專利名稱：基于分離的高處理量分析系統(tǒng)的制作方法
相關申請本申請要求于2001年5月15日提交的美國專利申請第09/859,962號和于2000年8月2日提交的美國臨時申請第60/222,491號以及于2001年3月16日提交的第60/276,731號的優(yōu)先權。上述這些申請中的整個內(nèi)容的通過完整地參考結合于此并適用所有的目的。
背景技術：
基于分離的分析是生物研究的主要部分，可以用于表征不同生物樣本、反映產(chǎn)物等。一些更加普遍的基于分離的分析的例子包括對大分子物種(例如，蛋白質(zhì)與核酸)的電泳分離。雖然已開發(fā)了能夠完成這些基于分離進行分析的常規(guī)技術，而且在某些情況下處于相當高的速率，但這些系統(tǒng)仍舊要比最佳處理量慢且是勞動密集操作。例如，常規(guī)的平板凝膠電泳是非常耗時且勞動密集的過程，其中在平板凝膠中電泳地分離樣本，該過程要耗用一個到幾個小時。凝膠及其包括的樣本隨后必須被染色并退染色，以便于在凝膠中檢測分離的物種。染色和退染色過程要再一次耗用幾個小時來完成。還開發(fā)了毛細系統(tǒng)，它通常是可自動的并仍然需要長運行時間來完成適當?shù)姆蛛x。
在基于分離的分析中還應用了微流體器件，并已在速度和準確性上產(chǎn)生了大量的優(yōu)點。但是雖然有這些優(yōu)點，商業(yè)上可提供的微流體分離系統(tǒng)還無法達到通常想要的處理量。因此，特別有用的是提供在處理量以及準確性和自動性上已得到改進的分析系統(tǒng)和方法。本發(fā)明就滿足了這些以及其它的需要。
發(fā)明概述總的來說，本發(fā)明提供了基于管道的系統(tǒng)，該系統(tǒng)在單獨的分析單元中結合大批材料的移動和電動能分離。這通常采取以大量裝載包含所感興趣樣本材料的流體為形式，隨后進行該樣本材料組成成份的電泳分離。
在第一方面，本發(fā)明通過提供一種系統(tǒng)從而提供了將樣本材料分成多個部分的方法，該系統(tǒng)包括在其中分布分離導管的基體以及在沿著樣本裝載導管的中間點上與分離導管進行流體連通的樣本裝載導管。該方法包含在分離基體基本上不偏離于分離導管的情況下將大量樣本材料流入樣本裝載導管，隨后將一部分樣本材料注入分離導管中。注入的樣本材料被隨后分為多個部分。
在相關的方面中，本發(fā)明還提供了與上述相似的方法，除了一點不同，即在樣本材料的分離之間，例如，在特定分離之前或之后，不是在分離導管中的所有分離基體都被替換掉。
本發(fā)明還通過提供一種系統(tǒng)從而提供了將樣本材料分成多個部分的方法，該系統(tǒng)包括其中含有分離基體的分離導管、與分離導管進行流體連通的樣本裝載導管、與樣本裝載導管進行流體連通的樣本材料源以及與樣本裝載導管進行流體連通的第一反應物源。該樣本材料和第一反應物被轉(zhuǎn)移到樣本裝載導管中，使得樣本材料和第一反應物形成第一混合物。該第一混合物的一部分被注入到分離導管中；且在第一混合物一部分中的樣本材料被分成多個部分。
相關地，本發(fā)明提供了一種分離系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含含有第一流體阻力和設置在其中的可流動分離基體的分離導管。該系統(tǒng)還提供了與分離導管流體連接并具有第二流體阻力的樣本裝載導管，以及用于將樣本材料轉(zhuǎn)移至樣本裝載導管的樣本裝載系統(tǒng)。第一流體阻力比第二流體阻力高出好多以避免當樣本材料被轉(zhuǎn)移到樣本裝載導管中時分離基體的大量偏移。
在相似的方面，設置的分離系統(tǒng)包含在其中分布可流動分離基體的分離導管、與分離導管流體連接的樣本裝載導管、與樣本裝載導管進行流體連通的樣本材料源、以及通過第一反應物介入管道與樣本裝載導管進行流體連通的第一反應物源。隨后將壓力源或真空源與樣本裝載導管耦連，用以在整個樣本裝載導管上施加壓力差，其中樣本裝載導管和第一反應物介入管道的尺寸，便于樣本材料和第一反應物在所施加的壓力差下以預選的速率轉(zhuǎn)移至樣本裝載導管中。
附圖簡述

圖1用示意圖描繪了含器件的微流體管道的分層結構。
圖2A是一種微流體器件的管道設計，該微流體器件特別適合本發(fā)明基于分離的分析工作。圖2B描繪了圖2A微流體器件的側視圖。
圖3A是根據(jù)本發(fā)明用于完成分離分析的一個可替換管道設計。圖3B示出了用于完成基于分離分析的一個較佳管道的設計。圖3C示出了用于執(zhí)行基于分離分析的較佳管道設計，該管道融合了一個后分離反應步驟。圖3D示出了另一個用于完成基于分離分析的可替換管道設計。
圖4是根據(jù)本發(fā)明的用于完成高處理量基于分離分析的整個系統(tǒng)。
圖5是在使用本發(fā)明器件和方法的基于ΦX174/HaeIIIDNA分離分析中的熒光與時間的曲線。
圖6是在使用本發(fā)明器件和方法的包括后分離稀釋步驟的標準蛋白質(zhì)梯形物的分離中熒光與時間的曲線。
本發(fā)明的詳細描述I.本發(fā)明的總方面本發(fā)明總的來說是針對于完成包括分離功能(比如，應用分離基體)的分析操作的改進方法和系統(tǒng)。特別是，這些方法和系統(tǒng)特別適合基于分離(比如，核酸分離、蛋白質(zhì)分離等)的高處理量分析。
特別是，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)通過大量將樣本材料流入裝載導管中的流體的裝載過程進行各個樣本的裝載來獲得高速的處理量。在樣本裝載之后，通過比如電泳分離對與裝載導管流體連接的分離導管中的一部分樣本材料進行分離。因為樣本被大量地流入到裝載導管中，所以樣本可被連續(xù)地裝載，用于在分離導管中的連續(xù)分析。
在互連導管中流體的大量裝載中，流體有流入或被推入到多個互連導管中的趨勢。在所述系統(tǒng)的情況下，經(jīng)常需要防止樣本材料大量流入分離導管以避免在所分析樣本材料量上的不確定性，并防止用于分離導管中的任何分離基體產(chǎn)生巨大偏移。因此，在本發(fā)明的內(nèi)容中，通常將系統(tǒng)設計成允許這種流體流過樣本裝載導管，而在分離導管中的任何分離基體基本上不會產(chǎn)生偏移或使該基體偏移到部分和/或預選的程度。
本發(fā)明還提供了裝載樣本材料同時將該材料與另外的諸如標志化合物(比如，分子量標準、標記化合物、稀釋劑等)之類的反應物混合。通過將反應物混合步驟與裝載功能結合，可消除稀釋、內(nèi)標準添加等的額外的樣本制備步驟，這些通常獨立于分離系統(tǒng)進行，比如，在多管井場板中進行。
一些額外的特征可選擇性地包括于所述的系統(tǒng)，用于特定的操作和處理，這些將在下文中作總體上詳細的描述。
II.系統(tǒng)根據(jù)本發(fā)明，提供的系統(tǒng)用于完成基于分離操作的分析。同樣的，這些系統(tǒng)通常采用在其中分布分離基體的分離導管。所提供的樣本裝載導管以流體連接于分離導管，從而允許樣本材料到分離導管的輸送，并在其中完成一部分分析的操作和檢測。樣本和分離導管可采用多種不同的形式，包括簡單地將管道或?qū)⒚毠苓B接在一起以形成所述的互連導管。但是，在較佳的方面中，這樣的系統(tǒng)可以嵌入在集成體結構或微流體器件中，其中導管是以單片襯底制成的。
通常，這種個體結構以分層結構制造的，其中所制造的第一襯底是包括一個或更多蝕刻、雕刻、壓紋、澆鑄或其它方式制造成的槽的平面襯底。這些槽通常決定了微流體器件體結構的互連管道網(wǎng)的至少一部分設計。隨后將第二襯底層覆蓋并鍵合于第一襯底的平面以密封地包裝槽，并從而決定了器件的所封電路或管道。
在圖1A中示出了簡化流體器件的分層結構的示意圖。為了在與正常操作比較時便于描繪所示的器件被倒置。如圖所示，整個器件100是由兩個平面襯底層102和104制得。所示的器件還包括與最終結構連接的采樣元件或毛細管106。在制造所示器件的過程中，將槽108的網(wǎng)制成在襯底102的表面中。可根據(jù)器件要進行的操作類型將槽制造成多種不同的配置或網(wǎng)絡幾何形狀。如圖所示，每個槽都終止于穿通襯底102的孔或口中，比如口110-118。當襯底102和104被匹配在一起并如箭頭所示地被鍵合在一起時，將槽網(wǎng)密封以確定所包含的管道網(wǎng)?？?10-118在一側上密封以確定流體存儲并將點接入到管道網(wǎng)中。毛細管元件106被插入并附著于孔120，孔120的定位使分布于毛細管106中的管道106a將與管道網(wǎng)108進行流體連通。在圖1B中描繪了一組裝后的完全導向的器件。
根據(jù)本發(fā)明，在集成體結構中充分提供了分離和樣本裝載導管或管道。在特別較佳的方面中，這些導管是微量尺寸，也就是說，它們具有至少小于500μm的剖面尺寸，比如在大約0.1到500μm之間，較佳在大約1μm和200μm之間，更佳地在大約1μm到100μm之間。這種集成的器件，作為它們在控制其操作時所具有精確公差和準確性的結果，可提供多個優(yōu)于先前所述系統(tǒng)的優(yōu)點。
樣本裝載導管，除了與分離導管進行流體連通，還與至少樣本材料的第一源進行流體連通。在集成體結構的情況中，樣本材料源可與體結構結合，比如，作為一個或更多個分布于體結構中并與裝載管道進行流體連通的容器。另外，樣本材料源可在體結構的外部，比如，一個試管或在多管井場板中的井，它被設計成通過采樣吸移管或毛細管元件與樣本裝載導管進行流體連通，采樣吸移管或毛細管元件本身與樣本裝載管道或它的一部分連接著。
在圖2A和圖2B中示出了包括樣本裝載導管和分離導管的集成器件的例子。如圖所示，器件200包括主體結構202。體結構202裝入了分離管道204和至少一部分樣本裝載管道206。如圖所示，整個樣本裝載管道206包括外部采樣吸移管214(圖2B中)或毛細管，它具有穿過自身的毛細管管道或?qū)Ч?，后者通過口212與管道206進行連通。吸移管214在一端開口從而能夠接觸比如試管、多管井場板等外部存儲容器的樣本材料。另外，可設計樣本裝載管道可與代替外部采樣吸移管214的集成于器件主體結構202的一個或多個不同樣本材料容器(未顯示)進行連通。在美國專利第5,779,868中詳細描述了微流體器件的采樣吸移管，在這里通過完整地參考結合于此。
如圖所示，分離管道204一邊與緩沖劑容器228進行連通，另一邊與廢料容器224進行連通。除了提供用于緩沖劑、分離基體和分析之后的廢料材料的容器以外，這些容器還提供了與電泳分離的電氣接觸。特別地，電極被設計成與比如容器224和228中流體相接觸，從而通過分離管道204施加所需電流從而將樣本材料電泳地分成多個部分或成份元素。類似地，樣本裝載管道206的一邊流體地連接于樣本吸移管214(或一個或多個樣本吸移管(未顯示))，在另一邊與廢料容器218連接。廢料容器218可選擇地提供真空源的連接口，用以通過大量的流體流動將樣本材料吸入到樣本裝載管道206中。在某些情況中，大流量的樣本材料和/或其它反應物既可通過向廢料容器218施加真空來驅(qū)動，也可以通過向樣本材料或反應物容器或兩者的組合施加正壓來驅(qū)動。
如圖所示，將樣本裝載管道206通過注入管道208與分離管道204進行連接，從而在樣本裝載管道和分離管道之間形成流體結點，該結點在一個端點附近插入樣本裝載管道206，與分離管道204相交叉并在另一端點連接容器226。雖然所示的是在樣本裝載管道和分離管道之間的中間點上，但由管道208表示的流體結點可根據(jù)所需的應用選擇性地設置在這些管道中的一個或兩個的端點。
如在分離和樣本裝載管道的情況中那樣，所示的容器可選擇性地提供緩沖劑和/或廢料的存儲，并還提供對器件管道的接觸以控制從樣本裝載管道206到分離管道204的材料的移動(也被稱為樣本材料的“注入”)。
選擇性地，可在器件200的集成主體結構202之中設置比如容器222的一個或更多個額外的反應物容器。這些額外的容器提供了可用于要進行的分析操作中的額外反應物。這種反應物的例子包括，比如內(nèi)部標準，比如大小基于分離的分子量標記和標志化合物，比如插入的染料、親和標記等，稀釋劑、緩沖劑等。反應物容器222通過反應物導入管道210流體連接于樣本裝載管道206。
額外的容器220也被設置通過管道216流體地連接于樣本裝載管道206。在所示的器件中，該額外的容器和管道被用于施加必須的源動力，從而從樣本裝載管道206通過注入管道208向分離管道204注入樣本材料。在電動能注入的情況中，這通過在容器220和容器226之間施加電流，從而電動能地移動材料通過注入管道208和分離管道204的交叉點來完成。類似地，可在這些容器之間可選擇地施加壓力差以通過該交叉點大量流動樣本材料。在使用大流量注入的情況中，較佳地在每個容器(以及吸移管)處可同時調(diào)節(jié)壓力以保證通過交叉點的流量以控制的方式發(fā)生，比如，無過多流入分離管道主要部分的流量。
根據(jù)所述的方法和系統(tǒng)也可選擇性地完成額外的后分離反應，包括后分離標記、稀釋、加熱等。這樣的后分離處理通常包含添加連接于廢料容器端的分離管道的容器和管道，但是要在管道內(nèi)的檢測區(qū)內(nèi)完成。在某個較佳的方面，比如，在蛋白質(zhì)分離中，應用后分離稀釋步驟以稀釋清潔劑，即SDS的量，直到臨界膠束濃度，從而優(yōu)化被標記蛋白質(zhì)對無清潔劑膠束的檢測。在出版的PCT申請?zhí)朩O00/46594中詳細描述了這種柱后處理，并通過參考全文結合于此。在圖3C中示出了用于進行這種后分離反應的包含管道幾何形狀的微流體器件的例子。
除了微流體器件，本發(fā)明的系統(tǒng)選擇性地包括額外的部件，諸如用于大量將樣本材料流入樣本裝載管道的流量控制器、用于通過分離管道(以及選擇性地注入管道)施加電流的電氣控制器以及用于檢測分離的樣本材料部分的檢測系統(tǒng)。
流量控制器通常包括與接口連接一起的一個或多個可變或恒定的壓力源或真空源，用以操作地將該源耦連于容器。這種接口通常包括具有密封墊片、密封圈、插入耦合器等的端口，用于在壓力或真空源和容器或端口之間提供密封的連接。該壓力或真空源可根據(jù)要完成的特定操作施加固定壓力或可變壓力。固定和可變壓力以及真空源都是已知，包括，比如蠕動泵、注射泵、隔膜泵等。壓力和/或真空源通常耦連于一個或更多個器件上的不同容器，從而在一個或更多個容器上控制壓力。在比如于2000年2月23日提交的美國專利申請60/184,390號中描述了與壓力無關的多容控制器的例子，并通過結合參考于此。使用比如電滲透的電動能的力，通過包括集成或外部的電滲透泵系統(tǒng)也可選擇性地控制大流量的控制。在美國專利號6,012,902中描述了電滲透泵的例子，本文通過參考結合于此。多種其它的大流量流體的方法也可用于實踐本發(fā)明。例如，可應用離心力來針對其中的管道網(wǎng)被制成轉(zhuǎn)子形個體的流體運動，在其中，流動的方向從轉(zhuǎn)子的中心成放射狀向外延伸。類似地，可對大流量流體使用壁剪方法，比如，通過移動相對彼此的反向表面。也可選擇性地應用毛細管力來引起管道網(wǎng)中的大流量運動(見比如，公開的PCT申請WO00/43766號，通過參考結合于此)。其它的大流量流體的方法包括氣體發(fā)生技術或基于溫度變化的流體/氣體擴張/壓縮方法，比如，見Lipshutz等人的美國專利6,043,080號，通過參考全文將其結合于此。
除了在樣本裝載過程中控制大流量流體之外，本發(fā)明的系統(tǒng)還包括用于控制將樣本材料注入到分離導管以及通過分離導管移動樣本材料從而完成所需的分離/分餾。如以上所指出的，注入和分離操作可選擇性地使用基于壓力或大量流體移動的方法來執(zhí)行，比如，使用壓力注入樣本并使用基于壓力或含樣本材料的大量流體來通過適當?shù)姆蛛x基體進行分離。在這種情況下，僅僅延伸了上述的大流量控制器以控制在這些微流體器件額外部分中的流動。但是在較佳的方面中，注入和分離操作中至少一項要通過樣本材料的電泳移動來執(zhí)行，比如，在無大流量流動的情況下。
在這種情況下，這些操作的控制器通常包括通過合適電路耦連于電接口的電源，接口通過系統(tǒng)的適當導管，比如注入和/或分離導管，來傳輸電流。通常，這些接口包含電極管腳，這些電極管腳固定于要插入到器件容器中的控制器的接口部件。但是，可選擇地，該接口可包含，比如接觸連接片、插入耦合器等與包括分離導管的器件體結構上的電氣接觸相連接的電氣接觸。這些接觸隨后通過分布于體結構上或體結構內(nèi)的電路傳輸電流通過合適的導管，其中電路向容器或?qū)Ч軅鬏旊妷骸Ｔ诿绹鴮＠?,955,028號中描述了不同接口情況的例子，本文通過參考結合于此。
除了控制元件之外，本發(fā)明的系統(tǒng)通常還包括檢測系統(tǒng)，用于檢測分離管道內(nèi)樣本材料的分離部分，即跟蹤分離。檢測系統(tǒng)可根據(jù)多種著名的檢測方法，包括熒光光譜學(激光引發(fā)和非激光方法)、UV光譜學、電化學檢測、熱檢測、基于電容的檢測(見公開的PCT申請WO99/39190號)、基于質(zhì)譜測定法的檢測，比如，MALDI-TOF和電子束，可容易地設置這些以直接從毛細管或微流體器件出口等接收材料。在較佳的方面中，使用了光檢測方法，更確切地說是基于熒光的檢測方法。這種檢測系統(tǒng)通常包括以適當波長提供光線的激發(fā)光源以激發(fā)要檢測的特定熒光種類。該激光光線隨后通過合適的光學鏈，包括透鏡、濾光器(比如，波長和/或空間濾波器)、分束器等，并直接穿過，比如目標透鏡，到達分離導管的半透明部分。作為熒光類，樣本材料的成份或部分通過激發(fā)光，并且它們發(fā)出熒光。熒光發(fā)射隨后被收集并通過目標透鏡和同一個或另外的光學鏈傳送回光傳感器，比如光電二極管、光電倍增器、CCD等。
該系統(tǒng)通常還包括處理器，比如計算機，對它進行編程以記錄從檢測器接收到的數(shù)據(jù)，并選擇性地分析數(shù)據(jù)，比如，對峰值求積分、計算保留時間、用內(nèi)部標準校準分離等。還可較佳地對該處理器進行編程，從而根據(jù)一系列事先編好的和/或用戶輸入的指令(例如，大量流動或電動地移動材料有多快，應該從樣本源陣列中采樣的位置，比如微型板中的管等)監(jiān)測并指導控制器的操作。
還可根據(jù)所完成的特定應用選擇性地向所述的系統(tǒng)添加一些其它元件，包括比如，溫度控制元件，例如用于所述器件的加熱和/或冷卻部分加熱和冷卻元件；以及用于在器件附近移動樣本板和/或以獲取整個系統(tǒng)的不同材料和/或功能性的機械控制元件?？偟膩碚f，所有這些額外的元件都在商業(yè)上有供應并容易適用于所述的系統(tǒng)。
在圖4中示出了如上所述的整個系統(tǒng)的示意圖。如圖所示，該系統(tǒng)包括如圖2和圖3所示的微流體器件400。該微流體器件400通常可操作地耦連于控制器系統(tǒng)402。該流量控制器402向器件400管道內(nèi)的材料施加源動力以執(zhí)行所需的操作。根據(jù)所述的較佳方法，并參考圖2和圖4，控制器402通常包括壓力和/或真空源以及電源。該電源通過使用電連接器408耦連于電動能運動所需通過器件的管道，例如，分別通過容器220和226以及224和228的注入管道208和分離管道204，其中的電連接器408連接或本身就是分布在與其中的流體相接觸的容器的電極。壓力/真空源通常耦連于壓力所引起的大流量所需的管道，例如管道206和/或222，和/或毛細管元件214。在本發(fā)明較佳方法的情況中，單獨的真空源通常經(jīng)真空管道410與容器218連接，以將材料從毛細管元件(并由此，任何設置于毛細管的樣本源)以及反應物容器222吸入并通過管道206。應該注意的是，電氣耦連通常通過連接于電源并浸入器件容器的電極來完成。壓力/真空連接通常包含，比如應用墊片或密封圈，來使用密封壓力連接從而將壓力傳遞給容器，這如連接器412所示的。總的來說，在美國專利5,955,028號和6,071,478號中描述了這類的儀器/設備的接口，本文中通過參考其全部結合于此。壓力或真空源通常被廣泛地使用，且會根據(jù)特定場合的需要而變化。通常，對于微流體的應用，將比如注射泵等的正偏移泵用作壓力或真空源。包括蠕動、隔膜和其它泵的多種其它的泵可容易地應用。
檢測器404也通常應用于整個系統(tǒng)中。該檢測器通常設置在一個或多個器件管道的傳感通訊中。如在此處所使用的，術語“在傳感器通訊中”是指定位檢測器使之能夠從管道的容量中接收可檢測的信號。在光信號的情況下，這只需要定位檢測器使之從管道內(nèi)的材料接收光信號。這通常通過將光檢測器定位于鄰近管道段的透明或半透明部分從而它可以接收光信號來完成。光檢測器通常在現(xiàn)有技術中是已知的，并且包括基于熒光的檢測器(強度和極化)、分光光度檢測器、光散射檢測器等。對于其它的檢測配置，比如電化學檢測，經(jīng)常將檢測器或檢測器的一部分設置為通過比如，電極、基于半導體的傳感器或微電機傳感器(MEMS)，與含器件管道內(nèi)的流體相接觸。也可在所述的方法中有選擇性地應用另外的檢測器，包括’管道外檢測配置，例如，通過MALDIFOF的基于質(zhì)譜測定法的檢測或電子束質(zhì)譜測定法。這些檢測配置已在前面有所描述。
除了檢測器404、控制器402和器件400，整個系統(tǒng)通常包括計算機或處理器406，它可操作地與控制器402和檢測器404耦連。該計算機通常既連接于檢測器404又連接于控制器402。計算機通常包括編程，用以指示控制器的操作以根據(jù)用戶規(guī)定的指令引導流體通過器件400的管道進行移動。另外，也可對計算機406編程以從檢測器404接收并記錄數(shù)據(jù)，并且可選擇地分析數(shù)據(jù)以及產(chǎn)生用戶可理解的輸出或報告。
系統(tǒng)可選擇地應用樣本存取系統(tǒng)，例如，機械控制的x-y-z轉(zhuǎn)換級以及其它多管井場板處理器件，用于向微流體器件的采樣元件傳輸樣本材料管，即使得毛細管能浸入到樣本材料中，并在單獨的板以及多重板上存取多個不同的井。商業(yè)上可提供的系統(tǒng)包括，比如，由Zymark公司提供的Carl Creative傳送系統(tǒng)以及Twister系統(tǒng)，和比如由Parker Positioning Systems(定位系統(tǒng))公司提供的機械控制的x-y-z轉(zhuǎn)換臂。
III.壓力裝載/電泳分離如以上所指出的，本發(fā)明至少部分地針對于完成基于分離分析的器件、系統(tǒng)和方法，其中要分析的材料(“樣本材料”)通過大流量流體被裝載進樣本裝載導管中，并隨后通過分離基體或經(jīng)過基于壓力的色譜學經(jīng)受分離，例如強行或通過電泳使樣本材料通過適當?shù)姆蛛x基體(排斥、親和、離子交換、憎水性/親水性等)。此處使用的術語“大流量”是指流體穿過特定空間的移動，該移動在流體中攜帶著任何懸浮或溶解的流體成分。這點與這些穿過流體的各種成份的移動相反，它與流體本身(例如，在電泳中)的移動是無關的。
參考圖2所示及以上所述的器件，容易描繪本發(fā)明的特征和操作。首先，將分離基體導入，或者分離基體已經(jīng)與分離管道204相連，比如在制造過程中涂覆。在將分離基體導入分離管道的位置，通常放入容器224或228中的一個并允許在有額外施加的壓力或無額外施加的壓力的情況下通過毛細作用進入分離管道。通常，將分離基體設計為液體媒質(zhì)或固相媒質(zhì)的稀漿(例如，小球)。較佳電泳分離基體的例子包括聚合溶劑，例如線性聚丙烯酰胺、氧化纖維素聚合體等。在較佳的方面，在添加任何額外的流體成份之前將分離基體添加至器件的分離管道。隨后將緩沖劑和其它的流體通過壓力流添加到器件的合適管道，從而促使基體從這些管道出來。另外，可在整個系統(tǒng)都被注入緩沖劑之后添加分離基體，例如通過大量地使基體主要流入分離管道來完成。
樣本材料隨后被吸入樣本裝載管道206中，比如，通過設置外部吸移管214與樣本材料源相接觸并通過吸移管214和樣本裝載管道206吸入材料。在樣本裝載的過程中，任何進入樣本裝載管道206的分離基體被大流量的樣本材料洗去。
因為樣本裝載管道206與分離導管204連接并通過大流量進行裝載，所以通過比如，強行過早地將樣本材料裝入分離管道，或通過例如將基體推出管道或?qū)⑵淅霕颖狙b載管道以使分離基體偏離大量的延伸，來配置該系統(tǒng)，從而使樣本材料的大量裝載不會不利地影響分離導管204或其所含內(nèi)容。如根據(jù)以下的討論將變得清晰的那樣，在這些系統(tǒng)中大量的偏移經(jīng)常是允許的，而且事實上在某些場合也是需要的。
特別地，使樣本材料大流量地進入樣本裝載管道206。如以上所指出的，在一方面，樣本材料通過外部采樣毛細管214被吸入樣本裝載管道，或有選擇地來自一個或更多個集成樣本材料容器(未顯示)。將樣本材料吸入樣本裝載管道通常通過向容器218施加負壓(或真空)來進行，從而將樣本材料吸入并通過樣本裝載管道。該管道可包括有助于完成所需操作的額外元件，包括，比如用于減少媒質(zhì)/磁疇壁交互作用、電滲流等的表面涂層。
如圖所示，器件200還至少包括第一反應物導入管道210，它將第一反應物容器流體地耦連于樣本裝載管道206。當樣本材料被吸入樣本裝載管道206時，其它反應物也從容器222被導入樣本裝載管道206中。特別地，當施加真空以將樣本材料通過毛細管214吸入樣本裝載管道206時，它同時通過管道210從反應物容器222吸入反應物，隨后將該反應物與樣本材料進行混合。想要的樣本材料和其它反應物的比率可通過適當?shù)卦O計材料被導入公共管道所通過管道的流體阻力的比率來獲得，該公共管道例如為樣本裝載管道206、反應物導入管道210和毛細管214的結點。比如，通過向反應物導入管道210提供等同于采樣毛細管214流體阻力的流體阻力，可在樣本裝載管道206中完成基本相等的反應物和樣本材料的混合。類似地，在想充分稀釋樣本材料的情況下，例如當反應物是稀釋劑的情況下，可向反應物導入管道提供比采樣毛細管低得多的流體阻力(比如，低10X或更多)，以獲得適當?shù)南♂?，例?0倍或更多。在圖2A所示器件的情況下，還必須考慮到從分離管道204通過注入管道208進入樣本裝載管道的流量。但是，如圖所示，為這些管道提供了充分高的阻力，比如通過狹窄的橫截面和包括在內(nèi)的粘性分離基體，從而可充分地忽略該流量的作用。
管道內(nèi)的流體阻力通常通過改變管道的橫截面積、改變管道的長度，或改變通過管道運動的流體的速度，或任何這些的組合來改變。在較佳的方面，通過設置不同的管道具有不同的橫截面積和/或不同的長度來改變流體阻力。在制造微流體管道網(wǎng)的過程中容易考慮這兩個參數(shù)，例如，通過改變管道的寬度或深度和通過改變管道的路徑來改變其長度。在所示的器件中，通過向管道提供與采樣毛細管相比大得多的橫截面以得到較大的深度和寬度，來為反應物導入管道提供較低的阻力。這些尺寸，當與管道長度相結合時，為樣本材料和反應物提供了合適的選擇混合比，如所示的，反應物和樣本材料的比率為3∶1。
一旦樣本材料和選擇性混合的反應物被裝載到樣本裝載管道206中時，將一部分的樣本材料從樣本裝載管道通過注入管道208移入或注入分離管道204。將一部分樣本材料注入到分離管道可通過向注入管道208施加壓力差以將樣本材料移入分離管道來完成。另外較佳的是，一部分樣本材料(或樣本材料和反應物的混合物)的注入通過在整個交叉管道上施加電壓力差從而電動能地將樣本材料注入到分離管道。在任何一種情況下，源動力的施加，例如電流差或壓力差，通常經(jīng)過容器220和226進行施加。例如，對于較佳的電動能的注入，通過在容器220和226之間施加電壓梯度從而在樣本裝載管道206和分離管道204之間施加電流，這便在管道216內(nèi)、一部分管道206內(nèi)以及管道208內(nèi)產(chǎn)生了電流。產(chǎn)生的電流隨后電動地將樣本材料從樣本裝載管道206移入注入管道208并通過在這些交叉點上的分離管道204。
在通過注入管道208和分離管道204的交叉點注入樣本材料之后，在分離管道的整個長度上施加電流，從而將在交叉點上的樣本材料移入并通過分離管道。在較佳的方面，提供微電流返回通過管道208與分離管道204相遇的部分，從而將來自交叉點的樣本材料推回。這便通過除去會污染分離流道的大量泄漏提高了分離效率。因為樣本材料經(jīng)過電泳穿過分離管道內(nèi)的樣本基體，所以它被分成根據(jù)其分子量而不同的部分。
一旦完成了樣本材料的分離，或在某些情況下當進行分離的時候，可通過使外部吸移管214與樣本材料后續(xù)的源相接觸并將后續(xù)的樣本吸入樣本裝載管道，從而將子樣本材料吸入到樣本裝載管道內(nèi)。該后續(xù)的樣本材料隨后如上所述地被注入并分離。
如圖3A所示，在某些情況下可提供額外的容器230，通過比如管道332與分離管道304連接，從而為分離管道304提供額外容量的分離基體。該基體隨后被引入分離流道之間的分離管道304，或者在樣本裝載所含的內(nèi)容中(如至少參考本發(fā)明一部分所述的)，或作為重復分析中的分離過程步驟。該額外的容器通常通過，比如適當?shù)墓艿?32，與接近于分離柱一端或另一端的分離管道中的一點相連，比如在緩沖管328端或廢料容器管324端(如圖2所示)。在較佳的方面，該額外的容器接近地連接于廢料容器端，而且該基體被吸入到分離管道，從而在每個樣本裝載步驟中只顯示小部分的分離基體。特別地，大量裝載的樣本將小量的分離基體吸出分離管道并吸入樣本裝載管道，在該處小量的分離基體將被洗去。隨后從基體容器將差不多量的基體吸入到分離管道。對基體容器的使用分別獨立于緩沖劑容器228和廢料容器224，它提供了在先前分離操作中不被材料污染的基體源，例如樣本材料、離子、雜質(zhì)等。
還可選擇性地提供額外的反應物容器(例如，容器334)，用于添加按照慣例在特定分析中使用的額外的反應物，例如用于校準的標準分離階梯等。如圖所示，通過反應物導入管道336將容器耦連于注入管道308，從而允許該反應物被分離而獨立地注入到分離管道，而不是與樣本材料混合。
圖3B示出了根據(jù)本發(fā)明用于完成基于分離的分析的改進后的管道設計。特別在某些情況下，在圖2A所示裝載管道206中出現(xiàn)的在注入交叉點附近的急彎，會在材料和/或電場流過該裝載管道的途中產(chǎn)生偏差，并由此被注入到分離管道內(nèi)。特別是，它已經(jīng)確定了大分子量DNA的注入在圖2A所示的管道設計中將產(chǎn)生不一致的結果。如果不與操作的特別理論相結合，無法相信，這樣的不一致是從圖2A所示的裝載管道206中鄰近于注入點的急彎產(chǎn)生的。該急彎在注入過程中產(chǎn)生的大量非均勻的電場，在拐角的內(nèi)圈高，在外圈低。相信這便是不一致的起因。特別的，不同樣本之間樣本傳導性中的輕微差異將改變該彎附近的場強。彎附近的分散以及由差異電泳活動產(chǎn)生的分散盤旋，會引起諸如較大成份的較慢移動的非均勻注入。
為了除去這些不一致，生產(chǎn)了一種改進后的管道設計(見圖3)，在其中，將裝載管道306與注入管道308設定在一直線上(共線)。保持樣本裝載管道和分離管道之間的直線注入管道可產(chǎn)生充分地改進與這些較大分子量種類相關的一致性。另外的設計還確定了反應物導入管道310，從而從該管道流出的反應物掃過毛細管結點/口312，以防止在該結點的任何死區(qū)中材料的聚合，并促進從反應物導入管道310進入的反應物與從吸移管元件進入的材料的結合。這樣的結果是，通過同一毛細管元件進入的樣本受到較少的污染。
圖3C示出了用于進行后分離反應的分離操作的管道設計，比如，如以上所指出的用于蛋白質(zhì)分離。如圖所示，該器件與圖3B所示的器件在設計上是相似的。特別是，該器件包括仍舊與注入管道358共線的裝載管道256，并包括反應物導入管道360，定向該管道使從該管道流出的反應物掃過毛細管結點/口362。分離管道354通過檢測區(qū)388處于上游的稀釋管道384和386被截斷。這些稀釋管道在它們的另一端分別與容器380和382耦連。如圖所示，裝載管道356繞過容器382，從而避免與稀釋管道386交叉。在操作中，圖3C所示的器件工作的方式與圖3B中所示的相同，除了一點不同，即向容器380和382施加稀釋電壓，從而使稀釋劑(例如，稀釋離子和/或流體)進入分離管道354，從而在檢測點獲得需要的結果。在蛋白質(zhì)分離的情況中，這就使得分離緩沖的稀釋劑處于臨界膠束濃度之下，從而導致了與大量清潔劑膠束相關的背景信號電平的降低。在公開的PCT申請WO00/46594號中詳細描述了該檢驗的原理和操作，前文中通過參考其全文結合于此。如圖2A器件中所示，在分離中，在容器378和374之間施加電壓以在分離管道354中驅(qū)動電泳分離。
如圖所示，圖3C中的器件提供了使用熔合氧化硅毛細采樣元件的毫升刻度樣本存取。如上述器件中所述的，施加于比如容器324的單一真空，導致同時稀釋樣本材料和與標記化合物混合。該樣本隨后被電動能注入到包括分離基體的分離管道內(nèi)，包括比如9mM的SDS和熒光組合的染料，見WO00/46594號。隨后SDS則在檢測之前被稀釋出來。
在圖3D中示出了另外一個管道設計的選擇。如圖所示，圖3D的設計包括圖3B器件中所示的所有相同管道，雖然它們可處于稍微不同的位置。另外，雖然圖3D所示的器件包括了用于管理注入和分離的后退步驟的額外管道。該管道的添加允許更快地裝載后續(xù)樣本，例如在前分離步驟的過程中，沒有樣本移位污染的危險。在圖3B和圖3D中示出的每個器件中，用相同的標號表示相似的管道。
在操作中，圖3D器件的工作方式與圖3B器件的工作方式基本相同。特別地，樣本材料通過口312經(jīng)過外部吸移管被吸入到器件的管道內(nèi)。通過比如向容器318施加真空將樣本材料吸入器件的過程也通過反應物導入管道310將額外的反應物物從容器322吸入樣本裝載管道306，在樣本裝載管道306內(nèi)反應物與第一樣本材料混合。在容器320和326之間施加電流，從而將樣本材料裝載到管道308和分離管道304的注入交叉點。一旦被裝載，就把樣本材料注入到管道304中并通過在容器328和324之間施加電流來分離。在分離的過程中，施加輕微的后移電流從而將管道308任一邊的樣本材料移離注入交叉點，以防止在分離過程中泄漏的樣本進入分離管道。在圖3D所示的器件中，后移是指通過管道392后退到容器326和容器390(與圖3B器件中后退到容器318相反)。通過分路后移的樣本材料，可將其從樣本裝載管道306除去，在樣本裝載管道306它可能會與后續(xù)樣本材料混合并污染后續(xù)的流道。此外，如注入交叉點的擴展圖所示，設置管道392來截斷非常接近管道310和306結點的注入交叉點的注入管道。這便允許在后移步驟中裝載后續(xù)樣本材料，而不需要使新的樣本材料和后移材料交叉路徑和混合。因此，沿著管道392的后移路徑是不同的，即它不會在同一時間穿過相同的流徑，而會與沿著管道306的原始樣本裝載路徑相隔開。
IV.基體的維護和/或替代在分離管道內(nèi)不偏移分離基體的大量裝載的樣本材料是本發(fā)明優(yōu)于傳統(tǒng)毛細管方法以及先前在微流體方法中所描述方法的顯著優(yōu)點。特別地，如上所述地通過能夠大量裝載樣本材料，可顯著地減少以電泳裝載方法進行樣本裝載所需的時間。另外，通過基于壓力方法進行的大量裝載，在無樣本材料電泳偏壓的不利影響下提供了裝載的速度，例如，在它們被注入到分離導管之前預分離。
如上所述，本發(fā)明還在不引起分離基體大量偏移的情況下允許樣本材料的大量裝載。這在傳統(tǒng)的毛細管系統(tǒng)中基本上是不可能的，在該系統(tǒng)中任何大量流入毛細管的樣本材料都必然偏離分離基體相似的量。類似地，在前面描述的用于分離場合的微流體器件中(見比如，Woolley和Mathies，Proc.Nat’l Acad.Sci.美國，9111348-11352(1994))，使用了電泳樣本裝載。在這些前面描述的系統(tǒng)中，如果壓力裝載了樣本，則將大大地破壞并偏移在器件分離管道部分中的分離基體。
在本發(fā)明的器件中，在大量樣本裝載中的分離基體的偏移，通常通過在樣本裝載導管和分離導管之間提供充分流體阻力障礙來進行。該障礙以整體的方式嵌入在分離管道的設置中，比如，向分離導管提供足夠高的流體阻力以充分阻止樣本裝載管道內(nèi)的大流量壓力，正壓或負壓都可以。另外，在連接分離導管和樣本裝載導管的注入導管中設置障礙。特別地，可向連接樣本裝載導管和分離導管的注入導管提供充分高的流體阻力，從而阻礙樣本裝載和分離導管之間的大流量。
如本文中所指出的，管道結構中的流體阻力通常通過改變管道截面積和/或改變管道長度來變化，其中較小的橫截面積或較長的管道長度將產(chǎn)生較高的流體阻力。管道長度的變化通常包含簡單地改變管道路線以增加或減少其長度。類似地，通常通過將管道制造得較淺、較深或較寬來改變管道的截面積。有利的是，可在不顯著改變管道電阻的情況下充分改變該管道的大流量或流體動力學阻力，其中的電阻將影響通過管道(比如，在所述器件中的電泳注入和分離中)的流量。特別地，在具有縱橫比(寬度∶深度)大約超過5的微量管道內(nèi)，管道的流體動力學阻力是管道長度立方的函數(shù)，而電阻與管道長度線性相關。因此，管道長度減小10倍將使電阻減小10倍，但卻使流體動力學阻力減小1000倍。利用該特性可大大增加注入管道208和分離管道204中的流體動力學阻力，卻不會大大增加通過這些管道的電阻。
在本發(fā)明的這一方面，樣本材料在不顯著偏離分離基體的情況下被大量裝載。通常，如果原始出現(xiàn)在分離導管中的少于10％的基體在裝載特定樣本材料的過程中發(fā)生了偏移(比如，從分離導管被除去)，則分離基體也不會顯著地偏移，通常少于5％或較佳地少于1％的分離基體發(fā)生偏移。
為了完成樣本裝載管道中的大流量裝載，同時在分離管道內(nèi)獲得上述的最小偏移，通常向從樣本裝載管道引入和/或穿過分離管道的流徑提供流體阻力，該流體阻力是高于在樣本裝載管道內(nèi)流入連接點的阻力的某個被選擇的程度。在圖2所示器件的情況中，分離管道204，以及將樣本裝載管道208與分離管道204相連的注入管道208的小段的阻力，顯著地高于從樣本材料到管道208和管道206(包括毛細管214和樣本裝載管道206的一部分)流體結點的流徑阻力。通常，這些流體阻力的比率(基于速度相同的流體)較佳地大于2∶1(分離管道樣本裝載管道)，更佳地大于5∶1，且經(jīng)常大于10∶1或更高。當然，當將粘性分離基體導入分離管道的時候，將在分離管道內(nèi)產(chǎn)生流體阻力明顯較高的程度。
在某些情況下，會需要在分離導管內(nèi)偏移分離基體的較大或選擇的部分，而不是全部。特別地，經(jīng)常需要代替用于分離操作的分離基體，以除去在用于分離不同樣本的流道之間的交叉污染。在這種情況下，本發(fā)明也是非常有用的，因為它可在樣本裝載過程中完成所需程度的的基體偏移，而不需要偏移分離基體的整個或甚至基本部分。
一部分分離基體的所選偏移可由幾種方法完成。例如，可向含分離基體的容器施加正壓以強行使分離基體進入分離導管并同時偏移已在分離導管中的一部分分離基體。但是在較佳的方面，在至少部分使用用于大量裝載樣本材料的相同力的樣本裝載過程中，部分地偏移分離基體。特別參考圖2，當向廢料容器218施加真空以將樣本材料吸入樣本裝載管道206的時候，負壓也會將一部分樣本基體從分離管道204通過注入管道208吸入樣本裝載管道206。偏移的基體被分布于與分離管道耦合的一個容器(例如，容器224)或額外的基體存儲容器(例如，與廢料容器224分開的容器230)中的分離基體回填。
在更佳的方面，基體的偏移量被保持在分離管道內(nèi)總基體的所選部分。特別地，如以上所述，當在每個樣本裝載步驟中都需要一部分基體偏移時，該部分通常包括少于90％的原始分布于分離導管內(nèi)的分離基體，經(jīng)常少于75％，較佳地少于50％，更佳地少于20％，還要理想地少于大約10％、5％或甚至1％。
對基體偏移相對程度的控制通常通過改變樣本裝載管道206和分離管道204之間流體阻力的相對程度來完成。特別地，可改變分離管道的流體阻力，從而預選量的基體將在所選樣本裝載的條件下發(fā)生偏移。如文中再次指出的，對管道流體阻力的控制通常通過改變所給管道的一個或更多個橫截面積或長度來完成。在圖2和圖3所示器件的情況中，將分離管道設置為與樣本裝載管道相比較淺和/或較窄的管道，以賦予其充分高的流體阻力。該較高的流體動力學或流體阻力的配置，當與分布于管道內(nèi)分離基體的較高速度相結合時，在所加真空下顯著地減少了從分離管道到樣本裝載管道的材料流量。如以上所指出的，該增加的流體阻力只是適度地增加了電阻。根據(jù)著名的流體機械原理能夠容易地計算出在這些條件下的相對流體阻力，其中這些流體機械原理考慮了流體的特性，例如速度，以及流體所流過管道的尺寸，例如，長度和橫截面積。
IV.綜合反應物的混合如以上所指出的，本發(fā)明還提供了作為樣本裝載過程的完整步驟的對額外反應物的添加和混合。特別地，當完成傳統(tǒng)的基于毛細管的試驗時(例如，毛細管電泳)，導入分析所要求甚至所希望的任何反應物都需要在樣本裝載步驟之前被導入樣本材料。在高處理量的應用中，該添加的步驟會明顯地減慢速度并大大地增加在用于執(zhí)行添加的流體處理器件上的成本。根據(jù)本發(fā)明，通過將反應物材料源與樣本裝載導管連接，將反應物導入/混合步驟集成到大量樣本裝載的步驟中，從而使反應物與樣本材料同時被導入樣本裝載導管。
例如，如參考圖2說明所指出的，可選擇性地設置反應物容器222以結合進微流體器件200的主體結構202中。反應物容器222通過反應物導入管道210流體地耦連于樣本裝載管道206。當樣本材料大量流入樣本裝載管道206的時候，還施加適當?shù)脑磩恿σ允谷萜?22中的反應物材料穿過管道210并進入樣本裝載管道206。源動力通常取決于用于將大量樣本材料裝載進樣本裝載管道206的力的性質(zhì)。例如，在通過比如廢料容器218處所施加的真空將樣本材料裝載入樣本裝載管道206的情況下，同樣的所施加的真空通常將反應物從容器222吸入樣本裝載管道206。另外地或額外地，可向反應物容器222施加正壓，從而將反應物單獨或與在容器218施加的真空結合，推入樣本裝載管道。在于2000年2月23日提交的美國專利申請60/184,390號中描述了對以圖2所示互連微管道為結構的多重容器處的正壓和/或負壓的控制，本文通過參考其全文結合于此。
由于在較佳方面，使用施加的真空將樣本材料和至少部分的反應物材料吸入樣本裝載管道，所以通常設置毛細管元件214和反應物導入管道210的流體阻力以提供流過這些管道的樣本和反應物的適當混合比。特別地，并如以上所闡述的，對材料被吸入到公共管道所經(jīng)過的管道(例如，毛細管元件和反應物導入管道)的相對阻力進行選擇以提供流入樣本裝載管道的樣本和反應物的理想比率。該選擇通常包含制造帶適當橫截面尺寸和/或長度的管道以產(chǎn)生所需的阻力。
在基于分離分析的情況下，由綜合反應物容器提供的額外反應物通常包括至少一個內(nèi)部標準，例如一個分子量標記化合物。通過將內(nèi)部標準的混合物與樣本材料綜合，可不需要分離標準的分析步驟，該標準在分離樣本的分析中將改變。例如，在傳統(tǒng)的平板凝膠電泳中，通常用整道凝膠來運行樣本測量所依據(jù)的一組分量量標準。該綜合的途徑也不需要如通常在基于毛細管的分離方法中經(jīng)常做的那樣，將能夠內(nèi)部標準與分開的容器(比如，多管井場板或試管)中的樣本材料相混合。
將參考以下非限制的例子來進一步描繪本發(fā)明。
V.例子在以下的例子中將說明本發(fā)明的原理。
例1.基片設計和制造從一對平面玻璃襯底制造出圖2中示出的具有管道和容器配置的微流體器件。特別地，蝕刻第一襯底以提供器件的不同管道。蝕刻管道206和210的深度大約20μm，管道206具有大約90μm的寬度(在管道的頂部)，而管道210具有大約165μm的寬度。將管道204、208和216蝕刻為深度大約7μm，寬度大約24μm。分離管道204的總長度為56mm，注入管道208的總長度為15.6mm，它包括將分離管道與樣本裝載管道206相連的0.5mm段。樣本裝載管道206具有的總長度為39.6mm，而反應物導入管道210具有的長度為13.2mm，電氣連接管道216為8.9mm長。容器隨后在管道的端點被引入襯底。將平面襯底覆蓋并熱鍵合于第一襯底以密封管道并提供容器的底表面，該容器具有穿過它的單一小孔，該小孔與毛細管的外直徑尺寸相同。固定該孔從而與樣本裝載管道206的一端連通。隨后將毛細管插入該孔并附上粘合劑。
例2系列基于分離的分析圖2所示的器件用于通過大量將樣本材料裝載進樣本裝載管道、將該材料的小部分注入包括分離媒質(zhì)的分離管道并電泳分離材料來完成一定數(shù)量的系列DNA分離。
所有的反應物取自DNA7500LabChipkit，由Agilent Technologies商品提供。分離媒質(zhì)包括篩選聚合物溶劑和DNA插入染料的混合物。內(nèi)部DNA標記標準(DNA標記)包含15bp和2000bp的DNA部分，每一個的濃度為5ng/μl。用于產(chǎn)生測量樣本數(shù)據(jù)所基準的標準曲線的DNA階梯包括50bp、100bp、500bp、700bp和1000bp的部分，其中每個部分具有的濃度為4ng/μl。
通過向容器220、224、226和228(如圖2所示)添加25μl的分離媒質(zhì)來制備微流體器件。這些管的每一個都被加壓3psi長達2分鐘。隨后向以上的容器添加額外的25μl分離媒質(zhì)。隨后將毛細管元件214的開口端插入到多管井場板的緩沖管中，并向容器218施加2psi的真空。該真空將緩沖劑和DNA標記吸入裝載管道206中。在施加真空1分鐘之后，該基片便可準備用于分析。
含樣本的DNA被放置到96管的板中并根據(jù)相對于毛細管元件定位該板的x-y-z機械控制臂來放置，從而該毛細管可根據(jù)需要插入到該板的每個管中。隨后通過施加2psi的真空將樣本材料吸入毛細管元件和樣本裝載管道。對整個注入管道208施加5秒鐘的2000V以使該DNA樣本穿過與分離管道204的交叉點。在分離管道內(nèi)施加2秒鐘的輕微夾斷電流(每個管道部分中為0.5μA)以防止流動的樣本在交叉點上的樣本阻塞，并隨后沿著分離管道的長度施加1500V以沿著分離管道移動DNA樣本。同時，向部分注入管道208施加輕微的后移電流(每個方向上為0.1A)。在φX174/HaeIIIDNA的樣本上進行多個分離。在圖5中示出了這些運行中的典型電泳圖譜，其中示出了快速(近似75秒的分離時間)高分解分離。該分離可重復大約100次，分離分解的質(zhì)量無明顯下降。
例3用于蛋白質(zhì)的后分離稀釋圖3C所示的器件用于完成蛋白質(zhì)分離，其中在檢測前完成后分離稀釋操作。該器件被在0.12mM麥黃酮緩沖劑中裝載由帶0.25％SDS和syto60染料1t4μM的3.25％聚二甲基丙烯酰胺共丙烯酸。將該分離基體裝載進容器370和374-382，而且對這些管使用注射器進行4分鐘的加壓，以驅(qū)動穿過該器件管道的基體。將管380和382中的基體混合物除去并用無SDS和染料的基體代替。
用于分離的樣本是在PBS中被稀釋3X的Bio-Rad標準蛋白質(zhì)階梯(#148-2015)。50μl的稀釋階梯與25μl的樣本緩沖劑(4％SDS、10mM麥黃酮和3.5mM Tris)混合并被加熱到100℃長達5分鐘。在加熱后，用150Ml的水稀釋該樣本，且將該樣本裝載入96管場板的管中。
通過將采樣毛細管的一端放入96管場板的管中來操作該基片，并通過對管368施加5PSI的真空將該樣本從該管通過毛細管吸入該基片。在樣本裝載過程中，該樣本以1∶1與管372中的水稀釋。隨后通過在管370和376之間施加2000V將該樣本材料裝載進管道358和354的注入交叉點。隨后通過在容器378和374之間施加2350伏特來注入該樣本，分別向管370和376施加后移電流-0.3μA和-0.1μA。該分離在施加于管378和374之間的2350伏特用施加給退色管380和382的2550伏特繼續(xù)，以促使稀釋劑進入分離管道，同時保證在容器376的-0.05μA的后移電流。這便產(chǎn)生了近似9∶1的退色比。在檢測區(qū)388檢測熒光的峰值。在圖6中示出了熒光對時間的曲線，它表示所有階梯分量的高分解和基線分離。
本文中通過參考每個單獨的出版物或?qū)＠暾埖谋惶貏e并單獨地表示為通過參考結合的內(nèi)容，結合了所有的出版物和專利申請。雖然為了清楚和便于理解，已通過圖示和例子對本發(fā)明作了詳細的描述，但很明顯可在不脫離所附權利要求范圍的情況下實現(xiàn)某些變化和改進。
權利要求
1.一種將樣本材料分成多個部分的方法，包括提供一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含分離基體分布在其中的分離導管以及在沿著樣本裝載導管的中間點上與分離導管連通的樣本裝載導管；在不使分離基體大量偏移分離導管的情況下將樣本材料大量流入樣本裝載導管；將一部分樣本材料注入分離導管；以及將樣本材料分成多個部分。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，樣本裝載導管包含裝載端和廢料端，該裝載端與樣本材料源相接觸，并且還包含在整個樣本裝載導管上施加第一壓力差以將樣本材料移入樣本裝載管道的裝載端并流向樣本裝載管道的廢料端。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在將樣本材料大量流入樣本裝載導管的步驟中，分離導管中少于10％的分離基體發(fā)生了偏移。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在將樣本材料大量流入樣本裝載導管的步驟中，分離導管中少于5％的分離基體發(fā)生了偏移。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在將樣本材料大量流入樣本裝載導管的步驟中，分離導管中少于1％的分離基體發(fā)生了偏移。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，向分離導管提供高于樣本裝載導管的流體阻力。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，分離導管包含一個或更多個與樣本裝載導管相比較長的長度或較小的橫截面積。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，樣本裝載導管包含裝載端和廢料端，該裝載端與樣本材料源相接觸，并且還包含在整個樣本裝載導管上施加第一壓力差以將樣本材料移入樣本裝載管道的裝載端并流向樣本裝載管道的廢料端。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，向樣本裝載導管的廢料端施加負壓以在整個樣本裝載導管上提供第一壓力差。
10.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，樣本裝載導管和分離導管在第一流體結點進行流體連通，并且還包含將樣本裝載導管中的一部分樣本材料通過第一流體結點移入分離導管。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其特征在于，第一流體結點包含將樣本裝載導管與分離導管相連的管道段。
12.根據(jù)權利要求10所述的方法，其特征在于，將樣本材料從樣本裝載導管通過流體結點移入分離導管，包含穿過流體結點施加電壓力差以電動能地將樣本材料的部分從樣本裝載導管移入分離導管。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其特征在于，分離樣本材料的步驟包含在整個分離導管上施加電壓差，以電泳地將樣本材料分成不同的部分。
14.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，分離導管與分離基體源流體連通，并且還包含在整個分離導管上施加第二壓力差，從而在將樣本材料分成多個不同部分之后將大量的分離基體從分離基體源傳輸?shù)椒蛛x導管。
15.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，樣本裝載導管與至少第一反應物流體連通，且其中，將樣本材料傳輸進樣本裝載導管的步驟將大量的第一反應物傳輸進樣本裝載導管從而與樣本材料混合。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其特征在于，第一反應物選自標準化合物、稀釋劑、清潔劑或標志反應物。
17.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，樣本裝載導管基本在其中無分離基體。
18.一種將多個樣本分成不同部分的方法，包括提供分離基體分布在其中的分離導管；通過分離導管傳輸?shù)谝粯颖静牧希瑥亩鴮⒌谝粯颖静牧戏殖啥鄠€不同的第一部分；代替至少一部分分離導管中的分離基體；以及通過分離導管傳輸?shù)诙颖静牧?，從而將第二樣本材料分成多個不同的第二部分。
19.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在代替步驟中代替了少于90％的分離基體。
20.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在代替步驟中代替了少于75％的分離基體。
21.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在代替步驟中代替了少于50％的分離基體。
22.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在代替步驟中代替了少于20％的分離基體。
23.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在代替步驟中代替了少于10％的分離基體。
24.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在代替步驟中代替了少于5％的分離基體。
25.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在代替步驟中代替了少于1％的分離基體。
26.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，分離導管具有至少一個微量橫截面尺寸。
27.根據(jù)權利要求26所述的方法，其特征在于，分離導管分布于微流體器件中。
28.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，還包含提供與樣本裝載導管的中間點上的分離導管耦連的樣本裝載導管，該樣本裝載導管具有裝載端和廢料端；在整個樣本裝載導管上施加第一壓力差，從而將第二樣本材料移入樣本裝載導管的裝載端并流向樣本裝載管道的廢料端；以及在整個分離導管上施加第二壓力差，從而將分離基體的部分移出分離導管，并流向樣本裝載管道的廢料端。
29.根據(jù)權利要求28所述的方法，其特征在于，向樣本裝載導管的廢料端施加負壓，該負壓同時提供第一和第二壓力差。
30.根據(jù)權利要求28所述的方法，其特征在于，第一和第二壓力差基本相同，且其中，分離導管具有的尺寸使在施加第一和第二壓力差的步驟中只有一部分分離基體從分離導管中被除去。
31.根據(jù)權利要求28所述的方法，其特征在于，分離導管與分離基體源流體連通，而且施加第二壓力差從分離基體源向分離導管傳輸大量的分離基體。
32.根據(jù)權利要求28所述的方法，其特征在于，樣本裝載導管和分離導管在第一流體結點上進行流體連通，并且還包含移動樣本裝載導管中一部分第二樣本材料，使之通過第一流體結點并進入分離導管。
33.根據(jù)權利要求32所述的方法，其特征在于，將樣本材料通過流體結點從樣本裝載導管移入分離導管的步驟，包含通過流體結點施加電壓差以電動能地將第二樣本材料的部分從樣本裝載導管移入分離導管。
34.根據(jù)權利要求33所述的方法，其特征在于，分離第一和第二樣本材料的步驟包含在整個分離導管上施加電壓差，以電泳地將每個第一和第二樣本材料分成不同的部分。
35.一種將樣本材料分成多個部分的方法，包含提供一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含分離基體分布在其中的分離導管；與分離導管流體連通的樣本裝載導管；與樣本裝載導管流體連通的樣本材料源；以及與樣本裝載導管流體連通的第一反應物的源；將樣本材料和第一反應物傳輸進樣本裝載導管，其中，樣本材料和第一反應物形成了第一混合物；將一部分第一混合物注入分離導管；以及將第一混合物部分中的樣本材料分成多個部分。
36.根據(jù)權利要求35所述的方法，其特征在于，第一反應物包含標準標記化合物、標志反應物、稀釋劑或清潔劑。
37.根據(jù)權利要求35所述的方法，其特征在于，將樣本材料和第一反應物傳輸進樣本裝載導管的步驟，包含在整個樣本裝載管道上施加壓力差，該壓力差將大量的樣本材料和大量的第一反應物分別從樣本材料源和第一反應物源移入樣本裝載導管。
38.根據(jù)權利要求37所述的方法，其特征在于，第一反應物源通過第一反應物導入管道與樣本裝載導管流體連接，而且其中，第一反應物導入管道和樣本裝載管道的尺寸，使在所施加壓力差的條件下將所選比率的樣本材料和第一反應物傳輸進樣本裝載導管。
39.根據(jù)權利要求37所述的方法，其特征在于，樣本裝載導管包含裝載端和廢料端，而且通過向樣本裝載導管的廢料端施加負壓來施加壓力差。
40.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，將一部分混合物注入分離導管的步驟，包含在樣本裝載導管和分離導管之間施加電勢差，從而電動能地將第一混合物的部分從樣本裝載導管移入分離導管。
41.一種分離系統(tǒng)，包括具有第一流體阻力和可流動分離基體分布在其中的分離導管；與分離導管流體連接并且具有第二流體阻力的樣本裝載導管；將樣本材料傳輸進樣本裝載導管的樣本裝載系統(tǒng)；其中，第一流體阻力比第二流體阻力高出足夠的量，以防止在向樣本裝載導管傳輸樣本材料時分離基體的大量偏移。
42.一種分離系統(tǒng)，包括可流動分離基體分布在其中的分離導管；流體連接于分離導管的樣本裝載導管；與樣本裝載導管流體連通的樣本材料源；通過第一反應物導入管道與樣本裝載導管流體連通的第一反應物源；耦連于樣本裝載導管的壓力或真空源，用于在整個樣本裝載導管施加壓力差，其中，樣本裝載導管和第一反應物導入管道的尺寸，使在所施加壓力差的條件下以預選的速率向樣本裝載導管傳輸樣本材料和第一反應物。
43.一種微流體器件，包括主體結構；分布于主體結構中的樣本裝載管道；分布于主體結構中的分離管道，該分離管道在第一流體結點與樣本裝載管道相連；其中，樣本裝載管道的尺寸提供了比由分離管道的尺寸設置的流體阻力低的流體阻力。
44.根據(jù)權利要求43所述的微流體器件，其特征在于，分離管道包含至少為樣本裝載管道阻力兩倍的流體阻力。
45.根據(jù)權利要求43所述的微流體器件，其特征在于，樣本裝載管道包括外部采樣吸移管元件。
46.根據(jù)權利要求43所述的微流體器件，其特征在于，第一流體結點分布于樣本裝載管道和分離管道至少之一的中間點上。
47.根據(jù)權利要求43所述的微流體器件，其特征在于，第一流體結點分布于樣本裝載管道和分離管道中每一個的中間點上。
48.一種分離樣本材料的方法，包括提供具有樣本裝載管道和分離管道的微流體器件，該分離管道與樣本裝載管道流體地連接，且其中，該分離管道包含分布于其中的分離基體；使流體樣本材料大量地流入樣本裝載管道；將大量樣本材料從樣本裝載管道傳輸進分離管道；在分離管道內(nèi)電泳地將樣本材料分成分離部分；在電泳分離樣本材料之后代替分離管道內(nèi)至少一部分的分離基體；以及用額外的樣本材料重復大量流動、傳輸以及電泳分離步驟。
49.根據(jù)權利要求48所述的方法，其特征在于，在代替步驟中幾乎所有的分離基體都被替換。
50.根據(jù)權利要求48所述的方法，其特征在于，在代替步驟中少于90％的分離基體被替代。
51.根據(jù)權利要求48所述的方法，其特征在于，少于50％的分離基體被替代。
52.根據(jù)權利要求48所述的方法，其特征在于，對于至少每兩個額外的樣本材料重復大量流動、傳輸、電泳分離以及代替步驟。
53.根據(jù)權利要求48所述的方法，其特征在于，代替步驟是在樣本裝載步驟中進行的。
54.根據(jù)權利要求53所述的方法，其特征在于，樣本裝載步驟將至少一部分分離基體吸出分離管道進入樣本裝載管道，并將大量的分離基體從與分離管道流體連通的分離基體容器吸入分離管道，從而代替部分分離基體。
全文摘要
用于將樣本材料分成不同部分的器件、系統(tǒng)和方法，它們應用了大流量流體，用于在樣本材料的電泳分離之后裝載樣本。該器件應用的設計可隨意地允許在分離導管中的分離基體有或無偏移的情況下進行大量的樣本裝載。該器件包含在其中分布著分離基體的分離導管(304)、樣本裝載導管(306)以及可選擇地反應物導入管道(310)。
文檔編號G01N33/483GK1455864SQ01813626
公開日2003年11月12日 申請日期2001年7月31日 優(yōu)先權日2000年8月2日
發(fā)明者W·奧塞爾, L·J·保斯, R·S·杜布羅, S·A·森德博格, A·W·周, B·N·王 申請人:卡鉗技術有限公司