中所述指定遺傳序列是一種選擇標記。
85、權利要求77的方法，其中所述指定遺傳序列選自由SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ IDNO5組成的組。
86、權利要求77的方法，其中所述特異于所述指定序列的一部分的探針由至少二個結合區(qū)組成，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于擴增分子。
87、權利要求86的方法，其中所述擴增分子是一種樹狀物。
88、權利要求86的方法，其中所述擴增分子是一種酪酰胺。
89、權利要求77的方法，進一步包括加入特異于一參照遺傳序列的標記探針至所述基質上的所述第一個和第二個位置的所述樣品處的步驟。
90、權利要求89的方法，其中所述特異于一參照遺傳序列的至少一種探針由至少二個結合區(qū)組成，一個結合區(qū)特異于所述參照遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于擴增分子。
91、權利要求89的方法，其中所述參照遺傳序列選自由SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15和SEQ ID NO16組成的組。
92、權利要求77的方法，其中所述磁粒是一微米鐵芯羧基化顆粒。
93、權利要求77的方法，其中在沉積在所述基質上之前的所述DNA濃度為17-250ng/μl液體。
94、權利要求77的方法，其中在沉積在所述基質上之前的所述DNA濃度為12.5-500ng/μl液體。
95、權利要求77的方法，進一步包括在將所述基因組DNA沉積在所述基質上之前向所述基因組DNA中加入一形態(tài)學對照的步驟。
96、權利要求95的方法，其中所述的形態(tài)學對照是λDNA。
97、一種通過將組織樣品與一指定的對照組織樣品進行比較而篩選所述組織樣品是否包含指定遺傳序列的方法，所述篩選方法使用至少一種標記的靶結合探針和至少一種標記的參照結合探針，所述方法包括如下步驟
(a)用足夠量的裂解緩沖液處理所述組織樣品和所述指定的對照
組織樣品，以獲得包括基因組DNA的細胞碎片；
(b)用磁粒從所述組織樣品和所述指定的對照組織樣品的細胞碎
片中分離基因組DNA；
(c)將來自所述樣品的所述基因組DNA沉積在一種基質的第一
個位置；
(d)將來自所述指定的對照樣品的所述基因組DNA沉積在所述
基質的第二個位置；
(e)將至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探針加
至所述基質上的所述第一個和第二個位置；
(f)將至少一種標記的參照結合探針加至所述基質上的所述第一
個和第二個位置；
(g)檢測在所述基質上的所述第一個和第二個位置處的來自所述
至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探針的信
號；
(h)檢測在所述基質上的所述第一個和第二個位置處的來自所述
至少一種標記的參照結合探針的信號；
(i)比較來自所述基質上的所述第一個和第二個位置的信號，以
篩選樣品中是否包含所述指定遺傳序列。
98、權利要求97的方法，其中所述至少一種靶結合探針特異于指定遺傳序列的一部分。
99、權利要求97的方法，其中所述至少一種靶結合探針特異于一轉基因插入序列的一部分。
100、權利要求97的方法，其中所述至少一種靶結合探針特異于一種重組修飾或其一部分。
101、權利要求97的方法，其中所述至少一種標記的參照結合探針特異于一參照遺傳序列。
102、權利要求97的方法，其中所述參照遺傳序列選自由SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15和SEQ ID NO16組成的組。
103、權利要求97的方法，其中所述結合探針選自由SEQ IDNO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28和SEQ ID NO29組成的組。
104、權利要求97的方法，其中所述指定遺傳序列是一種選擇標記。
105、權利要求97的方法，其中所述指定遺傳序列是一種轉基因插入序列。
106、權利要求97的方法，其中所述標記是直接標記。
107、權利要求97的方法，其中所述標記是間接標記。
108、權利要求97的方法，其中所述至少一種標記的靶結合探針由至少二個結合區(qū)組成，一個結合區(qū)特異于所述靶遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于擴增分子。
109、權利要求106的方法，其中所述擴增分子是一種樹狀物。
110、權利要求106的方法，其中所述擴增分子是一種酪酰胺。
111、權利要求97的方法，其中所述至少一種標記的參照結合探針由至少二個結合區(qū)組成，一個結合區(qū)特異于所述參照遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于擴增分子。
112、權利要求109的方法，其中所述擴增分子是一種樹狀物。
113、權利要求109的方法，其中所述擴增分子是一種酪酰胺。
114、一種通過將組織樣品與一指定的對照組織樣品進行比較而篩選所述組織樣品是否包含指定遺傳序列的方法，其中包括所述基因組DNA的所述組織樣品由一遠端用戶送至一篩選實驗室，所述方法包括如下步驟
(a)通過將裂解緩沖液提供給一遠端用戶而促進從組織樣品提取
基因組DNA；
(b)用足夠量的所述裂解緩沖液處理所述組織樣品和所述指定的
對照組織樣品，以獲得包括基因組DNA的細胞碎片；
(c)將在所述裂解緩沖液中的所述組織樣品從所述遠端用戶傳送
給所述篩選實驗室；
(d)在所述篩選實驗室接受來自遠端用戶的裂解的組織樣品；
(e)用磁粒從所述組織樣品和所述指定的對照組織樣品的細胞碎
片中分離基因組DNA；
(f)將來自所述樣品的基因組DNA沉積在一種基質的第一個位
置；
(g)將來自所述指定的對照樣品的基因組DNA沉積在所述基質
的第二個位置；
(h)將至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探針加
至所述基質上的所述第一個和第二個位置；
(i)檢測在所述基質上的所述第一個和第二個位置處的來自所述
至少一種特異于所述指定遺傳序列的一部分的標記探針的信
號；
(j)比較來自所述基質上的所述第一個和第二個位置的信號，以
篩選樣品中是否包含所述指定遺傳序列。
115、權利要求114的方法，所述方法進一步包括在用磁粒分離所述基因組DNA之后，超聲處理所述基因組DNA以獲得約100bp-1kb的基因組DNA片段。
116、權利要求114的方法，所述方法進一步包括在用磁粒分離所述基因組DNA之后，超聲處理所述基因組DNA以獲得平均大小約500bp的基因組DNA片段。
117、權利要求114的方法，其中所述裂解緩沖液由在將所述樣品從遠端用戶連夜傳送給篩選實驗室期間裂解所述樣品的組分組成。
118、權利要求114的方法，其中所述裂解緩沖液由4M脲、0.1MTris-HCl(pH7.5)、180mM NaCl、10mM EDTA 1％SDS、5mM DDT和415mg蛋白酶K和RNA酶組成。
119、權利要求114的方法，其中所述指定遺傳序列是一種選擇標記。
120、權利要求114的方法，其中所述指定遺傳序列是一種轉基因插入序列。
121、權利要求114的方法，其中所述指定遺傳序列選自由SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ IDNO5組成的組。
122、權利要求114的方法，所述方法進一步包括在用磁粒分離所述基因組DNA之后，超聲處理所述基因組DNA以獲得約100bp-1kb的基因組DNA片段。
123、權利要求114的方法，所述方法進一步包括在用磁粒分離所述基因組DNA之后，超聲處理所述基因組DNA以獲得平均大小約500bp的基因組DNA片段。
124、權利要求114的方法，其中所述基質是光學平載片。
125、權利要求114的方法，其中所述特異于所述指定序列的一部分的探針由至少二個結合區(qū)組成，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于擴增分子。
126、權利要求125的方法，其中所述擴增分子是一種樹狀物。
127、權利要求125的方法，其中所述擴增分子是一種酪酰胺。
128、權利要求114的方法，其中所述特異于所述參照遺傳序列的探針由至少二個結合區(qū)組成，一個結合區(qū)特異于所述參照遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于擴增分子。
129、權利要求128的方法，其中所述擴增分子是一種樹狀物。
130、權利要求128的方法，其中所述擴增分子是一種酪酰胺。
131、權利要求114的方法，其中所述基質具有1-130000個基因組DNA沉積斑點。
132、權利要求114的方法，其中所述磁粒是1微米鐵芯羧基化顆粒。
133、權利要求114的方法，進一步包括在將所述基因組DNA沉積在所述基質上之前向所述基因組DNA中加入一形態(tài)學對照的步驟。
134、權利要求133的方法，其中所述的形態(tài)學對照是λDNA。
135、一種篩選由一遠端用戶送至一篩選實驗室的至少一種樣品的基因組DNA是否包含指定基因組DNA序列的方法，所述遠端用戶通過一電子通訊鏈接將篩選參數提供給所述篩選實驗室和一供應商，所述方法包括如下步驟
(a)經一電子通訊鏈接將一訪問請求從遠端用戶發(fā)送給篩選實驗
室；
(b)經一電子通訊鏈接將一允許訪問應答從所述篩選實驗室發(fā)送
給所述遠端用戶，所述允許訪問應答包括所述篩選參數；
(c)由所述遠端用戶選擇篩選參數；
(d)經一電子通訊鏈接將所述選定的篩選參數選擇從所述遠端用
戶發(fā)送給所述篩選實驗室；
(e)由所述篩選實驗室經所述通訊鏈接接收來自所述遠端用戶的
篩選參數選擇；
(f)經一電子通訊鏈接將一請求從所述遠端用戶發(fā)送給一供應商
以獲得符合選定篩選參數的探針；
(g)由所述實驗室接收所述探針；
(h)將所述樣品從所述遠端用戶傳送給所述篩選實驗室；
(i)根據所述選定篩選參數進行所述樣品的篩選以獲得數據；和
(j)經一電子通訊鏈接將所述數據發(fā)送給所述遠端用戶。
136、權利要求135的方法，其中所述電子通訊鏈接是互聯網。
137、權利要求135的方法，其中所述探針特異于所述指定序列的一部分，所述探針具有至少兩個結合區(qū)，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于擴增分子。
138、權利要求135的方法，其中所述探針特異于所述指定序列的一部分，所述探針具有至少兩個結合區(qū)，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于酪酰胺。
139、權利要求135的方法，其中所述探針特異于所述指定序列的一部分，所述探針具有至少兩個結合區(qū)，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于樹狀物。
140、權利要求135的方法，其中所述篩選實驗室每天篩選至少2000個樣品。
141、權利要求135的方法，其中所述供應包括一裂解緩沖液；所述裂解緩沖液配制成在所述樣品在所述遠端用戶和所述篩選實驗室之間傳送期間裂解所述樣品。
142、權利要求135的方法，其中所述數據在將所述選定篩選參數發(fā)送給所述篩選實驗室的48小時內報告給遠端用戶。
143、一種篩選由一遠端用戶送至一篩選實驗室的至少一種樣品的基因組DNA是否包含指定基因組DNA序列的方法，所述遠端用戶通過一電子通訊鏈接將篩選參數提供給所述篩選實驗室，所述方法包括如下步驟
(a)經一電子通訊鏈接將一訪問請求從遠端用戶發(fā)送給篩選實驗
室；
(b)經一電子通訊鏈接將一允許訪問應答從所述篩選實驗室發(fā)送
給所述遠端用戶，所述允許訪問應答包括所述篩選參數；
(c)由所述遠端用戶選擇篩選參數；
(d)經一電子通訊鏈接將所述選定的篩選參數選擇從所述遠端用
戶發(fā)送給所述篩選實驗室；
(e)由所述篩選實驗室經所述通訊鏈接接收來自所述遠端用戶的
篩選參數選擇；
(f)經一電子通訊鏈接將一請求從所述篩選實驗室發(fā)送給一供應
商以獲得符合選定篩選參數的探針；
(g)由所述篩選實驗室接收所述探針；
(h)將所述樣品從所述遠端用戶傳送給所述篩選實驗室；
(i)根據所述選定篩選參數進行所述樣品的篩選以獲得數據；和
(j)經一電子通訊鏈接將所述數據發(fā)送給所述遠端用戶。
144、權利要求143的方法，其中所述電子通訊鏈接是互聯網。
145、權利要求143的方法，其中所述探針特異于所述指定序列的一部分，所述探針具有至少兩個結合區(qū)，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于擴增分子。
146、權利要求143的方法，其中所述探針特異于所述指定序列的一部分，所述探針具有至少兩個結合區(qū)，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于酪酰胺。
147、權利要求143的方法，其中所述探針特異于所述指定序列的一部分，所述探針具有至少兩個結合區(qū)，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于樹狀物。
148、權利要求143的方法，其中所述篩選實驗室每天篩選至少2000個樣品。
149、權利要求143的方法，其中所述供應包括一裂解緩沖液；所述裂解緩沖液配制成在所述樣品在所述遠端用戶和所述篩選實驗室之間傳送期間裂解所述樣品。
150、權利要求143的方法，其中所述數據在將所述選定篩選參數發(fā)送給所述篩選實驗室的48小時內報告給遠端用戶。
151、權利要求143的方法，其中所述篩選參數選擇包括一選擇標記。
152、權利要求143的方法，其中所述篩選參數選擇包括鑒別待測品系數目。
153、權利要求143的方法，其中所述篩選參數選擇包括探針序列。
154、權利要求143的方法，其中所述篩選參數選擇包括一指定對照。
155、權利要求143的方法，其中所述篩選參數選擇包括一指定遺傳序列。
156、權利要求143的方法，其中所述篩選參數選擇包括一靶遺傳序列。
157、一種篩選由一遠端用戶送至一篩選實驗室的至少一種樣品的基因組DNA是否包含指定基因組DNA序列的方法，所述遠端用戶通過一電子通訊鏈接將篩選參數提供給所述篩選實驗室，所述方法包括如下步驟
(a)經一電子通訊鏈接將一訪問請求從遠端用戶發(fā)送給篩選實驗
室；
(b)經一電子通訊鏈接將一允許訪問應答從所述篩選實驗室發(fā)送
給所述遠端用戶，所述允許訪問應答包括所述篩選參數；
(c)由所述遠端用戶選擇篩選參數；
(d)經一電子通訊鏈接將所述選定的篩選參數選擇從所述遠端用
戶發(fā)送給所述篩選實驗室；
(e)由所述篩選實驗室經所述通訊鏈接接收來自所述遠端用戶的
篩選參數選擇；
(f)經一電子通訊鏈接將一請求從所述篩選實驗室發(fā)送給一供應
商以獲得符合選定篩選參數的探針；
(g)由所述篩選實驗室接收所述探針；
(h)將在一種裂解緩沖液中的組織樣品從所述遠端用戶傳送給所
述篩選實驗室，所述裂解緩沖液配制成在所述樣品在所述遠
端用戶和所述篩選實驗室之間傳送期間裂解所述樣品中的所
述組織；
(i)根據所述選定篩選參數進行所述樣品的篩選以獲得數據；和
(j)經一電子通訊鏈接將所述數據發(fā)送給所述遠端用戶。
158、權利要求157的方法，其中所述電子通訊鏈接是互聯網。
159、權利要求157的方法，其中所述探針特異于所述指定序列的一部分，所述探針具有至少兩個結合區(qū)，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于擴增分子。
160、權利要求157的方法，其中所述探針特異于所述指定序列的一部分，所述探針具有至少兩個結合區(qū)，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于酪酰胺。
161、權利要求157的方法，其中所述探針特異于所述指定序列的一部分，所述探針具有至少兩個結合區(qū)，一個結合區(qū)特異于所述指定遺傳序列，第二個結合區(qū)特異于樹狀物。
162、權利要求157的方法，其中所述篩選實驗室每天篩選至少2000個樣品。
163、權利要求157的方法，其中所述電子通訊鏈接是互聯網。
164、權利要求157的方法，其中所述緩沖液由4M脲、0.1MTris-HCl(pH7.5)、180mM NaCl、10mM EDTA 1％SDS、5mM DDT和415mg蛋白酶K和RNA酶組成。
165、權利要求157的方法，其中所述篩選參數選擇包括一選擇標記。
166、權利要求157的方法，其中所述篩選參數選擇包括鑒別待測品系數目。
167、權利要求157的方法，其中所述篩選參數選擇包括探針序列。
168、權利要求157的方法，其中所述篩選參數選擇包括一指定對照。
169、權利要求157的方法，其中所述篩選參數選擇包括一指定遺傳序列。
170、權利要求157的方法，其中所述篩選參數選擇包括一靶遺傳序列。
171、權利要求157的方法，其中所述供應包括探針，所述探針包括特異于遺傳靶和擴增分子的序列。
172、一種用于高容積篩選和定向誘變篩選由一遠端用戶送至一篩選實驗室的組織樣品的自動裝置，包括
(a)用于經一電子通訊鏈接將一訪問請求從一遠端用戶發(fā)送給
一篩選實驗室的裝置；
(b)用于經一電子通訊鏈接將一帶有篩選參數的允許訪問應答
從所述篩選實驗室發(fā)送給所述遠端用戶的裝置；
(c)用于將篩選參數選擇從所述遠端用戶發(fā)送給所述篩選實驗
室的裝置；
(d)用于將所述樣品從所述遠端用戶傳送給所述篩選實驗室的
裝置；
(e)用于從所述樣品分離基因組DNA的裝置；
(f)用于將所述基因組DNA沉積在一基質上的裝置；
(g)用于篩選基因組DNA的裝置；和
(h)用于將所述數據發(fā)送給所述遠端用戶的裝置。
173、權利要求172的裝置，其中所述傳送所述樣品的裝置是連夜郵包服務機構。
174、權利要求172的裝置，其中所述分離所述基因組DNA的裝置是一種磁力分離器。
175、權利要求172的裝置，其中所述發(fā)送數據的裝置是互聯網。
176、權利要求172的裝置，其中所述裝置能每天篩選至少2000個樣品。
177、權利要求172的裝置，其中所述用于沉積所述基因組DNA的裝置是一種自動陣列儀(arrayer)。
178、一種用于根據遠端用戶作出的篩選參數選擇篩選組織樣品是否存在的修飾或突變的基因組DNA的高容積裝置，包括
(a)用于將液體從第一個微孔板移至第二個微孔板的自動添加工
作站(accessioning station)；
(b)用于在所述第二個微孔板分離基因組DNA的分離工作站；
(c)用于調節(jié)所述第二個微孔板中的DNA濃度的光學標準化工
作站；
(d)用于將來自所述第二個測試板的所述基因組DNA沉積在一
基質上的陣列工作站；
(e)用于雜交與基因組DNA的部分結合的標記探針的雜交工作
站；
(f)用于檢測結合的標記探針的檢測工作站；
(g)用于由遠端用戶作出篩選參數選擇的裝置，所述遠端用戶通
過電子通訊鏈接與裝置通訊；
(h)用于將篩選結果通過電子通訊鏈接告知遠端用戶的裝置。
179、權利要求178的裝置，其中所述檢測工作站包括一微陣列成象儀。
180、權利要求178的裝置，其中所述篩選參數選擇包括一選擇標記。
181、權利要求179的裝置，其中所述篩選參數選擇包括鑒別待測品系數目。
182、權利要求178的裝置，其中所述篩選參數包括探針序列。
183、權利要求178的裝置，其中所述篩選參數包括一靶遺傳序列。
184、權利要求178的裝置，其中所述篩選參數包括一指定對照。
185、權利要求178的裝置，其中所述篩選參數包括一指定遺傳序列。
186、權利要求178的裝置，其中所述篩選參數選擇包括一靶遺傳序列。
187、權利要求178的裝置，其中所述第二個微孔板中的DNA濃度是17-250ng/μl液體。
188、權利要求178的裝置，其中所述第二個微孔板中的DNA濃度是12.5-500ng/μl液體。
189、權利要求178的裝置，其中所述裝置能每天篩選至少2000個樣品。
190、一種篩選樣品的基因組DNA是否含有指定的基因組DNA序列的系統，包括
(a)具有處理器、存儲器和網絡瀏覽器的計算機，其中該計算
機適于接收來自遠端用戶的篩選參數選擇；和
(b)一種用于根據所述篩選參數選擇分析基因組DNA樣品的
工作站，其中所述工作站包括一微陣列成象儀。
191、權利要求190的系統，其中所述篩選參數選擇選自指定遺傳序列；選擇標記；靶遺傳序列；指定對照的遺傳序列；待測品系數目；和探針序列。
192、權利要求190的系統，其中所述篩選參數選擇選自SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ IDNO5。
193、權利要求190的系統，其中所述篩選參數經互聯網接收。
194、權利要求190的系統，其中所述基因組DNA是原核的。
195、權利要求190的系統，其中所述基因組DNA是真核的。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于進行基因組DNA的轉基因和定向誘變篩選的方法和裝置。本發(fā)明還提供了用于篩選DNA是否含有指定的遺傳序列的系統，該系統包括具有處理器、存儲器和網絡瀏覽器的計算機和一種分析基因組DNA樣品是否含有所述指定序列的自動篩選裝置，其中該計算機經電子通訊形式接收來自遠端用戶的關于指定遺傳序列和其它篩選參數選擇的指令。
文檔編號G01N33/566GK1394234SQ0180350
公開日2003年1月29日 申請日期2001年9月4日 優(yōu)先權日2000年9月6日
發(fā)明者蒂莫西·A·霍奇 申請人:蒂莫西·A·霍奇