專利名稱：基于ercc1和ts表達(dá)確定化療方案的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有效用于醫(yī)學(xué)，特別是癌癥化療中的預(yù)測(cè)方法。更特別是，本發(fā)明涉及評(píng)估患者中的腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)人類中參與核苷酸合成和DNA修復(fù)的基因表達(dá)的mRNA，測(cè)定腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性化療劑，特別是抗代謝藥和以鉑制劑的方式破壞DNA的試劑的抗性。
背景技術(shù)：
當(dāng)正常細(xì)胞經(jīng)歷致癌性轉(zhuǎn)化并成為惡性細(xì)胞時(shí)癌癥發(fā)生。轉(zhuǎn)化的(惡性)細(xì)胞逃離可規(guī)定細(xì)胞表型并抑制細(xì)胞增殖的正常生理控制。個(gè)體機(jī)體中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞因此增殖，形成腫瘤。當(dāng)發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)，臨床目標(biāo)是選擇性地破壞惡性細(xì)胞，同時(shí)減輕在個(gè)體進(jìn)行治療過(guò)程中對(duì)正常細(xì)胞的任何損害。
化療方案是以對(duì)癌細(xì)胞具有選擇毒性(細(xì)胞毒性)的藥物的使用為基礎(chǔ)的。人們已經(jīng)研制出了很多類化療藥物，包括干擾核酸合成，蛋白合成，及其它重要代謝過(guò)程的藥物。這些通常被稱作抗代謝藥物。其它類的化療藥物是損害細(xì)胞的DNA。這些類藥物通常被稱作是基因毒性的。
然而，個(gè)體腫瘤對(duì)預(yù)期化療藥物或藥物聯(lián)合的敏感性常常只能在治療的試驗(yàn)期之后才能準(zhǔn)確地測(cè)定。在不成功試驗(yàn)期投入的時(shí)間會(huì)在臨床處理侵入性惡性腫瘤時(shí)造成重大的危險(xiǎn)。
對(duì)細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)是由細(xì)胞的酶促DNA修復(fù)機(jī)制進(jìn)行的一種重要生物過(guò)程。細(xì)胞基因組中的未修復(fù)病變可以阻礙DNA復(fù)制，損害新合成DNA的復(fù)制保真性和/或阻礙細(xì)胞存活所需基因的表達(dá)。因此，一般認(rèn)為基因毒性藥物對(duì)涉及DNA合成的活躍分裂的細(xì)胞比對(duì)靜止、不分裂的細(xì)胞毒性更強(qiáng)。然而，許多機(jī)體組織的正常細(xì)胞更靜止，并且不經(jīng)常重新進(jìn)入細(xì)胞周期和分裂。細(xì)胞分裂的各輪之間的時(shí)間更長(zhǎng)，因此提供給由化療基因毒性導(dǎo)致的正常細(xì)胞中DNA破壞的修復(fù)。因此，殺滅癌細(xì)胞達(dá)到了一定的選擇性。許多治療方案中嘗試通過(guò)屬于兩種或更多這些類的化療藥的共同給藥而改進(jìn)選擇性。
因?yàn)閷?duì)實(shí)體瘤進(jìn)行有效的化療通常需要聯(lián)合給藥，而對(duì)每種單一藥物的敏感性或抗性決定因素的鑒定和測(cè)量成為設(shè)計(jì)個(gè)體聯(lián)合化療的重要工具。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)損害細(xì)胞DNA的廣泛使用的基因毒性抗癌是順鉑(DDP)和卡鉑。目前順鉑和/或卡鉑用于治療選定的、各種上皮和間質(zhì)來(lái)源的腫瘤，包括呼吸道、胃腸道和生殖道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癌和肉瘤，以及頭和頸的鱗狀細(xì)胞癌。順鉑和其它試劑的聯(lián)合目前優(yōu)選用于睪丸癌的控制，在許多情況下產(chǎn)生持續(xù)的緩解(Loehrer等，1984，100Ann.Int.Med.704)。順鉑(DDP)通過(guò)形成鏈內(nèi)加合物而破壞DNA結(jié)構(gòu)。DDP等鉑制劑的抗性是由于對(duì)鉑加合物的耐受、藥物積聚減少、或DNA修復(fù)增加。
另一種具有1，2-二氨基環(huán)己烷環(huán)的基于鉑的化療劑奧沙利鉑在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出了抗腫瘤效力。認(rèn)為這種大的攜帶基團(tuán)導(dǎo)致鉑-DNA加合物，該加合物比其它鉑制劑形成的加合物具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性并且更有效阻斷DNA復(fù)制。最近的數(shù)據(jù)表明，錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)的缺陷和復(fù)制復(fù)合物跨DNA破壞位點(diǎn)合成DNA(增強(qiáng)的復(fù)制旁路)的能力增加導(dǎo)致對(duì)順鉑的抗性，對(duì)奧沙利鉑則并非如此(Raymond等，SeminOncol 25，Suppl 54-12，1998)。
大的DNA加合物，如鉑制劑形成的加合物的切除修復(fù)似乎由參與DNA破壞識(shí)別和切除的基因介導(dǎo)。Cleaver等，Carcinogenesis11875-882(1990)；Hoeijmakers等，Cancer Cells2311-320(1990)；Shivji等，Cell 69367-374(1992)。實(shí)際上，在酶促DNA修復(fù)機(jī)制的一個(gè)或多個(gè)元件中具有遺傳缺陷的細(xì)胞對(duì)順鉑極為敏感。Fraval等(1978)，51 Mutat.Res.121，Beck和Brubaker(1973)，116J.Bacteriol 1247。
切除修復(fù)交叉互補(bǔ)(ERCC1)基因在DNA加合物的修復(fù)中是關(guān)鍵的。已經(jīng)克隆了人ERCC1。Westerveld等，Nature(London)310425-428(1984)；Tanka等，Nature 34873-76(1990)；(編號(hào)XM-009432，在此引入作為參考，SEO ID NO10)。一些研究使用了該基因缺陷的突變?nèi)撕蛡}(cāng)鼠細(xì)胞系，并且人腫瘤組織的研究表明，由ERCC1編碼的產(chǎn)物參與鉑-DNA加合物的切除修復(fù)。Dabholkar等，J.Natl.Cancer Inst.841512-1517(1992)；Dijt等，Cancer Res.486058-6062(1998)；Hansson等，Nucleic Acids Res.1835-40(1990)。
當(dāng)轉(zhuǎn)染到DNA修復(fù)缺陷的CHO細(xì)胞中時(shí)，ERCC1通過(guò)其修復(fù)鉑-DNA加合物的能力賦予了對(duì)基于鉑的化療的細(xì)胞抗性。Hansson等，Nucleic Acids Res1835-40(1990)。目前接受的切除修復(fù)模型表明，破壞識(shí)別/切除是切除修復(fù)過(guò)程的限速步驟。
已經(jīng)檢測(cè)了接受基于鉑的化療的癌癥患者的惡性細(xì)胞中ERCC1等切除修復(fù)基因表達(dá)的相對(duì)水平。Dabholkar等，J.Natl.Cancer Inst.841512-1517(1992)。已經(jīng)報(bào)道，用基于鉑和基于抗代謝藥的聯(lián)合化療方案(順鉑/氟尿嘧啶)治療時(shí)，胃癌患者中ERCC1的過(guò)量表達(dá)對(duì)腫瘤反應(yīng)和最終存活率具有負(fù)影響。因此，ERCC1的腫瘤內(nèi)表達(dá)水平是確定單獨(dú)的基于鉑的化療或其與基于抗代謝藥的治療的聯(lián)合是否對(duì)治療患者有效的主要預(yù)測(cè)因子。
抗代謝細(xì)胞毒性化療化合物包括干擾核酸合成、蛋白合成和其它重要代謝過(guò)程的藥物。例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種在許多不同的癌癥類型，包括如胃腸道和乳腺的主要癌癥中廣泛使用的藥物(Moertel，C.G.New Engl.J.Med.，3301136-1142，1994)。5-FU在40多年中一直是結(jié)直腸癌標(biāo)準(zhǔn)一線治療的單一試劑，但最近將5-FU和CPT-11的聯(lián)合作為晚期結(jié)直腸癌的替代一線治療(Saltz等，Irinotecan Study Group.New England Journal of Medicine，343905-14，2000)。5-FU和奧沙利鉑的聯(lián)合在結(jié)直腸癌中產(chǎn)生了高有效率(Ray等，Semin.Oncol. 254-12，1998)。因此，很可能5-FU將在許多年中用于癌癥治療，因?yàn)樗匀皇钱?dāng)前化療方案中的核心成分。此外，單獨(dú)的5-FU治療仍然用于一些患者，5-FU與CPT-11或奧沙利鉑的聯(lián)合對(duì)這些患者特別具有毒性。
5-FU是大多數(shù)抗癌藥中最典型的，因?yàn)橹挥猩贁?shù)患者對(duì)治療產(chǎn)生有利的反應(yīng)。大量的隨機(jī)化臨床試驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者對(duì)作為單一試劑的5-FU的總體腫瘤反應(yīng)率為15-25％(Moertel，C.G.New Engl.J.Med.，3301136-1142，1994)。與上述其它化療聯(lián)合時(shí)，對(duì)基于5-FU的方案的腫瘤反應(yīng)率為約40％。然而，大多數(shù)受治療的患者沒有從接受基于5-FU的化療中得到明顯的益處，并且經(jīng)歷了顯著的危險(xiǎn)、不適和花費(fèi)大量開支。由于目前還沒有可靠的在治療前預(yù)測(cè)個(gè)體腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)的方法，標(biāo)準(zhǔn)的臨床實(shí)踐是讓所有患者接受5-FU治療，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者的結(jié)果不滿意。
為了鑒定藥物的抗腫瘤活性的最重要生化決定因素，一直在廣泛研究5-FU的活性和代謝途徑。最終的目的是通過(guò)a)調(diào)節(jié)5-FU的細(xì)胞內(nèi)代謝和生化以及b)通過(guò)在治療前測(cè)量患者中的反應(yīng)決定性因素以預(yù)測(cè)哪些患者最可能反應(yīng)(或不反應(yīng))于藥物，從而改進(jìn)5-FU的臨床有效性。
對(duì)基于5-FU的治療的腫瘤反應(yīng)預(yù)測(cè)領(lǐng)域的第一個(gè)研究是對(duì)其在結(jié)直腸癌中的靶酶，胸苷酸合成酶(TS)進(jìn)行的。已經(jīng)克隆了TS。(Kaneda等，J.Biol.Chem.265(33)，20277-20284；編號(hào)為NM-001071，在此引入?yún)⒖?，即SEQ ID NO11)。Leichman等(Leichman等，J.ClinOncol.，153223-3229，1997)進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性臨床試驗(yàn)，用于在腫瘤對(duì)5-FU的反應(yīng)和TS基因的表達(dá)之間建立聯(lián)系，這是通過(guò)RT-PCR在結(jié)直腸癌的預(yù)治療活檢物中測(cè)定的。該研究表明1)在這些腫瘤中TS基因表達(dá)水平有大的50倍范圍；和2)反應(yīng)和無(wú)反應(yīng)腫瘤的TS基因表達(dá)水平之間具有顯著差異。反應(yīng)組TS水平的范圍(0.5-4.1×10-3，相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照)窄于無(wú)反應(yīng)組的范圍(1.6-23.0×10-3，相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照)。研究者確定了所得到的TS表達(dá)的“無(wú)反應(yīng)截?cái)嘀怠庇蛩?，在該水平之上僅有無(wú)反應(yīng)者。這樣，TS表達(dá)水平高于該“無(wú)反應(yīng)截?cái)嘀怠庇虻幕颊呖梢栽谥委熐氨魂?yáng)性鑒定為無(wú)反應(yīng)者?！盁o(wú)反應(yīng)”分類包括所有腫瘤縮?。?0％，進(jìn)展性生長(zhǎng)導(dǎo)致腫瘤增加＞25％和非進(jìn)展性腫瘤縮?。?0％，無(wú)改變或增加＜25％。這些腫瘤具有最高的TS水平。因此，高TS表達(dá)特別鑒定了具有抗性的腫瘤。TS表達(dá)水平高于某域值鑒定為對(duì)5-FU無(wú)反應(yīng)的腫瘤亞型，而TS表達(dá)低于該數(shù)值的腫瘤預(yù)測(cè)具有稍高的反應(yīng)率。
令人感興趣的是，Papamichael等得出了奧沙利鉑增加聯(lián)合治療的5-FU的合成代謝途徑的結(jié)論(Br.J.Cancer，78(suppl.2)，98p.12.1998；Oncologist 1999；4(6)478-87)。這可以解釋5-FU和奧沙利鉑聯(lián)合化療在癌癥中的有效性。而且，由于已知基于5-FU和基于鉑的化療分別依賴于TS和ERCC1表達(dá)水平，準(zhǔn)確確定得到腫瘤組織的患者中ERCC1表達(dá)和TS表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)基于5-FU和基于鉑的化療是特別重要的。
絕大多數(shù)患者的病理樣品都是按常規(guī)固定且用石蠟包埋的(FPE)，然后用于組織學(xué)分析及隨后的存檔。因此，絕大多數(shù)活檢組織樣品都不能用于基因表達(dá)的分析，這是因?yàn)檫@種研究需要高度完整的RNA，才能進(jìn)行基因表達(dá)的準(zhǔn)確測(cè)量。目前，基因表達(dá)水平只能通過(guò)免疫組織化學(xué)染色在這種固定且包埋的樣品中定量監(jiān)測(cè)，從而監(jiān)測(cè)蛋白表達(dá)水平。
迄今為止，包括ERCC1和TS表達(dá)的定量基因表達(dá)研究都限于來(lái)自于新鮮和冷凍組織的RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增。Reed等的美國(guó)專利5,705336公開了定量卵巢腫瘤組織中的ERCC1mRNA并確定該組織是否對(duì)基于鉑的化療敏感的方法。如Leichman等，Reed等的文章中所描述，定量冷凍腫瘤活檢物的mRNA。
由健康護(hù)理專業(yè)人員使用冷凍組織具有相當(dāng)大的不便。在設(shè)計(jì)任何一種基于RNA的定量遺傳標(biāo)記測(cè)定法時(shí)，迅速遞送活檢樣品，以避免組織及后來(lái)的mRNA降解是首先要考慮的。進(jìn)行活檢的健康護(hù)理專業(yè)人員必須把組織樣品迅速遞送到所裝備的設(shè)備上，從而在收到組織樣品后立即進(jìn)行RNA提取。如果沒有這種設(shè)備，臨床醫(yī)師必須迅速將樣品冷凍，從而防止mRNA降解。為了在組織和RNA降解之前使用診斷設(shè)備進(jìn)行有效的RNA提取，組織樣品必須保持冷凍，直到它到達(dá)診斷設(shè)備，但可以位于較遠(yuǎn)處。在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，可使用帶有液氮和干冰的專用設(shè)備維持冷凍組織的完整性，但花費(fèi)較高。
常規(guī)的活檢樣品通常含有基質(zhì)和腫瘤組織的不均一混合物。與新鮮或冷凍組織不同，F(xiàn)PE活檢組織樣品可很容易地被顯微解剖，分成基質(zhì)和腫瘤組織，因此優(yōu)于使用新鮮或冷凍組織。而RNA從固定組織，特別是固定且石蠟包埋組織中的分離會(huì)產(chǎn)生高度降解的RNA，這通常被認(rèn)為不適于基因表達(dá)的研究。
現(xiàn)在有很多從生物樣品中純化RNA的技術(shù)，但還沒有一種可靠的從FPE樣品中分離RNA的方法。例如，Chomczynski(美國(guó)專利US5,346,994)描述了一種從組織中純化RNA的方法，它是以液相分離為基礎(chǔ)，使用苯酚和異硫氰酸胍進(jìn)行的。在苯酚和異硫氰酸胍的水溶液中勻化生物樣品，然后將勻漿與氯仿混合。離心后，勻漿分成有機(jī)相，中間相和水相。蛋白螯合在有機(jī)相中，DNA在中間相中，RNA在水相中。RNA可從水相中沉淀出來(lái)。不幸的是，該方法不適于固定且石蠟包埋的(FPE)組織樣品。
分離RNA的其它已知技術(shù)通常是利用胍鹽或苯酚提取，如Sambrook，J.等，(1989)pp.7.3-7.24，和Ausubel，F(xiàn).M.等，(1994)pp.4.0.3-4.4.7中實(shí)施例所述。同樣，在從石蠟包埋的組織樣品中分離RNA方面，還沒有一種已知方法能夠提供可再現(xiàn)的測(cè)量結(jié)果。
因此，特別需要一種從石蠟包埋組織中分離RNA的技術(shù)，從而研究腫瘤組織中的基因表達(dá)，然后將某些受體或酶的表達(dá)水平用于測(cè)定特定療法成功的可能性或適合性。
目前還沒有測(cè)定對(duì)奧沙利鉑的抗性或敏感性的預(yù)測(cè)標(biāo)記。需要確定基于奧沙利鉑/5-FU的治療的成功可能性。我們報(bào)道了切除修復(fù)基因ERCC1的細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)和胸苷酸合成酶基因(TS)的細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)與進(jìn)行奧沙利鉑/5-FU聯(lián)合化療的腫瘤患者的臨床結(jié)局具有顯著的反相關(guān)。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種定量腫瘤組織中ERCC1和/或TSmRNA的方法，以便為基因毒性化療提供早期預(yù)測(cè)。本發(fā)明另一個(gè)目的是通過(guò)檢測(cè)患者腫瘤細(xì)胞中ERCC1和/或TSmRNA的量，并把它與預(yù)定的閾表達(dá)水平進(jìn)行比較，而提供一種評(píng)估固定且石蠟包埋(FPE)的組織中ERCC1和/或TS的水平，并預(yù)測(cè)患者腫瘤對(duì)5-FU和奧沙利鉑治療的可能抗性的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供一種評(píng)估固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤細(xì)胞中ERCC1 mRNA表達(dá)水平的方法。
本發(fā)明另一方面提供一種評(píng)估固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤細(xì)胞中TS mRNA表達(dá)水平的方法。
本發(fā)明另一方面提供一種測(cè)量固定且石蠟包埋(FPE)的組織樣品中相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照的ERCC1 mRNA表達(dá)量的方法。該方法包括分離所述樣品的總mRNA，并測(cè)定相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的mRNA量的ERCC1 mRNA的量。
本發(fā)明另一方面提供一種測(cè)量固定且石蠟包埋(FPE)的組織樣品中相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照的TS mRNA表達(dá)量的方法。該方法包括分離所述樣品的總mRNA，并測(cè)定相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因mRNA量的TS mRNA的量。
在本發(fā)明這方面的其中一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有ERCC1-504F(SEQ ID NO1)或ERCC1-574R(SEQ ID NO2)序列和具有基本上與其相同序列的寡核苷酸引物。本發(fā)明還提供這樣一種寡核苷酸引物，其序列在嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或它們的互補(bǔ)序列雜交。
在本發(fā)明這方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有TS-763F(SEQ IDNO3)或TS-825R(SEQ ID NO4)序列和具有基本上與其相同序列的寡核苷酸引物。本發(fā)明還提供這樣一種寡核苷酸引物，其序列在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4或它們的互補(bǔ)序列雜交。
本發(fā)明另一方面提供一種確定患者的基于5-FU和奧沙利鉑的化療方案的方法，包括從固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中分離RNA；測(cè)定樣品中ERCC1的基因表達(dá)水平；把ERCC1基因表達(dá)水平與ERCC1基因的預(yù)定閾水平進(jìn)行比較；根據(jù)ERCC1基因表達(dá)水平和預(yù)定閾水平的比較結(jié)果確定化療方案。
本發(fā)明另一方面提供一種確定患者的基于5-FU和奧沙利鉑的化療方案的方法，包括從固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中分離RNA；測(cè)定樣品中TS的基因表達(dá)水平；把TS基因表達(dá)水平與TS基因的預(yù)定閾水平進(jìn)行比較；根據(jù)TS基因表達(dá)水平和預(yù)定閾水平的比較結(jié)果確定化療方案。
本發(fā)明另一方面提供一種確定患者的基于5-FU和奧沙利鉑的化療方案的方法，包括從固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中分離RNA；測(cè)定樣品中的TS和ERCC1基因表達(dá)水平；把TS和ERCC1基因表達(dá)水平與TS和ERCC1基因的預(yù)定閾水平進(jìn)行比較；根據(jù)TS和ERCC1基因表達(dá)水平與預(yù)定閾水平的比較結(jié)果確定化療方案。
本發(fā)明還涉及一種標(biāo)準(zhǔn)化組織樣品中相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的ERCC1和TS的未校正基因表達(dá)(UGE)的方法，其中所述組織樣品是使用TaqMan技術(shù)分析的，所述方法是通過(guò)利用pre-TaqMan技術(shù)，相對(duì)于樣品的內(nèi)部對(duì)照，對(duì)已知的ERCC1和TS表達(dá)水平進(jìn)行分析而進(jìn)行的。


圖1表示具有高(高于約7.5×10-3倍β肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；n＝7)和低水平(低于約7.5×10-3倍β肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；n＝43)的校正TS表達(dá)水平的結(jié)直腸腺癌患者接受5-FU和奧沙利鉑治療方案時(shí)估計(jì)的存活概率和以月表示的存活。
圖2表示具有高(高于約4.9×10-3倍β肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；n＝7)和低水平(低于約4.9×10-3倍β肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；n＝40)的校正TS表達(dá)水平的結(jié)直腸腺癌患者接受5-FU和奧沙利鉑治療方案時(shí)估計(jì)的存活概率和以月表示的存活。
圖3表示具有高(TS表達(dá)高于約7.5×10-3倍β肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；ERCC1表達(dá)高于約4.9×10-3倍β肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；n＝14)和低水平(TS表達(dá)高于約7.5×10-3倍β肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；ERCC1表達(dá)高于約4.9×10-3倍β肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；n＝36)的校正TS表達(dá)水平的結(jié)直腸腺癌患者接受5-FU和奧沙利鉑治療方案時(shí)估計(jì)的存活概率和以月表示的存活。
圖4是表示與通過(guò)單變量分析得到的ERCC1和TS表達(dá)相關(guān)的奧沙利鉑/5-FU治療的結(jié)直腸癌患者的存活的表。
圖5是表示與通過(guò)分層分析得到的ERCC1和TS表達(dá)相關(guān)的奧沙利鉑/5-FU治療的結(jié)直腸癌患者的存活的表。
圖6表示采用5-FU和奧沙利鉑化療方案的結(jié)直腸腺癌患者的反應(yīng)?；颊叻譃榫哂羞M(jìn)展性疾病(PD)、部分反應(yīng)(PR)和穩(wěn)定疾病(SD)。具有低水平TS和ERCC1表達(dá)的患者具有最佳反應(yīng)。
圖7是舉例說(shuō)明如何計(jì)算相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的ERCC1表達(dá)的圖表。所述圖表包括用兩種試驗(yàn)樣品獲得的數(shù)據(jù)，(未知1和2)，并舉例說(shuō)明如何測(cè)定未校正基因的表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)。該圖表還舉例說(shuō)明了如何利用通過(guò)pre-TaqMan技術(shù)測(cè)定的已知相對(duì)ERCC1值，標(biāo)準(zhǔn)化TaqMan儀器所產(chǎn)生的UGE。這是通過(guò)用UGE乘以校正因子KBRCC1完成的。圖中的內(nèi)部對(duì)照基因是β-肌動(dòng)蛋白，校準(zhǔn)RNA是人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)。
圖8是舉例說(shuō)明如何計(jì)算相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的TS表達(dá)的圖表。所述圖表包括用兩種試驗(yàn)樣品獲得的數(shù)據(jù)，(未知1和2)，并舉例說(shuō)明如何測(cè)定未校正基因的表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)。該圖表還舉例說(shuō)明了如何利用先前公開的TS值，標(biāo)準(zhǔn)化TaqMan儀器所產(chǎn)生的UGE。這是通過(guò)用UGE乘以校正因子KTS完成的。圖中的內(nèi)部對(duì)照基因是β-肌動(dòng)蛋白，校準(zhǔn)RNA是Universal PE RNA(Applied Biosystems，目錄號(hào)4307281；批號(hào)3617812014)。
圖9是表示與TS表達(dá)相關(guān)的結(jié)直腸癌患者腫瘤對(duì)奧沙利鉑/5-FU治療的反應(yīng)。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分依賴于TS和ERCC1 mRNA量分別與5-FU和奧沙利鉑制劑抗性相關(guān)的發(fā)現(xiàn)。表達(dá)高水平TS和/或ERCC1 mRNA的腫瘤被認(rèn)為可能對(duì)基于鉑的化療具有抗性。相反，表達(dá)低水平TS和ERCC1 mRNA的那些腫瘤可能對(duì)基于鉑的化療敏感。患者腫瘤的TS和ERCC1 mRNA表達(dá)狀態(tài)是通過(guò)把它與預(yù)定的閾表達(dá)水平進(jìn)行比較而確定的。
本發(fā)明提供一種測(cè)量固定或固定且石蠟包埋(FPE)的組織中，TS和/或ERCC1 mRNA相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因表達(dá)的表達(dá)量的方法。本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了可準(zhǔn)確評(píng)估固定或固定且包埋組織中的TS和ERCC1基因表達(dá)的寡核苷酸引物。本發(fā)明的寡核苷酸引物，ERCC1-504F(SEQ IDNO1)，ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或基本上與其相同的寡核苷酸引物，優(yōu)選與從固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中提取出來(lái)的RNA一起使用。本發(fā)明還提供寡核苷酸引物，TS-763F(SEQ ID NO3)，TS-825R(SEQ ID NO4)，或基本上與其相同的寡核苷酸引物，優(yōu)選與從固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中提取出來(lái)的RNA一起使用。然后可將TS和/或ERCC1基因表達(dá)的這種測(cè)量值用于預(yù)測(cè)基于鉑的化療。
本發(fā)明的該實(shí)施方案包括，第一，一種確實(shí)可靠的，從FPE樣品中提取RNA的方法，第二，通過(guò)使用一對(duì)寡核苷酸引物，使用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定樣品中ERCC1 mRNA含量的方法，其中優(yōu)選寡核苷酸引物對(duì)ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或基本上與其相同的寡核苷酸。
“基本上相同”的核酸是指在嚴(yán)格條件下與靶雜交的核酸，及適當(dāng)比對(duì)時(shí)，與具有適當(dāng)核苷酸插入和缺失的核酸相比較時(shí)，至少約60％，優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約80％，優(yōu)選至少約90％，更優(yōu)選至少約95-98％的核苷酸相同的核酸片段，或它們的互補(bǔ)鏈。當(dāng)選擇性高于特異性時(shí)，存在選擇性雜交。見，Kanehisa，NucleicAcidsRes.，12203-213(1984)。
本發(fā)明的該實(shí)施方案進(jìn)一步包括，通過(guò)使用一對(duì)寡核苷酸引物，使用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定樣品中ERCC1 mRNA含量的方法，其中優(yōu)選寡核苷酸引物對(duì)TS-763F(SEQ ID NO3)和TS-825R(SEQ IDNO4)或基本上與其相同的寡核苷酸。RNA是通過(guò)1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)09/469,338中描述的任意mRNA分離的方法從FPE細(xì)胞中提取的，該專利申請(qǐng)?jiān)诖艘米鳛閰⒖肌?br> 本發(fā)明的方法適用于患者的任意組織類型。對(duì)于檢驗(yàn)?zāi)[瘤組織的抗性，優(yōu)選檢驗(yàn)?zāi)[瘤組織。在優(yōu)選實(shí)施方案中，檢驗(yàn)得到腫瘤組織的患者的一部分正常組織。然后可以用更高量的化療組合物治療那些預(yù)計(jì)正常組織對(duì)基于鉑的化療化合物具有抗性，即表現(xiàn)出高水平TS和/或ERCC1基因表達(dá)，但預(yù)計(jì)腫瘤組織對(duì)所述化合物敏感，即表現(xiàn)出低水平TS和/或ERCC1基因表達(dá)的患者。
本發(fā)明的方法適用于各種腫瘤類型。它可制備個(gè)體“腫瘤表達(dá)分布”，由此在個(gè)體患者的樣品中測(cè)定TS和/或ERCC1的表達(dá)水平，并預(yù)測(cè)對(duì)各種化療的反應(yīng)。優(yōu)選，本發(fā)明的方法適用于實(shí)體瘤，最優(yōu)選結(jié)直腸癌。
此處定義的ERCC1表達(dá)的“預(yù)定閾水平”是一種ERCC1表達(dá)水平，當(dāng)高于此水平時(shí)，腫瘤可能對(duì)基于5-FU和/或奧沙利鉑的化療方案有抗性。表達(dá)水平低于該域值的腫瘤可能對(duì)基于5-FU和/或奧沙利鉑的化療方案敏感。表示為ERCC1β-肌動(dòng)蛋白之比的相對(duì)ERCC1表達(dá)在反應(yīng)于基于鉑的化療方案的腫瘤中的范圍為低于約4.9×10-3。不反應(yīng)于基于鉑的化療方案的腫瘤中表示為ERCC1β-肌動(dòng)蛋白之比的相對(duì)ERCC1表達(dá)范圍為高于約4.9×10-3。
此處定義的TS表達(dá)的“預(yù)定閾水平”是一種TS表達(dá)水平，當(dāng)高于此水平時(shí)，腫瘤可能對(duì)基于5-FU或5-FU以及奧沙利鉑的化療方案有抗性。表達(dá)水平低于該域值的腫瘤可能對(duì)基于5-FU或5-FU以及奧沙利鉑的化療方案敏感。表示為TSβ-肌動(dòng)蛋白之比的相對(duì)TS表達(dá)在反應(yīng)于基于5-FU或5-FU以及奧沙利鉑的化療方案的腫瘤中的范圍為低于約7.5×10-3。不反應(yīng)于基于5-FU或5-FU以及奧沙利鉑的化療方案的腫瘤中表示為TSβ-肌動(dòng)蛋白之比的相對(duì)TS表達(dá)范圍為高于約7.5×10-3。
在進(jìn)行本發(fā)明的方法時(shí)，測(cè)定患者腫瘤樣品中的ERCC1表達(dá)水平或TS表達(dá)水平，從而預(yù)測(cè)基于5-FU和奧沙利鉑的化療方案的效力。此外，在本發(fā)明的方法中，測(cè)定患者腫瘤樣品的TS表達(dá)水平，從而預(yù)測(cè)基于5-FU和奧沙利鉑的化療方案的效力。此外，在本發(fā)明的方法中，測(cè)定患者腫瘤樣品的ERCC1表達(dá)水平，從而預(yù)測(cè)基于奧沙利鉑的化療方案的效力。可選擇地，測(cè)定患者腫瘤樣品的ERCC1表達(dá)水平和TS表達(dá)水平，從而預(yù)測(cè)基于5-FU和奧沙利鉑的聯(lián)合化療方案的效力。
在進(jìn)行本發(fā)明該實(shí)施方案的方法時(shí)，優(yōu)選分離患者的腫瘤細(xì)胞。實(shí)體或淋巴瘤或其一部分是通過(guò)手術(shù)從患者切除下來(lái)的，或通過(guò)常規(guī)的活檢獲得。從冷凍或新鮮腫瘤樣品中分離出來(lái)的RNA是通過(guò)本領(lǐng)域任何一種典型的方法從細(xì)胞中提取出來(lái)的，例如Sambrook，F(xiàn)ischer和Maniatis，MolecularCloning，a laboratory manual，(2nded.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，(1989)。優(yōu)選在提取過(guò)程中，注意避免RNA降解。
然而，患者的組織在活檢后常常被固定，例如，通常用福爾馬林(甲醛)或gluteraldehyde固定，或用醇浸漬。通常是使固定的生物樣品脫水，并將其包埋在石蠟或本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的其它固體支持物中。見Plenat等，Ann Pathol 2001 Jan；21(1)29-47。沒有包埋的固定組織及固定且包埋的組織都可用于本發(fā)明的方法中。將包埋固定組織的固體支持物設(shè)計(jì)為可用有機(jī)溶劑除去，隨后使保存的組織再水合。
RNA是通過(guò)1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)US09/469,338中描述的任何一種方法從FPE細(xì)胞中提取出來(lái)的，所述專利申請(qǐng)全部引入此處作為參考。此處所述固定且石蠟包埋(FPE)的組織是指可儲(chǔ)存或存檔的組織樣品。RNA可從存檔的病理樣品或活檢樣品中分離出來(lái)，其首先脫石蠟。代表性的脫石蠟方法包括用有機(jī)溶劑，如二甲苯洗滌石蠟包埋的樣品。脫石蠟樣品還可用低級(jí)醇的水溶液再水合。適宜的低級(jí)醇包括，例如甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。脫石蠟樣品可用逐漸降低濃度的低級(jí)醇溶液連續(xù)洗滌而再水合?？蛇x擇地，樣品可同時(shí)脫石蠟和再水合。然后提取樣品中的RNA。
為了提取RNA，可利用機(jī)械，聲波或其它勻化工具勻化固定或固定且脫石蠟的樣品。再水合的樣品可在含有離液劑，如硫氰酸胍(也可作為異硫氰酸胍銷售)的溶液中勻化。將離液溶液中的勻化樣品加熱至約50-約100℃，所述離液溶液含有有效量的離液劑，如胍化合物。優(yōu)選的離液劑是硫氰酸胍。
“有效濃度的離液劑”的選擇是指從石蠟包埋的樣品中純化的RNA量比沒有離液劑情況下分離出來(lái)的RNA量高大約10倍。離液劑包括，如，胍化合物，脲，甲酰胺，碘化鉀，硫氰酸鉀及類似的化合物。本發(fā)明方法的優(yōu)選離液劑是胍化合物，如異硫氰酸胍(也作為硫氰酸胍銷售)和鹽酸胍。很多陰平衡離子都是有用的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可用這種適宜的陰離子制備多種胍鹽。本發(fā)明所用胍溶液的有效濃度通常約為1-5M，優(yōu)選約4M。如果RNA已存在于溶液中，那么胍溶液的濃度可以更高，這樣，樣品中獲得的最終濃度約為1-5M。優(yōu)選用適當(dāng)?shù)纳彌_液，如Tris-HCl把胍溶液緩沖至pH約3-6，更優(yōu)選約4。離液溶液還可含有還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)和β-巰基乙醇(BME)。離液溶液還可含有RNA酶抑制劑。
然后通過(guò)苯酚-氯仿萃取，離子交換色譜或大小排阻色譜回收離液溶液中的RNA。然后，利用提取，電泳，層析，沉淀技術(shù)或其它適宜技術(shù)進(jìn)一步純化RNA。
TS或ERCC1 mRNA的定量?jī)?yōu)選使用本領(lǐng)域常用的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行，其中所述TS或ERCC1 mRNA來(lái)源于新鮮，冷凍，或固定組織的純化總mRNA。定量TS或ERCC1 mRNA的其它方法包括，例如，使用多重PCR中所用的分子指標(biāo)和其它標(biāo)記探針。此外，本發(fā)明還利用沒有PCR的系統(tǒng)測(cè)量TS和/或ERCC1的mRNA，其中沒有PCR的系統(tǒng)使用的是與Invader測(cè)定(ThirdWave Technologies，Inc.)中使用的探針相似的熒光標(biāo)記探針。最優(yōu)選，TS和/或ERCC1cDNA及內(nèi)部對(duì)照或管家基因(例如，β-肌動(dòng)蛋白)的定量是利用基于熒光的實(shí)時(shí)檢測(cè)法(ABIPRISM 7700或7900 Sequence DetectionSystem[TaqMan]，Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA.)或與Heid等(Genome Res 1996；6986-994)和Gibson等(Genome Res 1996；6995-1001)所述相似的系統(tǒng)進(jìn)行的。ABI7700(TaqManInstrument)的輸出量是以Ct’s或“循環(huán)閾”表示的。使用TaqMan系統(tǒng)，樣品中具有較高數(shù)量靶分子的高水平表達(dá)基因產(chǎn)生一種信號(hào)，并且PCR循環(huán)(較低的Ct)比具有較少靶分子(較高的Ct)的低水平相對(duì)表達(dá)的基因要少。
此處所用“管家”基因或“內(nèi)部對(duì)照”是任何一種組成型或全局型表達(dá)基因，它的存在可評(píng)估TS和/或ERCC1 mRNA的水平。這種評(píng)估包括測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄的總體組成型水平和RNA回收中變異的對(duì)照?！肮芗摇被蚧颉皟?nèi)部對(duì)照”包括，但不限制于親環(huán)蛋白基因，β-肌動(dòng)蛋白基因，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因，GAPDH基固等。最優(yōu)選內(nèi)部對(duì)照基因是β-肌動(dòng)蛋白基因，如Eads等，Cancer Research 1999；592302-2306所述。
RNA回收中變異的對(duì)照需要使用“校準(zhǔn)RNA”?！靶?zhǔn)RNA”可以是任何一種可得到的精確預(yù)定量的對(duì)照RNA。優(yōu)選使用人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)定量ERCC1，使用Universal PERNA(Applied Biosystems，目錄號(hào)4307281，批號(hào)3617812014)定量TS。
此處所用“未校正基因表達(dá)(UGE)”是指由TaqMan儀器產(chǎn)生的相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的TS和/或ERCC1表達(dá)的數(shù)字輸出。用于確定UGE的公式在實(shí)施例3和4中表示，并用圖7和8的樣品計(jì)算結(jié)果舉例說(shuō)明。
本發(fā)明另一方面提供一種校準(zhǔn)化未校正基因表達(dá)(UGE)值的方法，所述未校正基因表達(dá)(UGE)值是利用源于非-TaqMan技術(shù)的“已知相對(duì)基因表達(dá)”值，從TaqMan儀器獲得的。優(yōu)選，源于TaqMan的組織樣品TS和/或ERCC1 UGE值是相對(duì)于樣品，用已知源于非-TaqMan的相對(duì)TS和/或ERCC1β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化的。
此處所用“校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)”是指標(biāo)準(zhǔn)化的ERCC1表達(dá)，UGE乘以ERCC1特異性校正因子(KERCC1)得到一個(gè)值，該值可與ERCC1相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的已知表達(dá)水平范圍相比較。實(shí)施例3和圖7詳細(xì)說(shuō)明了這些計(jì)算結(jié)果。這些數(shù)值可確定特定樣品的“校正相對(duì)ERCC1表達(dá)”是高于還是低于“預(yù)定閾”水平。相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白水平的校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)的預(yù)定域水平為約4.9×10-3。ERCC1，內(nèi)部對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)的特異性KERCC1為1.54×10-3。
“已知的相對(duì)基因表達(dá)”值源于先前分析的組織樣品，且它是以靶基因的RT-PCR信號(hào)與組成型表達(dá)的內(nèi)部對(duì)照基因(例如，β-肌動(dòng)蛋白，GAPDH等)的比值為基礎(chǔ)的。優(yōu)選這種組織樣品是用福爾馬林固定并用石蠟包埋(FPE)的樣品，RNA是按照實(shí)施例1描述的方案從它們之中提取出來(lái)的。為了測(cè)量相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照的基因表達(dá)，使用了本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)定量RT-PCR技術(shù)。Pre-TaqMan技術(shù)PCR反應(yīng)進(jìn)行固定的循環(huán)數(shù)(即，30次)，并報(bào)告每份樣品的終點(diǎn)值。然后按照ERCC1表達(dá)與β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的比值報(bào)道這些值。見Reed等的美國(guó)專利5,705,336。
除了β-肌動(dòng)蛋白和/或不同于人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)的校準(zhǔn)RNA之外，還可測(cè)定其它內(nèi)部對(duì)照基因的KERCC1。為此，人們必須校準(zhǔn)內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn)RNA，其中已經(jīng)測(cè)定了相對(duì)于特定內(nèi)部對(duì)照基因ERCC1的表達(dá)水平(即，“已知的相對(duì)基因表達(dá)”)。優(yōu)選這種組織樣品是福爾馬林固定且石蠟包埋的(FPE)樣品，RNA是按照實(shí)施例1和1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)09/469,338描述的方案從它們之中提取出來(lái)的，該專利申請(qǐng)?jiān)诖巳囊胱鳛閰⒖?。這種測(cè)定可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)pre-TaqMan定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行。根據(jù)這種測(cè)定，這種樣品具有ERCC1的“已知相對(duì)基因表達(dá)”水平，可用于測(cè)定對(duì)實(shí)施例3所述的新內(nèi)部對(duì)照和/或校準(zhǔn)RNA特異的新KERCC1。
此處所用“校正的相對(duì)TS表達(dá)”是指標(biāo)準(zhǔn)化的ERCC1表達(dá)，UGE乘以TS特異性校正因子(KTS)得到一個(gè)值，該值可與相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的TS已知表達(dá)水平范圍相比較。實(shí)施例4和圖8詳細(xì)說(shuō)明了這些計(jì)算結(jié)果。這些數(shù)值可確定特定樣品的“校正相對(duì)TS表達(dá)”是高于還是低于“預(yù)定閾”水平。相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白水平的校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)的預(yù)定域水平為約7.5×10-3。ERCC1，內(nèi)部對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)Universal PE RNA(Applied Biosystems，目錄號(hào)4307281，批號(hào)3617812014)的特異性KBRCC1為12.6×10-3。
除了β-肌動(dòng)蛋白和/或不同于Universal PE RNA(AppliedBiosystems，目錄號(hào)4307281，批號(hào)3617812014)的校準(zhǔn)RNA之外，還可測(cè)定相對(duì)于其它內(nèi)部對(duì)照基因的KTS。為此，人們必須校準(zhǔn)內(nèi)部對(duì)照基因并校準(zhǔn)RNA，其中已經(jīng)測(cè)定了相對(duì)于特定內(nèi)部對(duì)照基因TS的表達(dá)水平(即，“已知的相對(duì)基因表達(dá)”)。優(yōu)選這種組織樣品是福爾馬林固定且石蠟包埋的(FPE)樣品，RNA是按照實(shí)施例1和1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)09/469,338描述的方案從它們之中提取出來(lái)的，該專利申請(qǐng)?jiān)诖巳囊胱鳛閰⒖?。這種測(cè)定可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)pre-TaqMan定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行。根據(jù)這種測(cè)定，這種樣品具有TS的“已知相對(duì)基因表達(dá)”水平，可用于測(cè)定對(duì)實(shí)施例4所述的新內(nèi)部對(duì)照和/或校準(zhǔn)RNA特異的新KTS。
“以前公開的”相對(duì)基因表達(dá)結(jié)果是基于靶基因的RT-PCR信號(hào)與組成型表達(dá)的基因(β-激動(dòng)蛋白)的比值。在pre-TaqMan技術(shù)研究中，進(jìn)行固定循環(huán)數(shù)(即30)的PCR反應(yīng)，報(bào)道每個(gè)樣品的終點(diǎn)值。這些值然后報(bào)道為ERCC1或TS表達(dá)與β-激動(dòng)蛋白表達(dá)的比。Salonga等，Clinical Cancer Research，61322-1327，2000，在此全文引入作為參考。
本發(fā)明的方法可適于各種組織和腫瘤類型，可用于評(píng)估患者的臨床治療，并作為各種癌癥，包括乳腺癌，頭頸癌，肺癌，食管癌，結(jié)腸直腸癌等的診斷或預(yù)后工具。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法適于結(jié)直腸腺癌的預(yù)后。
化療前治療腫瘤活檢樣品通常只對(duì)固定且石蠟包埋(FPE)的組織有效，這些組織通常只含有非常少量的不均一組織。這種FPE樣品可很容易經(jīng)過(guò)顯微解剖，這樣就可測(cè)定沒有污染非惡性基質(zhì)組織的腫瘤組織中的TS和/或ERCC1基因表達(dá)。此外，比較還可在活檢組織樣品內(nèi)的非惡性基質(zhì)組織和腫瘤組織間進(jìn)行，因?yàn)檫@種樣品常常含有兩種類型的組織。
通常，如SEQ ID NO10所示，與ERCC1基因的一個(gè)區(qū)側(cè)面連接的任何寡核苷酸對(duì)都可用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。在嚴(yán)格條件下與ERCC1基因的一個(gè)區(qū)雜交，用于本發(fā)明的引物可擴(kuò)增20-1000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選50-100個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選少于100個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物。
本發(fā)明提供特異性的寡核苷酸引物對(duì)和與其基本上相同的寡核苷酸引物，可利用FPE組織精確評(píng)估ERCC1表達(dá)。優(yōu)選寡核苷酸引物，ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1(SEQ ID NO2)，(此處也稱為寡核苷酸引物對(duì)ERCC1)和基本上與其相同的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1)和ERCC1(SEQ ID NO2)顯示出對(duì)測(cè)量ERCC1 mRNA的水平特別有效，所述測(cè)量是使用通過(guò)任何一種mRNA分離方法從FPE細(xì)胞中提取出來(lái)的RNA進(jìn)行的，如實(shí)施例1所述。
此外，如SEQ ID NO11所示，與TS基因的一個(gè)區(qū)側(cè)面連接的任何寡核苷酸對(duì)都可用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。在嚴(yán)格條件下與TS基因的一個(gè)區(qū)雜交，用于本發(fā)明的引物可擴(kuò)增20-1000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選50-100個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選少于100個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物。
本發(fā)明提供特異性的寡核苷酸引物對(duì)和與其基本上相同的寡核苷酸引物，可利用FPE組織精確評(píng)估TS表達(dá)。優(yōu)選寡核苷酸引物，TS-763F(SEQ ID NO3)和TS(SEQ ID NO4)，(此處也稱為寡核苷酸引物對(duì)TS)和基本上與其相同的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物TS-763F(SEQ ID NO3)和TSSEQ ID NO4)顯示出對(duì)于測(cè)量TS mRNA的水平特別有效，所述測(cè)量是使用通過(guò)任何一種mRNA分離方法從FPE細(xì)胞中提取出來(lái)的RNA進(jìn)行的，如實(shí)施例1所述。
本發(fā)明包括基本上相同的寡核苷酸，其在嚴(yán)格條件下(如此處所定義的)與ERCC1-504F(SEQ ID NO1)，其互補(bǔ)序列，或ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或其互補(bǔ)序列的寡核苷酸引物序列，或TS-763F(SEQ ID NO3)，其互補(bǔ)序列，或TS-825R(SEQ ID NO4)或其互補(bǔ)序列的核苷酸引物序列的全部或一部分雜交。
在嚴(yán)格的雜交條件下，只有高度互補(bǔ)的，即，與此處所定義的基本上相似的核酸序列才能進(jìn)行雜交。優(yōu)選，這種條件會(huì)阻礙20個(gè)連續(xù)核苷酸中有4個(gè)或更多錯(cuò)配，更優(yōu)選20個(gè)連續(xù)核苷酸中有2個(gè)或更多錯(cuò)配，最優(yōu)選20個(gè)相連核苷酸中有1個(gè)或更多錯(cuò)配的核酸進(jìn)行雜交。
核酸的雜交部分通常至少約為10個(gè)(例如，15個(gè))核苷酸長(zhǎng)。核酸進(jìn)行雜交的部分與寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1)，其互補(bǔ)序列，或ERCC1-574R(SEQ ID NO2)，或其互補(bǔ)序列，或寡核苷酸引物TS-763F(SEQ ID NO3)，其互補(bǔ)序列，或TS-825R(SEQ IDNO4)或其互補(bǔ)序列的全部或一部分序列至少約80％，優(yōu)選至少約95％，或最優(yōu)選至少約98％相同。
寡核苷酸引物與核酸樣品在嚴(yán)格條件下的雜交在下面規(guī)定。核酸雙鏈體或雜交體的穩(wěn)定性是以解鏈溫度(Tm)表示的，它是探針從靶DNA解離下來(lái)的溫度。解鏈溫度可用于限定所需的嚴(yán)格條件。如果所要鑒定的序列與探針基本上相同，而不是相同，那么它可首先用于確定最低溫度，在最低溫度時(shí)，只有使用特殊濃度的鹽(例如，SSC或SSPE)才能進(jìn)行同源雜交。然后，假定1％錯(cuò)配導(dǎo)致Tm降低1℃，那么雜交反應(yīng)的最終洗滌溫度因此降低(例如，如果找到與探針的同一性＞95％的序列，那么最終的洗滌溫度降低5℃)。實(shí)際上，Tm在0.5℃-1.5℃/1％錯(cuò)配之間變化。
嚴(yán)格條件包括約68℃時(shí)，在5xSSC/5xDenhart’s溶液/1.0％SDS中雜交，室溫時(shí)，在0.2xSSC/0.1％SDS中洗滌。中度的嚴(yán)格條件包括約42℃時(shí)，在3xSSC中洗滌。改變鹽濃度和溫度參數(shù)，可在引物和靶核酸之間獲得最佳的同一性水平。有關(guān)這種條件的其它指導(dǎo)可在本領(lǐng)域中很容易地得到，例如，Sambrook，F(xiàn)ischer和Maniatis，MolecularCloning，a laboratory manual，(2nded.)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NewYork，(1989)和F.M.Ausubel等編輯，CurrentProtocols in Molecular Biology，JohnWiley和Sons(1994)。
此處公開的寡核苷酸引物能夠精確評(píng)估固定或固定且石蠟包埋的組織，及冷凍或新鮮組織中的TS和/或ERCC1基因表達(dá)。FPE樣品的RNA比新鮮或冷凍組織的RNA更破碎。因此，本發(fā)明的方法適用于測(cè)定所有組織中的TS和/或ERCC1基因表達(dá)，而先前不存在利用固定組織測(cè)定TS和/或ERCC1基因表達(dá)的方法。
可以與基于5-FU和奧沙利鉑的化療聯(lián)合的基因毒性劑形成持續(xù)的基因組損傷并且優(yōu)選作為癌癥的臨床控制。基因毒素誘導(dǎo)的DNA破壞的細(xì)胞修復(fù)速度，以及通過(guò)細(xì)胞分裂周期進(jìn)行的細(xì)胞生長(zhǎng)影響了基因毒素治療的結(jié)果。細(xì)胞基因組中未修復(fù)的損傷可以妨礙DNA復(fù)制，妨礙新合成的DNA的復(fù)制保真性或阻礙細(xì)胞存活所需基因的表達(dá)。因此，基因毒性劑的細(xì)胞毒性(導(dǎo)致細(xì)胞死亡的傾向)的一個(gè)決定因素是由其形成的基因組損傷對(duì)細(xì)胞修復(fù)的抗性。形成持續(xù)的基因組損傷，如保持在基因組中至少到細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期的損傷的基因毒性劑，相對(duì)于形成瞬時(shí)的、容易修復(fù)的基因組損傷的試劑一般是更有效的細(xì)胞毒素。
基因毒素奧沙利鉑，即順-草酸(反-1-1，2-環(huán)己烷二胺)鉑(II)描述于美國(guó)專利4,169,846。相關(guān)的專利包括美國(guó)專利5,290,961；美國(guó)專利5,298,642；美國(guó)專利5,338,874；美國(guó)專利5,420,319和PCT/IB/00614。奧沙利鉑屬于目前正在全面開發(fā)的鉑(II)-反-1，2-二氨基環(huán)己烷復(fù)合物類。所述復(fù)合物，或“dach”復(fù)合物正在進(jìn)行臨場(chǎng)試驗(yàn)并且對(duì)黑素瘤和卵巢、子宮、胃和腸的腫瘤特別有效。其它用于補(bǔ)充基于5-FU和奧沙利鉑的化療的化合物也可以包括奧沙利鉑的類似物如“dach”復(fù)合物和形成共價(jià)DNA加合物的那些。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的補(bǔ)充的鉑化合物是奧沙利鉑。
目前可以用鉑配位化合物控制的腫瘤包括睪丸、子宮內(nèi)膜、宮頸、胃、鱗狀細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)和小細(xì)胞肺癌，以及成髓細(xì)胞瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
上面描述了本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)際操作是通過(guò)下面給出的實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例舉例說(shuō)明的。技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到說(shuō)明實(shí)施例中使用的材料和方法可以各種方式進(jìn)行改進(jìn)。這種改進(jìn)也被認(rèn)為落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例1從FPE組織中分離RNARNA是通過(guò)下列一般過(guò)程從石蠟包埋組織中提取出來(lái)的。
A.切片的脫石蠟和水合(1)把約10μM的切片的一部分放在1.5mL塑料離心管中。
(2)加入600μL二甲苯，室溫(約20-25℃)用力振搖混合物約10分鐘。
(3)室溫時(shí)，以臺(tái)式離心機(jī)的最大速度(約10-20,000xg)將樣品離心約7分鐘。
(4)重復(fù)步驟2和3，直到絕大部分石蠟溶解。根據(jù)原始樣品部分所含的石蠟量，通常需要重復(fù)2次或更多次。
(5)用低級(jí)醇，優(yōu)選用100％乙醇(約600μL)用力振搖約3分鐘，除去二甲苯溶液。
(6)按照步驟(3)將試管離心約7分鐘。傾出并棄去上清液。顆粒狀物變?yōu)榘咨?br> (7)用更稀釋的乙醇溶液首先用約95％乙醇，然后用約80％乙醇，最后用約70％乙醇連續(xù)重復(fù)步驟5和6。
(8)按照步驟(3)，室溫將樣品離心7分鐘。棄去上清液，室溫干燥顆粒狀物約5分鐘。
B.用苯酚-氯仿分離RNA(1)加入400μL含0.5％肌氨酸的異硫氰酸胍溶液和8μL二硫蘇糖醇。
(2)然后用組織勻漿器(Ultra-Turrax，IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)勻化樣品約2-3分鐘，速度從低速(速度1)到高速(速度5)逐漸升高。
(3)然后將樣品在大約95℃時(shí)加熱約5-20分鐘。優(yōu)選在加熱到95℃之前，用細(xì)針刺入含樣品的試管的管帽?？蛇x擇地，管帽可用塑料夾子或?qū)嶒?yàn)用薄膜固定。
(4)然后用pH4.0的50μL2M醋酸鈉和600μL苯酚/氯仿/異戊醇(10∶1.93∶0.036)萃取樣品，其中苯酚/氯仿/異戊醇(10∶1.93∶0.036)是用18mL苯酚和3.6mL1∶49的異戊醇∶氯仿溶液新制備的。用力振搖溶液約10秒，然后在冰上冷卻約15分鐘。
(5)以最大速度將溶液離心約7分鐘。將上層的(水)相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的試管中。
(6)-20℃時(shí)，用約10μL糖原和400μL異丙醇沉淀RNA30分鐘。
(7)通過(guò)在臺(tái)式離心機(jī)中以最大速度離心約7分鐘，而使RNA成為顆粒狀物；傾出并棄去上清液；用大約500μL約70-75％的乙醇洗滌顆粒狀物。
(8)以最大速度將樣品再次離心7分鐘。棄去上清液，并將顆粒狀物風(fēng)干。然后將顆粒狀物溶解在適宜的緩沖液中，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)(例如，50pL 5mM Tris氯化物，pH8.0)。
實(shí)施例2mRNA的逆轉(zhuǎn)錄和PCR逆轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1中舉例說(shuō)明和1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)US09/469,338中的描述(全文引入此處作為參考)，RNA是從顯微解剖或非—顯微解剖的福爾馬林固定的石蠟包埋(FPE)組織中分離出來(lái)的。用乙醇沉淀并離心后，將RNA顆粒狀物溶解在50μL pH8.0的5mM Tris/Cl中。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶可延伸一種寡核苷酸引物，其在脫氧核苷酸存在的情況下與單鏈RNA或DNA模板雜交，產(chǎn)生互補(bǔ)鏈。所得RNA是用來(lái)源于Life Technologies的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)的六聚體逆轉(zhuǎn)錄的。逆轉(zhuǎn)錄是通過(guò)把25μLRNA溶液與25.5μL“逆轉(zhuǎn)錄混合物”混合進(jìn)行的(見下面)。將反應(yīng)物放在熱循環(huán)儀中，26℃時(shí)8分鐘(用于使隨機(jī)的六聚體與RNA結(jié)合)，42℃時(shí)45分鐘(用于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶促反應(yīng))，95℃時(shí)5分鐘(用于DNA酶的熱滅活)。
“逆轉(zhuǎn)錄混合物”由以下成分組成10μl5X緩沖液(250mMTris-HCl，pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，0.5μl隨機(jī)的六聚體(500.D.溶解在550μl，pH7.5的10mM Tris-HCl中)，5μl 10mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)，5μl 0.1M DTT，1.25μl BSA(在pH7.5的10mM Tris-HCL中為3mg/ml)，1.25μl RNAGuard24，800U/ml(RNA酶抑制劑)(目錄號(hào)27-0816，AmershamPharmacia)和2.5μl MMLV200U/μl(Life Tech目錄號(hào)28025-02)。
反應(yīng)組分的最終濃度是50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mMMgCl2，1.0mM dNTP，1.0mM DTT，0.00375mg/ml BSA，0.62U/μl RNAGuard和10U/μl MMLV。
mRNA表達(dá)的PCR定量。ERCC1 cDNA和內(nèi)部對(duì)照或管家基因(例如β-肌動(dòng)蛋白)cDNA的定量是使用Heid等，(Genome Res1996；6986-994)；Gibson等，(Genome Res1996；6995-1001)所述的基于熒光的實(shí)時(shí)檢測(cè)法(ABI PRISM 7700或7900序列檢測(cè)系統(tǒng)[TaqMan]，Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA.)進(jìn)行的。簡(jiǎn)言之，該方法使用一種雙重標(biāo)記的產(chǎn)熒光TaqMan寡核苷酸探針，(ERCC1-530Tc(SEQ ID NO5)，Tm＝70℃；TS-781(SEQ ID NO6)，β-肌動(dòng)蛋白-611(SEQ ID NO7)，其特異性地在正向和反向引物內(nèi)退火。含反應(yīng)混合物的加蓋孔內(nèi)的激光刺激引起3’猝滅劑染料(TAMRA)發(fā)射，直到探針在PCR延伸過(guò)程中被DNA聚合酶的5’-3’核酸酶活性裂解，引起5’報(bào)道染料(6FAM)的釋放。因此，擴(kuò)增子的產(chǎn)生引起熒光信號(hào)的發(fā)射，這是通過(guò)TaqMan’sCCD(電荷耦合器件)檢測(cè)照相機(jī)檢測(cè)的，PCR反應(yīng)純指數(shù)相內(nèi)，閾循環(huán)所產(chǎn)生的信號(hào)量可反映目標(biāo)序列的起始拷貝數(shù)。目標(biāo)序列起始拷貝數(shù)與內(nèi)部對(duì)照基因起始拷貝數(shù)的比較可提供相對(duì)基因表達(dá)水平。TaqMan分析了產(chǎn)率的水平，它是以兩個(gè)絕對(duì)測(cè)量值間的比值(目標(biāo)基因/內(nèi)部對(duì)照基因)表示的。
PCR反應(yīng)混合物由以下成分組成0.5μl含有如上制備的cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物，600nM各寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO1，Tm＝59℃)和ERCC1-574R(SEQ ID NO2，Tm＝58℃)或寡核苷酸引物TS-763F(SEQ ID NO3)和TS-825R(SEQ ID NO4)，200nMTaqMan探針(SEQ ID NO3或SEQ ID NO6)，5U AmpliTaq Gold聚合酶，200μM各dATP，dCTP，dGTP，400μM dTTP，5.5mMMgCl2，和含有參考染料的1xTaqman緩沖液A，最終的體積小于或等于25μl(所有試劑，AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)。循環(huán)條件是，95℃10分鐘，然后是95℃15秒和60℃1分鐘循環(huán)45次。用于定量?jī)?nèi)部對(duì)照基因β-肌動(dòng)蛋白的寡核苷酸是β-肌動(dòng)蛋白-592F(SEQ ID NO8)和β-肌動(dòng)蛋白-651R(SEQ ID NO9)。
實(shí)施例3測(cè)定ERCC1的未校正基因表達(dá)(UGE)進(jìn)行兩對(duì)平行反應(yīng)?！霸囼?yàn)”反應(yīng)和“校準(zhǔn)”反應(yīng)。圖7。ERCC1擴(kuò)增反應(yīng)和β-肌動(dòng)蛋白內(nèi)部對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)是試驗(yàn)反應(yīng)。單獨(dú)的ERCC1和β-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增反應(yīng)是在校準(zhǔn)RNA模板上進(jìn)行的，被稱作校準(zhǔn)反應(yīng)。TaqMan儀器產(chǎn)生4個(gè)不同的循環(huán)閾(Ct)值試驗(yàn)反應(yīng)的CtERCC1和Ctβ-肌動(dòng)蛋白，和校準(zhǔn)反應(yīng)的CtERCC1和Ctβ-肌動(dòng)蛋白。兩種反應(yīng)的Ct差值是根據(jù)下列公式確定的ΔCt試驗(yàn)＝CtERCC1-Ctβ-肌動(dòng)蛋白(“試驗(yàn)”反應(yīng))ΔCt校準(zhǔn)＝CtERCC1-Ctβ-肌動(dòng)蛋白(“校準(zhǔn)”反應(yīng))下一步是按照下列公式計(jì)算2的負(fù)ΔCt次方。
2-ΔCt試驗(yàn)(“試驗(yàn)”反應(yīng))2-ΔCt校準(zhǔn)(“校準(zhǔn)”反應(yīng))為了從TaqMan儀器獲得ERCC1的未校正基因表達(dá)，進(jìn)行了下列計(jì)算ERCC1的未?；虮磉_(dá)(UGE)＝2-ΔCt試驗(yàn)/2-ΔCt校準(zhǔn)用已知的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化UGE標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)算需要將UGE乘以對(duì)ERCC1和特定校準(zhǔn)RNA特異的校正因子(KERCC1)。還可測(cè)定任何一種內(nèi)部對(duì)照基因和任何一種精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA的校正因子KERCC1。優(yōu)選，使用內(nèi)部對(duì)照基因β-肌動(dòng)蛋白和精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA，人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)。已知這些試劑的校正因子KERCC1等于1.54×10-3。
標(biāo)準(zhǔn)化是使用ΔCt方法的改進(jìn)法進(jìn)行的，所述ΔCt方法由Applied Biosystems，TaqMan制造商，在UserBulletin#2中和上文描述。為了進(jìn)行該過(guò)程，使用上述TaqMan方法，分析了6個(gè)不同F(xiàn)PE試驗(yàn)組織的UGE的ERCC1表達(dá)。使用內(nèi)部對(duì)照基因β-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)RNA，人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)。
用各樣品AG221，AG222，AG252，成人肺，PC3，AdCol的已知相對(duì)ERCC1表達(dá)水平除以其相應(yīng)的源于TaqMan的UGE，得到不平均的校正因子K。
K不平均的＝已知的值/UGE接下來(lái)，求全部K值的平均值，從而確定對(duì)ERCC1，校準(zhǔn)RNA即Stratagene人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)和β-肌動(dòng)蛋白特異的單一KERCC1校正因子。
因此，為了成規(guī)模地測(cè)定與pre-TaqManERCC1表達(dá)研究一致的，未知組織樣品中的校正相對(duì)ERCC1表達(dá)，人們只需用源于TaqMan儀器的未校正基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)乘以KERCC1特異性校正因子，前提是使用相同的內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn)RNA。
校正的相對(duì)ERCC1表達(dá)＝UGE×KERCC1KERCC1可使用任何一種精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA或內(nèi)部對(duì)照基因測(cè)定。未來(lái)來(lái)源的精確預(yù)定量RNA可按照上述方法，相對(duì)于樣品用已知的相對(duì)ERCC1表達(dá)校準(zhǔn)或可相對(duì)于先前已經(jīng)校準(zhǔn)過(guò)的校準(zhǔn)RNA，如上述人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)校準(zhǔn)。
例如，如果隨后測(cè)定不同的內(nèi)部對(duì)照基因和/或不同的校準(zhǔn)RNA的KERCC1，則人們必須相對(duì)于組織樣品校準(zhǔn)內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn)RNA，其中已經(jīng)測(cè)定了相對(duì)于特定內(nèi)部對(duì)照基因的ERCC1表達(dá)水平。這種測(cè)定可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)pre-TaqMan，定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行。用這些樣品的已知表達(dá)水平除以它們相應(yīng)的UGE水平，可確定樣品的K值。然后根據(jù)已知樣品數(shù)，求K值的平均值，從而測(cè)定對(duì)不同內(nèi)部對(duì)照基因和/或校準(zhǔn)RNA特異的新KERCC1。
實(shí)施例4
測(cè)定TS的未校正基因表達(dá)(UGE)進(jìn)行兩對(duì)平行反應(yīng)。“試驗(yàn)”反應(yīng)和“校準(zhǔn)”反應(yīng)。圖7。TS擴(kuò)增反應(yīng)和β-肌動(dòng)蛋白內(nèi)部對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)是試驗(yàn)反應(yīng)。單獨(dú)的TS和β-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增反應(yīng)是在校準(zhǔn)RNA模板上進(jìn)行的，被稱作校準(zhǔn)反應(yīng)。TaqMan儀器產(chǎn)生4個(gè)不同的循環(huán)閾(Ct)值試驗(yàn)反應(yīng)的CtTS和Ctβ-肌動(dòng)蛋白，及校準(zhǔn)反應(yīng)的CtTS和Ctβ-肌動(dòng)蛋白。兩種反應(yīng)之間的Ct差值是根據(jù)下列公式確定的ΔCt試驗(yàn)＝CtTS-Ctβ-肌動(dòng)蛋白(“試驗(yàn)”反應(yīng))ΔCt校準(zhǔn)＝CtTS-Ctβ-肌動(dòng)蛋白(“校準(zhǔn)”反應(yīng))下一步是按照下列公式計(jì)算2的負(fù)ΔCt次方。
2-ΔCt試驗(yàn)(“試驗(yàn)”反應(yīng))2-ΔCt校準(zhǔn)(“校準(zhǔn)”反應(yīng))為了從TaqMan儀器獲得TS的未校正基因表達(dá)，進(jìn)行了下列計(jì)算TS的未校基因表達(dá)(UGE)＝2-ΔCt試驗(yàn)/2-ΔCt校準(zhǔn)用已知的相對(duì)TS表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化UGE標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)算需要將UGE乘以對(duì)TS和特定校準(zhǔn)RNA特異的校正因子(KTS)。還可測(cè)定相對(duì)于任何一種內(nèi)部對(duì)照基因和任何一種精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA的校正因子KTS。優(yōu)選，使用內(nèi)部對(duì)照基因β-肌動(dòng)蛋白和精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA，Universal PE RNA(AppliedBiosystems，目錄號(hào)4307281，批號(hào)3617812014)。這些試劑的校正因子KTS等于12.6×10-3。
標(biāo)準(zhǔn)化是使用ΔCt方法的改進(jìn)法進(jìn)行的，所述ΔCt方法是由Applied Biosystems，TaqMan制造商，在User Bulletin#2中和上文描述的。為了進(jìn)行該過(guò)程，使用上述TaqMan方法，分析了6個(gè)不同F(xiàn)PE試驗(yàn)組織的UGE的TS表達(dá)。這些組織樣品描述于Salonga等，Clinical Cancer Research，61322-1327，2000，在此全文引入作為參考。使用內(nèi)部對(duì)照基因β-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)RNA，Universal PERNA(Applied Biosystems，目錄號(hào)4307281，批號(hào)3617812014)。
用以前公開的各樣品L7，L91，L121，L150，L220，L164的相對(duì)TS表達(dá)水平除以其相應(yīng)的源于TaqMan的UGE，得到不平均的校正因子K。Salonga等，Clinical Cancer Research，61322-1327，2000，在此全文引入作為參考。
K不平均的＝已知的值/UGE接著，求全部K值的平均值，確定對(duì)TS，校準(zhǔn)RNA，即UniversalPE RNA(Applied Biosystems，目錄號(hào)4307281，批號(hào)3617812014)和β-肌動(dòng)蛋白特異的單一KTS校正因子。
因此，為了成規(guī)模地測(cè)定與pre-TaqManTS表達(dá)研究相一致的未知組織樣品中的校正相對(duì)TS表達(dá)，人們只需把源于TaqMan儀器的未校正基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)乘以KTS特異性校正因子，前提是使用相同的內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn)RNA。
校正的相對(duì)TS表達(dá)＝UGE×KTSKTS可使用任何一種精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA或內(nèi)部對(duì)照基因測(cè)定。未來(lái)來(lái)源的精確預(yù)定量RNA可按照上述方法，相對(duì)于樣品，用已知的相對(duì)TS表達(dá)校準(zhǔn)或相對(duì)于先前校準(zhǔn)過(guò)的校準(zhǔn)RNA，如上述UniversalPE RNA(Applied Biosystems，目錄號(hào)4307281，批號(hào)3617812014)校準(zhǔn)。
例如，如果隨后測(cè)定相對(duì)于不同的內(nèi)部對(duì)照基因和/或不同的校準(zhǔn)RNA的KTS，人們必須相對(duì)于組織樣品校準(zhǔn)內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn)RNA，其中已經(jīng)測(cè)定或公開了相對(duì)于特殊內(nèi)部對(duì)照基因的TS表達(dá)水平。這種測(cè)定可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)pre-TaqMan，定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行。用這些樣品的已知表達(dá)水平除以它們相應(yīng)的UGE水平，可確定樣品的K值。然后根據(jù)已知樣品數(shù)，求K值的平均值，從而測(cè)定對(duì)不同內(nèi)部對(duì)照基因和/或校準(zhǔn)RNA特異的新KTS。
實(shí)施例5患者選擇和化療所有患者在1998-2000年在南加利福尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)中心注冊(cè)參與3C-98-3方案并接受以下奧沙利鉑/5-FU聯(lián)合治療方案130mg/m2奧沙利鉑加連續(xù)5-FU輸注。所有患者在治療前用5-FU治療失敗，60％(30/50)患者用irinotecan(CPT-11)進(jìn)行二線治療失敗。所有患者在入選方案時(shí)表現(xiàn)出IV期結(jié)直腸癌的活躍疾病。
臨床評(píng)估和反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)在化療中，每周記錄身體狀況、體重、腹痛、完整的血計(jì)數(shù)和血清肌酐以及尿素氮水平的評(píng)估結(jié)果。使用計(jì)算機(jī)體層攝影(CT)測(cè)量腫瘤大小。在入組時(shí)必須有二維可測(cè)量的腫瘤團(tuán)塊。治療的反應(yīng)者分類為腫瘤縮小50％或更多，持續(xù)至少6周。無(wú)反應(yīng)者包括具有穩(wěn)定疾病或癌癥進(jìn)展的患者。存活期計(jì)算為從5-FU/奧沙利鉑化療開始至任何原因的死亡的天數(shù)。在最后一次隨訪評(píng)估時(shí)存活的患者在此時(shí)進(jìn)行檢查。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析TaqMan分析產(chǎn)生了兩個(gè)絕對(duì)測(cè)量值之間的比值(目的基因內(nèi)部參考基因)。分別用Mann-Whitney檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)評(píng)估TS和ERCC1表達(dá)(作為連續(xù)變量)與患者統(tǒng)計(jì)值之間的關(guān)系。Zar，Biostatistical Analysis.Prentice-Hall，Inc Englewood Cliffs，N.J.(1974)，p109-114和139-142。Miller和Sigmund(Miller等，Biometrics 381011-1016，1982)及Halpern(Biometrics381017-1023，1982)的最大卡方方法適于測(cè)定最有利于將患者二分成低和高TS和ERCC1表達(dá)亞組的截?cái)嘤蛑?。Pearson卡方檢驗(yàn)用于評(píng)估二分的分子標(biāo)記和對(duì)化療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。Zar，BiostatisticalAnalysis.Prentice-Hall，Inc Englewood Cliffs，N.J.(1974)，p59-68。危險(xiǎn)比用于計(jì)算死亡的相對(duì)危險(xiǎn)性。這些計(jì)算是基于Pike估計(jì)，使用觀察到的和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)中計(jì)算的預(yù)計(jì)事件數(shù)(Pike，JR Stat Soc Series A 135201-203，1972)。為了測(cè)定P值，其中所述P值被解釋為以最大卡方分析為基礎(chǔ)的相關(guān)強(qiáng)度的測(cè)量值，用1000引導(dǎo)指令樣刺激用于評(píng)估假設(shè)無(wú)關(guān)情況下的最大卡方統(tǒng)計(jì)量分布。(Halpern，Biometrics381017-1023，1982)。顯著性水平被定為p＜0.05。
人群統(tǒng)計(jì)和可以用于反應(yīng)和存活評(píng)估的患者在此研究中評(píng)估了由14名(28％)女性和36名(73％)男性組成的總共50名患者，平均年齡為59歲(最小34歲，最大83歲)。該組的種族背景包括39名高加索人，6名西班牙人，3名亞洲人和2名美國(guó)黑人。所有50名患者都可以評(píng)估TS表達(dá)和ERCC1表達(dá)與存活之間的關(guān)聯(lián)。45名(90％)可以經(jīng)評(píng)估而檢驗(yàn)該分子參數(shù)與高于引用標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。
TS表達(dá)水平和ERCC1表達(dá)水平總mRNA是從顯微解剖的FPE預(yù)處理腫瘤樣品中分離的，用定量RT-PCR測(cè)量ERCC1β-肌動(dòng)蛋白和/或TSβ-肌動(dòng)蛋白的相對(duì)mRNA表達(dá)水平。從樣品中分離mRNA的方法描述于實(shí)施例1中和1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)US09/469,338中的描述，在此全文引入此處作為參考。采用基于逆轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT/PCR)的測(cè)定系統(tǒng)確定ERCC1和β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平，如實(shí)施例2中所描述。分別按實(shí)施例3和4的描述確定校正的相對(duì)ERCC1和/或TS表達(dá)。
在分析的所有50個(gè)樣品中，TS基因表達(dá)都是可檢測(cè)的。相對(duì)于管家基因β-肌動(dòng)蛋白的中值校正TS表達(dá)為3.4×10-3(最小0.18×10-3，最大11.5×10-3)。在分析的47個(gè)(94％)樣品中可以檢測(cè)校正的ERCC1基因表達(dá)。中值校正ERCC1基因表達(dá)為2.53×10-3(最小0.00，最大14.61×10-3)。當(dāng)通過(guò)性別、年齡和種族起源進(jìn)行分析時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)校正的TS和ERCC1 mRNA表達(dá)之間有顯著差異。
與TS表達(dá)相關(guān)的存活在該研究中分析的50名患者中，中值隨訪期為10.5個(gè)月(95％C.I.1.8，21.2)，其中中值存活為8.4個(gè)月(95％C.I.6.4，12.3)。使用7.5×10-3的TS域值時(shí)，43名(86％)患者具有低校正TS表達(dá)水平，7名(14％)患者具有高校正TS表達(dá)水平。用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)評(píng)估校正的TS基因表達(dá)和存活之間的關(guān)聯(lián)。代表性存活曲線表示于圖1，該圖表示，在低校正TS表達(dá)組中，中值存活為10.2個(gè)月(95％C.I.7.4，15.1)，在高校正TS表達(dá)組中，中值存活為1.5個(gè)月(95％C.I.1.1，2.1)(P＜0.001；對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn))。校正的TS表達(dá)≤7.5×10-3的患者6個(gè)月時(shí)的存活概率為0.77，高表達(dá)組為0.00。在單變量分析中，校正的TS表達(dá)＞7.5×10-3的患者與校正的TS表達(dá)≤7.5×10-3的患者相比，死亡的相對(duì)危險(xiǎn)性增加了8.4(95％C.I.2.63，27.13)倍(P＜0.001，圖4)。
與ERCC1表達(dá)相關(guān)的存活使用4.9×10-3為域值，40名(80％)患者具有低校正ERCC1表達(dá)水平，10名(20％)患者具有高校正ERCC1水平。圖2表示用估計(jì)的存活概率對(duì)校正的ERCC1表達(dá)水平所作的Kaplan Meier圖，并且表示出，在低表達(dá)組中，中值存活為10.2個(gè)月(95％C.I.7.8，15.1)，在高表達(dá)組中為1.9個(gè)月(95％C.I.1.1，4.9)(P＜0.001；對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn))。校正的ERCC1表達(dá)≤4.9×10-3的患者6個(gè)月時(shí)的存活概率為0.76，校正的ERCC1表達(dá)＞4.9×10-3的患者為0.16。在單變量分析中，校正的ERCC1表達(dá)＞4.9×10-3的患者與校正的ERCC1表達(dá)≤4.9×10-3的患者相比，死亡的相對(duì)危險(xiǎn)性增加了4.8(95％C.I.2.09，15.88)倍(P＜0.001，圖4)。
與聯(lián)合的ERCC1和TS表達(dá)相關(guān)的存活在36名(72％)患者中檢測(cè)到了低校正TS和ERCC1表達(dá)水平，14名(28％)具有高校正TS和ERCC1表達(dá)水平。兩種基因都具有低表達(dá)水平的患者具有顯著更佳的存活。低校正TS和ERCC1表達(dá)者的中值存活為11.1個(gè)月(95％C.I.8.4，17.5)，高校正TS和/或ERCC1表達(dá)者的中值存活為1.9個(gè)月(95％C.I.1.1，4.9)(P＜0.001；對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，圖3)。兩種基因都具有低校正表達(dá)水平的患者6個(gè)月時(shí)的存活概率為0.85，對(duì)至少一種基因，TS或ERCC1具有高校正表達(dá)水平的患者為0.10。至少一種基因(TS或ERCC1)的校正表達(dá)水平增加的患者與腫瘤中兩種基因的表達(dá)水平都低的患者相比的相對(duì)死亡危險(xiǎn)性為7.12(95％C.I.2.60，19.52)(P＜0.001；圖4)。通過(guò)分層分析表明，TS和ERCC1 mRNA表達(dá)是彼此獨(dú)立的。
反應(yīng)與TS和ERCC1基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)45名可測(cè)量患者的中值校正TS表達(dá)為3.4×10-3(最小0.18×10-3；最大11.50×10-3)，與整個(gè)50名患者的隊(duì)列相同。當(dāng)通過(guò)將腫瘤分為低和高TS表達(dá)者分析反應(yīng)時(shí)，3/4(75％)部分反應(yīng)者，26/27(96％)的穩(wěn)定疾病患者，和9/14(64％)的進(jìn)展性疾病患者具有低校正TS表達(dá)(P＝0.02；Fisher精確檢驗(yàn)，圖9)。
45名可測(cè)量患者的中值校正ERCC1表達(dá)為2.7×10-3(最小0.00；最大14.61×10-3)，與整個(gè)50名患者的隊(duì)列無(wú)顯著差異。然而ERCC1表達(dá)水平與對(duì)化療的反應(yīng)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)性(P＝0.29；Fisher精確檢驗(yàn))。
序列表<110>K.D.達(dá)南伯格等<120>基于ERCC1和TS表達(dá)確定化療方案的方法<130>11220-119<140>待定<141>2001-03-09<160>11<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>21<222>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>1gggaatttgg cgacgtaatt c 21<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>2gcggaggctg aggaacga 18<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>3ggcctcggtg tgccttt17<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>4gatgtgcgca atcatgtacgt 21<210>5<211>25<212>DNA<223>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探針<400>5cacaggtgct ctggcccagc acata 25<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>6aacatcgcca gctacgccct gc 22<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸探針<400>7accaccacgg ccgagcgg 18<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸探針<400>9tgagcgcggc tacagctt 18<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>9tccttaatgt cacgcacgattt 22<210>10<211>1097<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>10aagtgctgcg agccctgggc cacgctggcc gtgctggcag tgggccgcct cgatccctct 60gcagtctttc ccttgaggct ccaagaccag caggtgaggc ctcgcggcgc tgaaaccgtg 120aggcccggac cacaggctcc agatggaccc tgggaaggac aaagaggggg tgccccagcc 180ctcagggccg ccagcaagga agaaatttgt gatacccctc gacgaggatg aggtccctcc 240tggagtggcc aagcccttat tccgatctac acagagcctt cccactgtgg acacctcggc 300ccaggcggcc cctcagacct acgccgaata tgccatctca cagcctctgg aaggggctgg 360ggccacgtgc cccacagggt cagagcccct ggcaggagag acgcccaacc aggccctgaa 420acccggggca aaatccaaca gcatcattgt gagccctcgg cagaggggca atcccgtact 480gaagttcgtg cgcaatgtgc cctgggaatt tggcgacgta attcccgact atgtgctggg 540ccagagcacc tgtgccctgt tcctcagcct ccgctaccac aacctgcacc cagactacat 600
ccatgggcgg ctgcagagcc tggggaagaa cttcgccttg cgggtcctgc ttgtccaggt 660ggatgtgaaa gatccccagc aggccctcaa ggagctggct aagatgtgta tcctggccga 720ctgcacattg atcctcgcct ggagccccga ggaagctggg cggtacctgg agacctacaa 780ggcctatgag cagaaaccag cggacctcct gatggagaag ctagagcagg acttcgtctc 840ccgggtgact gaatgtctga ccaccgtgaa gtcagtcaac aaaacggaca gtcagaccct 900cctgaccaca tttggatctc tggaacagct catcgccgca tcaagagaag atctggcctt 960atgcccaggc ctgggccctc agaaagcccg gaggctgttt gatgtcctgc acgagccctt 1020cttgaaagta ccctgatgac cccagctgcc aaggaaaccc ccagtgtaat aataaatcgt 1080cctcccaggc caggctc1097<210>11<211>1536<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>11gggggggggg ggaccacttg gcctgcctcc gtcccgccgc gccacttggc ctgcctccgt 60cccgccgcgc cacttcgcct gcctccgtcc cccgcccgcc gcgccatgcc tgtggccggc 120tcggagctgc cgcgccggcc cttgcccccc gccgcacagg agcgggacgc cgagccgcgt 180ccgccgcacg gggagctgca gtacctgggg cagatccaac acatcctccg ctgcggcgtc 240aggaaggacg accgcacggg caccggcacc ctgtcggtat tcggcatgca ggcgcgctac 300agcctgagag atgaattccc tctgctgaca accaaacgtg tgttctggaa gggtgttttg 360gaggagttgc tgtggtttat caagggatcc acaaatgcta aagagctgtc ttccaaggga 420gtgaaaatct gggatgccaa tggatcccga gactttttgg acagcctggg attctccacc 460agagaagaag gggacttggg cccagtttat ggcttccagt ggaggcattt tggggcagaa 540tacagagata tggaatcaga ttattcagga cagggagttg accaactgca aagagtgatt 600gacaccatca aaaccaaccc tgacgacaga agaatcatca tgtgcgcttg gaatccaaga 660gatcttcctc tgatggcgct gcctccatgc catgccctct gccagttcta tgtggtgaac 720agtgagctgt cctgccagct gtaccagaga tcgggagaca tgggcctcgg tgtgcctttc 780aacatcgcca gctacgccct gctcacgtac atgattgcgc acatcacggg cctgaagcca 840ggtgacttta tacacacttt gggagatgca catatttacc tgaatcacat cgagccactg 900aaaattcagc ttcagcgaga acccagacct ttcccaaagc tcaggattct tcgaaaagtt 960gagaaaattg atgacttcaa agctgaagac tttcagattg aagggtacaa tccgcatcca 1020actattaaaa tggaaatggc tgtttagggt gctttcaaag gagcttgaag gatattgtca 1080gtctttaggg gttgggctgg atgccgaggt aaaagttctt tttgctctaa aagaaaaagg 1140aactaggtca aaaatctgtc cgtgacctat cagttattaa tttttaagga tgttgccact 1200ggcaaatgta actgtgccag ttctttccat aataaaaggc tttgagttaa ctcactgagg 1260gtatctgaca atgctgaggt tatgaacaaa gtgaggagaa tgaaatgtat gtgctcttag 1320caaaaacatg tatgtgcatt tcaatcccac gtacttataa agaaggttgg tgaatttcac 1380aagctatttt tggaatattt ttagaatatt ttaagaattt cacaagctat tccctcaaat 1440ctgagggagc tgagtaacac catcgatcat gatgtagagt gtggttatga actttatagt 1500tgttttatat gttgctataa taaagaagtg ttctgc 153權(quán)利要求
1.一種確定用于治療患者腫瘤的含有5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑或其聯(lián)合的化療方案的方法，所述方法包括(a)獲得腫瘤的組織樣品并固定樣品，以獲得固定的腫瘤樣品；(b)從固定的腫瘤樣品分離mRNA；(c)使用在嚴(yán)格條件下與ERCC1基因的一個(gè)區(qū)雜交的寡核苷酸引物對(duì)，或在嚴(yán)格條件下與TS基因的一個(gè)區(qū)雜交的寡核苷酸引物對(duì)擴(kuò)增mRNA，獲得ERCC1或TS擴(kuò)增樣品；(d)測(cè)定擴(kuò)增樣品中的TS或ERCC1 mRNA的量；(e)比較步驟(d)的TS或ERCC1 mRNA的量與內(nèi)部對(duì)照基因的mRNA量；并且(f)基于擴(kuò)增樣品中TS和/或ERCC1 mRNA的量和TS和/或ERCC1基因表達(dá)的域水平確定含有5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑或其聯(lián)合的化療方案。
2.一種確定用于治療患者腫瘤的含有5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑或其聯(lián)合的化療方案的方法，所述方法包括(a)獲得腫瘤的組織樣品并固定樣品，以獲得固定的腫瘤樣品；(b)從固定的腫瘤樣品分離mRNA；(c)使用在嚴(yán)格條件下與ERCC1基因的一個(gè)區(qū)雜交的寡核苷酸引物對(duì)擴(kuò)增mRNA，獲得擴(kuò)增樣品；(d)測(cè)定擴(kuò)增樣品中的ERCC1 mRNA的量；(e)比較步驟(d)的ERCC1 mRNA的量與內(nèi)部對(duì)照基因的mRNA量；并且(f)基于擴(kuò)增樣品中ERCC1 mRNA的量和ERCC1基因表達(dá)的域水平確定含有5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑或其聯(lián)合的化療方案。
3.一種確定用于治療患者腫瘤的含有5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑或其聯(lián)合的化療方案的方法，所述方法包括(a)獲得腫瘤的組織樣品并固定樣品，以獲得固定的腫瘤樣品；(b)從固定的腫瘤樣品分離mRNA；(c)使用在嚴(yán)格條件下與TS基因的一個(gè)區(qū)雜交的寡核苷酸引物對(duì)擴(kuò)增mRNA，獲得擴(kuò)增樣品；(d)測(cè)定擴(kuò)增樣品中的TS mRNA的量；(e)比較步驟(d)的TS mRNA的量與內(nèi)部對(duì)照基因的mRNA量；并且(f)基于擴(kuò)增樣品中TS mRNA的量和TS基因表達(dá)的域水平確定含有5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑或其聯(lián)合的化療方案。
4.一種確定用于治療患者腫瘤的含有5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑或其聯(lián)合的化療方案的方法，所述方法包括(a)獲得腫瘤的組織樣品并固定樣品，以獲得固定的腫瘤樣品；(b)從固定的腫瘤樣品分離mRNA；(c)使用在嚴(yán)格條件下與ERCC1基因的一個(gè)區(qū)雜交的寡核苷酸引物對(duì)，以及在嚴(yán)格條件下與TS基因的一個(gè)區(qū)雜交的寡核苷酸引物對(duì)擴(kuò)增mRNA，獲得ERCC1和TS擴(kuò)增樣品；(d)測(cè)定擴(kuò)增樣品中的TS和ERCC1 mRNA的量；(e)比較步驟(d)的TS和ERCC1 mRNA的量與內(nèi)部對(duì)照基因的mRNA量；并且(f)基于擴(kuò)增樣品中TS和/或ERCC1 mRNA的量和TS和/或ERCC1基因表達(dá)的域水平確定含有5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑或其聯(lián)合的化療方案。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述寡核苷酸引物由寡核苷酸引物對(duì)ERCC1，或基本上與其相同的寡核苷酸引物對(duì)組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述寡核苷酸引物由寡核苷酸引物對(duì)TS，或基本上與其相同的寡核苷酸引物對(duì)組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3，或4任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述腫瘤是結(jié)直腸腺癌腫瘤。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述引物由寡核苷酸引物對(duì)TS和寡核苷酸引物對(duì)ERCC1組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1，2，或4任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述ERCC1基因表達(dá)的閾水平是內(nèi)部對(duì)照基因表達(dá)水平的約4.9倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求1，3，或4任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述TS基因表達(dá)的閾水平是內(nèi)部對(duì)照基因表達(dá)水平的約7.5倍。
11.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3或4任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述內(nèi)部對(duì)照基因是β-肌動(dòng)蛋白。
12.一種測(cè)定固定且石蠟包埋的組織樣品中ERCC1表達(dá)水平的方法，包括(a)將組織樣品脫石蠟，獲得脫石蠟的樣品；(b)在存在有效量離液劑的條件下，分離脫石蠟樣品的mRNA；(c)使用在嚴(yán)格條件下與ERCC1基因的一個(gè)區(qū)雜交的寡核苷酸引物對(duì)擴(kuò)增mRNA，獲得擴(kuò)增樣品；(d)測(cè)定相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因mRNA量的ERCC1 mRNA量。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述寡核苷酸引物對(duì)由寡核苷酸引物對(duì)ERCC1或基本上與其相似的寡核苷酸引物對(duì)組成。
14.一種測(cè)定固定且石蠟包埋的組織樣品中TS表達(dá)水平的方法，包括(a)將組織樣品脫石蠟，獲得脫石蠟的樣品；(b)在存在有效量離液劑的條件下，分離脫石蠟樣品的mRNA；(c)使用在嚴(yán)格條件下與TS基因的一個(gè)區(qū)雜交的寡核苷酸引物對(duì)擴(kuò)增mRNA，獲得擴(kuò)增樣品；(d)測(cè)定相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因mRNA量的TS mRNA量。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述寡核苷酸引物對(duì)由寡核苷酸引物對(duì)TS或基本上與其相似的寡核苷酸引物對(duì)組成。
16.根據(jù)權(quán)利要求12或14所述的方法，其中所述內(nèi)部對(duì)照基因是β-肌動(dòng)蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求12或14所述的方法，其中mRNA的分離是通過(guò)下列步驟進(jìn)行的(a)將含有有效濃度離液化合物的溶液中的組織樣品加熱至大約75℃-100℃，加熱約5-120分鐘；并且(b)回收離液溶液中的所述mRNA。
18.一種具有SEQ ID NO1序列的寡核苷酸引物或基本上與其相同的寡核苷酸。
19.一種具有SEQ ID NO2序列的寡核苷酸引物或基本上與其相同的寡核苷酸。
20.一種具有SEQ ID NO3序列的寡核苷酸引物或基本上與其相同的寡核苷酸。
21.一種具有SEQ ID NO4序列的寡核苷酸引物或基本上與其相同的寡核苷酸。
22.一種檢測(cè)ERCC1基因表達(dá)的試劑盒，其含有寡核苷酸對(duì)ERCC1或基本上與其相同的寡核苷酸對(duì)。
23.一種檢測(cè)TS基因表達(dá)的試劑盒，其含有寡核苷酸對(duì)TS或基本上與其相同的寡核苷酸對(duì)。
24.一種檢測(cè)TS和ERCC1基因表達(dá)的試劑盒，其含有寡核苷酸對(duì)TS或基本上與其相同的寡核苷酸對(duì)，及寡核苷酸對(duì)ERCC1或基本上與其相同的寡核苷酸對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于醫(yī)學(xué)，特別是癌癥化療中的預(yù)測(cè)方法。本發(fā)明目的是提供一種通過(guò)檢測(cè)患者腫瘤細(xì)胞中TS和/或ERCC1 mRNA的量，并把它與這些基因的預(yù)定閾表達(dá)水平進(jìn)行比較，從而評(píng)價(jià)固定或固定且石蠟包埋的組織中TS和/或ERCC1的表達(dá)水平，并預(yù)測(cè)患者腫瘤對(duì)基于5－FU和奧沙利鉑的治療的可能抗性的方法。更特別是，本發(fā)明提供寡核苷酸引物對(duì)ERCC1和TS，及使用它們分別檢測(cè)ERCC1和TS mRNA水平的方法。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1596314SQ01822464
公開日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2001年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月1日
發(fā)明者K·D·達(dá)南伯格 申請(qǐng)人:應(yīng)答遺傳公司