專利名稱：檢測配體或類配體低分子量化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過用配體受體基因轉(zhuǎn)染的配體依賴性細胞系的細胞增殖活性作為指標(biāo)來檢測配體或類配體低分子量化合物的方法。
迄今為止，已有30種類型的細胞因子、生長因子及其類似物被鑒定為配體。例如，粒性白細胞集落刺激因子(G-CSF)是一種由單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞或類似物產(chǎn)生的生長因子。已知這種因子作用于嗜中性前體并誘導(dǎo)它們的增殖、分化和興奮，其結(jié)果是該因子可以使有機體不受病原體的侵害，并具有抗腫瘤的活性[Asano等，“JIKKEN IGAKU(Experimental Medicines)”，7(15)，1859-1865(1989)]。相應(yīng)的，配體被期望不僅僅用于嗜中性白血球減少癥，頑固性傳染性疾病和骨髓機能減退，還用于AIDS。
在另一方面，已知白介素10(IL-10)是一種由Th2細胞產(chǎn)生的因子，且能抑制來自Th1細胞的細胞因子[Ishida等，“RINSHO MENEKI(Clinical Immunology)”，27(Suppl.16)，97-106(1995)]。最近幾年，這種IL-10已被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生于不同的細胞例如激活的B細胞，巨噬細胞，角質(zhì)形成細胞，肥大細胞等等。已知這種白介素可以抑制單核細胞或巨噬細胞的MHC II型抗原，B7(CD80，CD86)的表達，且也能抑制胞間粘附分子的表達[de Waal Malefyt等，“J.Exp.Med”，177，915(1991)]。此外，其增殖抑制作用抵抗了T細胞的增殖和其激活作用可以激活B細胞[Ishida等，“RINSHO MENEKI(Clinical Immunology)”，27(Suppl.16)，97-106(1995)]。鑒于這些作用，IL-10被期望臨床應(yīng)用于自身免疫疾病(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，等)、器官移植準(zhǔn)備、炎癥性細胞因子引起的器官移植后失敗、炎性疾病等等。
另外，紅細胞生成素(EPO)主要產(chǎn)生于管狀內(nèi)皮細胞，其通過促進成紅細胞的分化或增殖和血紅素合成的mRNA誘導(dǎo)作用于早期成紅細胞前體和晚期成紅細胞前體來刺激紅細胞生成[Hirashima等，“JIKKEN IGAKU(Experimental Medicines)”，7(15)，1852-1858(1989)]，且其目前被臨床應(yīng)用于腎貧血和頑固性貧血(再生障礙性貧血，頑固性貧血)。另一方面，血小板生成素(TPO)主要產(chǎn)生于肝的竇狀內(nèi)皮細胞，其作用于成巨核細胞前體和成巨核細胞來刺激誘導(dǎo)巨核細胞產(chǎn)生血小板[Teramura等，“GAN TOKAGAKU RYOHO”(Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy)，26(4)，421-428(1999)]，且其目前被期望臨床用于血小板減少癥，急性骨髓性白血病，再生障礙性貧血，脊髓發(fā)育不良綜合征以及與制癌化學(xué)療法，癌放射治療或骨髓移植相關(guān)的疾病等。
胰島素是一種生理活性物質(zhì)，其由胰腺β細胞產(chǎn)生且與糖尿病密切相關(guān)。與細胞膜上的胰島素受體結(jié)合的結(jié)果增強了細胞膜的跨膜傳遞，促進了糖或氨基酸進入細胞，抑制脂肪組織的脂肪水解作用，并促進糖原和蛋白質(zhì)在肌肉和肝臟中的合成[Zawalich，W.S.等，“Endocrinology”，103，2027-2034(1978)]。目前在日本采取胰島素療法治療的糖尿病患者有280，000之多，且此種病患者的人數(shù)呈每年穩(wěn)定地增加。
神經(jīng)生長因子(NGF)是被合成在大腦皮層和海馬溝中，其作用于周圍神經(jīng)例如交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)，且在功能維持和存活維持中是有效的[Mima等，“IYAKU JOURNAL(Medcine and Drug Journal)”，26(2)，245-249(1990)]?，F(xiàn)在神經(jīng)生長因子被期望發(fā)現(xiàn)對阿耳茨海默氏病，腦局部貧血病，外周神經(jīng)損傷等疾病的臨床應(yīng)用。
關(guān)于上述的這些配體(生理活性物質(zhì))，其基因最近被相繼地分離，由此可以提供基因重組型的生理活性物質(zhì)并且可以鑒定很多種能夠充當(dāng)配體(生理活性物質(zhì))的肽。
然而，這些肽除了很少一部分外尚未被用作藥物，僅僅G-CSF，干擾素α等在被臨床應(yīng)用。這些肽難于用作藥物的原因是，除了其他因素外，這些肽作為蛋白質(zhì)，易受新陳代謝的影響，且殘基階段短暫，另外其也趨向于誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生從而被中和。
鑒于要克服上述的問題，能夠誘導(dǎo)這些配體(生理活性物質(zhì))的類似功能取代蛋白質(zhì)配體的低分子量化合物(以下稱為“類配體低分子量化合物”)的篩選正在被進行中。然而，迄今已知的這些篩選方法伴隨這樣一個問題，由于它們要使用感受態(tài)細胞作為配體的受體(生理活性物質(zhì))，在結(jié)合配體到相應(yīng)的受體上之后必須進行信號的復(fù)雜追蹤盡管這種信號的測定是很難的。例如，產(chǎn)生于感受態(tài)細胞的物質(zhì)的定量測定或感受態(tài)細胞中的信號或類似物的測定是必需的，其中產(chǎn)生的問題是需要極端復(fù)雜的定量分析或測定。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種通過簡單的步驟精確篩選配體(生理活性物質(zhì))或能夠以類似的方式充當(dāng)配體的低分子量化合物的方法。
因此本發(fā)明提供了一種檢測供試化合物中的配體或類配體低分子量化合物的方法，其包括步驟從其他細胞系中分離配體依賴的細胞系，其已被轉(zhuǎn)染來自其它細胞系的配體受體基因和抗生素抗性基因，在供試化合物存在的條件下培養(yǎng)配體依賴的細胞系，然后檢測配體依賴的細胞系的細胞增殖活性。
本發(fā)明也提供了一種如上所述的檢測供試化合物中的配體或類配體低分子量化合物的方法，其中配體依賴的細胞系的培養(yǎng)是在供試化合物和至少一種還原劑和白介素3(IL-3)的存在下進行的。
本發(fā)明進一步提供了一種試劑和一種試劑盒，其用于上述的兩種方法中。
附圖2是一個顯示了實施例2培養(yǎng)基中hIL-10濃度和用hIL-10受體基因轉(zhuǎn)染的細胞系的增殖程度之間關(guān)系的圖表。
附圖3為一個顯示還原劑對G-CSF依賴的細胞系增殖的影響的圖表。
附圖4為一個顯示IL-3對G-CSF依賴的細胞系增殖的影響的圖表。
附圖5為一個顯示還原劑和IL-3對G-CSF依賴的細胞系增殖的影響的圖表，其中的G-CSF是類G-CSF低分子量物質(zhì)。
附圖6為一個顯示還原劑對IL-10依賴的細胞系增殖的影響的圖表。
附圖7為一個顯示IL-3對IL-10依賴的細胞系增殖的影響的圖表。
附圖8是一個圖表其表明實施例8培養(yǎng)基中的hEPO濃度和用hEPO受體基因轉(zhuǎn)染的細胞系增殖的程度之間關(guān)系的結(jié)果。
附圖9是一個表明還原劑對EPO依賴性細胞系的增殖的影響的圖表。
附

圖10是一個表明IL-3對EPO依賴細胞系的增殖的影響的圖表。
發(fā)明的實施方案此處的術(shù)語“配體依賴的細胞系”是指一種細胞系，其僅僅當(dāng)配體或類配體低分子量化合物(在下文被稱作“配體或其類似物”)存在于培養(yǎng)中時才可以生長和增殖。此外，術(shù)語“類配體低分子量化合物”是指一種低分子量化合物，其具有一種或多種特異性結(jié)合于在細胞表面表達的受體上的特性，一種激活受體的活性和一種取代細胞中信號的特性，并且該配體低分子量化合物作用于生物體類似于配體。
每一種用于本發(fā)明的配體依賴的細胞系均可通過導(dǎo)入與被測定的配體或其類似物相關(guān)的配體受體基因，和一種抗生素抗性基因到所培養(yǎng)的細胞系中來制備。
具體說，配體依賴的細胞系可通過懸浮所培養(yǎng)的細胞系在合適的緩沖液中，將已被用配體受體基因和抗生素抗體基因轉(zhuǎn)染的在合適溶劑中的DNA溶液加到懸浮液中，然后導(dǎo)入DNA到所培養(yǎng)的細胞系中來制備。
用于本發(fā)明的所培養(yǎng)的細胞系的例證為白介素3(IL-3)依賴的鼠細胞系，例如，BAF/B03[Palacios，R.等，“Cell”，41，727-734(1985)；Shi，Y.等，“J.I mmunol.”，159，5318-5328(1997)]。用于懸浮此種細胞的緩沖液的例子可包括K-PBS(30.8mM NaCl，120.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.46mMKH2PO4，5mM MgCl2)。
被插入到此種細胞中的配體受體基因，可以使用，例如通過下述論文中描述的方法獲得的-人粒細胞菌落刺激因子受體Larsen，B.A等，“J.Exp.Med”，172，1559-1570(1990).
-人白介素10受體Liu，Y等，“J.Immunol.”，152，1821-1829(1994).
-人促紅細胞生成素受體Jones，S.S，等，“Blood“，76，31-35(1990).
-人血小板生成素受體Mignotte，V.等，“Genomics”，20，5-12(1994).
-人胰島素受體Ebina，Y.等，“Cell”，40，747-758(1985).
-人神經(jīng)生長因子受體Johnson，D.等，“Cell”，47，545-554(1986).
在另一方面，在細胞中插入抗生素抗性基因是為了方便對帶有被導(dǎo)入的配體受體基因的細胞的篩選?？衫玫目股乜剐曰虻睦影ㄠ堰拭顾乜剐曰?，潮霉素抗性基因和新霉素抗性基因。與這些抗生素抗性基因一樣，那些通過已知的相關(guān)論文中描述的方法獲得的抗生素抗性基因可以被使用。然而，帶有各種被插入的抗生素抗性基因的質(zhì)粒也可以現(xiàn)成得到。所以，也可以插入上述的配體受體基因到這些質(zhì)粒中并將產(chǎn)生的質(zhì)粒用作配體受體基因和抗生素抗性基因轉(zhuǎn)染的DNAs。此種質(zhì)粒的例子為pcDNA3.1，pcDNA3.1/Zeo，pcDNA3.1/Hygro，和pIRESpuro。
在溶解和插入用配體受體基因和抗生素抗性基因轉(zhuǎn)染的DNA時，最好使用通常用來溶解DNAs的溶劑來溶解DNAs，例如，TE緩沖液(10mMTris-HCl，1mM EDTA；pH8.0)。
作為導(dǎo)入配體受體基因和抗生素抗性基因到所培養(yǎng)的細胞系中的程序和方法，已知的程序和方法例如電穿孔，DEAE葡聚糖法，核糖體法或微注射法可被使用。其中，優(yōu)選使用電穿孔法，因為其簡單且高效的基因?qū)搿?br> 依照電穿孔方法，采用高電壓脈沖來通過懸浮培養(yǎng)物細胞系和用于編碼配體受體基因及其類似物的DNA的溶液，由此使細胞系的細胞壁形成微孔并且通過這些微孔使配體受體基因被導(dǎo)入到細胞中。作為電穿孔的特定條件，優(yōu)選設(shè)置電壓為260V到300V且電容大約為960μF。一種關(guān)于配體受體基因?qū)氲叫∈蠹毎礏AF/B03中的方法已被Rowlinson S.W等所報道。配體受體的導(dǎo)入可以，采用被報道的方法[“J.Biological Chemistry”，273(9)，5307-5314(1998)]。
上述的導(dǎo)入配體受體基因的細胞系然后在配體和抗生素存在的條件下被培養(yǎng)來將其從未被導(dǎo)入配體受體基因的培養(yǎng)物細胞系中分離出來。此處所使用的培養(yǎng)基可以為常規(guī)的培養(yǎng)基。然而，必需的是培養(yǎng)基含有導(dǎo)入的配體受體對應(yīng)的配體以及與抗生素抗性基因?qū)?yīng)的抗生素，而不能加入其它的配體。
在此培養(yǎng)中，僅僅用配體受體基因和抗生素抗基因轉(zhuǎn)染的細胞系被允許生長，而讓沒有用配體受體基因轉(zhuǎn)染的細胞系全部死亡。此使得從其它細胞系中分離出配體依賴的細胞系成為可能。另外，如不將配體受體基因中組合進抗生素抗性基因的話，由于培養(yǎng)基中的成分，如胎牛血清(FCS)，的作用，即便是未用配體受體基因轉(zhuǎn)染的細胞系也會有增殖的可能性。
依上述方法構(gòu)建的配體依賴細胞系被用于供試化合物中配體或類配體低分子量化合物的測定。這種試驗的方法可通過在供試化合物以合適濃度存在的條件下培養(yǎng)細胞系且然后測定細胞增殖的程度來進行。由于配體依賴的細胞系僅在配體或類配體低分子量化合物存在的條件下生長，配體依賴的細胞系的增殖使得測定配體或類配體低分子化合物的存在成為可能，并且可以因此推斷化合物為類配體低分子化合物。
在進行配體依賴的細胞系的上述培養(yǎng)時，優(yōu)選除供試化合物外在培養(yǎng)基中加入還原劑和可選擇性地加入白介素3(IL-3)。其中，還原劑增強培養(yǎng)物中細胞的活性并促進其增殖。
盡管對還原劑沒有特別的限定，但從起作用的角度考慮，最好使用例如2-巰基-乙醇和α-硫代甘油等還原劑。還原劑在培養(yǎng)基中的優(yōu)選的量有個范圍，但并不特定的限定于，從大約10-6到大約10-3M，特別是10-5到大約10-4M。
此外，IL-3也可以增強所培養(yǎng)的細胞的活性，在本發(fā)明方法的實施中，IL-3可以產(chǎn)生促進所培養(yǎng)的細胞增殖的優(yōu)越效果。
對于IL-3來說，IL-3例如小鼠重組IL-3或已知含有相同物質(zhì)的培養(yǎng)物可以被使用。IL-3的濃度優(yōu)選從大約0.01到大約100ng/mL，特別是從大約0.1到大約10ng/mL。
配體依賴性細胞增殖或不增殖可以被測定，例如，通過培養(yǎng)配體依賴的細胞系在含有供試化合物的培養(yǎng)基中維持預(yù)定的時間且在培養(yǎng)結(jié)束后進行計數(shù)。培養(yǎng)可在優(yōu)選的條件下進行，例如，在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)大約48小時。在培養(yǎng)后進行細胞計數(shù)時，還原型顯影染色試劑被用作比色物質(zhì)。優(yōu)選的還原型顯影染色試劑的例子可包括四氮唑鹽，WST-1[2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二硫代-苯基)-2H-四氮唑鈉鹽]是特別優(yōu)選的。
作為此四氮唑-染色顯影劑的電子載體，吩嗪甲基硫酸鹽電子載體是優(yōu)選的，特別優(yōu)選的是與1-甲氧基PMS(1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸鹽)聯(lián)合使用。用于細胞增殖測定的試劑盒市場上有銷售，產(chǎn)品名稱為“細胞計數(shù)試劑盒”(”Cell Counting Kit”)，銷售廠家為Dojindo Laboratories。該試劑盒內(nèi)有WST-1和1-甲氧基PMS。
為了實施本發(fā)明的方法，優(yōu)選使用，例如用于配體或類配體低分子量化合物的分析試劑或試劑盒，其含有下列(a)到(d)的組分(a)一種用配體受體基因和抗生素抗性基因轉(zhuǎn)染的配體依賴的細胞系；(b)一種用于所述配體依賴的細胞系的培養(yǎng)基；(c)一種比色物質(zhì)；以及(d)一種電子載體。
在這些組分中，組分(a)和組分(b)分別為用于本發(fā)明方法中的細胞系和允許其增殖的培養(yǎng)基，而組分(c)和組分(d)為測定細胞增殖的試劑。依據(jù)需要可以將還原劑和/或IL-3加到上述組分的組分(b)中。
當(dāng)制備用于配體或其類似物的試劑盒時，這些單獨的組分可分別提供或以兩種或多種組分混合試劑的形式提供，且最終這些組分或組分混合試劑將被混合在一起。如果不自己制備試劑盒，也可以按上文提到的渠道，商業(yè)購買用于細胞增殖測定的WST-1、比色物質(zhì)、和1-甲氧基PMS、電子載體組合式試劑盒。這種試劑盒可被用來替代組分(c)和組分(d)。工業(yè)應(yīng)用性配體或類配體低分子量化合物物質(zhì)的傳統(tǒng)測定方法是使用配體(生理活性物質(zhì))的感受態(tài)細胞，并且需要經(jīng)過諸如測定信號或測定配體(生理活性物質(zhì))結(jié)合到物質(zhì)的受體上之后的產(chǎn)物等過程。
另一方面，本發(fā)明的方法利用了通過插入配體受體基因到細胞中而獲得的并在細胞表面含有生理活性物質(zhì)受體的細胞系。受體表達的細胞不能夠增殖除非來自受體的信號被傳遞。換句話說，這些細胞不能存活除非配體(生理活性物質(zhì))或其替代化合物結(jié)合到在細胞表面表達的受體上。
從前面所述的可以理解，通過細胞的存活或死亡表達來表示配體或類配體低分子量化合物在測試系統(tǒng)中的存在或不存在已成為可能。目前依據(jù)細胞系增殖的程度來定量篩選大量的低分子量化合物已成為可能，且與傳統(tǒng)的測定相比其非常地簡單。
相應(yīng)地，本發(fā)明能敏捷地和容易地測定替代配體(生理活性物質(zhì))參與免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)或神經(jīng)系統(tǒng)活動的低分子量化合物，并且在能夠直接作用免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)或神經(jīng)系統(tǒng)的藥物例如免疫增強劑的開發(fā)中是非常有用的。
表達載體人G-CSF-R/pIRESpuro，(20μg)被加到K-PBS(800μL；30.8mM NaCl，120.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.46mM KH2PO4，5mMMgCl2)中的宿主細胞BAF/B03(5×107細胞)中，產(chǎn)生的混合液4℃放置15分鐘?；虻膶?dǎo)入通過280V電壓和950μF電容電穿孔來進行。導(dǎo)入基因后，細胞被懸浮在含有10％小鼠細胞系WEHI-3B培養(yǎng)物(WEHIsup)的DMEM培養(yǎng)基((+)10％FCS)中并被溫育，所述培養(yǎng)物含有小鼠IL-3。48小時后，細胞被懸浮在含有嘌呤霉素(2μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基((+)10％FCS，2ng/mL重組人G-CSF(rhG-CSF))中，并且被構(gòu)建。
在檢測細胞增殖活性時，用人G-CSF受體基因(BAF/hGCSFR)轉(zhuǎn)染的細胞系被回收，用PBS(-)洗滌，被懸浮在DMEM培養(yǎng)基((-)FCS)中。細胞在96孔皿上被制備為5×104細胞/孔。對于每個小孔而言，rhG-CSF分別以0，0.025，0.1，0.4，1.6或6.4ng/mL被加入，然后在5％CO2中37℃溫育48小時。溫育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories產(chǎn)品)被加入到各小孔中(最終濃度5mM)且然后在CO2細菌培養(yǎng)箱中進行染色反應(yīng)。反應(yīng)后，在450nm的測定波長處進行測定。
結(jié)果，用人G-CSF受體基因轉(zhuǎn)染的細胞系(BAF/hGCSFR)被發(fā)現(xiàn)在0.025到6.4ng/mL的rhG-CSF濃度范圍中具有良好的線性(附圖1)。因此，很顯然本發(fā)明的方法使得hG-CSF或類hG-CSF低分子量化合物的定量測定成為可能。
表達載體，人IL-10/pIRESpuro，(20μg)被加到K-PBS(800μL；30.8mM NaCl，120.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.46mM KH2PO4，5mM MgCl2)中的宿主細胞BAF/B03(5×107細胞)中，產(chǎn)生的混合液4℃放置15分鐘。通過280V電壓和950μF電容電穿孔來進行基因的導(dǎo)入。導(dǎo)入基因后，細胞被懸浮在含有10％小鼠細胞系WEHI-3B培養(yǎng)物(WEHIsup)的DMEM培養(yǎng)基((+)10％FCS)中并被溫育，所述培養(yǎng)物含有小鼠IL-3。48小時后，細胞被懸浮在含有嘌呤霉素(2μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基((+)10％FCS，2ng/mL重組人IL-10(rhIL-10))中，并且被構(gòu)建。
在檢測細胞增殖活生時，回收用人IL-10受體基因(BAF/h IL-10R)轉(zhuǎn)染的細胞系，接著用PBS(-)洗滌，然后懸浮在DMEM培養(yǎng)基((-)FCS)中。細胞在96孔皿上被制備為5×104細胞/孔。對于每個小孔而言，rh IL-10分別以0、0.0001，0.001，0.01，0.1，1，10，100或1000ng/mL被加入，然后在5％CO2中37℃溫育48小時。溫育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories產(chǎn)品)被加入到各小孔中(最終濃度5mM)且然后在CO2細菌培養(yǎng)箱中進行染色反應(yīng)。在反應(yīng)后，在450nm的測定波長處進行測定。
結(jié)果，用人IL-10受體基因轉(zhuǎn)染的細胞系(BAF/h IL-10R)被確定其細胞增殖增加的量同等于當(dāng)rhIL-10為0.1到1000ng/mL時增加的量(附圖2)。因此，很顯然本發(fā)明的方法使得hIL-10或類hIL-10低分子量化合物的測定成為可能。
對于每個小孔而言，rhG-CSF分別以0，0.025，0.1，0.4，1.6或6.4ng/mL被加入，然后在5％CO2中37℃溫育48小時。溫育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories產(chǎn)品)被加入到各小孔中(最終濃度5mM)，且然后在CO2細菌培養(yǎng)箱中進行染色反應(yīng)。結(jié)果，BAF/hG-CSFR的增殖在rhG-CSF的存在下通過加入2-氫硫基乙醇，一種還原劑，經(jīng)過細胞系的溫育而被加強。此外，在rhG-CSF的濃度分別為0.1，0.4，1.6和6.4ng/mL時增殖的顯著的差別被觀察到。結(jié)果被顯示于附圖3。
這些培養(yǎng)基分別被注入到96孔皿的各小孔中，且已用PBS(-)洗滌的BAF/hG-CSFR被懸浮為5×104細胞/孔。對于每個小孔而言，rhG-CSF分別以0，0.025，0.1，0.4，1.6或6.4ng/mL被加入，然后在5％CO2中37℃溫育48小時。
溫育后，將WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories產(chǎn)品)加入到各小孔中(最終濃度5mM)，且然后在CO2細菌培養(yǎng)箱中進行染色反應(yīng)。結(jié)果，BAF/hG-CSFR的增殖在rhG-CSF的存在下通過加入小鼠重組IL-3和WEHIsup并經(jīng)過細胞系的溫育而被加強。當(dāng)經(jīng)過加入小鼠重組IL-3和WEHIsup的細胞增殖進行比較時，在rhG-CSF的濃度分別為1.6和6.4ng/mL時觀察到增殖的顯著差別。結(jié)果被顯示于附圖4。
這些培養(yǎng)基分別被注入到96孔皿的各小孔中，且已用PBS(-)洗滌的BAF/hG-CSFR被懸浮為5×104細胞/孔。對于每個小孔而言，分別以0，10-10，10-9，10-8，10-7和10-6M加入SB247464[一種替代G-CSF的低分子量化合物，Smithkline Beecham Seiyaku K.K報道；參見“Science”，281(5374)257-9(1998)]，然后在5％CO2中37℃溫育48小時。
溫育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories產(chǎn)品)被加入到各小孔中(最終濃度5mM)，且然后在CO2細菌培養(yǎng)箱中進行染色反應(yīng)。結(jié)果，BAF/hG-CSFR的增殖在SB247464的存在下通過加入WEHIsup到培養(yǎng)基中而被加強。此外，在SB247464的濃度分別為10-8，10-9，10-10時觀察到增殖的顯著差別。結(jié)果被顯示于附圖5。
對于每個小孔而言，rh IL-10F分別以0，0.0001，0.001，0.01，0.1，1，10，100和1000ng/mL被加入，然后在5％CO2中37℃溫育48小時。溫育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories產(chǎn)品)被加入到各小孔中(最終濃度5mM)，且然后在CO2細菌培養(yǎng)箱中進行染色反應(yīng)。結(jié)果，BAF/hIL-10R的增殖在rhIL-10的存在下通過加入2-氫硫基乙醇，一種還原劑，經(jīng)過細胞系的溫育而被加強。此外，在rhIL-10的濃度分別為10，100和1000ng/mL時被觀察到增殖的顯著差別。結(jié)果被顯示于附圖6。實施例7IL-3對IL-10-依賴的細胞系增殖的影響關(guān)于在實施例2中獲得的導(dǎo)入人IL-10受體基因的細胞系(BAF/hIL-10R)，通過IL-3的存在對其篩選產(chǎn)生的影響的研究被描述如下。首先，三種培養(yǎng)基被提供，包括一種通過加入一種以最終2ng/mL濃度的小鼠重組IL-3到DMEM培養(yǎng)基((-)FCS，加入終濃度為5×10-5M的2-氫硫基乙醇)中獲得的培養(yǎng)基，另一種培養(yǎng)基為通過加入小鼠細胞系WEHI-3B使終濃度為0.625％的培養(yǎng)物而獲得的培養(yǎng)基，且另一種培養(yǎng)基僅含有DMEM培養(yǎng)基((-)FCS)而沒有加入其它添加劑。
這些培養(yǎng)基分別被注入到96孔皿的各小孔中，且已用PBS(-)洗滌的BAF/hIL-10R被懸浮為5×104細胞/孔。對于每個小孔而言，分別加入以0、0.025、0.1、0.4、1.6或6.4ng/mL的rhIL-10，然后在5％CO2中37℃溫育48小時。
溫育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories產(chǎn)品)被加入到各小孔中(最終濃度5mM)，且然后在CO2細菌培養(yǎng)箱中進行染色反應(yīng)。結(jié)果，BAF/hIL-10R的增殖在rIL-10的存在下通過加入小鼠重組IL-3和WEHIsup并經(jīng)過細胞系的溫育而被加強。結(jié)果被顯示于附圖7。
表達載體人EPO-R/pIRESpuro，(20μg)被加到K-PBS(800μL；30.8mM NaCl，120.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4.1.46mM KH2PO4，5mM MgCl2)中的宿主細胞BAF/B03(5×107細胞)中，產(chǎn)生的混合液4℃放置15分鐘?；虻膶?dǎo)入通過280V電壓和950μF電容電穿孔來進行。導(dǎo)入基因后，細胞被懸浮在含有含有小鼠IL-3的DMEM培養(yǎng)基((+)10％FCS)中，并被溫育。48小時后，細胞被懸浮在含有嘌呤霉素(2μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基((+)10％FCS，250單位/mL重組人EPO(rhEPO))中，且細胞系(BAF/hEPOR)被構(gòu)建。
在檢測細胞增殖活性時，回收用人EPO受體基因(BAF/hEPOR)轉(zhuǎn)染的細胞系，用PBS(-)洗滌后，懸浮在DMEM培養(yǎng)基((-)FCS)中。細胞在96孔皿上被制備為5×104細胞/孔。對于每個小孔而言，rhEPO分別以0，0.8，1.6，3.1，6.3，12.525或50單位/mL被加入，然后在5％CO2中37℃溫育48小時。溫育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories產(chǎn)品)被加入到各小孔中(最終濃度5mM)且然后在CO2細菌培養(yǎng)箱中進行染色反應(yīng)。在反應(yīng)后，在450nm的測定波長處進行測定。
結(jié)果，用人EPO受體基因轉(zhuǎn)染的細胞系(BAF/hEPOR)被發(fā)現(xiàn)在0.8到50單位/mL的rhEPO濃度范圍中具有良好的線性(附圖8)。因此，很顯然本發(fā)明的方法使得hEPO或類hEPO低分子量化合物的定量測定成為可能。
對于每個小孔而言，分別加入0，0.8，1.6，3.1，6.3，12.5，25或50單位/mL的rhEPO，然后在5％CO2中37℃溫育48小時。溫育后，WST-l/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories產(chǎn)品)被加入到各小孔中(最終濃度5mM)，且然后在CO2細菌培養(yǎng)箱中進行染色反應(yīng)。反應(yīng)后，在450nm的測定波長處進行測定。結(jié)果，BAF/hEPOR的增殖在rhEPO的存在下通過加入2-氫硫基乙醇，一種還原劑，經(jīng)過細胞系的溫育而被加強。結(jié)果被顯示于附圖9。
這些培養(yǎng)基分別被注入到96孔皿的各小孔中，且已用PBS(-)洗滌的BAF/hEPOR被懸浮為5×104細胞/孔。對于每個小孔而言，分別加入0，0.8，1.6，3.1，6.3，12.5，25或50單位/mL的rhEPO，然后在5％CO2中37℃溫育48小時。
溫育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories產(chǎn)品)被加入到各小孔中(最終濃度5mM)，且然后在CO2細菌培養(yǎng)箱中進行染色反應(yīng)。反應(yīng)后，在450nm的測定波長處進行測定。結(jié)果，BAF/hEPOR的增殖在rEPO的存在下通過加入小鼠重組IL-3和WEHIsup并經(jīng)過細胞系的溫育而被加強。當(dāng)加入小鼠重組IL-3和WEHIsup的增殖被進行比較時，在rhEPO的濃度分別為3.1，6.3和12.5單位/mL時觀察到顯著的差異。結(jié)果被顯示于附圖10。
其它的配體受體基因也可被形成為將被插入的基因，通過RT-PCR技術(shù)克隆它們并插入這些克隆基因到如實施例1，2或8的表達載體中。在進行實施例1，2或8的方法后，形成的基因也可通過電穿孔或類似的操作被導(dǎo)入到靶細胞中，且能夠抵抗相應(yīng)的配體或類配體低分子物質(zhì)進行增殖的細胞系可被構(gòu)建。此外，依據(jù)實施例3到7或?qū)嵤├?或10的描述，配體或類配體低分子化合物可分別利用細胞系被檢測。
權(quán)利要求
1.一種測定供試化合物中的配體或類配體低分子化合物的方法，其包括從其它的細胞系中分離用配體受體基因和抗生素抗性基因轉(zhuǎn)染的配體依賴性細胞系，在所述供試化合物存在的條件下培養(yǎng)所述的配體依賴的細胞系，然后檢測所述配體依賴的細胞系的細胞增殖活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用所述配體受體基因和所述抗生素抗性基因轉(zhuǎn)染的所述配體依賴性細胞系的所述培養(yǎng)是在所述供試化合物和一種還原劑存在的條件下進行的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的還原劑是2-氫硫基乙醇或α-硫代甘油。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用所述配體受體基因和所述抗生素抗性基因轉(zhuǎn)染的所述配體依賴性細胞系的所述培養(yǎng)是在所述供試化合物，一種還原劑和白介素3存在的條件下進行的。
5.根據(jù)任一權(quán)利要求1-4之一的方法，其中所述配體受體基因是人粒性白細胞集落刺激因子受體基因，且所述供試化合物中的所述配體或所述類配體低分子量化合物為人粒性白細胞集落刺激因子或能夠替代人粒性白細胞集落刺激因子的低分子量化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的方法，其中所述配體受體基因是人白介素10受體基因，且所述供試化合物中的所述配體或所述類配體低分子量化合物為人白介素10或能夠替代人白介素10的低分子量化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的方法，其中所述配體受體基因是人促紅細胞生成素受體基因，且所述供試化合物中的所述配體或所述類配體低分子量化合物為人促紅細胞生成素或能夠替代人促紅細胞生成素的低分子量化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的方法，其中所述配體受體基因是人血小板生成素受體基因，且所述供試化合物中的所述配體或所述類配體低分子量化合物為人血小板生成素或能夠替代人血小板生成素的低分子量化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的方法，其中所述配體受體基因是人胰島素受體基因，且所述供試化合物中的所述配體或所述類配體低分子量化合物為人胰島素或能夠替代人胰島素的低分子量化合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的方法，其中所述配體受體基因是人神經(jīng)生長因子受體基因，且所述供試化合物中的所述配體或所述類配體低分子量化合物為人神經(jīng)生長因子或能夠替代人神經(jīng)生長因子的低分子量化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的方法，其中所述抗生素抗性基因是對具有蛋白質(zhì)合成抑制作用的抗生素有抗性的基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或8的方法，其中所述的抗生素抗性基因是嘌呤霉素抗性基因，潮霉素抗性基因或新霉素抗性基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的方法，其中所述配體依賴細胞系的細胞增殖活性是通過在所述配體依賴細胞系上產(chǎn)生比色物質(zhì)和電子載體來被測定的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述的比色物質(zhì)是四氮唑鹽，以及所述的電子載體為吩嗪甲基硫酸鹽電子載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的比色物質(zhì)是WST-1，以及所述的電子載體為1-甲氧基PMS。
16.一種用于配體或類配體低分子量化合物的檢測試劑，其含有下列的組分(a)-(d)(a)一種用配體受體基因和抗生素抗性基因轉(zhuǎn)染的配體依賴細胞系；(b)一種用于所述配體依賴的細胞系的培養(yǎng)基；(c)一種比色物質(zhì)；以及(d)一種電子載體。
17.如權(quán)利要求16所述的檢測試劑，其中所述的組分(b)含有一種還原劑和/或白介素3。
18.一種用于配體或類配體低分子量化合物的檢測試劑盒，其含有下列組分(a)-(d)的一種或多種(a)一種用配體受體基因和抗生素抗性基因轉(zhuǎn)染的配體依賴細胞系；(b)一種用于所述配體依賴的細胞系的培養(yǎng)基；(c)一種比色物質(zhì)；以及(d)一種電子載體。
19.如權(quán)利要求18所述的檢測試劑盒，其中所述的組分(b)含有一種還原劑和/或白介素3。
全文摘要
一種測定供試化合物中的配體或類配體低分子量化合物的方法，其特征在于從其它的細胞系中分離用配體受體基因和抗生素抗性基因轉(zhuǎn)染的配體依賴性細胞系，在所述供試化合物存在的條件下培養(yǎng)所述的配體依賴的細胞系且然后檢測細胞的細胞增殖活性。此方法的應(yīng)用使得通過簡單步驟來精確地篩選配體(生理活性物質(zhì))或具有相同功能的低分子量化合物成為可能。
文檔編號G01N33/50GK1401000SQ01804648
公開日2003年3月5日 申請日期2001年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月8日
發(fā)明者谷山忠義, 西村忠洋, 草野浩二, 榎原真二, 橘公一 申請人:愛詩愛詩制藥株式會社