專利名稱：過敏原微陣列分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)樣品中的與過敏原相結(jié)合的免疫球蛋白的方法以及一種用于在體外診斷過敏癥(allergy)患者的方法。
過敏癥是由機(jī)體的免疫系統(tǒng)針對(duì)一種物質(zhì)產(chǎn)生的反應(yīng)，該物質(zhì)通常被認(rèn)為是無害的。正是這種反應(yīng)導(dǎo)致了被稱為過敏反應(yīng)的一類癥狀。因此，過敏癥的產(chǎn)生并非是由于免疫系統(tǒng)的衰竭，而是免疫系統(tǒng)的過度激活。過敏癥患者對(duì)一種過敏原的反應(yīng)可以產(chǎn)生很寬泛的癥狀。例如，一些人的癥狀可以表現(xiàn)為哮喘、濕疹、皮疹、眼部發(fā)癢、鼻竇炎、鼻塞或流涕，以及枯草熱，但是也會(huì)出現(xiàn)更為嚴(yán)重的癥狀。而由諸如蛇毒、堅(jiān)果和貝類所引起的過敏則有可能導(dǎo)致一種稱之為“過敏性休克”的危急情況發(fā)生。這是由于當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生的反應(yīng)如此強(qiáng)烈以至于引起喉頭水腫、血壓下降和呼吸困難。某些情況下，此類反應(yīng)是致命的。
在發(fā)達(dá)國(guó)家(即歐洲、北美和日本)，過敏癥的發(fā)病率越來越高，估計(jì)有20-50％的人口受到影響?，F(xiàn)在已經(jīng)知道，過敏癥是免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞成分的失衡所導(dǎo)致的結(jié)果。更確切地講，過敏癥患者的T輔助細(xì)胞2型(Th2)相對(duì)于T輔助細(xì)胞1型(Th1)而言活性是增高的，這引起IgE的產(chǎn)生增加。
IgE(免疫球蛋白E)至少是引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)之一。正常情況下，在血液中檢測(cè)不到對(duì)一種過敏原具有特異性的IgE，其僅在人體被一種物質(zhì)致敏后產(chǎn)生。引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)(稱為過敏原)可誘導(dǎo)產(chǎn)生一種特異性的IgE，其只與該物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。IgE與過敏原之間的反應(yīng)就像是鎖和鑰匙，IgE與過敏原結(jié)合后會(huì)引起細(xì)胞釋放化學(xué)物質(zhì)(例如組織胺)，后者可引起過敏癥狀。人可能會(huì)對(duì)不只一種的物質(zhì)產(chǎn)生特異性IgE，因此可以對(duì)不只一種的物質(zhì)發(fā)生過敏反應(yīng)。IgE的檢測(cè)結(jié)果以梯度表示，以示出血液中所檢測(cè)的特異于該物質(zhì)的IgE的量。梯度越高，病人越可能出現(xiàn)過敏情況。在過去的幾十年中，診斷過敏性疾病僅使用得自主要過敏原來源的幾乎未經(jīng)純化的提取物。顯然，這些粗提純的混合物的組分復(fù)雜而不穩(wěn)定。結(jié)果造成這些提取物的診斷效力時(shí)常變化并導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性結(jié)果。后者主要是由提取物中的過敏原不穩(wěn)定引起。使用提取物來診斷過敏的另一個(gè)缺點(diǎn)在于目前的產(chǎn)品在免疫原組合物方面缺乏標(biāo)準(zhǔn)化。市場(chǎng)上各個(gè)公司產(chǎn)品的效力單位以及計(jì)算方法均各不相同。其結(jié)果是各個(gè)公司的診斷產(chǎn)品之間缺乏可比性。
過去的幾十年間已經(jīng)鑒定出了最重要的疾病相關(guān)的成分——主要過敏原，但尚未將其量化用作過敏原提取物的標(biāo)準(zhǔn)化基礎(chǔ)。針對(duì)大多數(shù)主要過敏原的單克隆抗體已經(jīng)出現(xiàn)。
根據(jù)已知方法對(duì)過敏癥進(jìn)行檢測(cè)并非是一個(gè)簡(jiǎn)單的過程，假如采集病史以鑒定哪一種檢測(cè)方法是最為合適的，那么這些方法將十分有用。但是，目前僅有很少幾種能夠鑒定過敏癥的醫(yī)學(xué)檢查方法，并且此類檢查方法通常僅限于在臨床實(shí)驗(yàn)室和?？浦行氖褂?。同時(shí)，盡管執(zhí)業(yè)人員或過敏癥的?？漆t(yī)生可相對(duì)容易地做出遺傳性過敏癥或過敏癥的診斷，但通常仍然需要進(jìn)一步檢查來加以證實(shí)。
各種類型的過敏癥檢查方法有
1.皮膚針刺試驗(yàn)將疑似過敏原注射到緊鄰皮膚表面的下方，其反應(yīng)由具有資格的護(hù)士或醫(yī)生進(jìn)行觀察。如果反應(yīng)呈陽性，會(huì)出現(xiàn)局部皮膚發(fā)紅，反應(yīng)越強(qiáng)，則該發(fā)紅的區(qū)域越大。皮膚試驗(yàn)具有很高的敏感性，盡管該方法并不能對(duì)所有類型的過敏癥進(jìn)行判定。
2.皮膚接觸試驗(yàn)皮膚接觸試驗(yàn)可用于診斷接觸性皮炎。所檢測(cè)的物質(zhì)通常用貼片覆蓋在皮膚上，并在原位保留48小時(shí)。陽性反應(yīng)者會(huì)出現(xiàn)一小片濕疹，同樣，其反應(yīng)由具有資格的護(hù)士或醫(yī)生進(jìn)行觀察。
3.其他的過敏癥檢測(cè)方法其他類型的過敏癥檢測(cè)方法還有很多，但均不夠精確或未被醫(yī)學(xué)界所認(rèn)可，這些檢測(cè)方法通常既不準(zhǔn)確又十分昂貴。
4.Vega試驗(yàn)Vege試驗(yàn)是屬于生物能調(diào)節(jié)技術(shù)(bioenergetic regulatorytechnique)的電檢測(cè)方法(electrical test)。該儀器通過惠斯通電路(Wheatstone circuit)來測(cè)定電導(dǎo)。檢測(cè)時(shí)將電極連接于針刺部位或由病人手持電極，然后將各種溶液放入一個(gè)金屬槽內(nèi)。然后將一個(gè)裝有毒物的玻璃小瓶置于槽內(nèi)對(duì)儀器進(jìn)行校對(duì)，小瓶引起導(dǎo)電性下降，再將其他物質(zhì)置于槽內(nèi)，如果其能產(chǎn)生相近的讀數(shù)，即可視為過敏反應(yīng)或“敏感(sensitive)”反應(yīng)。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于健康食品店，但其價(jià)值并未得到認(rèn)可，也沒有有效的試驗(yàn)對(duì)其加以證實(shí)。
5.白細(xì)胞毒性試驗(yàn)白細(xì)胞毒性試驗(yàn)包括將病人的白細(xì)胞與特定食物的提取物相混合，然后通過不同途徑觀察細(xì)胞的一些改變形式來進(jìn)行測(cè)定。因其具有很高的假陽性和假陰性反應(yīng)率，美國(guó)變態(tài)反應(yīng)疾病協(xié)會(huì)(AmericanAcademy of Allergy)認(rèn)為沒有證據(jù)顯示其對(duì)食物和吸入性過敏癥的診斷有幫助。
6.毛發(fā)分析另一種檢測(cè)方法是毛發(fā)分析。毛發(fā)分析可發(fā)現(xiàn)體內(nèi)是否存在有毒金屬例如鉛、汞以及鎘，或是否缺乏硒、鋅、錳和鎂。司法界關(guān)于重金屬中毒有很多記載，其中毛發(fā)分析可用于證實(shí)是否存在有毒金屬接觸。但是，毛發(fā)分析這種類似于“探詢水源(dowsing)”的方法作為診斷過敏癥的手段，還從未被證明是有效的。
7.應(yīng)用性運(yùn)動(dòng)機(jī)能學(xué)(Applied kinesiology)將食物樣品放置于病人的舌下或放入玻璃容器內(nèi)由病人手持，然后請(qǐng)病人用不持容器的手臂用力推檢測(cè)者的手臂，過敏反應(yīng)被檢測(cè)到的表現(xiàn)為病人的肌肉反應(yīng)性下降以及手臂上舉困難。但該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)經(jīng)雙盲試驗(yàn)證實(shí)是無效的。
此外，尚有各種通過檢測(cè)來自病人的血液樣品中存在的IgE或IgG抗體來診斷過敏癥的體外檢測(cè)方法8.傳統(tǒng)的方法如ELISA或蛋白印跡借助于(重組)免疫原來檢測(cè)病人血清中存在的抗體(IgE)。
9.放射免疫吸附試驗(yàn)(Radioallergosorbent test(RAST))其過程為將特異性免疫原偶聯(lián)于紙盤上；如果待檢測(cè)的(病人)血清中存在免疫特異性的IgE，其將結(jié)合于盤上；然后通過放射性標(biāo)記的抗IgE實(shí)施檢測(cè)。各種不同的評(píng)分體系均將所得檢測(cè)結(jié)果與陰性對(duì)照的絕對(duì)結(jié)合進(jìn)行比較。通常而言，改良的RAST方法采用孵育過夜以獲得更高的敏感性。
10.基于RAST的定量IgE抑制實(shí)驗(yàn)，其中將過敏原提取物點(diǎn)到硝酸纖維素條上，將測(cè)定量的血清與特異性重組過敏原的混合物進(jìn)行預(yù)孵育，然后再將此混合物置于所述硝酸纖維素條上進(jìn)行孵育，通過抗人IgE抗體對(duì)結(jié)合的IgE進(jìn)行檢測(cè)，最后計(jì)算經(jīng)重組過敏原預(yù)吸附后的、IgE與天然提取物的結(jié)合抑制百分?jǐn)?shù)。
11.細(xì)胞抗原刺激試驗(yàn)(CAST)，其中將病人的嗜堿性細(xì)胞用白細(xì)胞介素-3(IL-3)和過敏原進(jìn)行刺激，繼而用ELISA測(cè)定新產(chǎn)生并釋放的硫化白三烯(sulfidoleukotriene(SLT))。
12.UniCAP將重組過敏原固定于固相支持物上，然后檢測(cè)存在于病人血清中的抗體與所述過敏原的結(jié)合。
但是，使用這些方法對(duì)大量(如100種)過敏原進(jìn)行檢測(cè)需要重復(fù)大量的實(shí)驗(yàn)步驟。此外，上述這些檢測(cè)方法并未顯示出足夠的敏感性和可靠性，并且十分費(fèi)時(shí)。同時(shí)進(jìn)行此類檢測(cè)需要大量的樣品量(如病人的血清)以及大量的純化的、很可能是昂貴的重組過敏原。
美國(guó)專利4,444,879涉及用于測(cè)定總免疫球蛋白和IgE的免疫分析的方法和裝置。其將提取的過敏原固定于包被了聚合物的微滴定板的孔內(nèi)，然后將待測(cè)樣品加入到孔內(nèi)，進(jìn)行傳統(tǒng)的免疫分析。
歐洲專利0,556,745A1描述了一種用于檢測(cè)體液中的抗小麥蛋白IgE抗體的方法，其中小麥免疫原提取物被固定于固相支持物的表面，所述固相支持物例如為層析和毛細(xì)材料或纖維、玻璃、尼龍、纖維素或它們的衍生物，其形式可以為玻璃珠、微顆粒、膜或是微滴定板的孔。同樣用傳統(tǒng)的免疫分析方法來檢測(cè)來自病人的樣品。
美國(guó)專利3,720,760涉及用于分析體液內(nèi)的免疫球蛋白的方法。其同樣將購(gòu)得的含有免疫原的提取物結(jié)合到不溶于水的聚合物上，然后進(jìn)行傳統(tǒng)的免疫分析。
美國(guó)專利4,849,337涉及通過將血清中的IgE結(jié)合到吸附于不溶性支持物上的免疫原而鑒定病人血清中的免疫原特異性IgE水平的方法。同樣，免疫原可以是直接來自于花粉、灰塵、動(dòng)物等的提取物或免疫原。
但是，這些傳統(tǒng)的免疫分析方法對(duì)于檢測(cè)病人的過敏癥并不很有效，因?yàn)楦鞣N過敏癥的數(shù)量已經(jīng)超過數(shù)百種，并且仍在穩(wěn)定增加。對(duì)于每天要對(duì)數(shù)百個(gè)病人的樣品進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室而言，若對(duì)病人的樣品進(jìn)行分析以便認(rèn)定所有可能存在的以及罕見的過敏癥，其所需花費(fèi)的時(shí)間和工作量十分巨大，因此無法進(jìn)行。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)可結(jié)合于樣品中的過敏原的免疫球蛋白的方法，所述方法能克服上述缺點(diǎn)，操作時(shí)間短，僅需要少量的樣品和過敏原，并且具有高度的可靠性和敏感性，最重要的是，其可以在一次檢測(cè)中對(duì)幾乎是無數(shù)種的過敏原進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能夠克服上述缺點(diǎn)的、用于在體外對(duì)病人的過敏癥進(jìn)行診斷的方法。
上述方法的特征在于將一種或多種過敏原固定于微陣列芯片上，其后將樣品與所述固定的過敏原進(jìn)行孵育，使得具有過敏原特異性的免疫球蛋白能夠與所述特異性過敏原相結(jié)合，并由此對(duì)結(jié)合了所述的特異性的、固定的過敏原的免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
微陣列芯片已經(jīng)在一系列的科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)沿用已久DNA操作技術(shù)中得到應(yīng)用。此類DNA芯片已經(jīng)有多種不同的形式，并將最終改變現(xiàn)有的普通實(shí)驗(yàn)室工作中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方式。由于這一新型的體外DNA技術(shù)能夠以“高通量的方式(high-throughput format)”進(jìn)行復(fù)雜的檢測(cè)分析，因此使得體外DNA診斷變得更加省時(shí)、省力。在“蛋白質(zhì)組(proteome)”研究領(lǐng)域中，一些經(jīng)典的固相底物，例如微滴定板、濾膜以及顯微鏡玻片等，也隨之在轉(zhuǎn)變?yōu)楦呙芏鹊奈㈥嚵行问?。這一新型的、多用途的蛋白分析技術(shù)最終使得對(duì)基因表達(dá)和分子相互作用的高通量的篩選成為可能(Walter等，Curr Opin Microbiol 2000Jun；3(3)298-302；Emili和Cagney，Nat Biotechnol 2000Apr；18(4)393-7)。最近，蛋白微陣列的構(gòu)想已經(jīng)開始應(yīng)用于免疫分析中。
生物芯片被認(rèn)為能夠支持高通量(HT)的多元酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。這些生物芯片可由例如96孔光學(xué)平面玻璃板組成，其孔內(nèi)涂有疏水性Teflon涂層；但是，其他材料和形式的生物芯片已知也有應(yīng)用。試驗(yàn)證明，對(duì)排列于玻璃底物上的抗原進(jìn)行特異性的多元檢測(cè)是可行的。這一新型的高通量篩選(HTS)方式的其他應(yīng)用還包括直接細(xì)胞蛋白表達(dá)分析法、感染原的多元檢測(cè)方法以及對(duì)腫瘤的診斷(Mendoza LG等，Biotechniques 1999 Oct；27(4)778-80)。
但是，在此類已知的微陣列芯片蛋白分析方法中，是將抗體固定于微陣列芯片上。令人驚異的是，不僅抗體可被結(jié)合于微陣列芯片，甚至作為相應(yīng)于此類特異性抗體的抗原，特別是IgE和IgG的抗原的過敏原也可被結(jié)合于微陣列芯片。其尤其令人驚異的是，功能性過敏原在以高密度結(jié)合于例如微陣列芯片的固相支持物時(shí)，其可呈現(xiàn)出一種特別的被修飾的二級(jí)結(jié)構(gòu)。過敏原的結(jié)構(gòu)的這種修飾可能會(huì)影響抗體與過敏原的結(jié)合，由此可能會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性的結(jié)果?？贵w、抗體或肽的片段相對(duì)較小且具有高穩(wěn)定性，因此抗體在溶液中相對(duì)于其同源抗原而言具有更高的穩(wěn)定性。但當(dāng)固定于固相支持物上時(shí)，既便是抗體也僅有一小部分能保持完好和活性。
2000年11月9日被接受的Haab等的文章(Genom Biology 2000，I(6)pre-print 0001，1-0001，22)涉及檢測(cè)和定量溶液中的蛋白和抗體的蛋白微陣列。根據(jù)該文獻(xiàn)進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，僅有50％的陣列中的抗原以及20％的陣列中的抗體對(duì)同源過敏原做出了特異和精確的測(cè)定結(jié)果。
此外，就蛋白處理而言，特別是對(duì)于一系列在結(jié)構(gòu)上不同的過敏原進(jìn)行固定和染色，過敏原的差異當(dāng)然較抗體的差異性高得多。但是，令人驚異的發(fā)現(xiàn)，在用于檢測(cè)樣品中的免疫球蛋白方面，固定于微陣列芯片的過敏原具有很高的可靠性和敏感性。
這一方法可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟中對(duì)多種可與一種特異性過敏原相結(jié)合的免疫球蛋白進(jìn)行分析，而該分析還可更為微細(xì)化(atomised)即對(duì)超過100種的不同的過敏原進(jìn)行檢測(cè)而無需進(jìn)行如傳統(tǒng)的微滴定方法中所需的大量的實(shí)驗(yàn)步驟。此外，該方法具有高度的敏感性和可靠性。同時(shí)，該方法可在短時(shí)間內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，如大約3個(gè)小時(shí)，相對(duì)于傳統(tǒng)的RAST或ELISA檢測(cè)縮短了檢測(cè)時(shí)間。
不僅如此，在用含有來自不同病人的樣品的芯片進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，如通過在微滴定板樣涂層的每個(gè)孔中包含一定數(shù)量的不同過敏原的點(diǎn)，再將一個(gè)病人的樣品加入到每個(gè)孔中，微陣列分析具有高度的可重復(fù)性。本發(fā)明的方法的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，大量的不同的探針僅占據(jù)了一個(gè)相對(duì)較小的區(qū)域，因此其密度很高。很小的微陣列的表面區(qū)域使得結(jié)合條件(溫度調(diào)節(jié)、鹽濃度等)達(dá)到很高的均一性，而極大的探針數(shù)量使得雜交得以大量地平行進(jìn)行。由于此高密度的微陣列含有如此大量的探針數(shù)量，其有可能提供大量的對(duì)照，包括例如一種特異的過敏原的變異或突變對(duì)照、總體雜交條件對(duì)照、樣品制備條件對(duì)照、以及針對(duì)非特異性結(jié)合或交叉雜交的錯(cuò)配對(duì)照(mismatchcontrol)。
另外，與傳統(tǒng)檢測(cè)體系相比，此分析方法僅需要最低量的材料(過敏原以及樣品)。這意味著使用微陣列方法時(shí)，使用等量的原材料可以制造出更多的檢測(cè)試劑盒，而使用較小量的樣品便能對(duì)更大量的可結(jié)合于過敏原的免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)。同樣，在小體系中結(jié)合能夠很快地進(jìn)行。
天然的完整“免疫球蛋白”或抗體包含一種通常為Y形的四聚體分子，其在每一“上臂”的末端具有抗原結(jié)合部位?？乖Y(jié)合部位由一條重鏈的可變區(qū)與一條輕鏈的可變區(qū)共同組成。更精確地說，抗體的抗原結(jié)合部位本質(zhì)上是由一條重鏈的可變區(qū)(V.sub.H)的3個(gè)CDR(互補(bǔ)決定簇)和一條輕鏈的可變區(qū)(V.sub.L)的3個(gè)CDR形成的。
通常，術(shù)語“抗原”指的是一種能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的物質(zhì)，一般而言，使用該物質(zhì)可通過現(xiàn)有的、用于證實(shí)抗原抗體相互作用的多種體外和體內(nèi)的免疫學(xué)方法之一來檢測(cè)相應(yīng)的抗體。
類似地，術(shù)語“過敏原”是指能夠誘導(dǎo)并結(jié)合特異性抗體(如IgE)的抗原，該抗體引起一般意義上的過敏癥；但后者的定義并不排除過敏原也誘導(dǎo)反應(yīng)性抗體的可能性，其可以包括IgE以外的其他類型的免疫球蛋白。
文中的蛋白或肽的“固定”是指蛋白/肽以傳統(tǒng)方式結(jié)合于固相支持物，在固相支持物與過敏原之間可有或沒有間隔物。將蛋白/肽固定于支持物為本領(lǐng)域所熟知；在本發(fā)明的范圍內(nèi)，任何的固定包含以例如共價(jià)、非共價(jià)特別是通過疏水作用，分別與例如膜和合成表面等的相互作用。
“微陣列”是要素(feature)(如“點(diǎn)”)的一種排列方式，其非連續(xù)性要素的密度為至少大約16/cm2、優(yōu)選地為至少大約64/cm2、更優(yōu)選地為大約96/cm2、最優(yōu)選地為至少大約1000/cm2。微陣列上的要素具有典型的尺度(typical dimension)，例如直徑的范圍在大約10-2000微米之間，優(yōu)選地在大約50-500微米之間，更優(yōu)選地在大約150-250微米之間，并在微陣列上以與此相同的距離與其他要素相隔離。因此，可用于進(jìn)行常規(guī)性大規(guī)模篩選的本發(fā)明的微陣列可以具有至少500個(gè)、優(yōu)選地具有至少1000個(gè)不同的、包含過敏原、標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)照的點(diǎn)。
本發(fā)明的“芯片”實(shí)際上可以具有任何形狀，例如玻片、微滴定板的孔、甚至是眾多的表面，盡管優(yōu)選地為平坦的陣列表面。
檢測(cè)步驟可通過本領(lǐng)域人員已知的傳統(tǒng)方法進(jìn)行，例如物理性、酶性、化學(xué)性反應(yīng)等。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，IgE可作為免疫球蛋白來檢測(cè)。已知IgE是一種引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)，其僅由對(duì)一種物質(zhì)(即過敏原)過敏的人產(chǎn)生。因此，若要檢測(cè)一個(gè)樣品是否是來自于對(duì)特定過敏原過敏的病人，可對(duì)該樣品的IgE作為免疫球蛋白來檢測(cè)。樣品中的IgE的量越高，該病人越有可能對(duì)該特異性過敏原過敏。
優(yōu)選地可將IgG作為免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)。已知IgG可出現(xiàn)于對(duì)食物過敏的病人的樣品中，因此對(duì)IgG的檢測(cè)可用于食物過敏的指標(biāo)。
可將一種或多種天然的過敏原固定于微陣列芯片上。這些單一過敏原例如可純化自過敏原提取物，例如來自特定的食物或植物?？赏瑫r(shí)對(duì)一種或多種特定類型的過敏原進(jìn)行分析。
純化的方法大體上為本領(lǐng)域人員所熟知，例如層析純化、大量分離純化、通過過敏原與固相的特異性結(jié)合(例如通過抗體)進(jìn)行純化等，但將高度純化的過敏原應(yīng)用于過敏癥檢測(cè)方法的大量生產(chǎn)尚未被提出過。
“純化的”過敏原與提取物不同，其涉及的是單一的過敏原，例如天然的、重組的或合成的過敏原。這些固定于固相支持物上的純化的過敏原與過敏原提取物相比具有很多優(yōu)點(diǎn)由于所有的提取物均為多種蛋白的混合物，其中待檢測(cè)的過敏原濃度較純化的單一過敏原制劑要低得多。因此，純化的單一過敏原能以很高的濃度被固定于微陣列上。由于包含純化的過敏原的制劑中的分子是被限定的，因此只有經(jīng)限定的過敏原才有可能被固定于微陣列上。所以，微陣列以及借助于純化的過敏原來檢測(cè)抗體的方法可以做到標(biāo)準(zhǔn)化和精確定量對(duì)照分析。
此外，由于組合物中存在高濃度的純化的過敏原，過敏原能以較高的密度固定于微陣列上，因此使得借助于此微陣列的任何檢測(cè)方法與使用包含過敏原的提取物的微陣列相比具有更高的敏感性。純化的單一過敏原相對(duì)于過敏原提取物的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，經(jīng)固定的純化的過敏原是精確限定的。與純化的過敏原不同，過敏原提取物包含例如兩種、三種和更多的不同的微生物或?qū)ο筮^敏原。例如就蘋果而言，提取物可包含各種蘋果過敏原的混合物，而本發(fā)明的組合物則包含一種純化的蘋果過敏原或，視用途而定，一種經(jīng)限定的兩種或多種蘋果或其他過敏原的混合物。
純化的過敏原相對(duì)于非純化的過敏原(如混合物)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，由于提取物中存在其他的雜質(zhì)，提取物經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)變得不穩(wěn)定，例如會(huì)發(fā)霉。而這將會(huì)影響對(duì)過敏癥的檢測(cè)，因?yàn)樵谶@種情況下，對(duì)霉菌的過敏可以引起假陽性的結(jié)果。
此外，由于提取物中存在蛋白酶，提取物是不穩(wěn)定的，而純化的過敏原則不會(huì)如此。
同樣的，由于目前存在借助于純化的過敏原的治療方法，因此經(jīng)同一過敏原成分確定的診斷相對(duì)于經(jīng)非純化的過敏原確定的診斷而言具有很大的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)使用純化的過敏原對(duì)治療效果進(jìn)行跟蹤以及判斷病人對(duì)特異性治療的反應(yīng)時(shí)，前一種診斷具有特別的優(yōu)勢(shì)，并能由此為病人提供所謂“量體裁衣的(patient tailored)”的治療。
鑒于上述原因，通過將一種或多種純化的過敏原固定于微陣列芯片上，并由此對(duì)樣品中的可結(jié)合該過敏原的免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)的方法具有特別的優(yōu)勢(shì)。
優(yōu)選地，可將一種或多種重組的過敏原固定于微陣列芯片上。在過去的數(shù)年間，已經(jīng)生產(chǎn)出大量的重組的過敏原。重組過敏原的生產(chǎn)大體上也為本領(lǐng)域所知，但對(duì)常規(guī)的過敏原檢測(cè)方法幾乎未產(chǎn)生影響。應(yīng)用重組的過敏原，可以提供大量的一種或多種特異性過敏原。此外還可以對(duì)重組過敏原進(jìn)行特異性的修飾，以產(chǎn)生用于檢測(cè)特定的免疫球蛋白的變異過敏原。不僅如此，就檢測(cè)的穩(wěn)定性以及診斷的標(biāo)準(zhǔn)化而言，大量使用重組蛋白作為過敏原提供了一種可替代基于提取物的檢測(cè)方法的另一種方法。重組的(或合成的)過敏原就其生產(chǎn)方式而言也更利于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。此外，重組的(或合成的)過敏原較天然來源的過敏原在不同的生產(chǎn)批次之間的差別更小。本發(fā)明令人驚異地顯示，這些重組的過敏原在本發(fā)明的常規(guī)體外診斷檢測(cè)中的用途等同于或優(yōu)于傳統(tǒng)的基于提取物的檢測(cè)體系。與現(xiàn)有的常規(guī)系列檢測(cè)不同，使用重組過敏原的本過敏原檢測(cè)方法，在標(biāo)準(zhǔn)化、可控制性、可重復(fù)性等方面，為標(biāo)準(zhǔn)的過敏原檢測(cè)帶來了一種全新的質(zhì)量保證。
重組過敏原的實(shí)例見下述出版物中所述Chapman等，Allergy，52374-379(1997)、Laffer等，J Allergy Clin Immunol Vol 98 Number2 652-658(1996)、Mller等，Clinical和Experimental Allergy Vol 27 9.915-920(1997)、Niederberger等，J Allergy Clin Immunol Vol 102Number 4，Part 1 579-591(1998)、Menz等，Clinical and ExperimentalAllergy Vol 26，50-60(1996)，這些已作為參考并入本文。其他(重組)過敏原例如但不限于rBetv1、rBetv2、rBetv4、rJunO2、Cass1、rPhlp1、rPhlp2、rPhlp4、rPhlp5a、rPhlp6、rPhlp7、rPhlp11、rPhlp12、rParj2、Artv1a、Mugwort profilin、Apig1、Apig1.0201、Dauc1.2、rArah2、rArah5、Mald1、Mald2、rPena1、recCarp、rDerp1、rDerp2.0101、rDerp2、rDerp2b、rDerp5、rDerp5a、rDerp7、rDerp8、rDerp10、rTyrp2、rLepd2.01、rLepd13、rEurm2.0101、rFeld1、rFeld1a、rBosd2、來自貓的代表性過敏原、來自狗的代表性過敏原、來自BSA的代表性過敏原、來自小鼠的代表性過敏原、來自大鼠的代表性過敏原、來自豬的代表性過敏原、來自綿羊的代表性過敏原、來自雞的代表性過敏原、來自兔的代表性過敏原、來自倉(cāng)鼠的代表性過敏原、來自馬的代表性過敏原、來自鴿子的代表性過敏原、來自Guineaalbumin的代表性過敏原、HSA、a-NAC、rPenc3、Penn13、rPenc19a、rPenc19b、rAspf1、rAspf1a、rAspf3、rAspf3a、rAspf4、rAspf4a、rAspf6、rAspf6a、rAspf7、rAspf8、rAlta1、rAlta2、rMalf1、rMalf5、rMalf6、rMalf7、rMalf8、rMalf9、rHevb1、rHevb1a、rHevb3、rHevb8、rHevb9、rHevb10、rHevb11、rAK、rBlag2、rBlag4、rBlag5、磷脂酶A、透明質(zhì)酸酶、rVesv5、rVesg5。
在另一個(gè)有利的實(shí)施方案中，將一種或多種合成的過敏原固定于微陣列芯片上。前面提及的重組過敏原對(duì)于過敏原提取物以及純化的天然過敏原所具有的優(yōu)勢(shì)在此同樣存在。用于合成肽或蛋白的方法是現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域熟知的；通過合成過敏原，可以低成本提供大量的高度純化的過敏原，這是由于此類生產(chǎn)方法是高度自動(dòng)化的。此外還可提供經(jīng)過修飾或未經(jīng)修飾的任何過敏原的精確序列，由此增加本方法對(duì)免疫球蛋白的檢測(cè)的敏感性和可靠性。
其還可以在本發(fā)明的檢測(cè)方法中僅使用特定過敏原的過敏原性決定簇或過敏原性結(jié)構(gòu)域。這可以避免在大分子量蛋白質(zhì)操作中的危險(xiǎn)和缺點(diǎn)，因?yàn)樵诔Ｒ?guī)的生物芯片的生產(chǎn)中，較短的肽結(jié)構(gòu)較易于操作。這一點(diǎn)適用于所有純化的天然過敏原、重組過敏原以及合成過敏原。其進(jìn)一步可對(duì)單個(gè)的肽表位進(jìn)行檢測(cè)，特別是就特異性而言，這將使診斷試驗(yàn)和治療更加優(yōu)化。
在同一芯片中同時(shí)提供天然形式的過敏原和合成或重組形式的過敏原具有特別的優(yōu)勢(shì)。而優(yōu)選地是主要應(yīng)用重組的或合成的過敏原。天然形式的過敏原至少可以為芯片提供對(duì)照或附加的質(zhì)量信息。因此本發(fā)明的一種優(yōu)選的芯片包含至少一種過敏原的一種天然形式和一種合成或重組形式。這同樣可改善不同批次的過敏原的質(zhì)量對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)化。
優(yōu)選地，將一種或多種半抗原作為過敏原固定于微陣列芯片上?！鞍肟乖笔且环N低分子量(典型地為低于7000 Dalton)的物質(zhì)，在施用于動(dòng)物體內(nèi)、包括人體內(nèi)后，通常其自身不能引起顯著的抗體產(chǎn)生。這是由于半抗原太小而不能被機(jī)體的免疫系統(tǒng)所識(shí)別。但當(dāng)半抗原偶聯(lián)于一種較大的載體分子后，半抗原便可獲得抗原性。換言之，半抗原與載體分子的結(jié)合(形成分析物-載體分子復(fù)合物(analyte-carrier molecule combination))使得所結(jié)合的半抗原能夠被動(dòng)物的免疫系統(tǒng)所識(shí)別。在半抗原(偶聯(lián)了載體分子)與相應(yīng)的抗體之間可發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)。通過使用固定于微陣列芯片的半抗原，可在芯片上達(dá)到更高的密度。
當(dāng)然，上述不同形式的過敏原可以組合使用，例如同時(shí)使用重組的和(純化的)天然過敏原。通過將這些不同的形式進(jìn)行組合，可以對(duì)它們進(jìn)行比較，并可對(duì)例如重組過敏原進(jìn)行對(duì)照，還可為各種批次的天然過敏原作為對(duì)照，后者因生物來源、制備方法、純度等方面的不同而存在差異。
對(duì)于高效的檢測(cè)方法，所使用的過敏原優(yōu)選地具有最佳的特征，例如高結(jié)合力。但是對(duì)于低結(jié)合效率的過敏原變體的檢測(cè)，則優(yōu)選地使用活性較低或不同的抗原，如在脫敏治療(hyposensitizationtherapy)中的用途。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，過敏原被固定于微陣列芯片上直徑為10-2000微米、優(yōu)選地直徑為50-500微米、更優(yōu)選地直徑為150-250微米的點(diǎn)上。由于這些點(diǎn)的直徑很小，因此可以在微陣列芯片的分離的點(diǎn)上固定大量的不同中種類的過敏原以及各種濃度的特異性過敏原，從而可以提供能夠在一個(gè)自動(dòng)化步驟中對(duì)大量的過敏原或大量的過敏原濃度進(jìn)行分析的一種微陣列芯片。
優(yōu)選地過敏原被固定于固相支持物，優(yōu)選地可以分別是玻璃載體、合成載體、硅晶片以及膜。這些芯片可根據(jù)例如下列所述的方法生產(chǎn)Ge，H.(2000)，Nucleic Acids Research，28，e3(i-vii)；Qian W.等，(2000)，Clinical Chemistry，46(1456-1463)；MacBeath G.等，(2000)，Science，289，(1760-1763)，這些出版物所公開的內(nèi)容在此作為參考。這些材料各自的特征和優(yōu)點(diǎn)為本領(lǐng)域人員所熟知。因此，用于微陣列芯片的材料將根據(jù)所要檢測(cè)的過敏原、用于檢測(cè)結(jié)合形式的免疫球蛋白的方法、所用的緩沖液等進(jìn)行選擇。此外，經(jīng)濟(jì)問題也是選擇材料的一個(gè)因素。
優(yōu)選地微陣列芯片是經(jīng)過化學(xué)修飾的，優(yōu)選地分別為氨基反應(yīng)修飾和羧基反應(yīng)修飾。這樣可以精確地確定過敏原結(jié)合于微陣列芯片的方式。
優(yōu)選地過敏原共價(jià)結(jié)合于微陣列芯片。這樣可提供穩(wěn)定結(jié)合于微陣列芯片的過敏原，由此提供了一種特別可靠的方法。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)作為樣品的血清中的免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)過敏原過敏的病人，免疫球蛋白主要出現(xiàn)于血清中，因此對(duì)血清進(jìn)行分析是檢測(cè)免疫球蛋白的一種可靠方法。此外，病人的血清易于通過簡(jiǎn)單的途徑采集，樣品的采集甚至可以在病人的家中進(jìn)行。
優(yōu)選地，血清以1∶1-1∶15稀釋，優(yōu)選為1∶5?？捎萌魏芜m當(dāng)?shù)娜芤簩?duì)其進(jìn)行稀釋，例如1xTBST(10mM Tris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，0.5％TWEEN 20)。
優(yōu)選地將樣品與過敏原孵育1分鐘到24小時(shí)，優(yōu)選地為1-2小時(shí)。當(dāng)然，也可以將樣品與過敏原孵育數(shù)日。但這并不能信號(hào)強(qiáng)度或特異性。通常而言，孵育1小時(shí)足以獲得可靠而敏感的結(jié)果。
此外，樣品與過敏原優(yōu)選地在0-60℃之間孵育，優(yōu)選為37℃。較低的孵育溫度不能增加信號(hào)，反而可能增加非特異性結(jié)合及本底。在37℃孵育對(duì)檢測(cè)人的過敏原而言可得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。
優(yōu)選地，通過至少一種標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體對(duì)結(jié)合的免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)。在此使用的術(shù)語“抗體”指的是完整的分子以及其片段，例如Fa、F(ab).sub.2、和Fv，其均可結(jié)合表位決定簇。制備抗體可使用含有作為免疫原的所需小肽的完整的多肽和片段。用于免疫動(dòng)物的多肽或肽可由RNA的翻譯獲得，也可化學(xué)合成，如果需要，可以連接上載體蛋白。通常用于與肽進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)的載體包括牛血清白蛋白和甲狀腺球蛋白。然后用偶聯(lián)的肽來免疫動(dòng)物(例如小鼠、大鼠或兔)。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語抗體指單克隆或多克隆抗體，其中單克隆抗體可由任何在培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系中產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)進(jìn)行制備。這包括但不限于雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以及IBV雜交瘤技術(shù)。此外尚有嵌合抗體、單鏈抗體以及合成抗體。
抗體可用任何已知方法進(jìn)行標(biāo)記，從而可對(duì)結(jié)合的抗體進(jìn)行定性，并優(yōu)選地進(jìn)行定量。適合用于本發(fā)明的可檢測(cè)的標(biāo)記物包括任何可由分光光度計(jì)、光化學(xué)方法、生化方法、免疫化學(xué)方法、電學(xué)方法、光學(xué)方法或化學(xué)方法檢測(cè)的組合物。有用的標(biāo)記物包括以標(biāo)記的抗生物素綴合物進(jìn)行染色的生物素、磁珠、熒光染料(如熒光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等等)、放射性標(biāo)記(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶以及其他在ELISA中常用的酶)、以及比色標(biāo)記物如膠體金或彩色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯乳膠等)珠。
本領(lǐng)域已知檢測(cè)此類標(biāo)記物的方法。因此，例如放射性標(biāo)記物可通過顯影膠片或閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行檢測(cè)，熒光標(biāo)記物可通過檢測(cè)發(fā)射光的光檢測(cè)器來檢測(cè)。酶標(biāo)記物可典型地可通過將底物提供給酶然后檢測(cè)酶與底物的反應(yīng)產(chǎn)物來檢測(cè)，而比色標(biāo)記物可通過簡(jiǎn)單地觀察有色標(biāo)記物來檢測(cè)。
優(yōu)選地，結(jié)合的免疫球蛋白通過至少一種分別用熒光和放射性標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體來檢測(cè)。這些用于定性和定量分析結(jié)合的抗體的經(jīng)典方法十分特異可靠。
其他優(yōu)選的用于微陣列的檢測(cè)體系例如見下列所述Schult K.等，(1999)，Anal Chem，71(5430-5435)；Vo-Dinh T.等，(1999)，AnalChem，71(358-363)；Brignac SJJr.等，(1999)，IEEE Eng Med Biol Mag，18(120-122)；Otamiri M.等，(1999)，Int J Biol Macromol，26(263-268)；Wright，GL Jr.(2000)，Prostate Cancer and Prostatic Diseases，2(264-276)；Nelson RW等，(2000)，Electrophoresis 21(1155-1163)；RichRL.等，(2000)，Curr Opin Biotechnol 11(54-61)；Chen JJ.等，(1998)，Genomics，51(313-324)，其出版物在此并入作為參考。
優(yōu)選地，將一種或多種室內(nèi)過敏原作為過敏原進(jìn)行固定。這些可以是但不限于螨(Mites)、Tyr.put、Lep.dest.或Lep.mayrei、Felis、Bos、Albumine、Pen.cit.、Pen.not.、Asp.fumigatus、Alt.alt.、Malasseziafurfur、膠乳(Latex)、Plodia、Blatella。
在本發(fā)明的一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，將一種或多種戶外過敏原作為過敏原進(jìn)行固定。這些可以是但不限于Betula、Juniperus、Phleum、Parietaria judicea。
進(jìn)一步地，將一種或多種食物過敏原作為過敏原進(jìn)行固定。例如sellerie、karott、花生、蘋果、蝦、魚。
進(jìn)一步地，將一種或多種毒物過敏原作為過敏原進(jìn)行固定。這些可以是但不限于蜜蜂或黃蜂。
同樣地，將一種或多種自體過敏原作為過敏原進(jìn)行固定。這些自體過敏原可以是例如肝細(xì)胞膜抗原、ssDNA抗原、骨骼肌細(xì)胞內(nèi)或表面抗原等。
本發(fā)明的另一方面涉及在體外診斷病人的過敏癥的方法，其中包括采集病人的血清樣品，然后按照上述的本發(fā)明的方法分析樣品中的可結(jié)合于過敏原的免疫球蛋白，在該方法中將至少10種、優(yōu)選至少50種、更加優(yōu)選至少90種不同的過敏原固定于微陣列芯片上，然后將樣品與固定的過敏原之間出現(xiàn)陽性反應(yīng)者診斷為過敏癥。與已知診斷過敏癥的方法相比，上述定義的用于體外診斷過敏癥的本方法具有優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的方法的優(yōu)勢(shì)在于，由于所有待測(cè)的過敏原均被固定于一個(gè)微陣列芯片上，因此僅用一份樣品便可同時(shí)對(duì)大量的過敏癥進(jìn)行診斷。每一步均在同一個(gè)芯片上進(jìn)行，而此芯片還包含未固定過敏原的點(diǎn)，因此同時(shí)可進(jìn)行陰性檢測(cè)。待測(cè)過敏原的數(shù)量并無限定，當(dāng)然還可以使用兩個(gè)或更多的微陣列芯片。
本發(fā)明的另一方面涉及其上固定了一種或多種過敏原的微陣列芯片。上述的定義和優(yōu)勢(shì)也同樣應(yīng)用于本方面。
優(yōu)選地，過敏原被固定于直徑為100-500微米、優(yōu)選直徑為200-300微米的點(diǎn)上。
優(yōu)選地微陣列芯片分別為玻璃載體、合成載體、硅晶片以及膜。
優(yōu)選地，微陣列芯片是經(jīng)過化學(xué)修飾的，優(yōu)選地分別經(jīng)過氨基反應(yīng)和羧基反應(yīng)修飾。
優(yōu)選地，過敏原共價(jià)結(jié)合于微陣列芯片上。
本發(fā)明的另一方面涉及一種試劑盒，其包含上述的本發(fā)明的微陣列芯片和一種第一試劑以及可能的一種第二試劑，所述第一試劑包含至少一種免疫球蛋白檢測(cè)試劑，優(yōu)選地為抗免疫球蛋白抗體，優(yōu)選地為已知濃度，所述第二試劑作為陽性樣品包含至少一種可結(jié)合于過敏原的免疫球蛋白。所述第一試劑包含至少一種免疫球蛋白檢測(cè)試劑，優(yōu)選地為可用于檢測(cè)結(jié)合的免疫球蛋白的抗免疫球蛋白抗體，其中的抗免疫球蛋白抗體優(yōu)選地按上述進(jìn)行標(biāo)記。優(yōu)選地第一試劑的抗體是已知濃度的，由此可提供具有可重復(fù)性的結(jié)果。此外，此試劑盒優(yōu)選地包含一種第二試劑作為陽性樣品，其包含至少一種可結(jié)合于過敏原的免疫球蛋白。同樣地，第二試劑中的該免疫球蛋白優(yōu)選地是已知濃度的，由此通過將所得的病人樣品的結(jié)果與陽性樣品(第二試劑)的結(jié)果進(jìn)行比較可以對(duì)樣品中的免疫球蛋白進(jìn)行定量。
優(yōu)選地，所提供的該試劑盒用于如上所述的本發(fā)明的方法。為此，所述第一試劑與第二試劑被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)病人的可結(jié)合于特定過敏原的特異性免疫球蛋白，或者是檢測(cè)病人的一種特定的過敏癥。但該試劑盒也被設(shè)計(jì)為用于檢測(cè)病人的可結(jié)合于多種過敏原的多種免疫球蛋白，或者是用于診斷多種過敏癥。
現(xiàn)就下列實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的描述，本發(fā)明當(dāng)然不限于此。


圖1顯示的為一種過敏原微陣列的示意圖2顯示來自過敏病人的血清經(jīng)過敏原微陣列分析后的掃描圖像；圖3a-3c顯示的為得自一次三重分析的散點(diǎn)圖。
圖4a-4c顯示對(duì)固定的提取物和固定的重組過敏原所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度％。
實(shí)施例1過敏原點(diǎn)樣(Allergen spotting)使用Genetic Microsystems的GMS 417點(diǎn)樣儀(spotter)來排列過敏原。蛋白被點(diǎn)到衍生化的(derivatized)玻璃片上。將每一種過敏原在一個(gè)圓點(diǎn)上點(diǎn)一次，共點(diǎn)3個(gè)圓點(diǎn)。該圓點(diǎn)(要素(features))的直徑為大約200微米。
過敏原的功能組合方式如下(A)戶外(I.樹木[1＝rBetv1，2＝rBetv2、3＝rBetv4、4＝rJunO2、5＝Cass1]、II.草[6＝rPhlp2、7＝rPhlp4、8＝rPhlp5a、9＝rPhlp1、10＝rPhlp6、11＝rPhlp7、12＝rPhlp11、13＝rPhlp12]、III.種子[14＝rParj2、15＝Arty1a、16＝Mugwort profilin])，(C)食物過敏原(X.蔬菜[17＝Apig1、18＝Apig1.0201、19＝Dauc1.2、20＝rArah2、21＝rArah5]、XI.水果[22＝Mald1、23＝Mald2]、XII.蝦[24＝rPena1]、XIII.魚[25＝recCarp])，(B)室內(nèi)(IV.Mites[26＝rDerp1、27＝rDerp2.0101、28＝rDerp2、29＝rDerp2b、30＝rDerp5、31＝rDerp5a、32＝rDerp7、33＝rDerp8、34＝rDerp10、35＝rTyrp2]、V.動(dòng)物[36＝rLepd2.01、37＝rLepd13、38＝rEurm2.0101、39＝rFeld1、40＝rFeld1a、41＝rBosd2、42＝來自貓的代表性過敏原、43＝來自狗的代表性過敏原、44＝BSA、45＝來自小鼠的代表性過敏原、46＝來自大鼠的代表性過敏原、47＝來自豬的代表性過敏原、48＝來自綿羊的代表性過敏原、49＝來自雞的代表性過敏原、50＝來自兔的代表性過敏原、51＝來自倉(cāng)鼠的代表性過敏原、52＝來自馬的代表性過敏原、53＝來自鴿子的代表性過敏原、54＝來自Guineaalbumin的代表性過敏原、VI.霉菌[55＝rPenc3、56＝rPenc19a、57＝rPenc19b、58＝Penn13、59＝rAspf1、60＝rAspf3、61＝rAspf4、62＝rAspf6、63＝rAspf1a、64＝rAspf3a、65＝rAspf4a、66＝rAspf6a、67＝rAspf7、68＝rAspf8、69＝rAlta1、70＝rAlta2]、VII.酵母[71＝rMalf7、72＝rMalf1、73＝rMalf5、74＝rMalf6、75＝rMalf8、76＝rMalf9]、VIII.乳酸[77＝rHevb1、78＝rHevbla、79＝rHevb3、80＝rHevb8、81＝rHevb9、82＝rHevb10、83＝rHevb11]、IX.Insects[84＝rAK、85＝rBlag2、86＝rBlag4、87＝rBlag5.]]，(D)毒物(XIV.蜜蜂[88＝Ag5、89＝磷脂酶A、90＝透明質(zhì)酸酶、91＝rVesv5、92＝rVesg5]、XV.黃蜂[93＝Ag5])，(E)自體過敏原(94＝HSA、95＝a-NAC)此外，將緩沖液圓點(diǎn)散布于過敏原的亞組之間作為背景對(duì)照，以″X″標(biāo)出，″ab″為標(biāo)記的抗體。(圖11864×1182象素、1.86×1.18cm、1000象素/cm、象素深度/色彩8/256、1.象素對(duì)應(yīng)于10微米)。
100微升測(cè)定用量的過敏原分配至96孔微滴定板的孔內(nèi)，其在點(diǎn)樣緩沖液(300mM磷酸鈉pH8.5)內(nèi)的濃度為大約200納克/微升。固定過敏原所用的最佳濃度由滴定實(shí)驗(yàn)計(jì)算得出，所述實(shí)驗(yàn)使用了數(shù)種不同緩沖液內(nèi)的過敏原和不同的玻片。當(dāng)濃度達(dá)到或超過100納克/微升時(shí)，所分析的蛋白顯示出飽和性，用GMS掃描儀進(jìn)行掃描時(shí)變?yōu)槌掷m(xù)的強(qiáng)烈的白色信號(hào)。在此濃度下，過敏原的結(jié)合性與儲(chǔ)存的組合物(the composition of the storage)以及點(diǎn)樣緩沖液無關(guān)。
實(shí)施例2SOPHIA(固相免疫吸附試驗(yàn))購(gòu)自CEL A ssociates(乙醛玻片(aldehyde slides))或自制的玻片經(jīng)孵育過夜后，將其在Falcon管中、在環(huán)境溫度下用1xTBST(10mM Tris pH8.0/150mM NaCl/0.5％Tween 20)震蕩洗滌。然后將玻片轉(zhuǎn)移至含有0.01％BSA的1xTBST溶液中，在環(huán)境溫度中封閉2小時(shí)。接下來將玻片在1xTBST中洗滌15分鐘，并用蒸餾水略加沖洗。
將過敏原微陣列與稀釋的血清(以1xTBST按1∶5稀釋)在37℃孵育(至少)60分鐘，并震蕩。已經(jīng)對(duì)多種稀釋程度的血清進(jìn)行過測(cè)試，范圍在1∶1-1∶15。通常按1∶5稀釋可得到最佳的結(jié)果。將30微升稀釋的血清加到購(gòu)自SIGMA Technologies的加壓密封盒(PressSeal Chamber)內(nèi)的玻片上。加壓密封盒的使用參照廠家提供的方案。與血清一同孵育時(shí)間的范圍為60分鐘到過夜，對(duì)此范圍內(nèi)的多種孵育時(shí)間進(jìn)行了分析。但延長(zhǎng)與血清一同孵育的時(shí)間不能增加信號(hào)強(qiáng)度或特異性。與血清一同孵育后，用1xTBST洗滌玻片(15分鐘，環(huán)境溫度)并震蕩。
選取5份取自曾經(jīng)用傳統(tǒng)的診斷方法(皮膚針刺試驗(yàn)、RAST、ELISA)檢測(cè)過的不同病人的血清和1份取自非遺傳性過敏癥病人的血清用于進(jìn)行過敏原微陣列的基準(zhǔn)測(cè)試。每份血清用不同批次的過敏原微陣列分析至少2次。
將0.01％BSA/1xTBST溶液內(nèi)的、依照生產(chǎn)商提供的方案用AlexaFluor熒光染料標(biāo)記的熒光標(biāo)記的αIgE抗體加入到過敏原微陣列中，在環(huán)境溫度下孵育60分鐘。依據(jù)標(biāo)記的時(shí)間和效率，抗體的工作稀釋濃度的范圍在1∶1000-1∶5000之間。免疫分析后，在環(huán)境溫度下，將玻片以1xTBST洗滌15分鐘并震蕩，然后用蒸餾水略加沖洗。
免疫吸附分析后，使用GMS雙色掃描儀對(duì)玻片進(jìn)行評(píng)價(jià)。通常不同的分析和不同的玻片之間的信號(hào)強(qiáng)度僅存在輕微的差別。但所使用的玻片的類型會(huì)造成背景值的不同。圖2顯示的是對(duì)一個(gè)過敏癥病人的血清用過敏原微陣列分析后的掃描圖像的實(shí)例。該病人對(duì)Phleum、Mite、Felis和蜜蜂有很強(qiáng)的反應(yīng)(參見圖1)。沒有發(fā)現(xiàn)由于緩沖液圓點(diǎn)或自身過敏原的非特異性反應(yīng)引起的背景信號(hào)。經(jīng)過對(duì)過敏癥病人的血清進(jìn)行充分的評(píng)價(jià)后，所得結(jié)果與使用RAST方法檢測(cè)同一份血清所得到的初步數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。用本發(fā)明的方法得到的結(jié)果與已有的數(shù)據(jù)具有良好的一致性。
實(shí)施例3可重復(fù)性檢測(cè)分析病人C的血清使用分別制備的過敏原微陣列對(duì)病人C的血清進(jìn)行了3次分析。
實(shí)驗(yàn)步驟與上述基本一致。
分析后，將玻片用同一硬件設(shè)施進(jìn)行掃描。使用GenePix軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)算3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)，對(duì)每一種過敏原的3次實(shí)驗(yàn)的信號(hào)強(qiáng)度的平均值進(jìn)行比較。
只有比緩沖液點(diǎn)的信號(hào)的平均值高出至少1.5倍的信號(hào)的相應(yīng)的值才用于最后的分析。表1顯示的為相應(yīng)的信號(hào)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及標(biāo)出差百分?jǐn)?shù)。
表1過敏原 檢測(cè)1 檢測(cè)2 檢測(cè)3 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差％ 平均rBet v120731 21325 25060 22372.00 1916.11 8.56rPhl p217176 15529 14227 15644.00 1206.67 7.71rPhl p436134 33511 29328 32991.00 2802.76 8.50rPhl p5a 56600 53068 55594 55087.33 1485.77 2.70rPhl p656244 51359 37625 48409.33 7882.14 16.28rPhl p12 6291 700312289 8527.67 2675.50 31.37rPar j27552 76789444 8224.67 863.7310.50Artv 1a6997 793111258 8728.67 1828.70 20.95Mugwort- 7901 76699260 8276.67 701.748.48profilinMal d1 9890 15295 8176 11120.33 3033.74 27.28HAS9868 873210708 9769.33 809.718.29綿羊白蛋白 9858 829510222 9458.33 835.928.84馬白蛋白 9602 906110559 9740.67 619.376.36rAsp f1(b) 12216 10129 10781 11042.00 871.777.90rMal f513459 11018 12035 12170.67 1001.14 8.23rAK20680 14202 19978 18286.67 2902.48 15.87由3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)分析所得到的值計(jì)算出的平均標(biāo)準(zhǔn)差為12.36％。這說明基于芯片的免疫學(xué)分析方法對(duì)于檢測(cè)病人血清中的IgE具有良好的可重復(fù)性。這一點(diǎn)從三重分析之3中得到的散點(diǎn)圖中也可看出，見圖3a-3c，其中圖3a顯示了測(cè)試1對(duì)測(cè)試3的散點(diǎn)圖，圖3b為測(cè)試2對(duì)測(cè)試3的散點(diǎn)圖，而圖3c為測(cè)試1對(duì)測(cè)試2的散點(diǎn)圖；A代表過敏原，而FI代表熒光強(qiáng)度。
實(shí)施例4不同微陣列的比較為檢測(cè)用于本發(fā)明的最佳的玻片，按照下述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)分別制備的玻片進(jìn)行評(píng)價(jià)—生產(chǎn)方法根據(jù)一些參數(shù)，例如有害化學(xué)品含量以及生產(chǎn)時(shí)間對(duì)制備的玻片做出評(píng)價(jià)。
—生產(chǎn)成本比較自制的和購(gòu)買的玻片的成本。
—結(jié)合能力根據(jù)不同的玻片與熒光標(biāo)記的蛋白的結(jié)合能力對(duì)其做出評(píng)價(jià)。
—可重復(fù)性用經(jīng)過不同預(yù)處理的玻片進(jìn)行系列實(shí)驗(yàn)，根據(jù)總體的分析表現(xiàn)對(duì)其做出評(píng)價(jià)。
—總體背景在進(jìn)行過敏癥分析前后，對(duì)所有的玻片就其有可能降低信號(hào)/噪音比的系統(tǒng)性表面背景做出評(píng)價(jià)。
—檢測(cè)極限評(píng)價(jià)所有玻片在過敏癥篩選分析中每個(gè)點(diǎn)所能檢測(cè)到的最小蛋白濃度。
—血清耐受性通常，病人的血清是一種復(fù)雜的蛋白混合物，不同批次的病人血清對(duì)基于微陣列的免疫分析常會(huì)產(chǎn)生負(fù)性干擾。
—封閉評(píng)價(jià)所有玻片在進(jìn)行過敏癥分析前是否有必要進(jìn)行封閉步驟。
—儲(chǔ)存過敏原芯片制備好后，評(píng)價(jià)所有玻片的長(zhǎng)期存放的情況。
表2所示為上述評(píng)價(jià)研究的結(jié)果
表2
表2所示為文中描述的評(píng)價(jià)研究的結(jié)果。下列符號(hào)及其意義分別為(++)優(yōu)，(+)好，(-)較差，(--)差。(/)代表沒有就此項(xiàng)對(duì)該玻片進(jìn)行分析。(1)具有含醛基的功能性表面的玻片。(2)具有氨基反應(yīng)表面的玻片，其確切的化學(xué)性質(zhì)不明。(3)自制的玻片，具有如表2所示的官能團(tuán)。(4)具有固定蛋白所需的膜的玻片。其所采用的表面衍生物的工作名稱為ProteoBind，其在基于微陣列的過敏癥診斷中具有最佳的表現(xiàn)，并包含(1-[3”-[三甲氧基甲硅烷基]丙基]-1’(4”-異硫代氰酰苯基)硫脲)，根據(jù)Chen等的方法(Nucleic Acids Research，199，vol.27，No.2)制備，將其并入作為參考。
根據(jù)上述評(píng)價(jià)研究，選擇ProteoBind作為用來生產(chǎn)過敏原微陣列的優(yōu)良表面衍生物。
實(shí)施例5比較使用固定的重組過敏原與使用固定的提取物對(duì)樣品中的免疫球蛋白的檢測(cè)為測(cè)定固定于微陣列的純化的重組過敏原與固定于微陣列的過敏原提取物的敏感性以及診斷的相關(guān)信息，將同一來源的特異性過敏原與過敏原提取物進(jìn)行比較。
過敏原組合物固定于微陣列后，將包含所述特異性血清的不同樣品加入到微陣列中，然后檢測(cè)相當(dāng)于結(jié)合了過敏原的抗體的量的熒光。結(jié)果顯示于表3、4和5以及圖4a、4b和4c，其中“FL”代表熒光％。這些結(jié)果清楚地表明使用重組過敏原較使用過敏原提取物可獲得更敏感的檢測(cè)和定量結(jié)果。單一重組過敏原的熒光強(qiáng)度明顯高于提取物的熒光強(qiáng)度。此外，與使用重組過敏原的檢測(cè)不同，使用提取物僅能檢測(cè)出提取物的來源，而無法確定究竟是其中的哪一種特異性抗原引起了過敏癥。
因此，使用單一純化的過敏原、特別是重組的過敏原的本發(fā)明的方法優(yōu)于使用包含過敏原的提取物的方法。
表3
表4
表權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)樣品中與過敏原結(jié)合的免疫球蛋白的方法，其特征為將一種或多種過敏原固定于微陣列芯片上，其后將樣品與所述經(jīng)固定的過敏原進(jìn)行孵育，由此使得對(duì)所述過敏原具有特異性的免疫球蛋白與所述特異性過敏原相結(jié)合，其后對(duì)與所述經(jīng)固定的特異性過敏原相結(jié)合的免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征為所檢測(cè)的免疫球蛋白為IgE。
3.權(quán)利要求1的方法，其特征為所檢測(cè)的免疫球蛋白為IgG。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其特征為將一種或多種純化的過敏原固定于所述微陣列芯片上。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其特征為將一種或多種重組的過敏原固定于所述微陣列芯片上。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其特征為將一種或多種合成的過敏原固定于所述微陣列芯片上。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其特征為將一種或多種半抗原作為過敏原固定于所述微陣列芯片上。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其特征為將所述過敏原固定于所述微陣列芯片上的直徑為10-2000微米、優(yōu)選地直徑為50-500微米、更優(yōu)選地直徑為150-250微米的點(diǎn)上。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其特征為將所述過敏原固定于用作所述微陣列芯片的固相支持物上。
10.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其特征為將所述過敏原分別固定于用作所述微陣列芯片的玻璃和合成載體上。
11.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其特征為將所述過敏原固定于用作所述微陣列芯片的硅晶片上。
12.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其特征為將所述過敏原固定于用作所述微陣列芯片的膜上。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其特征為所述微陣列芯片是經(jīng)過化學(xué)修飾的，優(yōu)選地分別為氨基反應(yīng)和羧基反應(yīng)修飾。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其特征為所述過敏原共價(jià)結(jié)合于所述微陣列芯片。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，其特征為檢測(cè)血清樣品中的所述免疫球蛋白。
16.權(quán)利要求15的方法，其特征為將所述血清按1∶1-1∶15、優(yōu)選地按1∶5進(jìn)行稀釋。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其特征為將所述樣品與所述過敏原孵育1分鐘-24小時(shí)、優(yōu)選地為孵育1-2小時(shí)。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的方法，其特征為將所述樣品與所述過敏原在0-60℃、優(yōu)選地在37℃進(jìn)行孵育。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法，其特征為用至少一種經(jīng)過標(biāo)記的、特異性抗免疫球蛋白抗體對(duì)所述已結(jié)合的免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
20.權(quán)利要求19的方法，其特征為用至少一種經(jīng)過熒光標(biāo)記的、特異性抗免疫球蛋白抗體對(duì)所述已結(jié)合的免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
21.權(quán)利要求19的方法，其特征為用至少一種經(jīng)過放射性標(biāo)記的、特異性抗免疫球蛋白抗體對(duì)所述已結(jié)合的免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其特征為將一種或多種室內(nèi)過敏原作為過敏原進(jìn)行固定。
23.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其特征為將一種或多種室外過敏原作為過敏原進(jìn)行固定。
24.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其特征為將一種或多種食物過敏原作為過敏原進(jìn)行固定。
25.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其特征為將一種或多種毒液過敏原作為過敏原進(jìn)行固定。
26.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其特征為將一種或多種自體過敏原作為過敏原進(jìn)行固定。
27.一種用于在體外診斷病人的過敏癥的方法，其特征為自病人取得血清樣品，其后按權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法對(duì)所述樣品中的與過敏原結(jié)合的免疫球蛋白進(jìn)行分析，其中使用了微陣列芯片，所述微陣列芯片上固定了至少10種、優(yōu)選地至少50種、更優(yōu)選地至少90種不同的過敏原，其后將所述樣品與所述固定的過敏原之間出現(xiàn)的陽性反應(yīng)診斷為過敏癥。
28.其上固定了一種或多種過敏原的微陣列芯片。
29.權(quán)利要求28的微陣列芯片，其特征為將所述過敏原固定于直徑為100-500微米、優(yōu)選地直徑為200-300微米的點(diǎn)上。
30.權(quán)利要求28或29的微陣列芯片，其特征為其是一種玻璃載體。
31.權(quán)利要求28或29的微陣列芯片，其特征為其是一種合成載體。
32.權(quán)利要求28或29的微陣列芯片，其特征為其是一種硅晶片。
33.權(quán)利要求28或29的微陣列芯片，其特征為其是一種膜。
34.權(quán)利要求28-33中任一項(xiàng)的微陣列芯片，其特征為其經(jīng)過化學(xué)修飾、優(yōu)選地分別為氨基反應(yīng)和羧基反應(yīng)修飾。
35.權(quán)利要求28-34中任一項(xiàng)的微陣列芯片，其特征為將所述過敏原與其共價(jià)結(jié)合。
36.一試劑盒，其特征為包含權(quán)利要求28-35中任一項(xiàng)的微陣列芯片和一種第一試劑以及可能地一種第二試劑，所述第一試劑包含至少一種免疫球蛋白檢測(cè)試劑、優(yōu)選地為一種抗免疫球蛋白抗體、且優(yōu)選地為已知濃度，所述第二試劑用作陽性樣品，其包含至少一種與過敏原結(jié)合的免疫球蛋白。
37.權(quán)利要求36的試劑盒，其用于進(jìn)行權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中與過敏原結(jié)合的免疫球蛋白的方法，其中將一種或多種過敏原固定于微陣列芯片上，其后將樣品與所述經(jīng)固定的過敏原進(jìn)行孵育，由此使得對(duì)所述過敏原具有特異性的免疫球蛋白與所述特異性過敏原相結(jié)合，其后對(duì)與所述經(jīng)固定的特異性過敏原相結(jié)合的免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明還提供了一種用于在體外診斷病人的過敏癥的方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1527943SQ01816796
公開日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2001年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月3日
發(fā)明者賴因哈德·希勒, 賴因哈德 希勒, 克里斯蒂安·哈瓦內(nèi)格, 蒂安 哈瓦內(nèi)格, 德 W穆勒, 曼弗雷德·W穆勒 申請(qǐng)人:Vbc-基因組生物科學(xué)研究股份公司