專利名稱：用于乙肝表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的診斷試劑和診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于乙肝表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的診斷試劑及其制備方法，以及乙肝表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的診斷方法。
在發(fā)現(xiàn)澳大利亞抗原-一種特異的肝炎病毒抗原后，Dane于1970年在肝炎患者的血清中發(fā)現(xiàn)了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和完整的HBV顆粒(Seo，J.H.，Park，B.C.肝炎病毒(1)，生命科學(xué)2(3)163-174，1992)。至今已經(jīng)在HBV的基因中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)開放閱讀框。在由它們所表達(dá)的蛋白中，24kd SHBs(S位點(diǎn))，31kd MHBs(Pre S2+S)和38kd LHBs(Pre S1+Pre S2+S)組成了HBV的病毒外殼。用電泳測(cè)定來自血漿中的HBsAg時(shí)，發(fā)現(xiàn)似乎HBsAg彼此之間具有不同分子量的p-24和糖基化的p-30。在自然條件下，HBsAg不是以單獨(dú)的蛋白質(zhì)存在，而是以含有糖和脂類的復(fù)合蛋白的形式存在。HBsAg以具有約3,000,000的分子量和約20nm的直徑的大顆粒的形式存在。當(dāng)被乙肝病毒感染后，HBcAg(乙肝核心抗原)，HBsAg和HBeAg(乙肝e抗原)的抗體產(chǎn)生。其中，只有HBsAg抗體已被證實(shí)對(duì)HBV的再次感染具有免疫保護(hù)作用。
因此，至今開發(fā)針對(duì)乙肝病毒的保護(hù)疫苗的目標(biāo)是通過施用疫苗產(chǎn)生HBsAg抗體。一個(gè)人是否獲得了對(duì)乙肝的免疫力取決于HBsAg抗體的存在。通常，當(dāng)他/她的HBsAg抗體濃度高于10mIU/ml時(shí)，即認(rèn)為已經(jīng)獲得了抗HBV的免疫力。如果抗體水平低于10mIU/ml就推薦再次接種疫苗。
很多公司已經(jīng)生產(chǎn)出了檢測(cè)抗HBsAg抗體的診斷試劑。反應(yīng)原理利用了夾層法，即加入的血漿或血清同固定在固體支持物(例如平板，珠或其它同類的東西等)上的HBsAg發(fā)生反應(yīng)從而使HBsAg抗體同表面抗原結(jié)合，然后用酶或同位素或其它類似技術(shù)標(biāo)記的第二HBsAg同抗體結(jié)合。根據(jù)標(biāo)記的方法，在診斷試劑中所用的分析方法被分成幾類；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，放射免疫測(cè)定(RIA)和其它同類的方法?，F(xiàn)在已經(jīng)使用的用于檢測(cè)HBsAg抗體的大多數(shù)診斷試劑利用由血漿中純化的HBsAg。但是由血漿純化的HBsAg不是純的表面抗原蛋白，而是含有糖類和脂類的復(fù)合蛋白。因此，可能檢測(cè)出不是由HBsAg抗體蛋白而是由除HBsAg蛋白以外的成分的抗體或同其具有親和性的材料所造成的錯(cuò)誤陽(yáng)性信號(hào)。雖然使用了低濃度的標(biāo)記的第二抗原以降低這樣的錯(cuò)誤陽(yáng)性信號(hào)，但是在這種情況下診斷試劑的靈敏度降低。作為克服這些方法的低靈敏度的嘗試，有一種試劑盒(Abbot，美國(guó))，它利用了將生物素共價(jià)連接到第二HbsAg上和使用用辣根過氧化酶標(biāo)記的抗生物素抗體的技術(shù)。
發(fā)明的公開本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于乙肝表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的具有更高靈敏度和特異性的診斷試劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于乙肝表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的診斷試劑的制備方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供靈敏度和特異性更高的診斷乙肝表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的方法。
本發(fā)明提供了一種使用夾層免疫測(cè)定作為乙肝表面抗原抗體的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑，其特征在于該診斷試劑含有由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種使用夾層免疫測(cè)定作為乙肝病毒抗體的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑，其特征在于該診斷試劑含有由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。
本發(fā)明還提供了一種利用夾層免疫測(cè)定作為乙肝表面抗原抗體的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑的制備方法，其特征在于該方法包括將由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原包含在診斷試劑中的步驟。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種利用夾層免疫測(cè)定作為乙肝病毒抗體的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑的制備方法，其特征在于該方法包括將由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原包含在診斷試劑中的步驟。
另外，本發(fā)明提供了一種利用夾層免疫測(cè)定作為乙肝表面抗原抗體的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗體的診斷方法，其特征在于該診斷方法利用由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種利用夾層免疫測(cè)定作為乙肝病毒抗體的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗體的診斷方法，其特征在于該診斷方法利用由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。
例如根據(jù)來源(例如來自血漿的HBsAg和重組HBsAg)或一對(duì)第一和第二抗原的純化方法，本發(fā)明的診斷試劑包含兩種互不相同的HBsAg。
檢測(cè)乙肝抗體的常規(guī)的診斷試劑利用了通過乙肝病毒表面抗原(HBsAg)檢測(cè)抗體的方法。在這種情況下使用的HBsAg是從人血漿中獲得的HBsAg或重組HBsAg(Ostrow，D.H.等，通過自動(dòng)微粒酶免疫法定量測(cè)定乙肝表面抗體，病毒學(xué)方法雜志32(1991)265-276)。但是，HBsAg是一種膜蛋白。這種純蛋白質(zhì)自己不能保持其天然構(gòu)象。因此，HBsAg含有大量的碳水化合物和脂類。而且，由于HBsAg的顆粒結(jié)構(gòu)，幾乎不可能以純蛋白質(zhì)的形式分離出HBsAg。換句話說，用于檢測(cè)乙肝抗體的診斷試劑中的乙肝表面抗原不可避免地含有大量雜質(zhì)。本發(fā)明能夠通過結(jié)合兩種，例如根據(jù)來源或純化方法而互不相同的HBsAg來減少由這樣的雜質(zhì)所引起的非特異性反應(yīng)。
按照本發(fā)明，提供了具有更高靈敏度和特異性的用于乙肝表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的診斷試劑，及其制備方法。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供了用于乙肝表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的具有更高靈敏度和特異性的診斷方法。根據(jù)下面的說明和所附的權(quán)利要求將使本發(fā)明的其它特征、方面以及優(yōu)點(diǎn)更易于理解。
特別地，本發(fā)明提供了一種以?shī)A層免疫分析作為乙肝表面抗原抗體的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑，其特征在于該診斷試劑含有由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種利用夾層免疫測(cè)定作為乙肝病毒抗體的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑，其特征在于該試劑含有由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。
優(yōu)選的，本發(fā)明的診斷試劑可以含有源于血漿的表面抗原和重組表面抗原作為一對(duì)乙肝表面抗原。更優(yōu)選的是，本發(fā)明診斷試劑中的重組表面抗原可以包括源于酵母或源于動(dòng)物細(xì)胞的表面抗原。另外，本發(fā)明的診斷試劑可以含有由不同純化方法得到的互不相同的兩種表面抗原作為一對(duì)乙肝表面抗原。在本發(fā)明診斷試劑的一個(gè)實(shí)施例中，固定在支持物上的第一抗原可以是源于血漿的表面抗原，同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原可以是重組表面抗原。在本發(fā)明診斷試劑的另一個(gè)實(shí)施方案中，固定在支持物上的第一抗原可以是重組表面抗原，同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原可以是源于血漿的表面抗原。在本發(fā)明診斷試劑中的標(biāo)記物可以包括酶、放射性物質(zhì)、微顆粒、染色劑或其它同類的物質(zhì)。
另外，本發(fā)明提供了一種利用夾層免疫測(cè)定作為乙肝表面抗原抗體的定量或定性分析方法的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑的制備方法，其特征在于該方法包括將由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物相結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原包含在診斷試劑中的步驟。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種利用夾層免疫測(cè)定作為乙肝病毒抗體的定量或定性分析方法的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑的制備方法，其特征在于該方法包括將由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物相結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原包含在診斷試劑中的步驟。
另外，本發(fā)明提供了一種利用夾層免疫測(cè)定作為乙肝表面抗原抗體的定量或定性分析方法的用于乙肝表面抗原抗體的診斷方法，其特征在于該方法利用了由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物相結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種利用夾層免疫測(cè)定作為乙肝病毒抗體的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗體的診斷方法，其特征在于該方法利用了由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物相結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。
下文將對(duì)本發(fā)明做出詳細(xì)描述。將乙肝病毒表面抗原(第一抗原)固定在如微孔平板、膜或微顆粒一類的固體支持物上是為了用于結(jié)合HBsAg特異抗體。然后，使用同標(biāo)記物結(jié)合的另一個(gè)表面抗原(第二抗原)檢測(cè)與固定在支持物上的第一抗原結(jié)合的抗體。例如，根據(jù)來源或純化方法，所使用的第二抗原不同于第一抗原。例如，可以用從血漿獲得的HBsAg和重組HBsAg分別作為第一和第二抗原。也可以用重組HBsAg和從血漿獲得的HBsAg分別作為第一和第二抗原。在這些情況下，重組HBsAg包括從酵母中獲得的和從動(dòng)物細(xì)胞或同類的細(xì)胞中獲得的。另外，以不同方法純化的HBsAg可以分別用作第一或第二抗原。可以通過上述標(biāo)記物檢測(cè)乙肝抗體的濃度。與第二抗原結(jié)合的標(biāo)記物包括象放射性同位素一類的放射性物質(zhì)，象堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶一類的酶，象微顆粒、膠體金一類的熒光物質(zhì)或染料，或諸如此類的物質(zhì)。利用上面的方法，本發(fā)明的診斷試劑能以更高的靈敏度和特異性檢測(cè)乙肝抗體。
上面描述的本發(fā)明具有很多優(yōu)點(diǎn)，包括提供了具有更高靈敏度和特異性的用于乙肝表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的診斷試劑，提供了其制備方法，并且提供了具有更高靈敏度和特異性的的用于乙肝表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的診斷方法。
下面結(jié)合以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出更詳細(xì)的描述，這些實(shí)施例應(yīng)當(dāng)認(rèn)為僅僅是作為示范而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 從血漿中純化乙肝病毒表面抗原在冰浴中，將59ml飽和硫酸銨緩慢加入到140ml乙肝表面抗原陽(yáng)性血液中并攪拌1小時(shí)。將溶液在離心機(jī)中以12,000rpm離心20分鐘，將得到的200ml上清液轉(zhuǎn)入冰浴的500-ml玻璃燒杯中。將80ml的飽和硫酸銨緩慢加入到上清液中并攪拌2小時(shí)。去除上清液后，加入30ml磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解殘余物質(zhì)。使該溶液通過裝有2L瓊脂糖凝膠CL-4B(Pharmacia，瑞典)并用PBS平衡的柱。然后，以每次40ml收集洗脫液。用LG HBsAg-ELISA(LG household & health Care，韓國(guó))測(cè)定每部分洗脫液的抗原效價(jià)以收集含有抗原的部分。向收集液中加入氯化銫(CsCl)以使最終濃度達(dá)到25％并溶解，然后在45,000rpm下超速離心48小時(shí)。收集含有抗原的部分后，將其在1L的PBS中透析3次并儲(chǔ)存在冰箱中。實(shí)施例2 從重組酵母中純化乙肝病毒表面抗原將70g表達(dá)乙肝病毒抗原的重組酵母，啤酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)pYLBC GAP-UB-HBs/AB110(于1996年1月5日保藏在韓國(guó)生物科學(xué)技術(shù)研究所典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)KCTC 8722P，參考韓國(guó)專利號(hào)177307)懸浮在細(xì)胞裂解液中(0.5M NaCl，10mM EDTA，0.1M磷酸鹽緩沖液，0.5％ Triton X-100，pH 7.0)，用Bead Beaor(Biospec Product，美國(guó))玻璃珠裂解酵母細(xì)胞。將5N的鹽酸(HCl)加入到該溶液中以調(diào)整pH到3.8，然后通過離心獲得澄清的上清液。該上清液被滴定到pH為7.0后，向上清液中加入硅石粉(Aerosil-380)然后在冷室中攪拌12小時(shí)以使表面抗原固定在硅石上。通過離心收集固定了表面抗原的硅石并用PBS洗滌兩次以去除沒有吸附上的雜質(zhì)。在50mM pH9.5的碳酸鹽緩沖液中攪拌3小時(shí)以使乙肝表面抗原從硅石上解吸附，然后離心溶液以獲得上清液。然后將上清液進(jìn)行DEAE層析和凝膠過濾層析，從重組酵母中純化表面抗原并用于分析。實(shí)施例3 制備同辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的乙肝表面抗原在Centriprep(Amicon，美國(guó))中將上面實(shí)施例2中制備的純化的重組乙肝表面抗原溶液重復(fù)離心(3,000rpm，10分鐘)濃縮到1ml。當(dāng)用商業(yè)上可獲得的BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)，用PBS稀釋濃縮物到最終蛋白濃度為10mg/ml。將10mg/ml的抗原溶液在1升pH9.6的0.01M的碳酸鈉緩沖液中于4℃下透析1天。在透析過程中更換3次緩沖液。測(cè)量5mg的HRP并將其溶解于裝有0.5ml蒸餾水的試管中。為氧化HRP，將42mg/ml的NaIO4100μl加入到0.5ml 10mg/ml的HRP溶液。并將試管用箔包裹后在室溫下振蕩30分鐘進(jìn)行氧化反應(yīng)。在上述溶液中加入60μl1M的甘油以終止氧化反應(yīng)。然后，將用箔包裹的試管在室溫下振蕩1小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)。將上述溶液在1L 0.01M pH9.6的碳酸鈉緩沖液中于4℃下透析1天進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。在透析過程中更換3次緩沖液。透析后，將氧化的HRP溶液轉(zhuǎn)入新的試管中，然后向新試管中加入上述10mg/ml的抗原溶液250μl。用箔包裹試管并于室溫下振蕩3小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)。在3小時(shí)的反應(yīng)過程中，制備4mg/ml的NaBH4(即稱量4mg的NaBH4并溶于1ml的去離子水中)。為了穩(wěn)定HPR-抗原結(jié)合物，將40.8μl 4mg/ml的NaBH4溶液加入到試管中，將用箔包裹的試管在4℃下振蕩反應(yīng)2小時(shí)。為了將酶-抗原結(jié)合物從沒有結(jié)合的酶中分離出來，使用在純化結(jié)合物的前一天用PBS平衡的瓊脂糖凝膠CL-6B柱(1cm×45cm，Pharmacia，瑞典)。以PBS作為緩沖液將結(jié)合物溶液通過上述柱。流速大約為0.4ml/min，每分鐘收集一次。繪制了每一收集部分所代表的蛋白濃度的圖形，收集相應(yīng)于圖中第一個(gè)峰的部分。用商業(yè)上可獲得的BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定收集部分的蛋白質(zhì)濃度。向樣品中加入最終濃度為1％的牛血清清蛋白(BSV)后在-20℃下儲(chǔ)藏。實(shí)施例4 制備檢測(cè)乙肝表面抗原抗體的96孔平板96孔平板(Nunc International，美國(guó))的每一個(gè)用作酶免疫測(cè)定(EIA)的孔中分別加入100μl上述實(shí)施例1中源自血漿的純化的乙肝表面抗原溶液。用0.1M的碳酸鈉緩沖液(pH9.5)稀釋抗原溶液以使蛋白質(zhì)的最終濃度達(dá)到0.5μg/ml，然后使用。用密封帶密封平板并放置在冷室中過夜以使抗原結(jié)合到孔的表面。然后，去掉密封帶，也去除抗原溶液。在每個(gè)孔中加入250μl含有1％BSA的PBS，然后將平板在室溫下放置2小時(shí)。去掉孔中的溶液，然后將平板置于室溫下干燥以去潮。將平板和去濕劑放在密閉容器中并儲(chǔ)存于4℃的冰箱中備用。實(shí)施例5 乙肝表面抗原抗體的檢測(cè)用實(shí)施例1和2的方法獲得血漿和重組抗原后，用實(shí)施例4的方法將血漿抗原或重組抗原固定到96孔平板上以制備每一個(gè)用于檢測(cè)的平板，用實(shí)施例3的方法將辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合到血漿抗原或重組抗原上以檢測(cè)HBsAg抗體。檢測(cè)抗體的診斷實(shí)驗(yàn)以4種不同的組合進(jìn)行，取決于固定到平板上的抗原和酶結(jié)合抗原的組合(A組固定到平板上的重組抗原和重組抗原-酶結(jié)合物；B組固定到平板上的重組抗原和血漿抗原-酶結(jié)合物；C組固定到平板上的血漿抗原和重組抗原-酶結(jié)合物；D組固定到平板上的血漿抗原和血漿抗原-酶結(jié)合物)。
將抗體陰性血漿樣品和抗體陽(yáng)性血漿樣品各100μl加入到制備好的平板的各孔中。然后，將25μl的結(jié)合物溶液加入到每個(gè)孔中，然后輕輕敲打平板框使其很好地混和。將平板轉(zhuǎn)入到反應(yīng)器中在37℃下反應(yīng)60分鐘。
用每次300μl含有吐溫20的PBS洗滌平板孔5次，然后向每個(gè)孔中加入100μl的底物溶液(100μg/ml的四甲基聯(lián)苯胺，0.006％的過氧化氫，pH4.5的檸檬酸磷酸鹽緩沖液)。在暗處顯色30分鐘后，向每個(gè)孔中加入100μl的反應(yīng)終止液(2N的硫酸)。用96孔平板讀出器(Molecular Devices，美國(guó))在450nm下測(cè)定(參考波長(zhǎng)620nm)吸光度。結(jié)果如下面的表1中所示。
表1

上面的表1的結(jié)果證明了如果用同一類型的HBsAg組合作為第一和第二抗原那么非特異性反應(yīng)率高。另一方面，用不同類型的HBsAg作為第一和第二抗原的組合的B和C組則具有低的非特異性和高的陽(yáng)性/陰性水平。實(shí)施例6 同商業(yè)上可獲得的產(chǎn)品的靈敏度的比較在四種不同的商業(yè)上可獲得的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑(對(duì)比例1-4)和按照實(shí)施例5(本發(fā)明的實(shí)施例)的C組診斷試劑之間進(jìn)行靈敏度對(duì)比實(shí)驗(yàn)。在下面表2中，對(duì)比例1的診斷試劑來自美國(guó)Abbott實(shí)驗(yàn)室的AUSABXEIA；對(duì)比例2的診斷試劑是來自德國(guó)Dade Behring的EnzygnosteAnti-HBs micro；對(duì)比例3的診斷試劑是來自韓國(guó)Green Cross的GENEDIAAnti-HBs ELISA 3.0；而對(duì)比例4的診斷試劑是來自韓國(guó)DongA Pharmaceutical Co.的DongA Anti-HBs ELISA。
靈敏度實(shí)驗(yàn)中使用的抗體是WHO(世界衛(wèi)生組織)的標(biāo)準(zhǔn)抗體。用1，2.5，5，10，50和100mIU/ml的WHO標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定吸光度以確定靈敏度。結(jié)果如下面的表2所示。表2

一般通過給陰性值加0.05-0.07以測(cè)定產(chǎn)品的截流值。
如上面的表2所示，當(dāng)每種抗體濃度分別超過10mlU/ml，5mlU/ml，10mlU/ml和10mlU/ml時(shí)，對(duì)比例1，2，3和4中的每種診斷試劑顯示出陽(yáng)性信號(hào)。相反，當(dāng)抗體濃度超過2.5mlU/ml時(shí)，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的診斷試劑顯示陽(yáng)性信號(hào)，所以它比其它對(duì)比例具有更高的靈敏度。
應(yīng)當(dāng)清楚上述實(shí)施例僅僅是為了作為示范而不是對(duì)本發(fā)明的限制。雖然根據(jù)上面的特定的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但仍然可能有其它的實(shí)施方案。因此在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的各種修改和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說應(yīng)當(dāng)是顯而易見的并且這樣的修改和改變會(huì)包括在下面的權(quán)利要求的范圍中。
權(quán)利要求
1.一種使用夾層免疫測(cè)定作為乙肝表面抗原抗體的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑，其特征在于該診斷試劑含有由固定在固體支持物上的第一抗原以及同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑，其中的診斷試劑含有源于血漿的表面抗原和重組表面抗原作為所述的一對(duì)乙肝表面抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑，其中所述的重組表面抗原包括從酵母或動(dòng)物細(xì)胞中得到的重組表面抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑，其中的診斷試劑含有用不同純化方法獲得的互不相同的兩種表面抗原作為所述的一對(duì)乙肝表面抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑，其中所述的固定在固體支持物上的第一抗原是從血漿中得到的表面抗原，而同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原是重組表面抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑，其中所述的固定在固體支持物上的第一抗原是重組表面抗原，而同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原是從血漿中得到的表面抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑，其中所述的標(biāo)記物包括酶、放射性物質(zhì)、微顆粒、染料或類似的物質(zhì)。
8.一種使用夾層免疫測(cè)定作為乙肝病毒抗體的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑，其特征在于該診斷試劑含有由固定在固體支持物上的第一抗原以及同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑，其中的診斷試劑含有源于血漿的表面抗原和重組表面抗原作為所述的一對(duì)乙肝表面抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑，其中所述的重組表面抗原包括從酵母或動(dòng)物細(xì)胞中得到的重組表面抗原。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑，其中的診斷試劑含有用不同純化方法獲得的互不相同的兩種表面抗原作為所述的一對(duì)乙肝表面抗原。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑，其中所述的固定在固體支持物上的第一抗原是從血漿中得到的表面抗原，而同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原是重組表面抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑，其中所述的固定在固體支持物上的第一抗原是重組表面抗原，而同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原是從血漿中得到的表面抗原。
14.根據(jù)權(quán)利要求8的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑，其中所述的標(biāo)記物包括酶、放射性物質(zhì)、微顆粒、染料或類似的物質(zhì)。
15.一種使用夾層免疫測(cè)定作為乙肝表面抗原抗體的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑的制備方法，其特征在于該方法包括將由固定在固體支持物上的第一抗原以及同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原包含在診斷試劑中的步驟。
16.一種使用夾層免疫測(cè)定作為乙肝病毒抗體的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑的制備方法，其特征在于該方法包括將由固定在固體支持物上的第一抗原以及同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原包含在診斷試劑中的步驟。
17.一種使用夾層免疫測(cè)定作為乙肝表面抗原抗體的定量或定性分析法的用于乙肝表面抗原抗體的診斷試劑的制備方法，其特征在于該診斷方法利用了由固定在固體支持物上的第一抗原以及同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。
18.一種使用夾層免疫測(cè)定作為乙肝病毒抗體的定量或定性分析法的用于乙肝病毒抗體的診斷試劑的制備方法，其特征在于該診斷方法利用了由固定在固體支持物上的第一抗原以及同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用夾層免疫測(cè)定作為乙肝表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的定量或定性的分析方法的用于乙肝表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的診斷試劑，其特征是每種診斷試劑含有由固定在固體支持物上的第一抗原和同標(biāo)記物結(jié)合的第二抗原組成的互不相同的一對(duì)乙肝表面抗原。本發(fā)明也提供了其制備方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于乙肝病毒表面抗原抗體和乙肝病毒抗體的診斷方法。與單獨(dú)使用一種乙肝病毒表面抗原的診斷試劑和方法相比較，本發(fā)明所提供的診斷試劑和方法的靈敏度和特異性有顯著地提高。
文檔編號(hào)G01N33/576GK1416463SQ01804338
公開日2003年5月7日 申請(qǐng)日期2001年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月1日
發(fā)明者林國(guó)鎮(zhèn), 吳宰勳, 孫美進(jìn), 柳承范, 李相翊 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Lgci