專利名稱：旋毛蟲病快速診斷試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種旋毛蟲病診斷試劑顯示器具，特別是涉及一種旋毛蟲病快速診斷試紙條。
背景技術(shù)：
眾所周知，旋毛蟲病是人畜共患的一種寄生蟲病。其感染宿主眾多，流行范圍非常廣泛，傳染途徑復(fù)雜，約有150多種動(dòng)物能感染旋蟲病，對(duì)人類身體健康造成很大威脅。旋毛蟲病對(duì)畜牧業(yè)(特別是養(yǎng)豬業(yè))，肉食品加工業(yè)，外貿(mào)出口業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。旋毛蟲的含蟲包囊對(duì)外界環(huán)境具有很強(qiáng)的抵抗能力，如在--12℃的環(huán)境中可存活57天，對(duì)含有旋毛蟲的肉類進(jìn)行熏烤、腌制、爆炒及曝曬等很難殺死包囊內(nèi)的旋毛蟲的幼蟲，人類感染旋毛蟲的途徑，往往是吃了保持活力的肉類食品中的旋毛蟲肌幼蟲，如水餃、爆炒肉片或被污染的涼菜等。人被感染后，其臨床表現(xiàn)為微熱，身體虛弱、易疲勞，有時(shí)有腹瀉，嘔吐，腹痛現(xiàn)象；嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)咀嚼、吞咽和說(shuō)話困難，聲音嘶啞，呼吸及眼球疼痛，最為嚴(yán)重的可能會(huì)波及心臟和中樞神經(jīng)，造成心力衰竭、昏迷甚至死亡。所以旋毛蟲病對(duì)人類健康為害是人之共知的。但是很多動(dòng)物如豬等對(duì)旋毛蟲具有很大的耐受力，感染旋毛蟲的病豬幾乎不表現(xiàn)臨床癥狀。這給人類預(yù)防旋毛蟲病又帶來(lái)一定困難。1979年某省豬的旋毛蟲病感染率為0.4％，而到1982年，感染率上升到0.85％，其中1980年～1982年，某地區(qū)豬的旋毛蟲病感染率為13.8％，而1986年豬的旋毛蟲血清學(xué)陽(yáng)性率上升到18.7％，據(jù)1996年不完全統(tǒng)計(jì)，僅某省旋毛蟲病患者已達(dá)1萬(wàn)多人，可看出旋毛蟲病對(duì)人們身體健康危害日益嚴(yán)重。長(zhǎng)期以來(lái)，為確保肉食品安全，獸醫(yī)衛(wèi)生檢驗(yàn)部門主要依靠傳統(tǒng)屠宰后取隔肌壓片鏡檢法，或用胃蛋白酶消化肌肉收集蟲體的方法診斷旋毛蟲病。但上述方法，檢出率底，部分旋毛蟲病豬漏檢流向市場(chǎng)，危害人們健康，影響食品安全。同時(shí)上述兩種檢驗(yàn)方法不能在家畜宰殺前進(jìn)行，不適應(yīng)現(xiàn)代化肉類加工廠屠宰作業(yè)生產(chǎn)線的現(xiàn)場(chǎng)檢疫，也不適應(yīng)市場(chǎng)檢疫，也無(wú)法提供活豬出口檢疫，給生豬的檢疫帶來(lái)較大困難。為此國(guó)內(nèi)外科技工作者又創(chuàng)造其它幾種診斷旋毛蟲病的方法。
(1)皮內(nèi)試驗(yàn)，該方法是應(yīng)用變態(tài)反應(yīng)來(lái)診斷旋毛蟲病。該診斷方法所需時(shí)間較短，對(duì)人體的診斷約15分鐘，對(duì)豬體診斷約需30～45分鐘。但該方法的突出缺陷是存在嚴(yán)重的假陽(yáng)性反應(yīng)和交叉反應(yīng)，只有60％的檢率，目前很少采用。
(2)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(CF)，由于并非所有的抗體均能固定補(bǔ)體、所以該法只能檢出一部分旋毛蟲抗體，其敏感性和特異性較差，并且，補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)工，不同操作者之間存在差異較大，影響結(jié)果判斷，造成難以推廣應(yīng)用。
(3)凝集試驗(yàn)，將旋毛蟲可溶性抗原吸附于某些載體表面，然后用吸附抗原的載體顆粒與血清中的抗體進(jìn)行間接凝集試驗(yàn)，以檢測(cè)旋毛蟲病，近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的旋毛蟲病凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法，主要有皂土絮狀凝集試驗(yàn)(BFT)，乳膠凝集試驗(yàn)(LA)，間接血凝試驗(yàn)(IHA)等。這些方法的優(yōu)點(diǎn)是較大提高了旋毛蟲病的檢出率，但操作復(fù)雜，要求操作人員的素質(zhì)較高，并且只能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，無(wú)法到現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
(4)沉淀試驗(yàn)，主要有微量沉淀試驗(yàn)，對(duì)流免疫電泳，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)等。這些方法的敏感性評(píng)價(jià)不一，所用試劑和方法欠標(biāo)準(zhǔn)化。
(5)免疫熒光抗體技術(shù)(IF)，IF不僅可用于旋毛蟲病的檢測(cè)，也可用于旋毛蟲抗原的定位。應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)的敏感性和特異性同顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察相結(jié)合，具有敏感、特異、穩(wěn)定及結(jié)果判定準(zhǔn)確直觀等優(yōu)點(diǎn)，是目前檢測(cè)旋毛蟲病的一種較好方法。但存在制片工作繁瑣，工作量大，顯微鏡觀察帶有主觀性，同時(shí)非特異性熒光的干擾也常常影響結(jié)果的判定，需要較好顯微設(shè)備。
(6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，將ELISA技術(shù)應(yīng)用于旋毛蟲病的檢測(cè)，大大提高了檢出率，而且非常敏感；假陽(yáng)性率大大下降，大幅度提高準(zhǔn)確度，使旋毛蟲病的免疫學(xué)檢測(cè)取得突破性進(jìn)展。當(dāng)前我們研制成功的豬旋毛蟲病快診斷試劑盒已得到廣泛應(yīng)用，但操作復(fù)雜，且需要附帶4種試劑才能完成實(shí)驗(yàn)操作，對(duì)操作人員的技術(shù)水平要求較高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
(7)DNA檢測(cè)技術(shù)，是從分子水平上檢測(cè)旋毛蟲感染的一種高新技術(shù)，具有高度的敏感性和特異性。對(duì)旋毛蟲的分類和鑒定開(kāi)辟了新的途徑，使旋毛蟲病的研究更加深入。但由于旋毛蟲本身及其在宿主體內(nèi)寄生部位的特殊性。使得難以從感染動(dòng)物血液及其組織或排泄物中擴(kuò)增到旋毛蟲DNA，因而用PCR等基因檢測(cè)技術(shù)對(duì)旋毛蟲的檢測(cè)受到限制。
綜合上述，從二十世紀(jì)四十年代開(kāi)始至今，許多學(xué)者探索了旋毛蟲病的很多檢測(cè)方法，不斷取得進(jìn)步，不斷提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率，但始終未能克服特異性不強(qiáng)和出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，上述方法均存在操作復(fù)雜、繁瑣，有的還需要專用儀器設(shè)備，需要專業(yè)人員操作。不適應(yīng)現(xiàn)代化肉類聯(lián)合加工廠的流水作業(yè)生產(chǎn)線操作，造成旋毛蟲病豬的漏檢，危害人們的食用安全，威脅人類健康。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用旋毛蟲抗原、抗體技術(shù)，建立旋毛蟲特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便的旋毛蟲病診斷方法，研制出兩種對(duì)人和動(dòng)物旋毛蟲病的快速診斷試紙條(I)和(II)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)含有支撐層，反應(yīng)試劑載體吸附層，支撐層為不吸水的薄片層，反應(yīng)試劑載體吸附層固定在支撐層上，吸附層從樣品端依次為纖維層，旋毛蟲金標(biāo)抗體W1或W2纖維層，纖維素膜層，手柄端為吸水材料層，分別用旋毛蟲的單克隆抗體W1或W2溶液和抗小鼠IgG抗體溶液在纖維素膜層上印制診斷印跡“|”或“一”和對(duì)照印跡“一”或“|”。
支撐層可為硬質(zhì)塑膠片條，或?yàn)椴晃布垪l，纖維層可為玻璃棉，纖維素膜層可用硝酸纖維素膜，吸水材料層可用吸水紙，旋毛蟲金標(biāo)抗體W1或W2纖維層，為膠金標(biāo)記抗旋毛蟲分泌抗原(ES)的單克隆抗體吸附在玻璃棉上，診斷印跡和對(duì)照印跡組合可為“+”，“‖”，“＝”，中的一種，選用“+”或“‖”或“＝”組合印跡較好，在纖維層，金標(biāo)W1或W2玻璃棉，吸水材料層上覆蓋有塑膠保護(hù)膜，在纖維層和金標(biāo)W1或W2纖維層交界處對(duì)應(yīng)保護(hù)膜偏向纖維層一側(cè)約0.5cm處印制樣品標(biāo)記線。
一種旋毛蟲病快速診斷試紙條(II)，含有支撐層，反應(yīng)試劑載體吸附層，支撐層為不吸水的薄片層，反應(yīng)試劑載體吸附層固定在支撐層上，吸附層從樣品端依次為纖維層，旋毛蟲金標(biāo)抗原M纖維層，纖維素膜層，手柄端為吸水材料層，用抗人或抗某動(dòng)物IgG抗體Xi溶液在纖維素膜層上印制檢測(cè)印跡“|”或“一”，用抗旋毛蟲ES抗原的單克隆抗體溶液在纖維素膜層上印制對(duì)照印跡“一”或“|”。
不吸水的支撐層可用硬塑料膠片條，或不吸水的硬紙條，纖維層可用玻璃棉，金標(biāo)抗原M纖維層為吸附金標(biāo)ES抗原的玻璃棉，金標(biāo)抗原M為膠金標(biāo)記旋毛蟲的ES抗原，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的組合可為“+”，或“‖”，或“＝”，或 或 ，或 ，或 中的一種，選用“+”或“‖”或“＝”組合印跡較好，在纖維層，金標(biāo)M纖維層及吸水材料層上覆蓋固定有塑膠保護(hù)膜，在纖維層和金標(biāo)M纖維層交界處對(duì)應(yīng)保護(hù)膜偏纖維層一側(cè)約0.5cm處印制樣品標(biāo)記線。
抗人或抗某動(dòng)物IgG的抗體Xi印制檢測(cè)印跡“|”或“一”可為下列抗體中的一種；抗人IgG抗體X1，抗豬IgG抗體X2，抗貓IgG抗體X3，抗狗IgG抗體X4，……抗某動(dòng)物IgG抗體Xn，旋毛蟲ES抗原包括蟲體分泌ES抗原及表達(dá)ES抗原。
本發(fā)明具有積極有益效果。
(1)旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)和(II)，特異性強(qiáng)，敏感性高。兩種診斷試紙條都使用以膠金標(biāo)記高親和力單克隆抗體及重組ES抗原為基礎(chǔ)試劑制備而成，金標(biāo)抗體和抗原中金顆粒與抗體或ES抗原分子之間無(wú)共價(jià)鍵形成，二者通過(guò)異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠金標(biāo)記對(duì)單克隆抗體的特異性及親和力和對(duì)ES抗原的抗原性影響很小，且具有很高的標(biāo)記率，使兩種快速診斷試紙條具有特異性強(qiáng)，敏感性高的特性。
(2)操作簡(jiǎn)便、快速，大幅度縮短診斷時(shí)間。只要將快速診斷試紙條插入待測(cè)樣品中10秒左右，在2分鐘內(nèi)即可判斷診斷結(jié)果。
(3)顯示診斷結(jié)果形象，直觀、準(zhǔn)確、明了。兩種診斷試紙條以顯示紅棕色和“‖”或“-”和“+”作為診斷結(jié)果的陰性或陽(yáng)性標(biāo)記，結(jié)果判斷甚為形象，直觀，準(zhǔn)確、明了，易記，不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和誤判。
(4)無(wú)需儀器設(shè)備，無(wú)需其它任何試劑，無(wú)需專業(yè)檢測(cè)人員，投資少，成本低，將會(huì)深受客戶歡迎。
(5)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)操作診斷，一步到位，將深受飼養(yǎng)場(chǎng)，肉類聯(lián)合加工廠，海關(guān)等部門歡迎，適合我國(guó)國(guó)情。
(6)容易推廣應(yīng)用，由于診斷操作簡(jiǎn)單，無(wú)需專門培訓(xùn)，可說(shuō)是人人都可操作，容易推廣應(yīng)用。


圖1旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)和(II)結(jié)構(gòu)示意2旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)和(II)俯視結(jié)構(gòu)示意圖之一圖3旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)和(II)俯視結(jié)構(gòu)示意圖之二具體實(shí)施例方式旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)和(II)可廣泛用于人和動(dòng)物(豬，貓，狗等)的旋毛蟲病快速診斷。為完成本發(fā)明的實(shí)施，首先必須完成制備旋毛蟲分泌抗原ES，制備抗ES抗原的單克隆抗體，制備抗人，抗小鼠、抗豬、抗貓、抗狗等動(dòng)物IgG抗體。用于制備金標(biāo)W1和M纖維層。
(1)旋毛蟲ES抗原的制備以表達(dá)性質(zhì)粒pCDM8為載體，構(gòu)建了豬旋毛蟲肌幼蟲表達(dá)性cDNA基因文庫(kù)。以該基因文庫(kù)轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后，用免疫組化法鑒定陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞用微吸管吸取獲得，提取制備細(xì)胞中的質(zhì)料DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌并快速克隆，應(yīng)用該法準(zhǔn)確地獲得了全息ES抗原(分子量為45kda、49kda)兩個(gè)編碼基因即TS·ESI和TS·ESII。用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶中單層COS7細(xì)胞，將消化細(xì)胞1000r/min，離心10min，棄上清液，沉淀加入DMEM-10培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)重新懸浮細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸浮液稀為105個(gè)/ml，接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種1ml，置37℃ 5％CO2培訓(xùn)箱中培養(yǎng)24h.，培養(yǎng)后細(xì)胞覆蓋率為60％。用DMEM-SF(無(wú)血清DMEM)洗滌COS7細(xì)胞一次，每孔加入1ml。用EMEM稀釋表達(dá)質(zhì)料DNA和脂質(zhì)體，每孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞按以下程序操作，取Eppendorf 1支管，加入DMEM-SF 100μl，文庫(kù)DNA 3μl(0.5μg/μl)，混合均勻。另取Eppendorf 1支管依次加入，EMEM-SF 100μl，脂質(zhì)體10μl，混合均勻，室溫放置40min后，將兩個(gè)Eppendorf管混合均勻，室溫放置15min，加入800μl DMEM-SF，輕輕混合后加入COS7細(xì)胞孔內(nèi)。置37℃ 5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h.，吸出DMEM-SF培養(yǎng)基，用DMEM-10洗滌一次，加入DMEM-10每孔1ml，繼續(xù)培養(yǎng)48～60h后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液并濃縮，以鎳螯合樹脂純化重組ES抗原，用于制備抗ES抗原單克隆抗體及金標(biāo)抗原(M)。
(2)制備抗ES抗原單克隆抗體以50mg-100mg/只的ES抗原免疫BALB/c系小鼠三次，每次間隔15～30天，第三次加強(qiáng)免疫后3～4天將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，于75％酒精浸泡5-10min，無(wú)菌取其脾臟，剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，1000r/min離心10min，收集脾細(xì)胞；將1×108的脾細(xì)胞與2-5×107的NS0漿細(xì)胞瘤細(xì)胞混合，1000r/min離心10min，棄上清，細(xì)胞沉淀于37℃水浴中緩緩加入0.7-1ml的40％-59％PEG4000(pH8.5-9.0)作用1min，然后緩慢加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基15ml，以終止PEG的作用，37℃水浴5-10min，1000r/min離心10min棄上清，將細(xì)胞沉淀重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔培養(yǎng)板(100ul-200ul/孔)置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7-10天后，以5mg-10mg/ml的ES抗原包被酶標(biāo)板(40孔/塊)以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)雜交瘤的培養(yǎng)上清，挑取強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞克隆(CD492＝0.8以上)，進(jìn)行連續(xù)三次的有限稀釋法克隆化，所生產(chǎn)的雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)為92-98，其分泌的單克隆抗體特異地與ES抗原反應(yīng)，而不與其它無(wú)關(guān)蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，親和力常數(shù)達(dá)109-10，輕鏈亞型為K或入，重鏈亞型為IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3、針對(duì)ES抗原決定簇的單克隆抗體，用于制備金標(biāo)抗體棉。
(3)制備金標(biāo)抗體(W1或W2)、金標(biāo)抗原M及金標(biāo)抗體W1或W2玻璃棉或金標(biāo)M玻璃棉。
以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠，即在沸騰的50-100ml0.01％-0.05％氯金酸水溶液中加入2-4ml的0.5％-2％檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15nm左右的膠金。以0.1mol/L K2CO3調(diào)膠金pH至8.5-9.5，以1∶1000-1∶3000的標(biāo)記比將待標(biāo)記的抗ES單克隆抗體W1或W2或ES抗原加入pH8.5-9.5金溶膠中，標(biāo)記10min后，加20％PEG10000至終濃度0.05％，4℃1500-3000g離心20min，除去未結(jié)合的金顆粒，4℃15000g離心1h，棄上清，獲初步純化金標(biāo)蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標(biāo)蛋白，獲得膠金標(biāo)記抗體或抗原。將1∶100-1∶500稀釋的膠金標(biāo)記抗體或抗原吸附于精制玻璃棉中，4℃低溫真空干燥，制備成金標(biāo)抗體棉或金標(biāo)抗原棉。
(4)制備抗人及抗小鼠、抗豬、抗貓、抗狗等動(dòng)物IgG抗體以飽和硫酸銨提取人血清IgG蛋白，取1份人血清加2份PBS(7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨混勻，置4℃冰箱2h，4℃12000r/min離心15min，棄上清；以兩倍血清體積的PBS(7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨至終濃度33％，置4℃冰箱2h，4℃12000r/min離心15min，棄上清，以少量PBS(7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱在PBS(7.2)中過(guò)夜透析，換液2-3次，4℃12000r/min離心15min，收集上清，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白濃度，以50mg-100mg/kg體重的人血清IgG蛋白經(jīng)皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3-4次，末次免疫10天后，靜脈采血，以ELISA測(cè)定其血清抗體效價(jià)在1∶2000以上，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨提取羊或兔抗人IgG抗體(方法與提取人血清IgG相同，不重述)。該方法適用于抗小鼠、抗豬、抗貓、抗狗等動(dòng)物IgG抗體的制備不重述。
(5)旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)和(II)的反應(yīng)原理旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)的反應(yīng)原理是，當(dāng)旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)樣品端插入待檢測(cè)樣品溶液后，待檢溶液通過(guò)虹吸帶動(dòng)旋毛蟲ES抗原及金標(biāo)玻璃棉中的金標(biāo)抗體W1或W2一起向硝酸纖維素膜擴(kuò)散，并最終滲入濾紙中(吸水層)，在擴(kuò)散過(guò)程中ES抗原可與抗ES抗原的金標(biāo)抗體W1或W2相結(jié)合，形成ES抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，該復(fù)合物又與纖維素膜層上的抗ES單克隆抗體檢測(cè)印跡相結(jié)合，生成紅棕色″-″或″|″標(biāo)記，部分未與檢測(cè)印跡結(jié)合的金標(biāo)抗體W1或W2與纖維膜層上的抗小鼠IgG抗體對(duì)照印跡相結(jié)合，生成紅棕色“|”或“—”標(biāo)記，兩種標(biāo)記互相組合疊加結(jié)果，形成陽(yáng)性顯示“+”或“‖”，反之，金標(biāo)抗體(W1或W2)由于沒(méi)有形式ES抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，不能與纖維素膜層上的抗ES單克隆抗體檢測(cè)印跡相結(jié)合，只能與纖維素膜層上的抗小鼠IgG抗體對(duì)照印跡相結(jié)合，生成單一紅棕色陰性標(biāo)記“|”或“—”，如果試紙條檢測(cè)結(jié)果，纖維素膜上既沒(méi)有陽(yáng)性顯示標(biāo)記“+”或“‖”，也沒(méi)有陰性顯示標(biāo)記“|”或“—”，則表時(shí)試紙條已失效，不能再用于檢測(cè)。
旋毛蟲病快速診斷試紙條(II)的反應(yīng)原理是，當(dāng)旋毛蟲病快速診斷試紙條II樣品端插入待檢樣品溶液后，待檢溶液通過(guò)虹吸帶動(dòng)旋毛蟲抗體及金標(biāo)抗原M一起向硝酸纖維素膜擴(kuò)散，并最終滲入吸水層濾紙中，在擴(kuò)散過(guò)程中旋毛蟲抗體可與ES金標(biāo)抗原M相結(jié)合，形成ES金標(biāo)抗原-抗體復(fù)合物，該復(fù)合物又可與纖維素膜層上的抗人或抗豬、抗貓、抗狗等抗體(Xi)檢測(cè)印跡相結(jié)合，生成紅棕色“—”或“|”標(biāo)記，部分未與檢測(cè)印跡結(jié)合的金標(biāo)抗原M與纖維素膜層上抗ES抗原單克隆抗體對(duì)照印跡相結(jié)合，生成紅棕色“|”或“—”標(biāo)記，兩種標(biāo)記互相組合疊加結(jié)果，形成陽(yáng)性顯示“+”或“‖”，反之，金標(biāo)抗原M由于沒(méi)有形成金標(biāo)ES抗原-抗體復(fù)合物，不能與纖維素膜層上的抗人或抗豬、或抗貓、或抗狗等抗體(Xi)檢測(cè)印跡相結(jié)合，只能與纖維素膜層上的抗ES單克隆抗體對(duì)照印跡相結(jié)合，生成單一的紅棕色陰性標(biāo)記“|”或“—”，如果試紙條檢測(cè)結(jié)果，纖維素膜上既沒(méi)有陽(yáng)性顯示標(biāo)記“+”或“‖”，也沒(méi)有陰性顯示標(biāo)記“|”或“—”，則表明試紙條已失效，不能繼續(xù)使用。
(6)制備旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)和(II)的待測(cè)樣品及檢測(cè)方法檢測(cè)樣品液的制備，旋毛蟲病快速診斷試紙條用于檢測(cè)血液、肉及肉制品旋毛蟲感染，采集人或豬、貓、狗等動(dòng)物抗凝血，或?qū)⒇i、貓、狗等動(dòng)物的肉及肉制品的樣品剪碎、研磨，以生理鹽水制成1∶2～1∶10待檢樣品懸液，旋毛蟲病抗體檢測(cè)試紙條用于檢測(cè)血清抗體，采集人或豬、貓、狗等動(dòng)物靜脈血制備血清，用生理鹽水將樣品作1∶2、1∶4、1∶8.....倍比稀釋，制備檢測(cè)樣品溶液。
將旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)或(II)的樣品端插入待檢樣品溶液，插入深度不要超過(guò)標(biāo)記線9，約10秒后取出檢測(cè)試紙條，水平放置約2分鐘，觀察結(jié)果。
結(jié)果判定如果在纖維素膜上有紅棕色陽(yáng)性標(biāo)記“+”或“‖”顯示表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即在所檢樣品中檢出旋毛蟲抗原或旋毛蟲抗體，表示被檢測(cè)的人或動(dòng)物患有旋毛蟲病。如果纖維素膜上有紅棕色陰性標(biāo)記“—”或“|”顯示，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，即在所檢樣品中未檢出旋毛蟲抗原或旋毛蟲抗體，表示被檢測(cè)的人或動(dòng)物未患旋毛蟲病。如果纖維素膜上沒(méi)有紅棕色標(biāo)記顯示，則表明試紙條失效，要停止使用，報(bào)廢。
實(shí)施例一人旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)，參見(jiàn)圖1和2或圖1和3。首先按實(shí)施例(1)步驟制備旋毛蟲ES抗原，按實(shí)施例(2)步驟制備旋毛蟲金標(biāo)抗體W1或W2，以及相對(duì)應(yīng)的金標(biāo)W1或W2纖維棉，即金標(biāo)W1或W2玻璃棉。按實(shí)施例中(4)步驟制備抗小鼠IgG抗體溶液。
圖中，1為支撐層，采用塑膠薄片制成，2為玻璃棉(樣品端)即纖維層，3為吸附有旋毛蟲金標(biāo)抗體W1或W2的玻璃棉，即金標(biāo)W1或W2棉，4為纖維素膜層，本實(shí)施例選用硝酸纖維素膜，5為吸水材料層，選用濾紙(即手柄端)上述標(biāo)號(hào)2、3、4、5依次粘固在支撐層1上的塑膠薄片上，構(gòu)成反應(yīng)試劑載體吸附層，使用旋毛蟲ES抗原單克隆抗體溶液在硝酸纖維素膜層4上印制診斷印跡6“|”或“—”，使用抗小鼠IgG抗體溶液在硝酸纖維素膜層4印制對(duì)照印跡7“—”或“|”。兩種印跡疊加后呈“+”或“‖”，在玻璃棉2，旋毛蟲金標(biāo)W1或W2棉3上覆蓋有保護(hù)膜8-1，濾紙吸水層5的上面覆蓋固定有保護(hù)膜8-2，本實(shí)施例采用淺黃色透明塑料膜。在玻璃棉2和旋毛蟲金標(biāo)W1或W2棉3的交界處偏玻璃棉2一側(cè)約0.5cm處印制標(biāo)記線9，9的右邊印制有箭頭指向標(biāo)記線，箭頭下印有max字樣。試紙條全長(zhǎng)約8cm，寬約0.3cm。
制備待測(cè)樣品溶液，對(duì)待檢人進(jìn)行靜脈采血1～2ml，加適量抗凝劑，用生理鹽水制成1∶5至1∶10待測(cè)樣品懸液。
診斷檢測(cè)方法是將人的旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)的樣品端即玻璃棉纖維層2，插入待檢樣品溶液中，插入深度不要超過(guò)標(biāo)記線9，約10秒后，取出試紙條，水平放置，2分鐘左右即可看到快速診斷結(jié)果，如果在硝酸纖維素膜層4上顯示有紅棕色“+”或“‖”標(biāo)記，表示檢測(cè)樣品呈陽(yáng)性，即所采人的血樣中存在旋毛蟲ES抗原，被檢測(cè)者患有旋毛蟲?。蝗绻跛崂w維素膜層4上顯示“-”或“|”的紅棕色標(biāo)記，表示所檢樣品呈陰性，說(shuō)明被檢測(cè)血液中不存在旋毛蟲ES抗原，即被檢測(cè)者未患旋毛蟲病。如果硝酸纖維素膜層4上不顯標(biāo)記，即表示該試紙條已失效。
實(shí)施例二人旋毛蟲病快速診斷試紙條(II)。本實(shí)施例的快速診斷試紙條(II)，其結(jié)構(gòu)與實(shí)施例一快速診斷試紙條(I)基本相同，相同的結(jié)構(gòu)不再重復(fù)敘述。不同的是3為旋毛蟲金標(biāo)抗原M棉，6為抗人IgG抗體溶液印制的檢測(cè)印跡“|”或“—”，7為旋毛蟲抗ES抗原的單克隆抗體溶液印制的對(duì)照印跡“—”或“|”。
待測(cè)樣品溶液制備對(duì)待人進(jìn)行靜脈采血1～2ml制備血清，用生理鹽水作1∶2，1∶4，1∶8，......倍比稀釋，制成檢測(cè)樣品溶液。
其檢測(cè)方法的步驟，顯示結(jié)果方式，以及判斷方法同實(shí)施例一不重?cái)ⅰ?br> 實(shí)施例三，豬旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)，參見(jiàn)圖1和2，或圖1和3，本實(shí)施例的試紙條(I)結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一試紙條(I)相同不重述。
豬的待測(cè)樣品，采豬血，按人血相同的處理方法處理，不重述，若采用豬肉或豬肉制品為待檢樣品，先將豬肉或豬肉制品剪碎或研磨制成1∶5～1∶10的樣品溶液，其檢測(cè)方法及結(jié)果觀察同實(shí)施例一，不重述。
實(shí)施例四豬旋毛蟲病快速診斷試紙條(II)，本實(shí)施例試紙條(II)的結(jié)構(gòu)基本相同實(shí)施例二，有一點(diǎn)不同的是在硝酸纖維素膜層4的診斷印跡6使用抗豬IgG抗體(X2)溶液印制，豬的待測(cè)樣品溶液的制備同實(shí)施例三，不重述。
實(shí)施例五貓旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)其結(jié)構(gòu)和檢測(cè)方法、顯示結(jié)果和實(shí)施例一相同，不重述。貓的待測(cè)樣品制備同實(shí)施例三中豬的待測(cè)樣品，不重述。
實(shí)施例六貓旋毛蟲病快速診斷試紙條(II)，同其結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法，顯示結(jié)果同實(shí)施例二，不重述。有點(diǎn)不同的是在硝酸纖維素膜層4上的診斷印跡6使用抗貓IgG抗體(X3)溶液印制。待測(cè)樣品的制備同實(shí)施例二和三類似不重述。
實(shí)施例七狗旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)，其結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法，顯示結(jié)果，同實(shí)施例一，不重述。其待測(cè)樣品溶液的制備同實(shí)施例三不重述。
實(shí)施例八狗旋毛蟲病快速診斷試紙條(II)其結(jié)構(gòu)，檢測(cè)方法，顯示結(jié)果同實(shí)施例二，不重述。有一點(diǎn)不同的是硝酸纖維素膜層4上的診斷印跡采用抗狗IgG抗體(X4)印制。其待測(cè)樣品溶液的制備同實(shí)施例二和實(shí)施例三類似，不重述。
其它動(dòng)物旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)和(II)可用類似方法制造設(shè)計(jì)出，在這里不再重述。
權(quán)利要求
1.一種旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)含有支撐層，反應(yīng)試劑載體吸附層，支撐層為不吸水的薄片層，反應(yīng)試劑載體吸附層固定在支撐層上，其特征是吸附層從樣品端依次為纖維層，旋毛蟲金標(biāo)抗體W1或W2纖維層，纖維素膜層，手柄端為吸水材料層，分別用旋毛蟲的單克隆抗體 或W2溶液和抗小鼠IgG抗體溶液在纖維素膜層上印制診斷印跡“|”或“一”和對(duì)照印跡“一”或“|”。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條(I)，其特征是支撐層可為硬質(zhì)塑膠片條，或?yàn)椴晃布垪l，纖維層可為玻璃棉，纖維素膜層可用硝酸纖維素膜，吸水材料層可用吸水紙，旋毛蟲金標(biāo)抗體W1或W2纖維層，為膠金標(biāo)記抗旋毛蟲分泌抗原(ES)的單克隆抗體吸附在玻璃棉上，診斷印跡和對(duì)照印跡組合可為“+”，“‖”，“＝”， 中的一種，選用“+”或“‖”或“＝”組合印跡較好，在纖維層，金標(biāo)W1或W2玻璃棉，吸水材料層上覆蓋有塑膠保護(hù)膜，在纖維層和金標(biāo)W1或W2纖維層交界處對(duì)應(yīng)保護(hù)膜偏向纖維層一側(cè)約0.5cm處印制樣品標(biāo)記線。
3.一種旋毛蟲病快速診斷試紙條(II)含有支撐層，反應(yīng)試劑載體吸附層，支撐層為不吸水的薄片層，反應(yīng)試劑載體吸附層固定在支撐層上，其特征是吸附層從樣品端依次為纖維層，旋毛蟲金標(biāo)抗原M纖維層，纖維素膜層，手柄端為吸水材料層，用抗人或抗某動(dòng)物IgG抗體Xi溶液在纖維素膜層上印制檢測(cè)印跡“|”或“一”，用抗旋毛蟲ES抗原的單克隆抗體溶液在纖維素膜層上印制對(duì)照印跡“一”或“|”。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試紙條(II)，其特征是不吸水的支撐層可用硬塑料膠片條，或不吸水的硬紙條，纖維層可用玻璃棉，金標(biāo)M纖維層為吸附金標(biāo)ES抗原的玻璃棉，金標(biāo)抗原M為膠金標(biāo)記旋毛蟲的ES抗原，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的組合可為“+”，或“‖”，或“＝”，或 或 或 或 中的一種，選用“+”或“‖”或“＝”組合印跡較好，在纖維層，金標(biāo)抗原M纖維層及吸水材料層上覆蓋固定有塑膠保護(hù)膜，在纖維層和金標(biāo)抗原M纖維層交界處對(duì)應(yīng)保護(hù)膜偏纖維層一側(cè)約0.5cm處印制樣品標(biāo)記線。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試紙條(II)，其特征是抗人或抗某動(dòng)物IgG的抗體Xi印制檢測(cè)印跡“|”或“一”可為下列抗體中的一種；抗人IgG抗體X1，抗豬IgG抗體X2，抗貓IgG抗體X3，抗狗IgG抗體X4，……抗某動(dòng)物IgG抗體Xn，旋毛蟲ES抗原包括蟲體分泌ES抗原及表達(dá)ES抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種旋毛蟲病診斷試劑顯示的器具，特別是涉及一種旋毛蟲病快速診斷試紙條(I)和(II)，含有支撐層、反應(yīng)試劑載體吸附層，支撐層為不吸水薄片條，反應(yīng)試劑載體吸附層粘貼于支撐層上，從樣品端依次為纖維層，旋毛蟲金標(biāo)抗體W
文檔編號(hào)G01N33/53GK1403813SQ0210192
公開(kāi)日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2002年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月15日
發(fā)明者張改平, 李學(xué)伍, 楊艷艷, 鄧瑞廣, 肖治軍, 康曉笛, 郭軍慶, 李青梅, 李靈霞, 王愛(ài)萍, 楊繼飛 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所