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      用于在一種樣品中檢測(cè)還原輔因子存在的試驗(yàn)條及其使用方法

      文檔序號(hào):5838819閱讀:145來源:國(guó)知局
      專利名稱:用于在一種樣品中檢測(cè)還原輔因子存在的試驗(yàn)條及其使用方法
      介紹發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明的領(lǐng)域是被分析物測(cè)定。
      背景技術(shù)
      在生理液體,如血液或血液衍生物中測(cè)定需測(cè)被分析物的在當(dāng)今社會(huì)中日益重要。被分析物檢測(cè)試驗(yàn)用于多方面,包括臨床實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)、家庭檢測(cè)等,這些檢測(cè)結(jié)果對(duì)于多種疾病癥狀的診斷和治療都起著重要作用。這些被分析物包括醇、甲醛、葡萄糖、谷氨酸,甘油,β-羥基丁酸酯、L-乳酸酯、亮氨酸、蘋果酸、丙酮酸、類固醇等。隨著分析測(cè)定的日益重要,已開發(fā)了多種用于臨床和家用的被分析物測(cè)定方案及裝置。
      目前開發(fā)了許多方案和裝置,其采用信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng),以鑒定在生理樣品如血液中是否存在需測(cè)被分析物。
      盡管已開發(fā)了多種這樣的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng),用于測(cè)定多種不同的被分析物,但仍需要對(duì)這些系統(tǒng)進(jìn)一步開發(fā)。
      相關(guān)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)包括EP 0 908 453 A1;WO 94/01578及WO 94/01544。
      發(fā)明概要提供了用于在一種樣品中檢測(cè)被分析物的試驗(yàn)條及其使用方法。本試驗(yàn)條的特征在于,在正電荷底物的表面上至少包括一種水溶性的四唑鹽。在許多實(shí)施方案中,該水溶性的四唑鹽是被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的一部分,該系統(tǒng)包括一種或多種下列附加成分一種被分析物氧化酶,如一種被分析物脫氫酶或一種被分析物氧化酶;一種電子轉(zhuǎn)移劑;及一種酶輔因子。還提供了系統(tǒng)及包括本試驗(yàn)條的試劑盒。本試驗(yàn)條、系統(tǒng)和試劑盒用于在一種樣品中檢測(cè)多種被分析物,例如生理樣品,如血液或血液成分,或ISF(間質(zhì)液)。
      附圖簡(jiǎn)要說明

      圖1提供了在帶正電荷和不帶電荷膜上進(jìn)行的400mg/dl葡萄糖試驗(yàn)結(jié)果,用本發(fā)明所述的水溶性的四唑鹽作為指示劑。
      具體實(shí)施方案的描述提供了用于在一種樣品中檢測(cè)被分析物的試驗(yàn)條及其使用方法。本試驗(yàn)條的特征是,在正電荷底物的表面上至少包括一種水溶性的四唑鹽。在許多實(shí)施方案中,該水溶性的四唑鹽是被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的一部分,該系統(tǒng)包括一種或多種下列附加成分一種被分析物氧化酶,如一種被分析物脫氫酶或一種被分析物氧化酶;一種電子轉(zhuǎn)移試劑;及一種酶輔因子。還提供了系統(tǒng)及包括有本試驗(yàn)條的試劑盒。本試驗(yàn)條、系統(tǒng)和試劑盒用于在一種樣品中檢測(cè)多種被分析物,如包括生理樣品,例如血液或血液成分,或ISF(間質(zhì)液)。
      在進(jìn)一步描述本發(fā)明前,應(yīng)理解為本發(fā)明不限于本發(fā)明以下所介紹的具體實(shí)施方案,對(duì)實(shí)施方案所作的改變?nèi)詫⒙淙胨綑?quán)項(xiàng)的范圍。還應(yīng)理解為本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)是用于說明具體實(shí)施方案,而并不是對(duì)其進(jìn)行限定。相反,本發(fā)明的范圍以所附權(quán)項(xiàng)為準(zhǔn)。
      在說明書和所附權(quán)利要求書中,除非另有明確說明,單數(shù)的術(shù)語(yǔ)也包括其復(fù)數(shù)。除了另有其定義,用于此的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)對(duì)于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員具有如通常理解的同樣意義。
      組合物如上概要所述,本發(fā)明提供了用于在一種樣品中檢測(cè)多種被分析物的組合物。該組合物包括一種帶正電荷的底物和在底物表面存在的水溶性四唑鹽,通常作為被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的成分。所述組合物是通常干的組合物,如存在于試劑試驗(yàn)條中的組合物。具體而言,本發(fā)明提供了一種試驗(yàn)條,用于在全血或其成分中檢測(cè)特定的被分析物,如葡萄糖、醇、糖化蛋白等。從廣義上講,試劑試驗(yàn)條包括一種正電荷底物和一種存在于底物表面的被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng),該系統(tǒng)包括一種水溶性的四唑鹽。
      本發(fā)明組合物的上述成分將如下詳述。
      帶正電荷的底物本組合物的一個(gè)特征是存在帶正電荷的底物。所謂帶正電荷的底物,是指在其至少一個(gè)表面上顯示一個(gè)或多個(gè)(通常是大量的)正電荷的底物,如帶正電荷的基團(tuán)或結(jié)構(gòu)部分。底物可由一種材料組成,或是由兩種或多種不同材料構(gòu)成的復(fù)合物,這些不同的材料可以混合、分層,或用其它方式排列,以提供所需的帶正電荷表面。
      此外,帶正電荷的底物可以是吸收性的或非吸收性的。吸收性意味著一種材料顯示出對(duì)一種或多種成分的優(yōu)先保留,例如,在色譜分離時(shí)能夠吸收一種或多種成分的材料。吸收性的材料包括但不限于未處理的紙、硝基纖維素和那些可使經(jīng)過的含在液體樣品中的成分層析分離的材料。
      可選擇地,帶正電荷的底物可以是非吸收性的。非吸收性帶正電荷的底物包括惰性多孔可滲透的基質(zhì),可對(duì)下文將提到的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的不同膜提供支持,并帶有正電荷。這些基質(zhì)通??蔀樯順悠罚缪?,提供施涂的場(chǎng)所,并檢測(cè)信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的染色劑所產(chǎn)生的生色產(chǎn)物。同樣,基質(zhì)通常應(yīng)允許液體流經(jīng)通過,并提供足夠的空間,以保證信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。已開發(fā)出多種不同的帶正電荷的多孔基質(zhì)用于各種被分析物的測(cè)定試驗(yàn)。這些基質(zhì)的材料、孔徑、體積等可以不同。代表性的材料見美國(guó)專利5,932,431;5,874,099;5,871,767;5,869,077;5,866,322;5,834,001;5,800,829;5,800,828;5,798,113;5,670,381;5,663,054;5,459,080;5,459,078;5,441,894和5,212,061;這些公開文件在此引入作為參考。試驗(yàn)條的尺度和孔隙率可以有很大的不同,基質(zhì)可以具有或無(wú)孔隙率的梯度,如在樣品施涂區(qū)或其附近有較大的孔,在檢測(cè)區(qū)有較小的孔??捎脦д姾傻木酆衔铮缇埘0分苽鋷д姷哪???蛇x擇地,可用各種技術(shù),如用陽(yáng)離子表面活性劑或聚合物表面涂布的方法制備這類膜。涂布可采用浸漬涂布、化學(xué)處理、光接枝、等離子聚合等。在另一些實(shí)施方案中,可用一種或多種帶正電荷材料與成膜聚合物共混制備膜。帶正電荷聚合物的實(shí)例是聚酰胺、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)、聚(烯丙基胺)、聚(乙烯基芐基二甲基氯化銨)、聚賴氨酸和殼聚糖。陽(yáng)離子表面活性劑包括含伯、仲和季胺基團(tuán)的表面活性劑。該材料可以或不必被官能化,以為信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的各種成分提供共價(jià)或非共價(jià)連接,詳述如下。
      在許多實(shí)施方案中,將基質(zhì)制成膜測(cè)試墊并連接在一個(gè)固體支持物上,該支持物可以是塑料(如聚苯乙烯、尼龍或聚酯)或金屬片,或任何現(xiàn)有技術(shù)已知的其它適用的材料。在許多實(shí)施方案中所需的是公開在美國(guó)專利5,972,294;5,968,836;5,968,760;5,902,731;5,846,486;5,843,692;5,843,691;5,789,255;5,780,304;5,753,452;5,753,429;5,736,103;5,719,034;5,714,123;383,550;381,591;5,620,863;5,605,837;5,563,042;5,526,120;5,515,170;367,109;5,453,360;5,426,032;5,418,142;5,306,623;5,304,468;5,179,005;5,059,394;5,049,487;4,935,346;4,900,666和4,734,360中的試驗(yàn)條結(jié)構(gòu),這些公開文件在此引入作為參考。
      信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)如上所綜述的那樣,本組合物的特征是包括至少一種水溶性的四唑鹽,該成分通常與被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)一種或多種成分共同存在。具體而言,本組合物的特征是存在水溶性的四唑鹽,其能夠接受氫化物產(chǎn)生水溶性的著色的甲產(chǎn)物。所需的水溶性的四唑鹽包括EP 0 908 453所述的,該公開文件在此引入作為參考。一類有意義的水溶性的四唑鹽包括在EP 0 908 453中第2頁(yè),35~48行,配方2中所提到的那些。另一類所需的水溶性的四唑鹽包括EP 0 908 453第3頁(yè),10~25行,配方1中所提到的那些。
      特別需要的水溶性的四唑類化合物或鹽包括,但不限于2,2′-二苯并噻唑基-5,5′-雙[4-二(2-硫代乙基)氨基甲酰苯基]-3,3′-(3,3′-二甲氧基-4,4′-聯(lián)苯撐)二四唑,二鈉鹽(WST-5);2-二苯并噻唑-3-(4-羧基-2-甲氧苯基)-5-[4-(2-硫代乙基)氨基甲酰苯基]-2H-四唑(WST-4)等。在許多實(shí)施方案中優(yōu)選WST-5,因其可迅速溶于水介質(zhì)中,最適用于生物樣品。此外,產(chǎn)生的甲化合物在紫蘭區(qū)顯示出強(qiáng)的光譜吸收,這樣可減少校正血色素背景信號(hào)的必要。
      如上所述,水溶性的四唑鹽通常以被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的一個(gè)成分存在。信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)意味著能夠一致作用的兩個(gè)或多個(gè)化合物或分子組合,當(dāng)結(jié)合時(shí),產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào),能夠指示出所給樣品中特定的被分析物的存在,通常還能得出該分析物的量。術(shù)語(yǔ)信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)廣泛用于包括所有信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的試劑成分的混合物,也包括其中一種或多種試劑成分彼此分別存放的一個(gè)系統(tǒng),如在試劑盒中。
      如上所述,本組合物和試驗(yàn)條的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)是被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)。被分析物氧化劑通常是能除去被分析物氫化物的酶,生成被分析物的氧化形式。被分析物氧化酶包括被分析物氧化酶和被分析物脫氫酶。所需的被分析物氧化酶包括,但不限于葡萄糖氧化酶(其中被分析物是葡萄糖);膽固醇氧化酶(其中被分析物是膽固醇);醇氧化酶(其中被分析物是醇);膽紅素氧化酶(其中被分析物是膽紅素);膽堿氧化酶(其中被分析物是膽堿);甲醛脫氫酶(其中被分析物是甲醛);谷氨酸鹽氧化酶(其中被分析物是L-谷氨酸);甘油氧化酶(其中被分析物是甘油);半乳糖氧化酶(其中被分析物是半乳糖);L-抗壞血酸鹽氧化酶(其中被分析物是抗壞血酸);乳酸鹽氧化酶(其中被分析物是乳酸);亮氨酸氧化酶(其中被分析物是亮氨酸);蘋果酸氧化酶(其中被分析物是蘋果酸);丙酮酸鹽氧化酶(其中被分析物是丙酮酸);尿酸鹽氧化酶(其中被分析物是尿酸)等。
      所需的被分析物脫氫酶包括,但不限于醇脫氫酶用于醇;甲醛脫氫酶用于甲醛;葡萄糖脫氫酶用于葡萄糖;葡萄糖-6-磷酸酯脫氫酶用于葡萄糖-6-磷酸酯;谷氨酸鹽脫氫酶用于谷氨酸;甘油脫氫酶用于甘油;β-羥基丁酸酯脫氫酶用于β-羥基丁酸酯;羥基類固醇脫氫酶用于類固醇;L-乳酸酯脫氫酶用于L-乳酸酯;亮氨酸脫氫酶用于亮氨酸;蘋果酸酯脫氫酶用于蘋果酸,及丙酮酸鹽脫氫酶用于丙酮酸。
      在許多實(shí)施方案中,本信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)也包括能夠以被分析物被氧化劑氧化的方式與氧化劑相互作用的酶輔因子,該氧化劑同時(shí)還原酶輔因子。所需的酶輔因子包括,但不限于β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD);β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(β-NADP);硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸;硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯;煙酰胺1,N6-亞乙烯腺嘌呤二核苷酸;煙酰胺1,N6-亞乙烯腺嘌呤二核苷酸磷酸酯;及吡咯并-喹啉醌(PQQ)??砂ㄔ谛盘?hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的特別需要的酶輔因子包括NADH或NAD(P)H。
      除了被分析物氧化劑,本信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)通常還包括一種電子轉(zhuǎn)移劑。電子轉(zhuǎn)移劑是一種化合物或分子,可以以一種氫化物離子的形式從還原酶輔因子轉(zhuǎn)移電子至水溶性的四唑鹽產(chǎn)物。所需的電子轉(zhuǎn)移劑包括低和高分子量的電子轉(zhuǎn)移劑。在本說明書中,低分子量表示分子量不超過2000道爾頓,通常約1000道爾頓,在許多實(shí)施方案中約500道爾頓。高分子量表示分子量至少約5000道爾頓,在許多實(shí)施方案中約為10,000或20,000道爾頓或更高。高分子量電子轉(zhuǎn)移劑的分子量一般不超過100,000道爾頓。在許多實(shí)施方案中,低分子量電子轉(zhuǎn)移劑是非蛋白化合物,而高分子量電子轉(zhuǎn)移劑是蛋白化合物。蛋白化合物是多肽或其類似物的聚合物。
      各種低分子量非蛋白化合物電子轉(zhuǎn)移劑是所需的。包括黃素,如核黃素(RBF)、咯嗪(ALL)和二甲基異咯嗪(LC);吩嗪類,如吩嗪、吩嗪N-甲硫酸酯(PMS)、吩嗪N-乙硫酸酯、甲氧吩嗪N-甲硫酸酯和藏紅;甲基-1,4-萘酚(甲萘醌),酚噻嗪類,如PT及其游離基陽(yáng)離子,PT+,硫堇(TH),天青A(AA),天青B(AB),天青C(AC),亞甲蘭(MB),亞甲綠(MG)及甲苯胺蘭0(TOL);吩噁嗪類如吩噁嗪(POA)、堿性蘭3(BB3),和亮甲酚蘭ALD(BCBA)、氯化苯并-α-二甲基苯基吡唑酮鎓(Medola蘭);靛酚類,如2,6-二氯酚靛酚(DCIP)和吲噠胺類,如Bindschedler綠和亞苯基蘭等。在許多實(shí)施方案中,特別需要的是吩嗪化合物,如PMS、吩嗪N-甲硫酸酯、甲氧吩嗪N-甲硫酸酯和藏紅,其中,在許多實(shí)施方案中PMS是低分子量非蛋白電子轉(zhuǎn)移劑。
      在許多實(shí)施方案中,高分子量蛋白電子轉(zhuǎn)移劑是能夠氧化被還原的輔因子的酶,如NAD(P)H,并同時(shí)還原信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的四唑鹽。在許多實(shí)施方案中,這種電子轉(zhuǎn)移酶是心肌黃酶,如硫辛酸脫氫酶、鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶、脂酰胺脫氫酶、NADPH脫氫酶等。多種心肌黃酶是可以得到并可被使用的,有代表性的可存在于本信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)中的市售心肌黃酶包括桿菌心肌黃酶、梭菌心肌黃酶、弧菌心肌黃酶、豬心肌黃酶等。
      上述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)通常存在于本組合物中作為試劑組合物。在許多實(shí)施方案中,試劑組合物是干的組合物。最小的試劑組合物是包括水溶性的四唑鹽的組合物。但在許多實(shí)施方案中,試劑組合物還包括酶輔因子、被分析物氧化酶及一種電子轉(zhuǎn)移劑,這些成分如上所述。
      試劑試驗(yàn)條在本發(fā)明許多實(shí)施方案中,特別需要的是包括上述組合物的試劑試驗(yàn)條,可用于測(cè)定一個(gè)樣品中被分析物的存在或其濃度。特別是,本發(fā)明提供了干燥的試驗(yàn)條用于檢測(cè)全血中的特殊被分析物,如β-羥基丁酸酯、葡萄糖等。從最廣義而言,試劑試驗(yàn)條包括帶正電荷的固體支持物和在其上存在的干的試劑組合物,其中干的試劑組合物由所有對(duì)使被分析物中存在的待檢測(cè)物質(zhì)產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)所必需的試劑化合物組成。在本發(fā)明大多數(shù)實(shí)施方案中,存在于本試驗(yàn)條上的干的試劑組合物包括下列成分被分析物氧化酶,一種酶輔因子、一種電子轉(zhuǎn)移劑和一種水溶性的四唑鹽,其中每一種成分上文中已詳述。
      在許多實(shí)施方案中,本試驗(yàn)條包括一個(gè)膜試驗(yàn)墊,其固定在一個(gè)固體支持物上。該支持物可以是塑料,如聚苯乙烯、尼龍或聚酯,或金屬片或或任何現(xiàn)有技術(shù)已知的其它適用的材料。試劑組合物與試驗(yàn)墊連在一起,如涂布在試驗(yàn)墊上,與試驗(yàn)墊結(jié)合在一起等。試驗(yàn)條也可以由更復(fù)雜的排列而構(gòu)成,如試驗(yàn)墊位于支持物和表面層之間,樣品中所用的一種或多種試劑存在于表面層上。此外,如現(xiàn)有技術(shù)所知,試驗(yàn)條上可以有流動(dòng)的小徑或通道。在許多所需的實(shí)施方案中,所需試驗(yàn)條的構(gòu)造已公開在美國(guó)專利5,902,731,該公開文件在此引入作為參考。
      本試驗(yàn)條可用任何方便的方法制成。一個(gè)方便的方法是用包括所有試劑組合物成分的水溶性的組合物至少接觸試驗(yàn)條的試驗(yàn)墊部分,該組合物在最終試劑試驗(yàn)條上與試驗(yàn)墊相結(jié)合。方便的方法是將試驗(yàn)墊浸入水溶性組合物中,保持足夠長(zhǎng)的時(shí)間,然后干燥,這樣,制成已與試劑組合物結(jié)合了的試劑試驗(yàn)條的試驗(yàn)墊。如上所述,水溶性的組合物包括與試劑試驗(yàn)條的試驗(yàn)墊結(jié)合的試劑組合物的各種成分,其中各種成分的含量足以提供試驗(yàn)墊中試劑組合物中的所需量。因此,當(dāng)電子轉(zhuǎn)移劑是非蛋白質(zhì)時(shí),存在于水溶性的組合物中的電子轉(zhuǎn)移劑典型濃度范圍約為10~50,000μM,通常約50~10,000μM,最常見范圍約100~5,000μM。在其它實(shí)施方案中,當(dāng)電子轉(zhuǎn)移劑是蛋白質(zhì)時(shí),存在于水溶性的組合物中的電子轉(zhuǎn)移劑典型濃度范圍約為10~10,000U/ml,通常約50~5,000U/ml,最常見范圍約100~3,000U/ml。水溶性的組合物中四唑鹽濃度范圍約3mM~36mM,通常約6mM~24mM。當(dāng)存在酶輔因子時(shí),其濃度范圍約1.5mM~28mM,通常約3.5mM~14mM。同樣,當(dāng)存在被分析物氧化劑酶時(shí),其濃度范圍約100U~2000U,通常約200U~1000U。制備本試劑試驗(yàn)條的典型方法,請(qǐng)見下面實(shí)驗(yàn)部分詳述。
      被分析物測(cè)量方法上述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)、試劑組合物和試驗(yàn)條,用于對(duì)樣品中被分析物的存在、其含量(通常是濃度)的檢測(cè)方法中。用本方法可檢測(cè)多種不同的被分析物,其中代表性的被分析物包括上文已述的,如,醇、甲醛、葡萄糖、谷氨酸、甘油、β-羥基丁酸酯、L-乳酸酯、亮氨酸、蘋果酸、丙酮酸、類固醇等。原則上,本方法可測(cè)定多種不同生理樣品中被分析物的存在和濃度,生理樣品包括尿、淚、唾液等,尤其適于測(cè)定血液或血液成分(如來自樣品中血液)中被分析物濃度,特別適于測(cè)定全血、ISF(間質(zhì)液)。
      在本方法中,樣品和信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)在反應(yīng)混合物中結(jié)合,反應(yīng)進(jìn)行足夠長(zhǎng)的時(shí)間,以生成顯示樣品中被分析物存在(通常是含量)可檢測(cè)的信號(hào),測(cè)定所得信號(hào),可以得出樣品中被分析物存在(通常是含量)的結(jié)論。上述步驟發(fā)生在如前所述的試劑試驗(yàn)條上。
      本方法的特點(diǎn)之一是可檢測(cè)信號(hào)由試驗(yàn)條底物的表面上形成的不可洗的斑點(diǎn)組成。該不可洗的斑點(diǎn)由水溶性的甲產(chǎn)物組成,該產(chǎn)物緊緊結(jié)合在底物的表面上,在標(biāo)準(zhǔn)洗滌條件下難以從該表面除去。標(biāo)準(zhǔn)洗滌條件是在分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,底物的表面上未被結(jié)合的成分均必須除去的條件。標(biāo)準(zhǔn)洗滌條件的一個(gè)實(shí)施方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員在陣列基本核酸雜交試驗(yàn)(array based nucleic acid hybridizationassays)中,在進(jìn)行雜交步驟后,其中未被雜交的核酸從陣列的表面被除去。這種條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。因此,本方法的特點(diǎn)是在帶正電荷底物的表面上形成不可洗的斑點(diǎn),該不可洗的斑點(diǎn)由水溶性的甲產(chǎn)物組成。
      在實(shí)施本方法時(shí),第一步是將一定量的生理樣品施涂在如上所述的試驗(yàn)條上,施涂在試驗(yàn)條上生理樣品(如血液)的量可以改變,但一般范圍在約2μL~40μL,通常約5μL~20μL。因?yàn)楸驹囼?yàn)條的性質(zhì)決定,施涂在試驗(yàn)條上血液樣品的量可相對(duì)較小,約2μL~40μL,通常約5μL~20μL。當(dāng)生理樣品是血液時(shí),用本方法可測(cè)定多種血細(xì)胞比容不同的血液樣品,血細(xì)胞比容范圍約在20%~65%,通常約25%~60%。
      將樣品施涂在試驗(yàn)條上后,讓樣品與信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的成分反應(yīng),生成一種可檢測(cè)的產(chǎn)物,即不可洗的斑點(diǎn),該斑點(diǎn)與樣品中存在的被分析物的初始量以一定比例的量存在??蓹z測(cè)產(chǎn)物的量,即信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)生成的不可洗的斑點(diǎn)形式的信號(hào)被測(cè)定并與初始樣品中被分析物的量相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中,使用自動(dòng)儀器完成上述檢測(cè)和相關(guān)步驟。上述反應(yīng)、檢測(cè)和有關(guān)步驟,以及其所用的儀器在下列文獻(xiàn)中有詳述美國(guó)專利4,734,360;4,900,666;4,935,346;5,059,394;5,304,468;5,306,623;5,418,142;5,426,032;5,515,170;5,526,120;5,563,042;5,620,863;5,753,429;5,573,452;5,780,304;5,789,255;5,843,691;5,846,486;5,902,731;5,968,836和5,972,294;這些公開文件在此引入作為參考。在相關(guān)步驟中,得出的被分析物濃度應(yīng)考慮競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)對(duì)觀察到的信號(hào)的恒定的影響,如對(duì)所用儀器進(jìn)行校正。
      試劑盒本發(fā)明還提供了用于實(shí)施本方法的試劑盒,本發(fā)明的試劑盒至少包括如前述的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng),其中信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的成分可與一種試劑組合物混合或分別放置,如分放于不同容器。在某些實(shí)施方案中,信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)以前述試劑試驗(yàn)條的形式存放于試劑盒中,本試劑盒中還包括一種得到生理樣品的工具。例如,若生理樣品是血液,試劑盒中還包括一種取血樣的工具,比如刺破手指的刺針、活動(dòng)工具刺針等。此外,本試劑盒中還包括一種對(duì)照液,或標(biāo)準(zhǔn)液,如含標(biāo)準(zhǔn)濃度被分析物的被分析物對(duì)照液。在某些實(shí)施方案中,試劑盒中還包括一種如前述的自動(dòng)儀器,用于檢測(cè)所用樣品在試驗(yàn)條上施涂后生成產(chǎn)物的量,并關(guān)聯(lián)出檢測(cè)的產(chǎn)物對(duì)樣品中被分析物的量。最后,試劑盒中還包括使用本試劑盒的成分測(cè)定生理樣品中被分析物濃度的使用說明書。說明書可置于一種或多種包裝上,插入標(biāo)簽、放在盒中容器內(nèi)等。
      提供以下實(shí)施例是為了進(jìn)行說明,而非對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定。
      實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1將0.8μM尼龍膜(來自Pall公司East Hills,N.Y.)浸入表1的試劑中至飽和,用玻棒輕刮去過量試劑,將膜懸掛于56℃烘箱中10分鐘,至干。將Porex(0.6mm厚)浸入表2的亞硝酸溶液中,然后懸掛于100℃烘箱中10小時(shí),至干。最后,將膜在聚酯片(0.4mmMelenex聚酯,在來自ICI America,Wilmington,DE)和亞硝酸浸漬的Porex之間進(jìn)行層壓。
      實(shí)施例2重復(fù)實(shí)施例1步驟,所不同的是第一步浸入表3的試劑,且不需要第二步,因?yàn)椴恍枰狿orex。
      表1 用于葡萄糖試驗(yàn)墊試劑
      表2 亞硝酸試劑
      表3 用于葡萄糖試驗(yàn)墊試劑
      *聚(甲基乙烯基醚-alt-馬來酸酐)(分子量1080000,Cat#41632-0,Aldrich Chemicals,Milwaukee,WI,USA),稱取聚(甲基乙烯基醚-alt-馬來酸酐),配成6%水懸浮液(w/v),在95℃加熱45分鐘,冷至室溫后所得到的溶液可以備用。
      在不帶電荷和帶正電荷膜上測(cè)試各種葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,血中葡萄糖濃度從50~450mg/dl時(shí),信號(hào)為直線。圖1示出了進(jìn)行同樣浸漬涂布的不同膜。一個(gè)是帶正電荷尼龍膜,一個(gè)是不帶正電荷的聚砜膜。已涂布的膜用400mg/dl葡萄糖進(jìn)行測(cè)試。
      使用下述方案用前述試驗(yàn)條測(cè)定含400mg/dL葡萄糖的水溶性樣品10μL,試驗(yàn)條的膜根據(jù)不同的帶正電荷尼龍膜和不帶正電荷(不帶電荷)的聚砜膜試驗(yàn)條而改變。將10μl水溶性的樣品施涂于新制備的試驗(yàn)條。將試驗(yàn)條插入反射計(jì)中,得到數(shù)據(jù)。在615nm處以每1秒的間隔觀測(cè)反射比45秒。然后將數(shù)據(jù)從反射計(jì)的存儲(chǔ)緩沖器經(jīng)由改良的串行電纜加載在個(gè)人電腦中。用K/S對(duì)秒繪出反應(yīng)的曲線。
      (K/S是反射比的度量標(biāo)準(zhǔn),在美國(guó)專利4,935,346,14欄中有討論和定義,該公開文件在此引入作為參考)從上述結(jié)果和討論中可明顯看出,本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的試劑試驗(yàn)條的構(gòu)成進(jìn)行了改進(jìn)。通過水溶性的四唑鹽與帶正電荷的底物共同應(yīng)用,本發(fā)明適于所有具正電荷標(biāo)志的四唑化合物,并能從結(jié)果產(chǎn)生的水溶性甲中生成不可洗的報(bào)告信號(hào),因此本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有技術(shù)有重大貢獻(xiàn)。
      本說明書中引用的所有出版物和專利在此引入作為參考,每個(gè)單獨(dú)的出版物和專利都逐一地和單獨(dú)被引用參考。任何文獻(xiàn)的引用是因?yàn)槠湓谏暾?qǐng)日前已公開,而并非解釋為本發(fā)明由于以前發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)而沒有資格先于這些出版物。
      雖然為便于清楚理解,前述的發(fā)明已用說明和實(shí)施例的方式進(jìn)行了詳述,很明顯,對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員,在不脫離本發(fā)明的精神或所附權(quán)利要求的范圍情況下,根據(jù)本發(fā)明的可進(jìn)行某些改變和改進(jìn)。
      權(quán)利要求
      1.一種組合物,包括一種帶正電荷的底物;和至少一種水溶性的四唑鹽在所述帶正電荷的底物的至少一個(gè)表面上。
      2.權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述帶正電荷的底物是一種吸收性底物。
      3.權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述帶正電荷的底物是一種非吸收性底物。
      4.權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述水溶性的四唑鹽是被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的一部分。
      5.權(quán)利要求4所述的組合物,其中所述被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)包括一種被分析物氧化酶。
      6.權(quán)利要求4所述的組合物,其中所述被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)包括一種被分析物脫氫酶。
      7.權(quán)利要求4所述的組合物,其中所述被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)還包括一種電子轉(zhuǎn)移劑。
      8.權(quán)利要求4所述的組合物,其中所述被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)還包括一種酶輔因子。
      9.權(quán)利要求4所述的組合物,其中所述被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)以試劑組合物形式存在。
      10.一種試劑試驗(yàn)條,包括一種帶正電荷的底物;和存在于所述帶正電荷的底物之上的一種被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng),其中所述被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)包括一種水溶性的四唑鹽。
      11.權(quán)利要求10所述的試驗(yàn)條,其中所述帶正電荷的底物是吸收性的。
      12.權(quán)利要求10所述的試驗(yàn)條,其中所述帶正電荷的底物是非吸收性的。
      13.權(quán)利要求10所述的試驗(yàn)條,其中所述水溶性的四唑鹽接受氫化物生成水溶性的甲產(chǎn)物。
      14.權(quán)利要求10所述的試驗(yàn)條,其中所述被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)包括一種被分析物氧化酶。
      15.權(quán)利要求14所述的試驗(yàn)條,其中所述被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)還包括一種電子轉(zhuǎn)移劑。
      16.權(quán)利要求14所述的試驗(yàn)條,其中所述被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)還包括一種酶輔因子。
      17.權(quán)利要求10所述的試驗(yàn)條,其中所述被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)是葡萄糖氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)。
      18.一種被分析物檢測(cè)或測(cè)定系統(tǒng),包括(a)一種試劑試驗(yàn)條,包括(i)一種帶正電荷的底物;和(ii)一種存在于所述底物之上的被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng),其中所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)包括一種接受氫化物生成水溶性的甲產(chǎn)物的水溶性的四唑鹽;和(b)一種自動(dòng)儀器。
      19.一種用于檢測(cè)樣品中一種被分析物存在或測(cè)定其濃度的方法,所述方法包括(a)將所述生理樣品施涂到試劑試驗(yàn)條上,其包括(i)一種帶正電荷的底物;和(ii)一種存在于所述底物之上的被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng),其中所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)包括一種能生成水溶性的甲產(chǎn)物的水溶性的四唑鹽,由此在所述底物上生成包含所述甲產(chǎn)物的一種不可洗的斑點(diǎn);(b)檢測(cè)所述不可洗的斑點(diǎn);(c)將所述檢測(cè)到的不可洗的斑點(diǎn)與所述生理樣品中的所述被分析物的存在或濃度相關(guān)聯(lián)。
      20.權(quán)利要求19所述的方法,其中所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)還包括一種被分析物氧化酶。
      21.權(quán)利要求20所述的方法,其中所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)還包括至少一種電子轉(zhuǎn)移劑。
      22.權(quán)利要求19所述的方法,其中所述樣品是全血或其衍生物。
      23.權(quán)利要求19所述的方法,其中所述檢測(cè)和相關(guān)聯(lián)步驟用自動(dòng)儀器進(jìn)行操作。
      24.一種用于測(cè)定生理樣品中被分析物濃度的試劑盒,所述試劑盒包括(a)一種試劑試驗(yàn)條,其包括(i)一種帶正電荷的底物;和(ii)一種存在于所述底物之上的被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng),其中所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)包括一種能夠生成水溶性的甲產(chǎn)物的水溶性的四唑鹽;和(b)下列至少一種(i)一種獲得所述生理樣品的工具,和(ii)一種被分析物標(biāo)準(zhǔn)品。
      25.權(quán)利要求24所述的試劑盒,其中所述的獲得所述生理樣品的工具是一種刺針。
      26.權(quán)利要求24所述的試劑盒,其中所述被分析物標(biāo)準(zhǔn)品包括一種標(biāo)準(zhǔn)濃度的已知試劑。
      27.權(quán)利要求24所述的試劑盒,其中所述試劑盒包括一種獲得所述生理樣品的工具和一種被分析物標(biāo)準(zhǔn)品。
      全文摘要
      提供了用于在一種樣品中檢測(cè)被分析物的試驗(yàn)條及其使用方法。本試驗(yàn)條的特征在于,在正電荷底物的表面上至少包括一種水溶性的四唑鹽。在許多實(shí)施方案中,該水溶性的四唑鹽是被分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的一部分,該系統(tǒng)包括一種或多種下列附加成分一種被分析物氧化酶,如一種被分析物脫氫酶或一種被分析物氧化酶;一種電子轉(zhuǎn)移劑;及一種酶輔因子。還提供了系統(tǒng)及包括有本試驗(yàn)條的試劑盒。本試驗(yàn)條、系統(tǒng)和試劑盒用于在一種樣品中檢測(cè)多種被分析物,所述樣品包括生理樣品,如血液或血液成分。
      文檔編號(hào)G01N33/52GK1561397SQ01818709
      公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2001年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月12日
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